KR20210087869A

KR20210087869A - 분자 다중 이미징 방법 및 장치

Info

Publication number: KR20210087869A
Application number: KR1020200088091A
Authority: KR
Inventors: 장재범; 윤영규; 서준영; 심연보
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2020-01-03
Filing date: 2020-07-16
Publication date: 2021-07-13
Also published as: KR102351249B1

Abstract

다양한 생체 분자들이 세포 혹은 조직 내에서 어떻게 공간적으로 분포되어 있는지 알아내기 위해 필수적인 다분자 형광 이미징(multiplexed fluorescent imaging)을 개시한다. 본 개시는 형광 물질의 선정, 검출 파장대, 신호 분리 알고리즘을 새롭게 설계하여 한 번의 표지 및 이미징으로 10개 이상의 서로 다른 생체 분자 이미지를 얻을 수 있다. 본 개시는 형광 물질의 방출 스펙트럼 없이 이미지를 분리하는 블라인드 분리 기술인데, 이 기술에서는 4쌍의 형광 물질을 사용하는데 각 쌍은 방출 스펙트럼이 겹치는 2개의 형광 물질로 구성된다. 각 쌍의 형광 물질은 하나의 여기 레이저(excitation)에 의해서만 강하게 여기된다. 각 쌍마다 검출 파장대가 다른 2 개의 이미지가 얻어지며, 두 이미지는 상호정보량 최소화(mutual information minimization)를 통해 형광 물질 방출 스펙트럼 정보 없이 분리된다. 이 두 이미지는 그람-슈미트(Gram-Schmidt) 직교화 및 형광 측정 기반 분리법을 통해서도 분리될 수 있다. 이 신호 분리를 각 형광 물질 쌍마다 반복한다. 여기에 더해 위의 8개의 형광 물질의 발광 스펙트럼과는 겹치지 않는 파장대에서 발광하는 large stoke's shift 형광 물질을 두 개 추가하여 총 10개 이상의 형광 물질을 동시에 사용할 수 있다.

Description

분자 다중 이미징 방법 및 장치{METHOD AND APPARATUS FOR MULTIPLEXTED IMAGING OF SPECTRALLY-SIMILAR FLUOROPHORS}

본 개시는 분자 다중 이미징 방법 및 장치에 관한 것이다.

지난 수십년간 생물학 연구 및 의학 진단에서 생체 시료 내부의 생체 물질을 관찰하기 위해서 형광 이미징 기법을 많이 사용해 왔다. 형광 이미징 기법은 시료 내부의 생체 물질을 형광 물질로 표지한 후, 이 형광 물질에서 방출되는 빛을 이미징하여 시료 내부의 생체 물질을 간접적으로 관찰할 수 있는 기법이다. 형광 물질은 빛을 흡수하여 여기(excitation)된 후 다시 빛을 방출(emission)하는데, 이 때 흡수한 빛보다 긴 파장의 빛을 방출하게 된다. 예를 들어, 형광 물질은 특정 파장대(예를 들면, 350~400nm)의 빛을 흡수해서 특정 파장대(예를 들면, 400~600nm)의 빛을 방출한다. 형광 물질이 파장별로 여기되는 정도를 나타낸 것을 여기 스펙트럼(excitation spectrum)이라고 하고, 파장 별 방출하는 빛의 세기를 나타낸 것을 방출 스펙트럼(emission spectrum)이라고 한다.

해결하고자 하는 과제는 물질 다중 이미징 방법 및 장치를 제공하는 것이다.

본 개시에 따른 전자 장치의 동작 방법은, 상이한 생체 물질들에 각각 표지되어 있는 복수의 형광 물질들에 대해, 적어도 하나의 이미지를 획득하는 단계, 및 상기 획득된 이미지를 상기 생체 물질들 각각에 대한 이미지들로 분리하는 단계를 포함하고, 상기 형광 물질들 중 적어도 어느 두 개는, 유사한 파장대의 방출 스펙트럼들을 각각 나타낼 수 있다.

본 개시에 따른 전자 장치는, 메모리, 및 상기 메모리와 연결되고, 상기 메모리에 저장된 적어도 하나의 명령을 실행하도록 구성된 프로세서를 포함하고, 상기 프로세서는, 상이한 생체 물질들에 각각 표지되어 있는 복수의 형광 물질들에 대해, 적어도 하나의 이미지를 획득하고, 상기 획득된 이미지를 상기 생체 물질들 각각에 대한 이미지들로 분리하도록 구성되고, 상기 형광 물질들 중 적어도 어느 두 개는, 유사한 파장대의 방출 스펙트럼들을 각각 나타낼 수 있다.

본 개시에 따르면, 이미지 분리 정확도를 크게 향상시키고, 다중 이미징 속도를 높일 수 있다.

본 개시에 따르면, 한번의 염색에 8개 이상의 형광 물질(본 개시에서는 10개까지 구현)을 동시에 관찰할 수 있어서 전체 이미징에 걸리는 시간을 수 배 단축시킬 수 있다. 본 개시는 반복 염색 기법과 결합하는 것이 가능한데 이 경우 한번에 이미징 할 수 있는 생체 분자의 수가 3개에서 8개(혹은 10개)로 늘어나기 때문에 반복 염색 횟수를 3배 이상 줄일 수 있다. 반복 염색 횟수가 늘어나는 경우 여러 이미지들을 서로 정합(image registration) 해줘야 하는 번거로움이 있기 때문에 반복 염색 횟수를 줄일 수록 전체 이미징의 난이도가 내려가게 된다는 장점이 있고, 이미지 정합의 문제로 인해서 기존의 반복 염색 기법은 다분자의 분포를 삼차원으로 얻기 어렵지만, 본 기술을 이용하면 이미지 정합 없이 10종의 생체분자를 삼차원으로 이미징 할 수 있다. 본 개시에 따르면, 형광 물질의 방출 스펙트럼을 기반으로 하지 않기 때문에 현미경 별, 시료 별 보정 혹은 측정(calibration)이 필요 없다. 본 개시는 10개의 형광 물질을 동시에 이미징하는데에 단 8개의 방출 필터만을 필요로 하기 때문에 형광 필터 방식의 일반 공초점 현미경 혹은 저가의 간단한 형광 현미경으로도 구현 가능하다.

본 개시에 따르면, 동일한 형광 물질을 동시에 이미징하는 데에 ICA 혹은 NMF보다 적은 숫자의 이미지를 필요하기 때문에 이미징 시간이 단축된다. 또한, ICA 혹은 NMF에 비해서 적은 숫자의 원소만 유추하면 되기 때문에 그 정확도가 훨씬 더 높아 세포가 조밀하게 밀집되어 있는 조직에서 8개 이상의 형광 물질을 동시에 높은 정확도로 분리하는 것이 가능하다. 2개의 large stoke's shift 형광 물질을 추가로 사용하는 경우 총 10개의 형광 물질을 동시에 이미징하는 것이 가능하다. 본 개시에 따르면, 형광 물질의 수와 얻어야 하는 이미지의 수가 같아 이미징 획득 속도가 빠르고, 스펙트랄 디텍터를 필요로 하지 않으며, 신호 분리가 각 형광 물질 쌍에 대해 독립적으로 일어나기 때문에 신호 분리 오류가 다른 형광 쌍으로 전파되지 않고, 수백만의 픽셀로부터 하나의 원소만을 유추하기 때문에 그 정확도가 기존의 블라인드 분리 기술에 비해서 훨씬 더 높다.

도 1은 일반적인 형광 물질을 이용한 다분자 이미징에서의 형광 물질 선택의 예이다.
도 2는 본 개시의 다양한 실시예들에 따른 전자 장치의 블록도이다.
도 3은 본 개시의 다양한 실시예들에 따른 전자 장치의 분자 다중 이미징 방법의 흐름도이다.
도 4a는 도 3의 이미지 획득 단계의 흐름도이다.
도 4b는 도 3의 이미지들 분리 단계의 흐름도이다.
도 5는 일 실시예에 따른 형광 물질 선정 방법을 설명하는 도면이다.
도 6은 일 실시예에 따른 분자 다중 이미징 방법을 설명하는 도면이다.
도 7은 일 실시예에 따른 여러 레이저별 분자 다중 이미징의 예와 이에 대한 검증, 그리고 신호증폭 기술과 결합한 결과이다.
도 8은 일 실시예에 따른 동일 호스트에서 생산된 항체를 이용한 결과와 투명화된 조직에 적용한 결과, 그리고 mRNA 및 단백질을 동시에 이미징한 결과이다.
도 9는 일 실시예에 따른 8 개에서 10 개 단백질 동시 이미징 결과이다.
도 10은 일 실시예에 따른 병리학 시료의 다분자 이미징 결과이다.
도 11은 일 실시예에 따른 스펙트랄 디텍터 없이 대역 필터를 이용한 다분자 이미징 결과이다.
도 12는 항체 복합체 염색의 유효성 검증 결과이다.
도 13은 항체 복합체 간의 혼선 유무 검증 결과이다.
도 14는 항체 복합체를 사용하여 염색한 시료에서 상호정보량 최소화를 통한 신호 분리의 유효성 검증 결과이다.
도 15는 본 개시와 팽창 현미경(expansion microscopy, ExM)의 호환성 검증 결과이다.
도 16은 레이저 노출 시간(exposure time)에 따른 신호 밝기의 선형성 그래프이다.
도 17은 레이저 세기(laser intensity)에 따른 신호 밝기의 선형성 그래프이다.
도 18은 형광 물질 측정 기반 신호 분리 결과이다.
도 19는 본 개시의 다른 다분자 이미징 기술(t-CyCIF)로의 적용을 설명하는 도면이다.
도 20은 본 개시의 그람-슈미트 직교화를 통한 신호 분리 결과이다.

아래에서는 첨부한 도면을 참고로 하여 본 개시의 실시예에 대하여 본 개시가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 개시는 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본 개시를 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.

명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 또한, 명세서에 기재된 "…부", "…기", "모듈" 등의 용어는 적어도 하나의 기능이나 동작을 처리하는 단위를 의미하며, 이는 하드웨어나 소프트웨어 또는 하드웨어 및 소프트웨어의 결합으로 구현될 수 있다.

설명에서는 동작 주체가 생략될 수 있으나, 본 개시에서 설명하는 방법은 전자 장치, 예컨대 컴퓨팅 장치와 형광 현미경을 포함하는 장치에서 구현될 수 있다.

일반적으로 형광 물질로 생체 시료 내부의 생체 분자를 표지하여 형광 현미경으로 이미징 하는 경우, 그 과정은 아래와 같다.

광원(light source)에서부터 빛이 방출되는데, 광원은 백색광을 방출하는 램프 혹은 특정 파장대의 빛을 방출하는 레이저 또는 LED일 수 있다. 이 빛은 원하는 파장대의 빛만을 투과시키는 여기필터(excitation filter)를 거치면서 해당 파장대의 빛만 통과하게 된다. 여기필터를 통과한 빛은 이색거울(dichroic mirror)에서 반사되어 위쪽으로 올라가고, 현미경의 대물렌즈(objective)쪽으로 나아간다. 그 후 대물렌즈를 거쳐 시료(sample)에 조사(illuminate)된다.

시료 내부의 형광 물질들은 조사된 파장(예, 350 - 400nm)의 빛을 흡수하여 400 - 700nm 파장대의 빛을 방출하게 되는데, 이 빛은 다시 대물렌즈를 거치고 이색거울(dichroic mirror)를 통과하여 방출필터(emission filter)로 전달된다(이색거울은 특정 파장대의 빛은 반사시키고 나머지 빛은 통과시키는 특성이 있다).

이 때 시료에서부터 형광 물질이 방출하는 빛 이외에 시료 자체가 가지고 있는 자가형광(autofluorescence)이 동시에 방출되게 되는데, 이 자가형광은 매우 넓은 파장대에서 모두 방출되는 특성이 있다. 따라서 시료에서부터 방출된 빛은 형광 물질이 방출한 빛과 자가형광이 섞여 있다.

시료에서 방출된 빛은 특정 파장대의 빛만을 투과시키는 방출필터(emission filter)를 거치게 되는데, 400~700nm 파장대만 통과시키는 방출필터를 사용하여 샘플에서 방출된 빛 중에서 400~700nm를 제외한 빛은 제거하고 이 파장대의 빛만을 투과시킬 수 있다. 방출필터 대신 특정 파장대를 선택적으로 투과, 반사, 혹은 굴절시켜 특정 파장대의 빛만을 골라낼 수 있는 여러 종류의 장치가 사용될 수 있다.

방출필터를 통과한 빛은 접안렌즈(eyepiece)로 보내지거나 디텍터(detector)로 보내져서 디지털 이미지로 표현된다. 이렇게 얻은 형광 이미징의 한 예로, 시료(배양 세포) 속 특정 단백질(액틴)을 형광 물질로 표지한 후 형광 현미경으로 이미징할 수 있다.

도 1은 일반적인 형광 물질을 이용한 다분자 이미징에서의 형광 물질 선택의 예이다. 도 1을 참고하면, 하나의 시료에서 여러 생체 분자를 동시에 관찰하기 위해서는 여러 생체 분자를 서로 다른 형광 물질로 표지한 후, 각 형광 물질의 이미지를 선택적으로 얻는 것이 필요하다. 이를 위해서 여기 스펙트럼과 방출 스펙트럼이 겹치지 않는 형광 물질을 사용해야 하는데, 일반적으로 많이 사용하는 400~650nm 파장대의 광원을 이용해서 최대 4개의 형광 물질을 동시에 사용하기 위해서는 (a)와 같이 405nm에서 강하게 여기되는 형광 물질, 488nm에서 강하게 여기되는 형광 물질, 560nm에서 강하게 여기되는 형광 물질, 640nm에서 강하게 여기되는 형광 물질을 사용할 수 있다.

(a)를 참고하면, 형광 물질 Alexa 405는 405nm 레이저에서만 강하게 여기되고 다른 레이저로는 여기되는 않는 것을 알 수 있다. 다른 형광 물질들(Alexa 488, Alexa 546, Alexa 647) 역시 하나의 여기 레이저에서만 강하게 여기되는 것을 알 수 있다. 네 개의 형광 물질은 각기 특정 레이저로 여기되어 (b)에서 보이는 것과 같은 스펙트럼으로 빛을 방출한다.

(b)를 참고하면, 방출 필터의 스펙트럼(녹색, 노란색, 적색, 파란색 사각형)은 각 방출필터 별 투과시키는 빛의 파장을 나타낸다. 형광 물질에서 방출된 빛은 각 형광 물질별 방출 필터를 통해 자가형광을 최대한 제거한 후 디텍터를 통해 디지털 이미지로 표현된다.

네 가지 형광 물질로 다분자 이미징을 하는 과정을 나열하자면, 405nm 레이저를 시료에 조사하여 Alexa 405를 여기시키고, 이 형광 물질에서 방출되는 빛을 방출 필터 1으로 거른 후 디텍터로 이미징한다. 그 후 405nm 레이저를 끄고 488nm 레이저를 시료에 조사하여 Alexa 488을 여기시키고, 이 형광 물질에서 방출되는 빛을 방출 필터 2로 거른 후 디텍터로 이미징한다. 그 후 488nm 레이저를 끄고 560nm 레이저를 시료에 조사하여 Alexa 546을 여기시키고, 이 형광 물질에서 방출되는 빛을 방출 필터 3로 거른 후 디텍터로 이미징한다. 그 후 560nm 레이저를 끄고 640nm 레이저를 시료에 조사하여 Alexa 647을 여기시키고, 이 형광 물질에서 방출되는 빛을 방출 필터 4로 거른 후 디텍터로 이미징한다.

(b)에서 보는 것과 같이 형광 물질들의 방출 스펙트럼은 100nm 정도의 너비를 가지고 있어서 다섯 개 이상의 형광 물질을 동시에 사용할 수 없다. 다섯개의 형광 물질을 동시에 사용하는 경우, 형광 물질의 방출 스펙트럼이 겹치기 시작한다. 예를 들어 (c)와 같이 CF 594 형광 물질을 추가한 경우, CF 594 형광 물질의 방출 스펙트럼은 Alexa 546의 방출 스펙트럼 뒤쪽에 위치한다. CF 594 형광 물질은 Alexa 546과 마찬가지로 560nm 레이저로 강하게 여기된다. 따라서 시료 내부의 두 단백질을 Alexa 546과 CF 594로 각각 표지하고 560nm 레이저를 조사해주는 경우 두 형광 물질이 모두 빛을 강하게 방출한다. 하지만 이 경우 두 신호를 따로 분리하는 것이 불가능한데, (c)에 표시된 방출 필터 3을 사용하면 CF 594의 신호가 일부(붉은색 원) 섞이게 되고 방출 필터 5를 사용하면 Alexa 546의 신호가 일부(파란색 원) 섞이게 되는 문제점이 있다. 따라서 현재 다분자 이미징은 최대 네 개의 형광 물질만 동시에 사용할 수 있고, 5개 이상의 형광 문자를 동시에 사용할 수 없는 한계가 있다.

최근 디지털 병리학의 발전에 따라서 하나의 시료에서 더 많은 생체 분자 정보를 동시에 획득하고 분석하여, 기존보다 더 정밀한 진단법을 개발하려는 다양한 시도가 진행되고 있다. 또한, 최근 각광 받고 있는 3세대 항암 치료제인 면역 치료제의 경우, 환자의 암 조직 내부에 어떤 세포 타입이 존재하는지, 어떤 종류의 면역 세포가 존재하는지에 따라서 특정 치료제에 대한 반응성이 다르다는 연구 결과가 발표되고 있다. 따라서 하나의 시료에서 더 많은 생체 분자를 동시에 이미징 해야 하는 필요성이 대두되고 있다. 하지만 일반적으로 많이 사용하는 400~650nm 파장대의 광원을 이용하는 경우 한번에 최대 4개의 형광 물질만을 동시에 사용할 수 있다는 한계가 있다. 이러한 한계를 뛰어 넘기 위해서 다양한 기술들이 개발되었는데 이 기술들은 크게 세 가지(반복 염색 기법, 스펙트럼 이미징 후 신호 분리 기법, 블라인드 신호 분리 기법)로 나눌 수 있다.

먼저 첫번째로 반복 염색 기법(Multi-round staining)은 시료 내부의 생체 분자를 3개 혹은 4개의 형광 물질로 각각 표지하여 이미징 한 후, 화학적 처리를 통해 형광 물질을 비활성시키거나 생체 분자에서 형광 물질을 떼어 낸다. 그 후 다시 다른 생체 분자를 동일한 3개 혹은 4개의 형광 물질로 표지하여 이미징한다. 이러한 방법을 반복하면 하나의 생체 시료에서 수십가지 생체 분자를 동시에 관찰하는 것이 가능하다. 하지만 형광 물질 표지를 반복해야 하기 때문에 시간이 오래 걸리고, 화학 처리 과정 중 시료가 손상되는 문제가 있다.

두번째로, 스펙트럼 이미징 후 신호 분리 기법(Spectral Imaging and Signal unmixing)은 방출 스펙트럼이 겹치는 여러 형광 물질로 여러 생체 분자를 각각 표지한 후, 여러 형광 물질을 동시에 여기시킨다. 그 후 여러 검출 파장대에서 시료의 이미지를 얻은 후 파장대별 각 형광 물질의 상대적 세기에 대한 정보를 바탕으로, 얻은 이미지를 각 형광 물질만의 이미지로 분리한다. 예를 들어, 방출 스펙트럼이 겹치는 세 형광 물질(ECFP, EGFP, EYFP)로 시료 내부의 세 가지 생체 분자를 각각 표지한 후, 12개의 검출 파장대에서 이미지를 얻고, 이 12개의 이미지로부터 세 형광 물질의 이미지를 분리할 수 있다. ECFP는 450nm 파장에서부터 빛을 방출하기 시작하여 475nm에서 가장 강하게 빛을 방출하며, EGFP은 470nm에서부터 빛을 방출하기 시작하여 510nm 에서 가장 강하게 빛을 방출하며, EYFP는 500nm에서부터 빛을 방출하기 시작하여 530nm에서 가장 강하게 빛을 방출한다. 만약 각 형광 물질의 방출 스펙트럼을 알고 있다면, 12개의 파장대(1부터 12까지)에서 총 12장의 이미지를 얻은 후 형광 물질 별 방출 세기를 바탕으로 세 형광 물질의 이미지를 분리(unmixing)하는 것이 가능하다. 세 형광 물질의 신호를 분리하는 과정을 수학적으로 표현한다면 하기 [수학식 1]과 같이 나타낼 수 있다(위 과정을 통해서 얻어지는 이미지의 해상도가 1024 x 1024 픽셀이라고 가정).

좌변 행렬(IMG): 각 행은 각 형광 검출 파장대에서 얻은 이미지(예: IMG1, IMG2, … IMG12)를 나타내며, 각 열은 각 이미지에서 각 픽셀 별 절대 밝기 값(예: IMG1₁은 IMG1의 첫번째 픽셀의 밝기 값)을 나타냄. 이미지의 해상도가 1024 x 1024인 경우 행렬 IMG는 총 1,048,576(=1,024 x 1,024)개의 열을 가진다.

우변 첫번째 행렬(M): 각 형광 물질들의 각 검출 파장대에서의 상대적 밝기

우변 두번째 행렬(F): 이 행렬의 각 행은 각 형광 물질로만 이루어진 이미지로, F1은 첫번째 형광 물질(ECFP)의 신호로만 이루어진 이미지를 뜻하며, 각 열은 행렬 IMG와 마찬가지로 각 픽셀 별 절대 밝기 값을 나타냄

IMG1,2,3,4,…12: 서로 다른 파장대에서 얻은 이미지

IMG1₁: IMG1의 첫번째 픽셀의 값

IMG1_1,048,576: IMG1의 마지막 픽셀(1024 x 1024 = 1,048,576)의 값

F1,2,3: 세 형광 물질(ECFP, EGFP, EYFP) 신호로만 이루어진 이미지

F1₁: F1의 첫번째 픽셀의 값

F1_1,048,576: F1의 마지막 픽셀(1024 x 1024 = 1,048,576)의 값

검은색: 미리 알고 있는 값(M 행렬)이거나 측정된 값(IMG 행렬)

붉은색: 알아내야 하는 값(F 행렬)

이와 같이, 스펙트럼 이미징 후 신호 분리 기법은 각 검출 파장대에서 각 형광 물질의 세기를 알고 있을 때, 12 검출 파장대에서 이미지를 얻고, IMG/M을 통해 F 행렬을 얻을 수 있다. 즉, 이 기법은 M 행렬을 알고 있어야만 작동하는데, M 행렬은 현미경에 따라서, 시료의 화학적 환경에 따라서 달라지게 된다. M 행렬은 각 형광 물질의 검출 파장대 별 세기를 말하는데 현미경 내부의 광학적 특성과 디텍터의 파장 별 감도, 시료의 화학적 조성에 따라서 달라지게 된다. 따라서 현미경마다, 시료마다 해당 행렬을 따로 측정해줘야 한다는 번거로움이 있어 실제 조직 이미징에 널리 사용되지 못하고 있다.

마지막 세번째로 블라인드 신호 분리(Blind Unmixing)는 M 행렬을 모르는 상태에서 M 행렬과 F 행렬을 동시에 유추해내는 방법으로, 이를 위해서는 독립 성분 분석(Independent Component Analysis; ICA) 혹은 음수 미포함 행렬 분석(Non-negative Matrix Factorization; NMF)이 사용되어 왔다. 하지만 하기 [수학식 2]와 같이 M 행렬은 36개의 원소(element)를 가지고 있고, F 행렬은 3,145,728(=3 x 1024 x 1024)개의 원소를 가지고 있어 3백만개에 달하는 원소를 동시에 정확하게 유추하는 것이 매우 어렵다.

검은색: 측정된 값(IMG 행렬)

붉은색: 알아내야 하는 값(M 행렬, F 행렬)

그 결과 기존의 블라인드 신호 분리는 그 정확도가 크게 떨어져 매우 제한적으로 사용되어 왔다. 또한, 기존의 ICA, NMF는 분리를 위해서 필요한 이미지의 수(IMG 행렬의 행의 수)가 반드시 형광 물질의 수(F 행렬의 행의 수)보다 많아야 한다는 조건이 있다. 즉, 8개의 형광 물질을 동시에 이미징 하기 위해서는 9장 이상의 이미지를 얻어야 하기 때문에 시간이 오래 걸린다는 단점이 있다.

본 개시(Process of ultra-multiplexed Imaging of biomoleCules viA the unmixing of the Signals of Spectrally Overlapping fluorophores, PICASSO)는 이러한 종래기술의 단점을 해결한 것으로서, 블라인드 신호 분리 기법 중 하나이다. 하지만, 이 기술은 기존의 블라인드 신호 분리 기법들에 비해서 훨씬 더 높은 정확도로, 8번의 이미징만으로 8개의 형광 물질을 동시에 이미징 후 분리할 수 있다. 이를 위해 본 개시는 형광 물질 선정, 형광 검출 파장대 선정, 상호정보량 최소화를 통한 형광 물질 신호 분리를 포함한다.

본 개시는 위의 세 가지 기술을 통해 기존의 ICA 혹은 NMF 기반 기술에 비해서 동시에 유추해야 하는 원소의 수를 크게 줄여 이미지 분리 정확도를 크게 향상시켰다.

예를 들어 ICA 혹은 NMF로 방출 스펙트럼이 겹치는 두 형광 물질의 신호를 분리해야 하는 경우, 하기 [수학식 3]과 같이 최소 세 개의 서로 다른 파장대에서 이미징을 한 후, ICA 혹은 NMF알고리즘을 이용하여 M 행렬과 F 행렬을 동시에 유추해내야 한다.

하지만 M 행렬은 6개의 원소로 이루어져 있고 F 행렬은 2,097,152개의 원소로 이루어져 있어서 2백만개가 넘는 원소를 동시에 유추해내야 하기 때문에 그 정확도가 떨어지게 된다(붉은색으로 표시된 숫자들은 유추해야 하는 원소를 나타냄).

이에 비해서 본 개시에서는 형광 물질 선정 전략 및 형광 검출 파장대 선정 전략을 통해 위 문제를 하기 [수학식 4]와 같이 간략화할 수 있다.

위에서 볼 수 있듯이, 본 개시는 형광 물질과 형광 검출 파장대 선정을 통해 첫 번째 검출 파장대에서 얻은 이미지 IMG1에는 첫 번째 형광 물질의 신호인 F1만이 포함되도록 하여 IMG1 = F1의 관계가 성립한다. IMG2는 F1와 F2의 합(IMG2 = F1 x α + F2)으로 나타낼 수 있는데 F1은 측정값인 IMG1과 같기 때문에 α만 정확히 유추해낸다면 F2를 계산(F2 = IMG2 - α x IMG1)해낼 수 있다. 본 개시에서는 IMG1과 IMG2 사이의 상호정보량 최소화(Mutual information minimization)을 이용하여 α 값을 정확하게 유추할 수 있다.

즉, ICA 혹은 NMF를 이용한 방법에서는 ICA 혹은 NMF를 이용하여 수 백만 원소(M 행렬과 F 행렬)를 동시에 유추해야 하기 때문에 그 정확도가 떨어졌다면, 본 개시에서는 형광 물질 선정 전략 및 형광 검출 파장대 선정 전략을 통해 하나의 원소(α)만 정확히 유추하면 이미지가 분리될 수 있도록 실험을 설계하여 이미지 분리의 정확도를 비약적으로 향상시키고, α 값은 상호정보량 최소화 전략을 통해 유추할 수 있다.

세 개 이상의 형광 물질을 동시에 이미징해야 하는 경우, 서로 방출 스펙트럼이 겹치는 세 개의 형광 물질을 사용하는 대신, 방출 스펙트럼이 겹치는 형광 물질 쌍을 여러 개 사용할 수 있다. 예를 들어 일반적으로 ICA 혹은 NMF를 이용하여 방출 스펙트럼이 겹치는 세 개의 형광 물질을 분리하는 경우, 최소 4개의 파장대에서 이미지를 얻어서 M 행렬과 F 행렬을 동시에 유추해야 한다.

상기 [수학식 5]와 같이 방출 스펙트럼이 겹치는 형광 물질의 수가 증가할수록 M 행렬의 크기가 기하급수적으로 커지는 것을 알 수 있고, 방출 스펙트럼이 겹치는 2개의 형광 물질을 분리하는 경우 M 행렬의 크기는 3 x 2 = 6이며, 방출 스펙트럼이 겹치는 3개의 형광 물질을 분리하는 경우 M 행렬의 크기는 4 x 3 = 12 이다. 이와 같이 방출 스펙트럼이 겹치는 N 개의 형광 물질을 분리하는 경우 M 행렬의 크기는 N² 만큼 커지게 되어 더 많은 형광 물질을 분리하는 경우 그 수학적 복잡성이 급격히 상승한다. 예를 들어 ICA 혹은 NMF로 서로 방출 스펙트럼이 겹치는 8개의 형광 물질을 분리하는 과정을 수학적으로 나타내면 하기 [수학식 6]과 같다.

본 개시에서는 이와 같은 문제를 피하기 위하여 가시광선 영역을 4 개의 영역으로 나누고, 각 영역에서는 방출 스펙트럼이 겹치는 두 개의 형광 물질만을 사용한다. 가시광선 영역을 405nm 영역, 488nm 영역, 560nm 영역, 640nm 영역으로 나누고, 각 영역에서 방출 스펙트럼이 겹치는 두 개의 형광 물질만 사용한다. 그 결과 총 8개의 형광 물질을 동시에 사용하는 경우, 하기 [수학식 7]과 같이 표현된다.

이와 같이, 8개의 형광 물질을 동시에 사용하고 그 신호를 분리하는 문제를 α 값을 네 번 유추해내는 과정으로 간략화할 수 있다.

도 2는 본 개시의 다양한 실시예들에 따른 전자 장치(200)의 블록도이다.

도 2를 참조하면, 본 개시의 다양한 실시예들에 따른 전자 장치(200)는 디텍터(210), 입력 모듈(220), 출력 모듈(230), 메모리(240) 또는 프로세서(250) 중 적어도 어느 하나를 포함할 수 있다. 어떤 실시예에서는 전자 장치(200)의 구성 요소들 중 적어도 어느 하나가 생략되거나, 전자 장치(200)에 하나 이상의 다른 구성 요소들이 추가될 수 있다.

디텍터(210)는 시료에 대한 이미지를 촬영할 수 있다. 이 때 디텍터(210)은 전자 장치(200)의 미리 정해진 위치에 설치되어, 이미지를 촬영할 수 있다. 예를 들면, 디텍터(210)는 sCMOS(scientific complementary metal-oxide-semiconductor) 카메라, PMT(photo multiplier tube), 혹은 그 이외에 빛의 세기를 측정하여 이를 이미지로 표현할 수 있는 장비 중 적어도 어느 하나를 포함할 수 있다.

입력 모듈(220)은 전자 장치(200)의 구성 요소들 중 적어도 어느 하나에 사용될 명령 또는 데이터를 전자 장치(200)의 외부로부터 수신할 수 있다. 이 때 입력 모듈(220)은 입력 장치 또는 수신 장치 중 적어도 어느 하나를 포함할 수 있다. 예를 들면, 입력 장치는 마이크(microphone), 마우스 또는 키보드 중 적어도 어느 하나를 포함할 수 있다. 어떤 실시예에서, 입력 장치는 터치를 감지하도록 설정된 터치 회로(touch circuitry) 또는 터치에 의해 발생되는 힘의 세기를 측정하도록 설정된 센서 회로 중 적어도 어느 하나를 포함할 수 있다. 수신 장치는 무선 수신 장치 또는 유선 수신 장치 중 적어도 어느 하나를 포함할 수 있다.

출력 모듈(230)은 전자 장치(200)의 외부로 정보를 제공할 수 있다. 이 때 출력 모듈(230)은 표시 장치 또는 송신 장치 중 적어도 어느 하나를 포함할 수 있다. 예를 들면, 표시 장치는 디스플레이, 홀로그램 장치, 또는 프로젝터 중 적어도 어느 하나를 포함할 수 있다. 어떤 실시예에서, 표시 장치는 입력 모듈(220)의 터치 회로 또는 센서 회로 중 적어도 어느 하나와 조립되어, 터치 스크린으로 구현될 수 있다. 송신 장치는 무선 송신 장치 또는 유선 송신 장치 중 적어도 어느 하나를 포함할 수 있다.

일 실시예에 따르면, 수신 장치와 송신 장치는 하나의 통신 모듈로 통합될 수 있다. 통신 모듈은 전자 장치(200)와 외부 장치(미도시) 간 통신을 지원할 수 있다. 이러한 통신 모듈은 무선 통신 모듈 또는 유선 통신 모듈 중 적어도 어느 하나를 포함할 수 있다. 이 때 무선 통신 모듈은 무선 수신 장치 또는 무선 송신 장치 중 적어도 어느 하나로 이루어질 수 있다. 그리고, 무선 통신 모듈은 원거리 통신 방식 또는 근거리 통신 방식 중 적어도 어느 하나를 지원할 수 있다. 근거리 통신 방식은, 예컨대 블루투스(Bluetooth), 와이파이 다이렉트(WiFi direct), 또는 적외선 통신(IrDA; infrared data association) 중 적어도 어느 하나를 포함할 수 있다. 무선 통신 모듈은 네트워크를 통해 원거리 통신 방식으로 통신할 수 있으며, 네트워크는, 예컨대 셀룰러 네트워크, 인터넷, 또는 LAN(local area network)이나 WAN(wide area network)과 같은 컴퓨터 네트워크 중 적어도 어느 하나를 포함할 수 있다. 한편, 유선 통신 모듈은 유선 수신 장치 또는 유선 송신 장치 중 적어도 어느 하나로 이루어질 수 있다.

메모리(240)는 전자 장치(200)의 구성 요소들 중 적어도 어느 하나에 의해 사용되는 프로그램 또는 데이터 중 적어도 어느 하나를 저장할 수 있다. 예를 들면, 메모리(240)는 휘발성 메모리 또는 비휘발성 메모리 중 적어도 어느 하나를 포함할 수 있다.

프로세서(250)는 메모리(240)의 프로그램을 실행하여, 전자 장치(200)의 구성 요소들 중 적어도 어느 하나를 제어할 수 있고, 데이터 처리 또는 연산을 수행할 수 있다. 프로세서(250)는, 상이한 생체 분자들에 각각 표지되어 있는 복수의 형광 물질들에 대해, 적어도 하나의 이미지를 획득하고, 획득된 이미지를 생체 분자들 각각에 대한 이미지들로 분리하도록 구성될 수 있다. 이 때 형광 물질들 중 적어도 어느 두 개는, 유사한 파장대의 방출 스펙트럼들을 각각 나타낼 수 있다. 그리고, 각 파장대는, 방출 스펙트럼들 중 어느 하나의 일부에 대응하는 제 1 검출 파장대, 및 방출 스펙트럼들 중 어느 하나의 적어도 일부와 방출 스펙트럼들 중 다른 하나의 적어도 일부가 겹쳐져 있는 제 2 검출 파장대를 포함할 수 있다.

다양한 실시예들에 따르면, 프로세서(250)는, 제 1 검출 파장대의 제 1 이미지를 획득하고, 제 2 검출 파장대의 제 2 이미지를 획득할 수 있다. 이 때 프로세서(250)는, 파장대의 빛이 형광 물질들에 조사됨에 따라, 형광 물질들 중 적어도 어느 두 개의 방출 스펙트럼들에 대한 이미지를 생성하고, 생성된 이미지로부터 제 1 이미지와 제 2 이미지를 각각 획득할 수 있다. 일 실시예에 따르면, 제 1 이미지와 제 2 이미지는, 대역 필터에 의해, 각각 획득될 수 있다. 다른 실시예에 따르면, 제 1 이미지와 제 2 이미지는, 스펙트랄 디텍터에 의해, 각각 획득될 수 있다.

다양한 실시예들에 따르면, 프로세서(250)는 제 1 이미지를 기반으로, 제 2 이미지로부터 제 3 이미지를 획득할 수 있다. 이 때 프로세서(250)는, 제 2 이미지로부터 제 1 이미지와 제 2 이미지 사이에서 공유되는 정보를 최소화으로써, 제 3 이미지를 획득할 수 있다. 예를 들면, 프로세서(250)는, 제 1 검출 파장대에서의 형광 물질들 중 어느 하나의 밝기와 제 2 검출 파장대에서의 형광 물질들 중 어느 하나의 밝기에 대한 비율을 예측하고, 비율을 기반으로, 제 2 이미지로부터 제 3 이미지를 획득할 수 있다. 일 예로, 프로세서(250)는, 제 2 이미지로부터 비율과 제 1 이미지를 곱한 결과를 뺌으로써, 제 3 이미지를 획득하도록 구성될 수 있다.

이를 통해, 프로세서(250)는 제 1 이미지를 생체 분자들 중 어느 하나의 이미지로 검출하고, 제 3 이미지를 생체 분자들 중 다른 하나의 이미지로 검출할 수 있다.

본 개시에 따르면, 기존의 다분자 동시 이미징 기술에 비해서 아래와 같은 장점을 얻을 수 있다.

반복 염색 기법에 비해, 본 개시는 일반적으로 시료 염색에는 짧게는 1시간에서 길게는 수 시간이 걸리는데, 본 개시는 한번의 염색에 8개 이상의 형광 물질(본 개시에서는 10개까지 구현)을 동시에 관찰할 수 있어서 전체 이미징에 걸리는 시간을 수 배 단축시킬 수 있다. 본 개시는 반복 염색 기법과 결합하는 것이 가능한데 이 경우 한번에 이미징할 수 있는 생체 분자의 수가 3개에서 8개(혹은 10개)로 늘어나기 때문에 반복 염색 횟수를 3배 이상 줄일 수 있다. 반복 염색 횟수가 늘어나는 경우 여러 이미지들을 서로 정합(image registration) 해줘야 하는 번거로움이 있기 때문에 반복 염색 횟수를 줄일 수록 전체 이미징의 난이도가 내려가게 된다는 장점이 있다.

위의 이미지 정합의 문제로 인해서 기존의 반복 염색 기법은 다분자의 분포를 삼차원으로 얻기 어렵지만, 본 기술을 이용하면 이미지 정합 없이 10 종의 생체 분자의 분포를 삼차원으로 얻을 수 있다.

스펙트럼 이미징 후 신호 분리 기법에 비해, 본 개시는 형광 물질의 방출 스펙트럼을 기반으로 하지 않기 때문에 현미경 별, 시료 별 보정 혹은 측정(calibration)이 필요 없다. 스펙트럼 이미징을 위해서는 일반적으로 스펙트랄 디텍터(spectral detector)라는 고가의 장비를 따로 사용해야 하지만 일반적인 생물학 연구실 및 병원에서는 스펙트랄 디텍터가 구비된 현미경을 보유하고 있지 않다. 본 개시는 10개의 형광 물질을 동시에 이미징하는데 단 8개의 방출 필터만을 필요로 하기 때문에 형광 필터 방식의 일반 공초점 현미경 혹은 저가의 간단한 형광 현미경으로도 구현 가능하다.

블라인드 신호 분리 기법에 비해, 본 개시는 동일한 형광 물질을 동시에 이미징 하는 데에 ICA 혹은 NMF보다 적은 숫자의 이미지를 필요하기 때문에 이미징 시간이 단축된다. ICA 혹은 NMF에 비해서 적은 숫자의 원소만 유추하면 되기 때문에 그 정확도가 훨씬 더 높아 세포가 조밀하게 밀집되어 있는 조직에서 8개 이상의 형광 물질을 동시에 높은 정확도로 분리하는 것이 가능하다. 2개의 large stoke's shift 형광 물질을 추가로 사용하는 경우 총 10개의 형광 물질을 동시에 이미징하는 것이 가능하다.

도 3은 본 개시의 다양한 실시예들에 따른 전자 장치(200)의 분자 다중 이미징 방법의 흐름도이다. 도 4a는 도 3의 이미지 획득 단계의 흐름도이고, 도 4b는 도 3의 이미지들 분리 단계의 흐름도이다. 도 5는 일 실시예에 따른 형광 물질 선정 방법을 설명하는 도면이다. 도 6은 일 실시예에 따른 분자 다중 이미징 방법을 설명하는 도면이다.

도 3을 참조하면, 전자 장치(200)는 310 단계에서 복수의 형광 물질들에 대해, 적어도 하나의 이미지를 획득할 수 있다. 이 때 복수의 형광 물질들이 상이한 생체 분자들에 각각 표지될 수 있다. 이에 대해, 도 4a를 참조하여, 보다 상세하게 후술될 것이다.

도 4a를 참조하면, 전자 장치(200)는 411 동작에서 각 파장대의 형광 물질들을 선정할 수 있다. 이를 통해, 형광 물질들 중 적어도 어느 두 개가 유사한 파장대의 방출 스펙트럼들을 각각 나타낼 수 있다. 이를 위해, 현재 존재하는 수많은 형광 물질들 혹은 앞으로 새롭게 합성될 형광 물질 중에서 본 기술의 형광 물질 선정 방법에 따라 적어도 두 개의 형광 물질들이 선정될 수 있다.

본 개시에서는 일반적으로 많이 사용하는 가시광선 영역인 400 - 650nm 파장대의 네 가지 여기 레이저(excitation laser)를 사용하는데, 네 가지 여기 레이저 중 하나의 여기 레이저에서만 강하게 여기 되는 형광 물질들의 리스트를 작성한다. 예를 들어 CF405S와 ATTO390은 네 가지 여기 레이저 중에서 405nm 여기 레이저로만 강하게 여기 되기 때문에 사용 가능하지만, CF440은 405nm 여기 레이저와 488nm 여기 레이저로 여기 가능하기 때문에 리스트에서 포함하지 않을 수 있다.

방출 스펙트럼이 겹치지 않을수록 두 형광 물질의 신호를 분리하기 좋으므로, 방출 스펙트럼이 최대한 겹치지 않는 두 형광 물질을 선정하되 기준 값이상 차이나는 두 형광 물질을 선정할 수 있다. 각 여기 레이저 별 형광 물질 리스트에서 각 레이저별로 방출 스펙트럼의 최대가 되는 파장이 기준 값 이상 차이나는 두 형광 물질을 선정할 수 있다.

도 5에서, 405nm 여기 레이저의 형광 물질이 선택되는 방법을 살펴보면, 세 형광 물질 Alexa 405, CF405S, ATTO390은 모두 405nm 레이저로 강하게 여기되며, 다른 레이저로는 여기되지 않는다. Alexa 405와 CF405S는 방출 스펙트럼이 최대가 되는 파장의 차이가 10nm 이지만 CF405S와 ATTO390은 방출 스펙트럼이 최대가 되는 파장이 50nm 이상 떨어져 있다. 따라서 본 개시에서는 CF405S와 ATTO390을 선정(Alexa405와 ATTO390를 선정하거나 Alexa 405와 CF405S를 선정하는 것도 가능)할 수 있다. 위 조건에 따라서 선정한 각 여기 레이저별 형광 물질 쌍의 예시는 하기 [표 1]과 같다. 이외에도 다른 형광 물질 쌍도 가능하다.

405nm 여기 레이저와 488nm 여기 레이저에는 추가로 두 개의 large stoke's shift 형광 물질(CF405L, ATTO490LS)를 사용할 수 있다. Large-stoke's shift 형광 물질은 여기 스펙트럼과 방출 스펙트럼 사이에 100nm 정도의 큰 차이를 보이는 형광 물질을 뜻하는데, 이러한 특성으로 인해서 위의 8개의 형광 물질들과 동시에 사용할 수 있다. 560nm 여기 레이저 및 640nm 여기 레이저로 여기시킬 수 있는 Large-stoke's shift 형광 물질도 동시에 사용 가능한데, 이런 경우 총 12개의 형광 물질을 동시에 사용하는 것이 가능하다.

전자 장치(200)는 413 단계에서 각 파장대 내에서 복수의 검출 파장대들을 선정할 수 있다. 이 때 도 6 (a)에 도시된 바와 같이, 각 검출 파장대는, 방출 스펙트럼들 중 어느 하나의 일부에 대응하는 제 1 검출 파장대, 및 방출 스펙트럼들 중 어느 하나의 적어도 일부와 방출 스펙트럼들 중 다른 하나의 적어도 일부가 겹쳐져 있는 제 2 검출 파장대를 포함할 수 있다. 이러한 경우, 전자 장치(200)는 각 파장대에 대응하는 형광 물질들 중 첫번째 형광 물질의 신호만 검출되도록, 제 1 검출 파장대를 선정할 수 있다. 도 6 (a)는 사용되는 방출 스펙트럼이 겹치는 2개의 형광 물질의 방출 스펙트럼(실선과 음영 영역) 및 두 검출 파장대(점선)이다.

전자 장치(200)는 415 단계에서 검출 파장대들의 이미지들을 각각 획득할 수 있다. 이 때 전자 장치(200)는 제 1 검출 파장대의 제 1 이미지를 획득하고, 제 2 검출 파장대의 제 2 이미지를 획득할 수 있다. 이를 통해, 전자 장치(200)는 유사한 파장대의 형광 물질들 중 어느 하나에 대해 제 1 이미지를 획득하고, 유사한 파장대의 형광 물질들 모두에 대해 제 2 이미지를 획득할 수 있다. 이 후, 전자 장치(200)는 도 3으로 리턴하여, 320 단계로 진행할 수 있다.

일 실시예에 따르면, 4쌍의 형광 물질을 사용하는데, 방출 스펙트럼이 겹치는 각 쌍의 형광 물질들은 4개의 표준 여기 레이저(405, 488, 560, 640nm) 중 하나에 의해서만 강하게 여기된다. 따라서 각 여기 레이저당 두 형광 물질의 신호만 분리하면 되기 때문에 방출 스펙트럼이 겹치는 여러 개의 형광 물질의 신호를 분리하는 경우에 비해서 그 과정이 간단하다.

두 형광 물질로 시료 내부의 두 생체 분자를 각각 표지한 후 405nm 레이저를 조사(illuminate)해주면 도6 (a)에서 파란색으로 표시된 첫 번째 형광 물질과 녹색으로 표시된 두 번째 형광 물질이 동시에 빛을 방출한다. 이 빛을 파란색 점선으로 표시된 첫번째 검출 파장대를 투과시키는 투과 필터로 걸러주어 얻은 이미지 IMG1은 첫번째 형광 물질의 신호만을 포함하고 있기 때문에 IMG1 = F1의 관계가 성립한다. 그 후 시료에서 방출되는 빛을 녹색 점선으로 표시된 두번째 검출 파장대를 투과시키는 투과 필터로 걸러주어 얻은 이미지 IMG2는 두 형광 물질의 신호를 모두 포함하고 있다. 두 형광 물질로 생체 조직 내부의 두 생체 분자를 각각 표지 한 후, 두 검출 파장대에서 두 이미지를 얻는다. 이 때 스펙트랄 디텍터를 이용하여 각 검출 파장대에서 이미지를 얻을 수도 있고, 대역 필터(band-pass filter)를 이용할 수도 있다. 먼저 첫번째 검출 파장대는 첫 번째 형광 물질의 방출 스펙트럼의 앞쪽 파장대로, 이 파장대에서 얻은 이미지 IMG1는 첫번째 형광 물질의 신호 F1만이 포함되어 있다. 두 번째 파장대는 두 형광 물질의 신호가 모두 검출되는 파장대로, 이 파장대에서 얻은 이미지 IMG2는 첫번째 형광 물질의 신호 F1과 두번째 형광 물질의 신호 F2가 모두 포함되어 있다. 따라서 위의 도 6 (a) 에 표시된 IMG1, IMG2, F1, F2 사이의 관계는 하기 [수학식 8]과 같다.

α는 첫 번째 형광 물질의 첫 번째 검출 파장대에서의 밝기에 대한 두 번째 검출 파장대에서의 밝기에 대한 비율이다. 상기 [수학식 8]에서 알 수 있듯이, 이 α 값만 정확하게 알 수 있다면, IMG2에서부터 F1(=IMG1)의 신호를 완전히 제거하여 F2를 계산할 수 있다. 여기서, 도 6 (a)에서, α는 '녹색 점선 안에 포함된 파란색 음영의 넓이 / 파란색 점선 안에 포함된 파란색 음영의 넓이’ 이다.

다시 도 3을 참조하면, 전자 장치(200)는 320 단계에서 획득된 이미지를 생체 분자들 각각에 대한 이미지들로 분리할 수 있다. 이에 대해, 도 4b를 참조하여, 보다 상세하게 후술될 것이다.

도 4b를 참조하면, 전자 장치(200)는 421 단계에서 검출 파장대들에서 얻은 이미지들 사이의 상호정보량 최소화(mutual information minimization; MI minimization)를 위한 α를 유추할 수 있다. 이 때 전자 장치(200)는 제 1, 2이미지를 기반으로, α를 유추할 수 있다.

α 값을 유추하기 위해서 상호정보량 최소화를 이용할 수 있다. 상호정보량(MI)은 두 변수 간에 공유되는 정보의 양으로, 2개의 독립적인 랜덤 변수의 MI는 0이다. IMG2에서 F1이 완전히 제거되게 되면, 그 결과로 얻게 되는 (IMG2-αx F1)과 IMG1는 서로 독립 변수가 되어 상호정보량이 최소화가 된다고 가정한다. 따라서 IMG1과 (IMG2-αx F1) 사이의 상호정보량을 최소화 시킬 수 있는 α 값을 찾고, 이 값으로부터 F2를 계산한다. 이 방법은 수백만 픽셀 값을 가지는 IMG1, IMG2로부터 하나의 변수 α를 찾아내기 때문에, 기존의 블라인드 분리 기법에 비해서 그 정확도가 매우 높다. 또한, 본 개시에서는 α를 찾아내는 두 개의 추가적인 방법으로 M 행렬을 직접 측정하는 형광 측정 기반 분리법과 또 다른 블라인드 분리법인 그람-슈미트 직교화(Gram-Schmidt orthogonalization)를 이용할 수 있다.

전자 장치(200)는 423 단계에서 α를 기반으로, 생체 분자들 각각에 대한 이미지들을 검출할 수 있다. 이 때 전자 장치(200)는 α를 기반으로, 제 2 이미지로부터 제 3 이미지를 획득할 수 있다. 여기서, 전자 장치(200)는 제 2 이미지로부터 α와 제 1 이미지를 곱한 결과를 뺌으로써, 제 3 이미지를 획득할 수 있다. 이를 통해, 제 2 이미지로부터 제 1 이미지와 제 2 이미지 사이에서 공유되는 정보가 최소화되고, 이로써 제 3 이미지가 획득될 수 있다. 이에 따라, 제 1 이미지가 생체 분자들 중 어느 하나의 이미지로 검출되고, 제 3 이미지가 생체 분자들 중 다른 하나의 이미지로 검출될 수 있다.

도 6 (b)는 방출 스펙트럼이 겹치는 2개의 형광 물질로 표지 된 두 생체 분자를 도 6 (a)에서와 같이 두 개의 서로 다른 검출 파장대로 이미징 했을 때, 신호 분리 전후의 이미지이다.

도 6 (c)-(e)는 4개의 픽셀(맨 윗줄)로 구성된 이미지에 대한 신호 분리의 예로, α 는 1.2인 경우를 가정한 것이다. 사각형 안에 있는 숫자는 각 픽셀의 절대 밝기이다. (c)는 첫 번째 검출 파장대에서 얻은 이미지이고, (d)는 두 번째 검출 파장대에서 얻은 이미지이다. (e)는 신호 분리 후 두 번째 형광 물질에 대한 이미지이다. 상호 정보량 최소화를 통해 찾은 α값(1.2)를 첫 번째 검출 파장대에서 얻은 이미지에 곱한 후 두 번째 검출 파장대에서 얻은 이미지에서 뺀다. 예를 들어 도 6 (a)와 같이, 파란색으로 색칠된 부분과 녹색으로 색칠된 부분이 두 형광 물질의 방출 스펙트럼이며, 파란색 점선과 녹색 점선이 두 형광 검출 파장대를 나타낸다.

위의 방법을 이용하여 4개의 여기 레이저(405, 488, 560, 640nm)로 8개의 형광 물질을 동시에 이미징 하고, 그 신호를 분리시키는 방법은 하기 [수학식 9]와 같이 나타낼 수 있다.

상기 [수학식 9]에서 알 수 있듯이, 8개의 형광 물질을 동시에 이용하고 그 신호를 분리하는 과정이 각 파장 별 하나의 변수 α 를 네 번 유추해내는 과정으로 간략화 되었다. 또한, 하나의 α 유추에서 오차가 발생해도 이 오차가 다른 파장대의 형광 물질에는 영향을 미치지 않고, 같은 파장대의 형광 물질 하나에만 영향을 미치게 된다는 장점이 있다(예: α₄₀₅ 유추에 오차가 발생하는 경우 F2만 부정확해지고, F1, F3-8은 영향을 받지 않음). 본 개시에서는 위의 8개의 형광 물질에 더해서 여기 스펙트럼과 방출 스펙트럼이 큰 차이를 보이는 두 개의 large stoke's shift 형광 물질을 추가로 사용하였다. 이를 통해 4개의 일반 여기 레이저로 10개의 형광 물질을 동시에 사용하는 데에 성공하였다. 560nm 및 640nm 레이저로 강하게 여기 시킬 수 있는 추가적인 두 개의 Large-stoke's shift 형광 물질을 추가로 사용하는 경우 총 12개의 형광 물질을 동시에 사용하는 것도 가능하다.

도 6의 (b)는 생체 시료 내부의 두 생체 분자를 방출 스펙트럼이 겹치는 두 형광 물질로 표지하고, 두 형광 검출 파장대에서 IMG1, IMG2을 얻을 후, 두 생체 분자의 이미지 F1, F2가 분리되는 과정을 보여준다. 도 6의 (b)에서 볼 수 있듯이, 두 형광 물질로 생체 조직 내부의 두 생체 분자(사각형 점선, 원형 점선)을 표지 한 후 도 6의 (a)에서 표시된 두 형광 검출 파장대에서 두 이미지를 얻게 되면 IMG1은 원형 단백질을 보여주는 이미지가 되고, IMG2는 원형과 사각형 생체 분자를 모두 보여준다.

이렇게 얻은 두 이미지 IMG1(=F1)과 IMG2에 상호정보량 최소화를 적용하여 α를 계산해내고, 이를 이용하여 IMG2로부터 F2를 분리(unmixing)한다. 최종 결과물인 F1과 F2는 각각 원형 단백질, 사각형 생체 분자의 이미지이다.

두 이미지 분리 단계는 상호정보량 최소화(Mutual information minimization)를 통해, IMG1(=F1)과 IMG2에서부터 α를 유추한다.

상호정보량은 정보이론에서부터 비롯된 값으로, 두 변수 사이의 상호정보량은 두 변수가 공유하고 있는 정보의 총량을 말한다. 따라서 두 무작위 변수(two random variables) 사이의 상호정보량은 0 이다.

디지털 이미지는 불연속 변수(discrete variable)이므로 아래의 관계식을 활용해서 두 개의 이미지 사이의 상호정보량을 계산할 수 있다. 하기 [수학식 10]에서 p_X(x)와 p_Y(y)는 각 이미지의 확률분포함수(혹은 히스토그램)에 해당하며 p_(X,Y)(x,y)는 두 이미지의 결합 확률분포함수(혹은 결합 히스토그램)에 해당한다.

본 개시는 두 개의 이미지(IMG1, IMG2)가 있을 때, 상호정보량을 활용하여 손실함수를 하기 [수학식 11]과 같이 정의한다.

따라서, 손실함수는 α를 독립변수로 가지는 1차원 함수가 되며, 기울기 강하(gradient descent) 등의 최적화 방법을 활용하여 최소의 L(α)값을 가지는 α값을 찾아낼 수 있다. 즉, IMG2에서부터 IMG1을 정확하게 빼 줄수록(α를 정확하게 유추할수록) IMG2에는 생체 분자1(도 6 (b)에서 원형 생체 분자)의 정보가 사라지게 되고, 이에 따라서 생체 분자1의 이미지만을 포함하고 있는 IMG1과의 상호 정보량이 줄어들게 된다. 이를 이용해서 IMG1과 (IMG2-αx F1) 사이의 상호정보량이 최소가 되는 α 값을 찾아낼 수 있다.

기존의 블라인드 신호 분리 기법들은 주어진 형광 물질을 나누는 데에 집중했다면, 본 개시는 본 개시 특이적 형광 물질 선정 및 형광 검출 파장대 선정을 통해서 blind unmixing을 위해서 유추해야 하는 원소의 수를 극단적으로 감소시켰고, 그 후 상호정보량 최소화를 통해 이를 정확히 유추할 수 있다.

본 개시의 결과로 기존의 블라인드 신호 분리 기법으로는 단 한번도 달성하지 못했던 조직에서의 8개의 단백질을 동시에 관찰하는 결과를 얻을 수 있다. 또한, 기존의 블라인드 신호 분리 기법들은 분리하고자 하는 형광 물질의 수보다 많은 수의 이미지를 얻어야 하거나, 단백질 발현에 대한 조건 혹은 가정(예: 하나의 픽셀에는 하나의 단백질만 발현된다)을 도입해야 했으나 본 기술은 이러한 가정이나 조건이 없는 상태에서 작동하며, 분리하고자 하는 형광 물질과 같은 수의 이미지만을 필요로 한다. 본 개시에서는 10개 생체 분자의 이미지를 얻는 데에 이미지 정합을 필요로 하지 않기 때문에 다분자 삼차원 이미지를 얻는 것이 가능하다. 따라서, 이미지 정합의 난이도로 인해서 삼차원 이미지를 얻기 어려운 반복 염색 기법에 비해 큰 효과가 있다.

본 개시를 적용할 수 있는 생체 분자의 범위가 다양하고, 배양 세포, 동물 조직 절편, 임상 시료에서 본 기술이 작동함을 알 수 있다. 본 개시는 다종의 항체로 표지 된 단백질 혹은 DNA로 표지 된 mRNA을 동시에 이미징 할 수 있다. 본 개시는 위에 나열된 시료의 종류, 생체 분자의 종류에 국한되지 않고, 형광 물질이 사용될 수 있는 모든 종류의 시료에서 형광 물질로 표지 가능한 모든 생체 분자를 이미징 하는 데에 사용될 수 있다.

형광 현미경으로 조직 내부의 생체 분자를 관찰하기 위해서는 생체 조직 내부의 특정 생체 분자를 형광 물질로 표지하는 것이 필요하다. 일반적으로 단백질을 관찰하기 위해서는 형광 물질이 붙어 있는 항체를 사용하고, mRNA를 관찰하는 경우에는 형광 물질이 붙어 있는 oligonucleotide를 사용할 수 있다. 본 개시에서는 단백질을 관찰하기 위해서는 항체를 사용하였고, mRNA를 관찰하기 위해서는 oligonucleotide를 사용하였으나 본 개시는 형광 물질 구분에 대한 기술로, 형광 물질을 사용하는 모든 표지법 혹은 형광 물질이 붙어 있는 모든 표지 분자에 적용할 수 있다.

본 개시의 장치는 스펙트랄 디텍터를 갖추고 있는 점스캔 공초점 현미경(point-scanning confocal microscopy) 및 필터 방식의 회전 디스크 공초점 현미경(spinning-disk confocal microscopy)으로 구현 가능하다. 본 개시는 필터 방식의 점스캔 공초점 현미경 및 필터 방식의 형광현미경(widefield microscopy), 그리고 특장 파장대의 빛만을 선택적으로 검출할 수 있는 모든 현미경으로 구현할 수 있다.

본 개시에서는 방출 스펙트럼이 서로 겹치는 8개의 형광 물질과 두 개의 large stoke's shift 형광 물질을 사용하여 총 10개의 형광 물질을 동시에 이미징하는 데 성공하였다. 본 개시는 이 10개의 형광 물질에 국한되지 않고, 본 개시의 형광 물질 선정 전략에 부합되는 모든 형광 물질을 사용할 수 있다. 본 개시에서는 YFP 단백질의 신호와 CF488A의 형광 물질 신호 역시 성공적으로 분리하였는데 이와 같이 발광 스펙트럼이 겹치는 여러 형광 단백질들 혹은 형광 단백질과 형광 물질의 신호를 분리할 수 있다. 본 개시에서는 스펙트랄 디텍터를 사용하는 경우 10개의 형광 검출 파장대를 사용하였는데, 이 파장대뿐만 아니라 본 개시의 형광 검출 파장대 선정 전략에 부합하는 모든 파장대를 사용할 수 있다. 본 개시에서는 필터 방식 현미경을 사용하는 경우 8개의 방출 필터를 사용하였는데, 이 필터뿐만 아니라 본 개시의 형광 검출 파장대 선정 전략에 부합하는 모든 방출 필터를 사용할 수 있다. 본 개시는 스펙트랄 디텍터 혹은 방출 필터 이외에도 특정 파장대의 빛을 반사, 투과, 혹은 선택하여 검출할 수 있는 모든 장비를 사용하여 구현 가능하다. 또한, 본 개시는 다양한 광원으로 구현 가능한데, 특정 파장의 빛을 방출하는 레이저 혹은 LED 뿐만 아니라 백색 레이저, 메탈할라이드 램프, 수은 램프와 같이 넓은 파장대의 빛을 방출하고 이 중에서 특정 파장의 빛 만을 선택적으로 골라서 시료에 조사할 수 있는 모든 장치를 사용하여 구현 가능하다.

본 개시와 결합 가능한 기술들은 다양하다. 본 개시에서는 반복 염색 기술 중 하나인 t-CyCIF (Tissue-based cyclic immunofluorescence) 기술에 본 개시를 적용하여 한 염색 및 이미징 라운드에 더 많은 형광 물질을 사용할 수 있음을 보였는데, 본 개시는 형광 물질을 사용하는 모든 염색 기술에 적용할 수 있다. 또한, 본 개시에서는 본 기술에 형광 신호 증폭 기술을 도입하여 특정 형광 물질의 신호를 증폭할 수 있음을 보였는데, 본 개시에는 기존의 모든 형광 증폭 기술이 도입될 수 있다.

본 개시는 상호정보량 최소화를 이용한 방법 이외에, α 값을 유추하기 위한 다양한 방법이 이용 및 결합될 수 있다. 그 예 중 첫번째는 형광 물질 측정을 통한 α 측정법으로, 사용하는 형광 물질을 용액으로 만들고, 실제 시료를 이미징하는 현미경과 동일한 현미경에서 이 형광 물질 용액의 밝기를 측정하고 이 측정값을 바탕으로 α 값을 계산하여 IMG1과 IMG2를 분리한다. 두번째 예로는 Gram-Schmidt Orthogonalization을 통한 분리 방법으로, IMG1과 IMG2를 Gram-Schmidt Orthogonalization 하여 IMG2를 IMG1(=F1)에 수직한 성분과 수평한 성분으로 나눌 수 있다.

다음에서, 본 개시(PICASSO: Process of ultra-multiplexed Imaging of biomoleCules viA the unmixing of the Signals of Spectrally Overlapping fluorophores) 에 대해 설명한다.

다분자 형광 이미징(multiplexed fluorescent imaging)은 다양한 생체 분자들이 세포 혹은 조직 내에서 어떻게 공간적으로 분포되어 있는지 알아내기 위해 필수적인 기술이다. 하지만 형광 물질들의 방출 스펙트럼 겹침으로 인해 한번에 최대 4개의 생체 분자만을 동시 사용할 수 있다. 본 개시에서는 이러한 문제를 해결할 수 있는 기술인 Process of ultra-multiplexed Imaging of biomoleCules viA the unmixing of the Signals of Spectrally Overlapping fluorophores (PICASSO)를 제시한다. 이 기술은 기존의 Spectral unmixing 기술과는 달리 형광 물질의 스펙트럼 정보를 미리 알아야 하거나 미리 측정해야 하는 번거로움 없이 4개 이상의 형광 물질을 동시에 사용할 수 있게 해준다. 본 개시는 한번의 이미징으로 쥐 뇌 속 10종류의 생체 분자들을 동시에 관찰할 수 있다. 또한, 본 개시는 임상 시료(FFPE; formalin-fixed paraffin-embedded)에도 성공적으로 적용 가능하다. 나아가 다른 다분자 이미징 기술(tissue-based cyclic immunofluorescence, t-CyCIF)과도 쉽게 적용이 가능하여 더 높은 다분자 이미징 능력을 갖출 수 있다.

본 개시는 형광 물질의 선정, 검출 파장대, 신호 분리 알고리즘을 새롭게 설계하여 한 번의 표지 및 이미징으로 10개의 형광 이미징을 동시에 사용할 수 있다. 본 개시는 형광 물질의 방출 스펙트럼 없이 이미지를 분리하는 블라인드 분리 기술인데, 이 기술에서는 4쌍의 형광 물질을 사용하는데 각 쌍은 방출 스펙트럼이 겹치는 2개의 형광 물질로 구성된다. 각 쌍의 형광 물질은 하나의 여기 레이저(excitation)에 의해서만 강하게 여기된다. 각 쌍마다 검출 파장대가 다른 2개의 이미지가 얻어지며, 두 이미지는 상호정보량 최소화(mutual information minimization)를 통해 형광 물질 방출 스펙트럼 정보 없이 분리된다. 이 신호 분리를 각 형광 물질 쌍마다 반복한다. 본 개시는 기존 다분자 형광 이미징 기술들에 비해 크게 4가지의 장점이 있다.

첫째로, 본 개시는 형광 물질의 수와 얻어야 하는 이미지의 수가 같아 이미지 획득 속도가 빠르다. 둘째, 본 개시는 스펙트랄 디텍터를 필요로 하지 않는다. 셋째, 본 개시는 신호 분리가 각 형광 물질 쌍에 대해 독립적으로 일어나기 때문에 신호 분리 상 오류가 다른 형광 쌍으로 전파되지 않는다. 마지막으로, 본 개시는 수백만의 픽셀로부터 하나의 원소만을 유추하기 때문에 그 정확도가 기존의 블라인드 분리 기술에 비해서 훨씬 더 높다.

본 개시는 배양 세포, 쥐 조직 절편, 임상 시료 등 다양한 샘플에서 적용 가능하며, 동일 호스트에서 생산된 여러 일차 항체를 사용할 수 있게 해주는 항체 복합체 기술(preformed antibody complexes)을 이용하여 스펙트랄 디텍터 없이 토끼 유래 항체만을 사용하여 10개의 단백질을 관찰하는 것이 가능하다. 또한 반복 표지 다분자 이미징 기법들과 결합을 통해 한 번의 표지 및 이미징에서 사용할 수 있는 형광 물질의 수를 증가시킴으로써 기존의 반복 표지 다분자 이미징 기법을 개량할 수 있다.

도 7은 일 실시예에 따른 여러 레이저별 분자 다중 이미징의 예와 이에 대한 검증, 그리고 신호증폭 기술과 결합한 결과이다.

도 7을 참고하면, (a-d)는 사용되는 각 여기 레이저마다의 형광 물질 방출 스펙트럼(실선) 및 검출 파장대(점선 사각형)이다. (a) CF488A(빨간 실선), ATTO 514(초록 실선) 및 ATTO 490LS(large stoke's shift, 파란 실선)는 488-nm 레이저로 여기 된다. 이미지는 489-505nm(빨간 점선 사각형), 506~530nm(초록 점선 사각형) 및 630~680nm(파란 점선 사각형)의 3개의 검출 파장대에서 연속적으로 얻어낸다. (b) 405-nm 여기 레이저를 사용하여 CF405S(빨간 실선), ATTO 390(초록 실선) 및 CF405L(large stoke's shift, 파란 실선)를 여기 시킨다. 각 검출 파장대는 406~430nm(빨간 점선 사각형), 431~460nm(녹색 점선 사각형), 580~620nm(파란 점선 사각형)이다. (c) 두 형광 물질인 CF568(적색 실선) 및 ATTO Rho101(녹색 실선)는 557-nm 레이저로 여기 시킨다. 검출 파장대는 각각 558~575nm(빨간 점선 사각형) 및 576~620nm(초록 점선 사각형)이다. (d) 두 형광 물질인 CF633(빨간 실선)과 CF660R(초록 실선)는 640-nm 레이저로 여기 된다. 검출 파장대는 641~650nm(빨간 점선 사각형) 및 651~690nm(초록 점선 사각형)이다.

(e-h) a-d에 기재된 형광 물질과 그에 맞는 검출 파장대를 사용하여 HeLa 세포에서 2개 또는 3개의 다분자 면역 형광 이미징을 진행한 후, 상호정보량 최소화를 통하여 신호 분리한 이미지. 표적 단백질은 lamin A/C(빨간색), GM130(초록색) 및 vimentin(파란색)이다. (e) a에 나타낸 형광 물질, 검출 파장대 및 여기 레이저가 사용되었다. (f) b에 나타낸 조건을 사용하였다. (g) c에 나타낸 조건이 사용되었다. (h) d에 나타낸 조건이 사용되었다.

(i-l) e에서 보여준 이미지를 상호정보량 최소화에 의한 신호 분리 전·후에 따른 각 채널 별 이미지이다. (i) a에서 첫 번째 검출 파장대(빨간 점선)에서 얻어낸 이미지. Lamin A/C만이 관찰된다. (j) a에서 두 번째 검출 파장대(초록 점선)에서 얻어낸 이미지. Lamin A/C와 GM130 모두 관찰된다. (k) 신호 분리 후 이미지. i에 표시된 이미지에 상호정보량 최소화 의해 추정한 α 값을 곱한 후, j에 표시된 이미지에서 빼냈다. GM130 만을 나타낸다. (l) 세 번째 검출 파장대에서 얻은 이미지(a 파란 점선)이고, i, k 및 l에 표시된 이미지를 합쳐 e에 표시된 이미지를 생성했다.

(m-p) 상호정보량 최소화 의한 α 추정의 검증 결과이다. (m) PV 단백질에 대한 면역 형광 이미지이고, (n) Calbindin 단백질에 대한 면역 형광 이미지. (o) α 값이 2가 되게 m과 n을 인위적으로 합친 이미지이다. 이 이미지에는 PV와 calbindin이 모두 보인다. (p) 상호정보량 최소화 의한 신호 분리를 m의 이미지와 인위적으로 만들어낸 o의 이미지에 적용하여, o 이미지에서부터 calbindin의 신호만을 분리해낸 결과이다. (q-t) 형광 물질에 대한 항체(anti-fluorophore antibody)를 사용한 선택적 신호 증폭을 설명하는 도면이다. (q) 신호를 선택적으로 증폭시키는 메커니즘을 나타내는 모식도이다. 배양 세포에서 GM130은 Alexa 488, Lamin A/C는 ATTO 514를 사용하여 표지하였다. GM130 신호는 항 Alexa 488에 대한 항체(anti alexa488 antibody)를 사용하여 선택적으로 증폭시켰다.

(r-s) 신호 증폭의 전 (r)과 후 (s)에서의 첫 번째 검출 파장대에서 얻은 형광 이미지이다. r 및 s는 같은 이미징 및 시각화 조건을 사용하였고, s에서의 신호는 신호 밝기의 포화를 방지하기 위해 조정하였다. 초록색: GM130(Alexa 488); 파란색: DAPI 를 나타낸다. Lamin A/C 신호는 시각화 하지 않았다. (t) 신호 증폭 전·후의 GM130(Alexa 488)의 신호 밝기의 변화(n = 10, 오류 바: 표준편차)이다.

먼저 4개의 표준 여기 레이저를 사용하여 상호정보량 최소화를 통한 신호 분리의 타당성을 검증했다. (a-d)에서 볼 수 있는 것과 같이 4개의 여기 레이저(405, 488, 560, 640nm) 별 검출 파장대를 선정하였다. 신호 분리의 검증에는 타겟 단백질로 세포 내부에 공간적으로 분리되어 있다고 알려진 두 단백질인 Lamin A/C와 GM130을 사용하였다. 간접 면역 염색법으로 Lamin A/C와 GM130을 각각 방출 파장대가 겹치는 형광 물질로 표지한 후, (a-d)에 나온 검출 파장대에서 두 이미지를 얻었다. 그 후 상호정보량 최소화를 통해 두 이미지를 Lamin A/C 신호만 포함하고 있는 이미지와 GM130 신호만을 포함하고 있는 이미지로 분리하였다. 405nm와 488nm 레이저에 대해서는 large stoke's shift 형광 물질로 vimentin을 염색하고 이 형광 물질만 선택적으로 검출할 수 있는 검출 파장대를 추가적으로 사용하여 이미지를 얻었다.

(e-h)에서 볼 수 있는 것과 같이 4개의 여기 레이저에서 모두 Lamin A/C와 GM130이 성공적으로 분리되어 이미징 된 것을 알 수 있다.

(i-l)은 이러한 분리 과정을 나타낸 것으로, 분리 전 이미지(j)와 분리 후 이미지(k)를 비교해보면 분리 전 이미지에서 핵막 이미지가 성공적으로 분리되어 제거된 것을 알 수 있다.

(e-h)의 이미지들은 Gram-Schmidt 직교화를 이용한 분리법으로도 성공적으로 분리할 수 있었다(도 20 참조). 또한, 위의 상호정보량 최소화를 이용한 분리법이 직접 면역 염색법(direct staining)으로 표지 한 두 단백질의 분리에서도 작동함을 보였다.

상호정보량 최소화가 α 값을 정확하게 유추하는지 검증하기 위하여 한 곳에서 독립적으로 얻은 두 이미지를 인위적인 α 값을 이용하여 합친 후, 다시 상호정보량 최소화로 분리한 후 원본 이미지와 분리 후 이미지를 비교해보았다(m-p). 원본 이미지(n)와 분리 후 이미지(p)를 비교해보면 두 이미지 사이에 차이가 없을 것을 알 수 있다. 이미지를 합치는 데에 사용한 α값과 상호정보량 최소화를 통해 유추한 α값은 0.5%의 차이만을 보였다. 추가적으로 α 값을 0부터 3까지 0.001씩 증가시키며 합성 이미지를 생성함으로써 α 추정 정확도를 테스트했다. α 추정 평균 오차는 0.81 %였다. 그 다음으로는 첫 번째 검출 파장대에서 두 번째 형광 물질의 신호가 검출되지 않는다는 본 개시의 기본 가정을 검증했다. 먼저 (a-d)의 방출 스펙트럼으로부터 첫번째 검출 파장대에서 두 형광 물질 간의 형광 신호 밝기 비를 계산하였다. 그 비율은 405-nm 레이저에서 178.7, 488-nm 레이저에서 26.4, 557-nm 레이저에서는 8.5, 640-nm 레이저에서는 17.7이었다. 557-nm 레이저에서 형광 물질의 신호 밝기 비가 가장 낮았지만, 실제로 이 두 형광 물질로 면역 염색을 하여 첫번째 검출 파장대에서 이미지를 얻은 경우, 두번째 형광 물질의 신호는 보이지 않았다. 그 이유로는 557nm 레이저에서 사용한 두 형광 물질 CF568과 ATTO Rho101 중, 두번째 형광 물질인 ATTO Rho101의 557nm에서의 흡광 계수(absorption coefficient)가 CF568에 비해서 낮기 때문으로 생각된다. 이 가정이 다른 현미경에서도 유효한지 확인하기 위해, 위 두 형광 물질 용액의 형광 신호 밝기를 다른 현미경 시스템에서 측정하였다. 그 결과 첫번째 검출 파장대에서의 두 형광 물질의 신호 밝기 비는 28.4였다. 이러한 신호 밝기 비율은 신호 증폭을 통하여 더욱 높일 수 있다. 본 연구진은 방출 스펙트럼이 겹치는 두 개의 형광 물질 중 첫 번째 형광 물질의 신호만을 5 배 이상 향상시켜, 첫 번째 검출 파장대에서의 신호 세기 비를 100:1 이상으로 향상시킬 수 있음을 보였다(q-t).

도 8은 일 실시예에 따른 동일 호스트에서 생산된 항체를 이용한 결과이다.

도 8을 참고하면, 동일한 호스트에서 생산된 일차 항체를 사용한 다분자 형광 이미징 및 상호정보량 최소화에 의한 신호 분리 결과이다.

(a-d)는 사전에 형성된 항체 복합체를 이용한 면역 염색에 대한 검증이다. (a) 검증 실험에 대한 모식도. 해마를 포함한 쥐의 뇌 절편을 사전에 형성된 MAP2를 표지하는 토끼 항체 복합체 및 MAP2를 표지하는 닭 항체로 염색되었다.

(b-d) 뇌 절편 샘플의 공초점 현미경 이미지이다. (b) MAP2를 표지하는 사전에 형성된 토끼 항체 복합체의 신호이고, (c) MAP2를 표지하는 닭 항체의 신호이고, (d) b와 c 이미지를 합친 이미지이다.

(e-h) 여러 개의 사전 형성된 항체 복합체를 이용했을 때의 면역 염색에 대한 검증이다. (e) 검증 실험에 대한 모식도. Thy1-YFP 마우스 뇌 절편을 YFP 및 calbindin에 대한 2 개의 사전에 형성된 토끼 항체 복합체로 염색했다. Calbindin을 표지하는 사전에 형성된 항체 복합체만이 형광 물질을 가지고 있다. (f-h) 해당 샘플에 대한 공초점 현미경 이미지이고, (f) 샘플의 YFP 신호, (g) Calbindin를 표지하는 사전에 형성된 항체 복합체의 신호, (h) f 및 g 이미지를 합친 이미지이다.

(i-l) 방출 스펙트럼이 겹치는 형광 물질을 가진 항체 복합체에 의한 다중 면역 염색에 대한 신호 분리 결과이다. BS-C-1 세포를 Lamin B1 및 GM130에 대한 2 개의 사전에 형성된 토끼 항체 복합체로 염색했다. 두 개의 항체 복합체는 CF633 또는 Alexa 680 중 하나의 형광 물질만을 가진다. 640-nm 레이저 하에서 2 개의 검출 파장대에서 2 개의 이미지를 얻어 이를 상호정보량 최소화를 통해 분리했다. (i) 첫 번째 검출 파장대로부터 얻어낸 이미지이고, Lamin B1만이 관찰된다. (j) 두 번째 검출 파장대로부터 얻어낸 Lamin B1과 GM130 모두 관찰되는 이미지이고, (k) 상호정보량 최소화 의한 신호 분리의 결과이고, (l) i와 k 를 합친 이미지이다.

(m-n) 본 개시를 이용하여 1개의 여기 레이저로 mRNA 및 단백질 동시 이미징 결과이다. GAPDH mRNA는 Alexa 488로 표지하고 vimentin 단백질은 ATTO 514으로 표지했다. (m) 이미지 분리 전(빨간색: vimentin; 노란색: GAPDH mRNA)이고, (n) 이미지 분리 후(빨간색: vimentin; 초록색: GAPDH mRNA)이다.

(o-p) 2 개의 여기 레이저로 뇌 투명화 기술인 SHIELD 기법이 적용된 쥐 뇌 절편의 4 색의 다분자 형광 이미징 결과이다. (o) 이미지 분리 전(파란색: NeuN 및 NF-H; 빨간색: GFAP 및 Calretinin)이고, (p) 이미지 분리 후(파란색: NeuN; 초록색: GFAP; 빨간색: calretinin; 자주색: NF-H)이다.

다음으로 본 개시와 항체 복합체 기술을 결합하여 동일 호스트에서 생산된 항체로 여러 단백질을 동시에 관찰하는 것이 가능한지 확인하였다. 기존의 간접 면역 염색법에서는 각 단백질을 서로 다른 호스트에서 생산된 일차 항체로 표지하여야 했다. 하지만 대부분의 항체가 토끼를 포함한 3,4가지 호스트에서 생산되기 때문에 10개 이상의 단백질을 동시에 관찰하기 위해서는 동일 호스트에서 생산된 항체를 사용하는 것이 필요하다. 이에 본 연구진은 기존에 개발된 항체 복합체 기술에 본 개시를 결합하였다. 이 기술은 서로 다른 일차 항체를 각각 다른 형광 물질이 붙어 있는 Fab fragment 이차 항체와 튜브에서 각각 결합시킴으로써, 동일한 호스트에서 생산된 여러 일차 항체를 사용할 수 있게 해준다. (a-d)에서 볼 수 있는 것과 같이, 토끼 항체 복합체는 닭 항체를 사용한 일반적인 직접 면역 염색과 동일한 단백질 발현 패턴을 보였다. 또한, (f-h)에서 보는 것과 같이 항체 복합체 기술로 여러 단백질을 동시 이미징하는 경우에 항체 복합체 간의 상호작용(crosstalk)이 나타나지 않았다. 또한 토끼가 아닌 닭 항체 복합체를 통한 염색에서도 항체 복합체 기술이 잘 작동하는 것을 확인했다. 우리는 토끼 항체 복합체 기술을 46가지 단백질을 염색하여 그 발현 패턴이 알려진 패턴과 다르지 않다는 것을 확인했다. 또한, 항체 복합체의 크기가 1차, 2차 항체보다 큼에도 불구하고 간접 염색법과 비해서 비슷한 두께의 조직을 염색할 수 있을 것을 확인했다.

(i-l)에서 보는 것과 같이, 항체 복합체 기술과 본 개시를 결합하여 세포 내부의 두 단백질을 토끼에서 생산된 두 항체와 방출 스펙트럼이 겹치는 두 형광 물질로 이미징 및 분리하는 것이 가능했다. 그리고 이렇게 얻은 이미지가 간접 면역 염색법으로 얻은 신호가 일치함을 보였다. 본 개시는 형광 물질에 대한 기술로, 형광 물질을 사용하는 모든 기술에 적용 가능하다. 이 기술로 단백질과 mRNA를 방출 스펙트럼이 겹치는 두 형광 물질로 표지한 후, 그 신호를 분리할 수 있음을 보였다(m,n). 또한, 본 개시를 조직 투명화 기술(o,p)과 조직 팽창을 통한 초고해상도 이미징 기술에 적용하여 두 기술의 다분자 이미징 능력을 향상시킬 수 있음을 보였다.

도 9는 일 실시예에 따른 10개 단백질 동시 이미징 결과이다.

도 9를 참고하면, 본 개시를 통한 쥐 뇌의 초-다분자 형광 이미징 결과이다.

(a) 10가지 단백질의 다분자 형광 이미징 실험 과정이고, (b) 쥐 해마의 치상회에서의 8가지 단백질 다분자 이미징이고, (c) b 하단의 점선으로 둘러싸인 영역의 확대도이고, (d) 일반적인 혈액-뇌 관문(blood-brain barrier, BBB)의 구조이다.

(e-h) (b)에서 관찰된 혈액-뇌 관문의 세포 구조를 명확하게 보여주기 위해 b 상단의 점선 박스 영역의 확대도이다.

(i-n) c의 점선으로 둘러싸인 영역의 단백질 별 확대도이다.

(o) 쥐 해마에서의 10 색의 다분자 형광 이미징이다.

(p-t) o의 사각형 점선으로 둘러싸인 영역의 확대도이다. (p) 10 종류의 단백질을 한꺼번에 나타낸 그림이고, (q-t) 단일의 여기 레이저마다 신호 분리를 한 후, 3색 또는 2색의 다분자 형광 이미지이며, (u) 각 여기 레이저에서 얻은 10 종류의 표적 단백질을 서로 다른 색으로 표시한 목록이다.

본 개시를 이용하여 조직 내부의 다수의 단백질을 동시에 이미징 하였다. 먼저 8개 단백질의 이미징을 시도하였는데, 쥐 뇌 절편을 8개의 토끼 항체 복합체로 동시에 염색했다. 염색된 쥐의 뇌 절편을 4개의 여기 레이저로 각각 여기시키면서 8개의 검출 파장대에서 이미징 하였다(a). 표적 단백질은 PV, calbindin, NeuN, GFAP, GluT, ZNF3, laminin 및 calretinin이다(b). 이를 통해서 쥐 뇌 해마에서 기존에 알려져 있던 혈액-뇌 관문(BBB; b의 상단 흰 상자)의 구조를 확인했고, 또한 기존에 알려지지 않았던 세포별 단백질 발현 다양성(b의 하단 흰 상자, 확대는 c)을 확인할 수 있었다. (d)에서 볼 수 있듯이, 일반적으로 BBB는 안쪽에서부터 내피 세포(endothelial cell), 기저막(basal lamina), 성상 세포(astrocyte)의 말단으로 이루어져 있다. (e-h)에서 볼 수 있듯이, 8-color 이미징은 이러한 BBB의 세포 구조를 명확하게 보여주었다. 이에 더해서, (c)에서 볼 수 있듯이 8-color 이미징은 기존에 알려져 있지 않았던 시상(thalamus)에서의 세포간 단백질 발현의 다양성을 보여주었다. 먼저 본 연구진은 8종의 단백질 중, 시상에서 강하게 관찰된 5개 단백질(calbindin, calretinin, ZNF3, NeuN 및 PV)의 발현 패턴을 각 단백질의 발현 패턴에 대한 문헌과 비교하였고, 일치하는 것을 확인했다. 그리고 이 5개 단백질의 발현의 조합이 세포별로 어떻게 다른지 연구하였다. (c)의 흰 상자 안의 두 세포의 단백질 발현을 비교하면, 왼쪽의 세포는 calbindin, calretinin 및 ZNF3의 발현이 높은데 반해 오른쪽의 세포는 NeuN과 laminin의 발현이 높았다(i-n). 이와 같이 본 개시는 기존에는 따로 알려진 여러 단백질의 발현 패턴을 하나의 세포에서 보여줌으로써, 각 세포별 단백질 발현의 다양성을 연구할 수 있게 해준다.

여기서 더 나아가 10개 단백질을 동시에 이미징할 수 있다. 쥐 뇌 절편을 10개의 형광 물질이 각각 붙어 있는 10개의 토끼 항체 복합체로 표지하였다. 그 후 4개의 여기 레이저를 사용해서 10개의 서로 다른 검출 파장대에서 이미지를 얻고, 상호정보량 최소화를 통해 하나의 단백질의 신호만 들어있는 10 개의 이미지로 분리하였다. 이 실험에서는 위의 8-단백질 동시 이미징에서 관찰한 단백질에 신경 세포의 구조 및 기능에 중요한 역할을 하는 단백질을 추가하여 NeuN, CNP1, calbindin, calretinin, GFAP, MAP2, NF-H, GluT, NF-L, PV를 관찰하였다. 그 결과 수 밀리미터에 걸쳐 10개 세포 타입 마커 및 다양한 생체 분자들을 한번에 관찰할 수 있었다(o-p). 10개의 단백질 모두 기존에 알려진 각 단백질의 발현 패턴과 동일한 패턴을 보였는데, 특히 calbindin과 calretinin의 발현량이 시상(thalamus)과 중뇌(midbrain)의 경계에서 크게 변화하였다(o 점선 동그라미). 이러한 변화는 다양한 데이터베이스 및 문헌에서 보고된 것과 일치하였다. Calbindin은 칼슘 결합 단백질이며 인간의 뇌에서 많이 발현된다. 관찰된 Calbindin의 발현 패턴은 치아이랑(dentate gyrus, DG)에서 mossy fiber projection이 시각화되며 발현량이 높고 시상(thalamus, TH)에서는 낮았으며 이는 알려진 문헌과 일치했다.

Calretinin은 칼슘 결합 단백질이며 인간의 뇌에서 많이 발현된다. 관찰된 Calretinin의 발현은 문헌과 잘 일치했고 DG의 the molecular layer(DG-mo)와 granule cell layer(DG-sg) 및 시상(TH)에서 고도로 발현된다. ZNF3는 전사 인자이며, 인간의 뇌에서 고도로 발현된다. b의 ZNF3도 DG의 DG-sg, polymorph layer(DG-po)와 TH 고도로 발현되었다. NeuN은 뉴런 마커이며 뇌에서만 고도로 발현된다. (b)에서 볼 수 있듯이 NeuN은 DG-sg, DG-po, TH에서 발현되지만 TH보다 DG에서 발현이 높았으며, 이는 알려진 문헌과 일치하였다. Parvalbumin(PV)는 칼슘 결합 알부민 단백질이며, 인간의 뇌에서 많이 발현된다. 관찰된 PV는 DG의 DG-po, DG-sg, DG-mo와 TH에서 널리 발현되었으며 이는 알려진 문헌과 일치한다.

이에 더해 삼차원 다분자 이미징을 시도하였다. Thy1-YFP 쥐 뇌 절편을 DAPI 및 5개의 토끼 항체 복합체로 염색한 후, 7개의 검출 파장대에서 z-stack 이미지를 얻고, 상호정보량 최소화를 통해 분리하였다. 이를 통해 7가지 생체 분자(DAPI로 염색된 핵, 뇌 절편이 자체적으로 가지고 있는 YFP, 항체로 염색된 5개의 단백질)의 분포를 삼차원으로 이미징 하는 데에 성공하였다. 이 실험에서는 488-nm 여기 레이저로 YFP 단백질과 CF488A 형광 물질을 동시에 여기시키고, 그 신호를 분리하였다. 이 실험에서는 방출 스펙트럼이 겹치는 형광 단백질과 형광 물질의 신호도 분리하는 것이 가능함을 보였다.

도 10은 일 실시예에 따른 병리학 시료의 다분자 이미징 결과이다.

도 10을 참고하면, 본 개시를 통한 FFPE 임상 샘플에서의 다분자 형광 이미징이다.

(a-l) 하나의 여기 레이저를 사용한 12 종류 인체 조직의 2 색의 다분자 형광 이미징이다(빨간색: KRT 19(CF488A); 초록색: histone H3(ATTO 514)). (a) 유방, (b) 침샘, (c) 위; 몸통, (d) 소장; 공장, (e) 대장, (f) 신장; 피질, (g) 신장; 수질, (h) 방광, (i) 전립선, (j) 자궁 내막; 증식기, (k) 자궁 내막; 분비기, (l) 흉선이다.

(m-p) 같은 인체 조직 타입에 2 개의 여기 레이저를 사용한 4 색의 다분자 형광 이미징(파란색: KRT 19(CF488A); 초록색: histone H3(ATTO 514), 빨간색: COX IV(CF568); 노란색: vimentin(ATTO Rho101))이다. (m) 침샘, (n) 위; 몸통, (o) 소장; 공장, (p) 신장; 수질이다.

본 개시는 병리 시료에도 적용할 수 있음을 보였다. 12가지 장기의 Formalin-fixed paraffin-embedded(FFPE) 시료가 포함되어 있는 조직 마이크로 어레이(tissue microarray; TMA)에 본 개시를 사용하여 임상 시료에서 작동하는지 테스트했다. 먼저 keratin 19와 histone H3를 표적 단백질로 사용하였다. 이 두 단백질 모두 거의 모든 인간의 장기에서 높게 발현되고, 이들의 발현량 변화 또는 변형은 암 마커로 사용된다. Keratin 19와 histone H3는 세포 내의 다른 위치(세포질과 핵원형질)에서 발현되므로 두 단백질의 신호가 성공적으로 분리되었다면 두 발현 패턴은 공간적으로 분리되어야 한다. (a-l)에서 볼 수 있듯이, 12가지 장기에서 모두 keratin 19와 histone H3가 명확하게 공간적으로 분리되어 있는 것을 알 수 있다. 이 결과는 본 개시를 이용하여 임상 시료에서 1개의 여기 레이저로 두 단백질을 동시에 이미징 할 수 있다는 것을 보여준다. 일부 핵은 노란색으로 보이는데(i, j, l), 이는 현미경의 수직 분해능(axial resolution)의 한계 때문에 histone H3와 histone H3 아래에 있는 keratin 19이 동시 검출된 것으로 보인다.

더 나아가 4가지 장기의 FFPE 시료에서 4개 단백질(keratin 19, histone H3, vimentin, cytochrome c oxidase subunit 4;COX IV)의 발현을 이미징하였다. Keratin 19, histone H3와 마찬가지로, vimentin과 COX IV 역시 암과 밀접한 관련이 있으며, 암 마커로 사용된다. 또한 Vimentin과 keratin 비율은 epithelial-mesenchymal transition(EMT) 상태와 관련 있기 때문에 단일 시료에서의 vimentin과 keratin을 동시에 이미징 하는 것은 임상적으로 중요하다. (m-p)에서 보는 것과 같이, 병리 시료에서 방출 스펙트럼이 겹치는 형광 물질 2쌍과 2개의 여기 레이저를 사용하여, 4개의 단백질을 동시에 관찰할 수 있었다. 위 실험 결과는 병리 시료에서도 본 개시가 성공적으로 작동함을 보여준다.

도 11은 일 실시예에 따른 스펙트랄 디텍터 없이 대역 필터를 이용한 다분자 이미징 결과이다.

도 11을 참고하면, 스펙트랄 디텍터가 없는 대역 필터 기반의 현미경을 사용하여 쥐 뇌에서의 10 색의 다분자 형광 이미징 결과이다.

(a) 본 개시를 이용한 쥐 해마의 CA1 영역에서의 10 색의 다분자 형광 이미징이다. 위 이미지는 8 개의 대역 필터와 4 개의 여기 레이저를 갖춘 회전 디스크 공초점 현미경(spinning-disk confocal microscopy)을 사용하여 얻었다.

(b-e) a에서 보여준 이미지를 4개의 여기 레이저 중 각 단일 레이저를 이용하여 얻어낸 세 개의 채널 (b-c) 또는 두 개의 채널 (d-e)의 이미지이고, 여기 레이저의 파장은 405nm(b), 488nm(c), 561nm(d) 및 637nm(e)이다.

(f-h) a에 나타난 이미지에서 선택된 6개의 채널 (f) 또는 5 개의 채널 (g-h) 오버레이 이미지로 생물학적으로 관련 채널들을 명확하게 관찰하기 위함이다. 가시성을 극대화하기 위해 각 이미지의 단백질에 다른 색을 사용하였다. 모든 스케일 바는 50μm이다.

스펙트랄 디텍터 없이 대역 필터(band-pass filter)만으로 10개의 단백질을 동시에 관찰할 수 있음을 보였다. 시판되고 있는 다종의 대역 필터 중, 사용한 검출 파장대와 잘 매치되는 최적의 대역 필터를 선정하였다. 스펙트럼 상으로는 561nm 및 637nm 여기 레이저에서 첫번째 대역 필터에서의 두 형광 물질 간의 밝기 비율이 충분히 높지 않은 것으로 보였다. 하지만 형광 물질 용액을 이용하여 실제로 이 비율을 측정했을 때 두 형광 물질의 밝기 비율은 561-nm 레이저는 32.8, 640-nm 레이저에서는 20.3이었다. 이 비율은 커스텀 필터(custom band-pass filter)를 사용함으로써 개선할 수 있을 것으로 보인다. 또한, 도 7(q-t)에서 보인 신호 증폭 프로세스를 사용하여 더욱 개선 될 수 있다. 10개의 형광 물질을 동시에 사용하기 위해서 10개의 검출 파장대에서 이미지를 얻었지만 일반적인 현미경에는 최대 8개의 대역 필터를 설치할 수 있다. 따라서 하나의 필터를 두 개의 여기 레이저에서 반복해서 사용하는 방법으로 8개의 대역 필터로 10개의 단백질을 이미징할 수 있었다.

(a-e)에 볼 수 있는 것과 같이 이 방법을 이용하여 쥐 뇌 절편에서 토끼 항체만을 이용하여 10개 단백질을 동시에 이미징 하는 데에 성공하였다. 위 결과에서 볼 수 있는 생물학적 의미를 좀 더 명확히 표시하기 위하여 10개의 단백질 중 5-6개의 단백질을 선택하여 표시하였다(f-h). (f)의 흰색 상자 (i)에서는 BBB에서의 성상 세포(GFAP)와 상피 세포(GluT)의 배치를 볼 수 있다. (f,g)의 상자 (ii)와 (iii)에 있는 2개의 PV-양성 신경 세포의 단백질 발현을 비교하면, (ii)의 뉴런은 ZNF3를 높은 수준으로 발현하지만, MAP2는 낮은 수준으로 발현된다. 이와 반대로, (iii)의 뉴런은 ZNF3를 낮게 발현하지만 MAP2을 높게 발현한다. (h) 흰색 상자 (iv)은 SV2A 발현을 통해 시냅스의 위치를 관찰할 수 있다.

이와 같이, 본 개시는 8개의 대역 필터를 이용해서 스펙트랄 디텍터 없이 10개 단백질의 발현 분포를 동시에 관찰하는 것이 가능하다. 이에 더해서 이 이미지들이 형광 측정 기반 분리법으로도 잘 분리가 되는 것을 확인했다(도　18 참조).

본 개시는 반복 염색 다분자 이미징 기술과 결합할 수 있다(도 19 참조). 반복 염색 다분자 이미징 기법 중 하나인 t-CyCIF과 본 개시를 결합하여 t-CyCIF의 다분자 이미징 능력을 향상시킬 수 있는지 테스트하였다. 쥐의 뇌 절편의 두 단백질을 방출 스펙트럼이 겹치는 두 형광 물질로 표지하여 이미징 및 이미지 분리 한 후, 형광 물질을 화학적으로 비활성화하고, 다른 두 단백질을 같은 두 형광 물질로 표지하여 이미징 및 이미지 분리하였다. 위 과정으로 얻은 4개의 단백질의 패턴은 모두 예상되는 염색 패턴과 일치했다. 이 결과는 본 개시를 반복 염색 다분자 이미징 기법과 결합하여 한 번의 염색 및 표지 라운드에 4개 이상, 최대 10개의 단백질을 동시에 관찰할 수 있음을 보여준다.

이와 같이, 10종류의 형광 물질을 한 번에 시료에 적용하기 때문에 다른 다분자 이미징 기술과 비교하여 실험 절차의 복잡성 및 소요 시간이 크게 줄어든다. 또한 용액 교환이나 화학 처리를 하지 않고 한 번의 이미징으로 10가지의 생체 분자의 이미지를 얻을 수 있기 때문에 이미지 정합 과정이 필요하지 않으며, 삼차원 이미지를 얻는 것이 가능하다. 그리고 스펙트랄 디텍터를 사용하지 않고 대역 필터만으로 구현할 수 있기 때문에 장비의 요구 사항이 크게 줄어든다. 따라서, 본 개시는 생물학적 연구 및 진단에서 아주 유용하게 사용될 수 있을 것으로 보인다.

본 개시는 앞에서 사용한 4개의 가시광선 대역의 레이저(400 - 650nm)에 더하여 근적외선(near-infrared, NIR) 레이저와 방출 스펙트럼이 겹치는 2 종의 NIR 형광 분자(예: ATTO740 및 Cy7.5)를 사용하여 한 라운드 이미징만으로 12 가지 생체 분자를 이미징 할 수 있다. 또한, 560 nm, 640 nm, 근적외선에서 여기되는 large stoke's shift 형광 물질을 추가로 사용하는 경우, 15가지 생체 분자를 동시에 이미징 할 수 있다. 커스텀 다중 대역 필터(custom multi-band pass filter)를 사용하는 경우 8개의 대역 필터만으로 15가지 생체 분자를 동시에 이미징 할 수 있다. 신호 밝기와 신호 대비 잡음비(signal to noise ratio, SNR)를 개선 할 수 있다. 또한, 본 개시는 저가형 광원(LED 혹은 램프)과 대역 필터를 갖춘 단순 광학 현미경을 사용하여도 구현이 가능하다. 커스텀 대역 필터를 사용하여 간단한 장비로도 높은 신호 밝기와 분리 정도를 얻을 수 있을 것이다. 조직 투명화, 팽창 현미경, mRNA 또는 단백질 다분자 형광 이미징, 생체분석, 세포 추적 등의 다양한 이미징 기술과 결합하여 해당 기술의 이미징 능력을 개선시킬 수 있다. 또한 형광 바코드 기술과 결합하여 하나의 바코드가 인코딩 할 수 있는 정보량을 늘릴 수 있다. 본 개시는 생체 분자 공간 정보를 필요로 하는 다양한 분야에 유용하게 사용될 것으로 기대된다. 최근 생체 분자의 멀티 스케일 3차원 아틀라스가 구축됨에 따라서 생물학을 이해하는 방법이 변화되고 있다. 이러한 아틀라스 구축에서 형광 이미징은 생체 분자를 매핑하는 주요 도구 중 하나로 쓰이고 있다. 본 개시는 더 많은 생체 분자를 동시에 시각화 해주고, 단백질 혹은 mRNA 분자 사이의 동일위치 정보 또는 그 발현의 상관 관계에 대한 정보를 제공할 수 있다. 또한 병리학적 시료의 분자 구조를 시각화 함으로써 암의 진단과 예후 진단에 도움이 될 것이다.

세포 배양 및 고정은 다음과 같다.

BS-C-1, HeLa, NIH-3T3 세포는 한국 세포주 은행에서 구입했다. 세포는 Nunc Lab-Tek II chamber # 1.5 커버글라스에서 배양되었다. BS-C-1 세포는 10 % fetal bovine serum(FBS), 1 % penicillin-streptomycin, 1 % sodium pyruvate을 첨가한 Minimum Essential Medium(MEM)에서 배양되었다. HeLa 세포는 10 % FBS와 1 % penicillin-streptomycin 첨가한 Dulbecco's modified Eagles'medium(DMEM)에서 배양되었다. NIH-3T3 세포는 10 % bovine calf serum(BCS)와 1 % penicillin-streptomycin을 첨가한 DMEM에서 배양되었다. 모든 세포는 37 °C, 5 % CO2 조건 하에서 배양되었다. 고정을 위해 세포를 1x PBS로 3회 세척하고 4 % paraformaldehyde(PFA)가 첨가된 1x PBS 에서 10분간 고정한 후, 1x PBS로 3회 세척하였다. 이어서 세포를 0.1M glycine이 첨가된 1Х PBS에 10분 담가 놓은 뒤 1ХPBS로 3회 세척하였다.

쥐 관류 및 슬라이싱은 다음과 같다.

동물을 포함한 다음의 모든 절차는 한국과학기술원-동물실험윤리위원회(KAIST-IACUC)에 의해 승인되었다. 8-14 주령의 C57BL/6J 쥐를 사용했다. 쥐를 isoflurane으로 마취하고, 심장으로 4% PFA가 첨가된 1x PBS를 관류하여 고정시킨다. 관류를 통해 고정시킨 쥐로부터 뇌를 채취하여, 4

가 유지되는 환경에서 4% PFA가 첨가된 1x PBS에 2시간동안 보관한다. 그런 뇌를 절편기(vibratome, Leica VT1000S)를 사용하여 150μm 두께로 잘랐다. 잘려진 뇌 절편은 사용하기전까지 4

에서 0.1M 글리신이 첨가된 1x PBS에 보관하였다.

형광 물질과 항체의 결합은 다음과 같다.

Alexa와 CF 형광 물질 결합을 위해 1 M sodium bicarbonate(pH 8.3) 10 μL와 DMSO에 녹아 있는 succinimidyl ester-fluorophore stock을 항체 용액 몰수에 9배만큼 항체 용액에 넣어준다. 이 용액을 상온, 어두운 조건에서 1시간 반응시킨다. For ATTO 형광 물질 결합을 위해 항체 용액의 버퍼를 Zeba spin desalting columns을 이용하여 결합 버퍼(0.01 M sodium bicarbonate in 1x PBS, pH 8.3) 교환해주었다. 그 후 버퍼가 교환된 항체 용액에 DMSO에 녹아 있는 succinimidyl ester-fluorophore stock(10mg/ml)을 항체 몰수에 3배만큼 항체 용액에 넣어준다. 이 용액을 상온, 어두운 조건에서 1시간 반응시킨다. 결합된 항체의 정제를 위해 NAP-5 gel filtration 칼럼이 사용되었다. 칼럼은 1x PBS 10 mL로 equilibration 되었다. 반응된 용액 100 μL를 columns에 넣어 준다. 1x PBS 400 μL를 칼럼에 넣어 주면 결합되지 않은 형광 물질과 결합된 항체의 분리층이 관찰된다. 칼럼 밑에 수집 튜브를 위치시키고 500 μL 1x PBS를 넣어주면, 용출액이 모이고 이를 Vivaspin 칼럼(MWCO: 5,000)을 사용하여 농축시킨다.

항체 복합체의 형성은 다음과 같다.

1x PBS, 형광 물질이 결합된 Fab fragment를 포함하는 용액, 그리고 일차 항체를 포함하는 용액을 10:2:1의 부피비로 혼합하여 어두운 조건하에 10분 동안 상온에서 반응시켰다. 그 후, 해당 용액에 5 배 과량의 블로킹 버퍼(10 % normal rabbit serum, 0.2 % Triton X-100, 1x PBS 으로 이루어짐)를 첨가하여 어두운 조건하에 부드럽게 섞으며 상온에서 10 분 동안 반응시킨다. 26 종류의 형광 물질을 사전에 형성된 항체 복합체에 테스트하였다.

사전에 형성된 항체 복합체를 이용한 세포 및 마우스 뇌 절편 염색은 다음과 같다.

다음으로 진행되는 모든 단계들은 상온에서 실행되었다. 투과화 및 블로킹을 위해, 세포를 블로킹 버퍼(10 % normal rabbit serum, 0.2 % Triton X 100,1x PBS)에서 30 분 동안 담가 놓는다. 이어서 세포를 사전에 형성된 항체 복합체 혼합물에서 30 분간 염색하고, 블로킹 버퍼로 3 회 세척한다. 쥐의 뇌 절편을 염색하기 위해서는 배양 시간(블로킹: 3 시간, 세척: 30 분 염색: 하룻밤 동안)을 제외하고, 블로킹, 염색 및 세척 단계는 배양 세포 프로토콜과 같다.

시료 준비 및 병리학 시료 염색은 다음과 같다.

인간 시료를 사용한 모든 실험들은 한국과학기술원 생명윤리 심의위원회(KAIST IRB)의 승인을 받았다. 도 9에서 사용한 Human normal multi-organ tissue microarray(TMA)는 Novus Biologicals(NBP2-30189)에서 구입했다. 포르말린 고정된 파라핀-포매 병리학 시료의 경우, 시료 슬라이드를 60

오븐에서 1시간 건조시켰다. 슬라이드를 xylene에 2회 각 5분간 탈파라핀했다. 수화를 위해 슬라이드를 실온에서 각 3분씩 100 % 에탄올 2회, 95 % 에탄올, 80 % 에탄올, 탈이온수에 순서대로 넣었다. 이 연구에 사용된 슬라이드는 염색 전에 heat induced epitope retrieval(HIER) 처리되었다. 슬라이드를 10 mM sodium citrate solution(10 mM Sodium Citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0)에 95 ~ 100

에서 30 분간 두고 1x PBS에서 20 분간 냉각했다. 슬라이드를 블로킹 버퍼(10 % normal rabbit serum, 0.2 % Triton X-100,1x PBS)로 RT에서 3시간 블로킹하고, 상온에서 밤새 항체 복합체와 반응시킨 후, 상온에서 블로킹 버퍼로 3회 각 30분씩 세척하였다.

RNA-FISH는 다음과 같다.

제조업체의 사용설명서의 지침에 따라 NIH-3T3 세포로 RNAscope(Advanced Cell Diagnostics)를 실시했다. 간략하게, 고정된 세포를 에탄올로 탈수(dehydration)하고, 에탈올 및 1x PBS를 통해 재수화(rehydration)했다. 재수화된 세포는 프로테아제 III(RNAscope)를 1x PBS를 사용하여 1:15의 비율로 희석시켜 digestion되고, 그 이후에 1x PBS로 헹군다. RNAscope 증폭기를 처리하기 전에, 세포를 RNAscope 프로브와 반응시키고, 1x RNAscope 세척 버퍼로 헹군다. 증폭 후, 세포를 DAPI로 표지하고 1x PBS에서 헹군다. 그런 다음, 세포를 사전에 형성된 항체 복합체로 염색했다.

형광 물질의 불활성화(t-CyCIF)는 다음과 같다.

첫 번째 염색 라운드에서는 PV를 표지하는 항체 복합체(CF488A으로 표시)와 NeuN를 표지하는 항체 복합체(ATTO514으로 표시)를 사용하여 쥐의 뇌 절편을 염색했다. DAPI는 해당 시료에 기준 마커로 사용되었다. 첫 번째 이미징 라운드 후, 형광 물질로 염색된 시료를 백색광 하에 2 시간동안 상온에서 불활성화 버퍼(1x PBS에 4.5% H2O2 및 24 mM NaOH)에 담가 형광 물질을 불황성화 시킨다. 그 다음 시료를 1x PBS으로 각 1 시간마다 4 회 세척하고, 두 번째 염색 라운드를 실시하였다. 두 번째 염색에서는 동일 시료에 calretinin을 표지하는 항체 복합체(CF488A으로 표시)와 GluT를 표지하는 항체 복합체 2 종류를 사용하였다. DAPI도 다시 사용하였다.

항 형광 물질 항체(anti-fluorophore)를 이용한 신호 증폭은 다음과 같다.

이 부분에서 사용되는 모든 항체는 블로킹 버퍼(5 % normal donkey serum, 0.2 % Triton X-100,1x PBS)로 1:500으로 희석되었다. BS-C-1 세포를 투과화 처리 및 블로킹을 위해 블로킹 버퍼에서 1.5 시간동안 담가 놓는다. 뒤 이어서, GM130를 표지하는 토끼 일차 항체(rabbit anti-GM130)가 있는 용액을 넣어 섞어주고, 각각 5 분 마다 블로킹 버퍼로 3 회 세척하였다. 이어서 세포를 형광 물질인 alexa488와 결합한 당나귀 항 토끼 이차 항체(donkey anti-rabbit conjugated with alexa488)가 있는 용액에서 섞어주고, 블로킹 버퍼로 각각 5 분 마다 3 회 세척하였다. 세포를 토끼 항 alexa488 항체(rabbit anti-alexa488)가 있는 용액에 담근 후, 각각 5 분간 블로킹 버퍼로 3 회 세척하였다. 마지막으로, 세포를 위와 같은 이차 항체(donkey anti-rabbit conjugated with alexa488)가 있는 용액에 담근 후, 블로킹 버퍼로 각각 5 분간 3 회 세척하였다. 토끼 일차 항체에 대한 신호 증폭 후, 세포를 lamin A/C를 표지하는 쥐 일차 항체(mouse anti-laminA/C)가 있는 용액에서 섞어주고 블로킹 버퍼로 3 회 각각 5 분간 세척하였다. 마지막으로 세포를 ATTO514가 결합된 당나귀 항 쥐 이차 항체(donkey anti-mouse conjugated with ATTO514)가 있는 용액에 담근 후, 블로킹 버퍼로 3 회 각각 5 분간 세척하였다.

형광 물질 밝기 측정은 다음과 같다.

형광 물질 밝기 측정은 Andor 회전 디스크 공초점 현미경에서 실시했다. CF405S, ATTO390, CF405L은 100 μM 형광 물질 용액을 사용했다. CF488A, ATTO514, ATTO490LS, CF568, ATTO Rho101, CF633, CF660R는 10 μM 형광 물질 용액을 사용했다. 형광 물질 용액은 10 x 대물 렌즈에서 4 개의 여기 레이저(405-nm, 488-nm, 561-nm, 637-nm) 중 하나를 사용하여 이미징 했다.

Protein-retention expansion microscopy는 다음과 같다.

염색된 시료를 1x PBS에 희석된 acryloyl-X, SE(AcX)에 밤새 상온에서 반응시킨 후, 1x PBS로 3번 각 30분씩 세척하였다. 그 다음 시료를 monomer solution(7.5%(w/w) sodium acrylate, 2.5%(w/w) acrylamide, 0.15%(w/w) bis-acrylamide, 1x PBS, 2 M NaCl)에 2번 각 30분씩 4

에서 반응시킨다. 시료를 젤 버퍼(monomer solution, 0.2%(w/w) APS, 0.2%(w/w) TEMED, 0.01%(w/w) H-TEMPO)가 채워진 2개의 커버 글라스 사이에 놓고, 37

에서 1.5시간 반응시킨다. 만들어진 젤을 digestion buffer(25 mM EDTA, 50 mM Tris, 0.5% Triton X-100, 1M NaCl)에 1:100으로 희석한 proteinase K를 처리해주고 밤새 37

에서 부드럽게 섞어준다. Digestion 후 젤을 탈이온수에 넣고 부드럽게 섞어준다.

SHIELD는 다음과 같다.

500μm의 두께의 쥐 뇌 절편을 SHIELD-OFF 용액(DI 워터, SHIELD 완충액, SHIELD-Epoxy 용액의 1 : 1 : 2의 비율)에 담가 4

에서 하루 동안 부드럽게 섞어준다. 시료을 SHIELD-ON Buffer와 SHIELD-Epoxy Solution 7 : 1 비율의 혼합액에 옮기고 37

에서 6 시간 동안 부드럽게 섞어준다. 시료는 SHIELD-ON 버퍼에 담가 37 °C에서 하룻밤동안 부드럽게 섞어준다. 조직 투명화를 위해, 시료를 투명화 용액(300 mM sodium dodecyl sulfate, 10 mM boric acid, 100 mM sodium sulfite, pH 9.0)에 담가 37

에서 1 일간 부드럽게 섞어준다. 이미징은 Nikon C2 plus 공초점 현미경 with DUVB 디텍터, Leica TCS SP8, Andor Dragonly회전 디스크 공초점 현미경에서 40x 1.15 NA water immersion를 사용하여 얻었다.

이미지 프로세싱은 다음과 같다.

스펙트럼 디텍터로부터 얻은 이미지들은 spectral separation algorithm을 바로 적용하였고, 대역 필터를 갖춘 공초점 현미경으로 얻은 이미지들은 신호 분리 전에 사전 프로세싱을 했다. 사전 프로세싱을 위해 먼저, 이미지의 비네팅(vignetting)을 형광 슬라이드의 이미지를 사용하여 보정했다. 둘째로 여기 레이저의 간섭으로 인한 이미지 상의 링 모양 아티팩트를 어떠한 물체를 놓지 않고 찍은 이미지를 빼주어 제거하였다. 셋째로 색수차(chromatic aberration)에 의한 픽셀 이동은 이미지 정합을 통해 해결하였다. 상호정보량 최소화를 통한 신호 분리를 위해서, 우리는 α 초기 추정으로 시작하고 IMG1, (IMG2-αxIMG1) 사이의 상호 정보량을 측정하였다. 여기서 IMG1과 IMG2는 각각 첫 번째 그리고 두 번째 이미지이다. 상호 정보량을 측정할 때는 joint histogram 계산 속도를 향상시키기 위해 두 이미지 모두 3비트로 양자화 하였다. 하나의 매개 변수 추정을 위해 수백만의 픽셀들을 사용하므로, 양자화는 α 추정 정확도에 영향을 미치지 않는다. 경사하강법(gradient descent)을 사용하여 우리는 상호 정보량이 최소화된 최적의 α 값을 찾았다. 최적의 α_opt을 찾게 되면, 그 후 두 번째 형광 물질의 이미지를 얻기 위해 (IMG2-αopt x IMG1)를 계산해준다. 그람-슈미트 직교화를 통한 색분리를 위해 α_GS를 하기 [수학식 12]와 같이 추정한다.

여기서 <,>은 벡터 내적,

와

는 IMG1과 IMG2를 각각 벡터로 재정리한 것이다. 그리고 위와 동일하게 두 번째 형광 물질의 이미지를 얻기 위해 (IMG2-α_GSxIMG1)를 계산해준다. 위의 모든 이미지 프로세싱은 자체 제작한 MATLAB 코드를 사용하여 실행했다.

도 12는 항체 복합체 염색의 유효성 검증 결과이다.

도 12를 참고하면, 항체 복합체의 친화도와 특이성을 검증하기 위해, 하나의 타겟 단백질에 대해 기존의 항체와 항체 복합체 염색을 동시에 진행하고 형광 신호를 관찰한다. 왼쪽에서 오른쪽으로 차례로 기존의 항체 염색, 항체 복합체 염색, 두 이미지를 합친 이미지들을 나타낸다.

(a) GFP 항체로 표지 된 Thy1-YFP 쥐 뇌 절편의 공초점 현미경 이미지, (b) 쥐 뇌 절편 내 GFAP의 공초점 현미경 이미지, (c) 쥐 뇌 절편의 해마 부위 내 MBP의 공초점 현미경 이미지, (d) Confocal images of vimentin in BS-C-1 세포 내 vimentin의 공초점 현미경 이미지이다. 스케일 바: (a-c) 50 μm, (d) 20 μm.

도 13은 항체 복합체 간의 혼선 유무 검증 결과이다.

도 13을 참고하면, 도 8 (e-h)에서 보여준 혼선 검증 이미지의 추가 실험 결과 이미지이다. Thy1-YFP 쥐 뇌 절편에 YFP 항체 복합체, neurofilament heavy chain(NF-H) 항체 복합체를 염색한다.

(a) YFP의 형광 신호, (b) 항체 복합체로 염색한 NF-H(CF568, red), (c) a와 b를 합친 이미지이다. a와 b 사이에 혼선이 없음을 보았을 때, 일반 토끼 혈청(normal rabbit serum, NRS)이 결합하지 않은 Fab fragments 항체를 효과적으로 차단해주고 있음을 알 수 있다. 스케일 바: 50 μm.

도 14는 항체 복합체를 사용하여 염색한 시료에서 상호정보량 최소화를 통한 신호 분리의 유효성 검증 결과이다.

도 14를 참고하면, 쥐 뇌 절편을 calretinin(rabbit, CF568 conjugated) 항체 복합체와 GFAP(rabbit, ATTO Rho101 conjugated) 항체 복합체로 염색하고, GFAP(chicken, visualized by CF633) 항체로 간접 염색한 결과이다.

(a) 신호 분리 유효성 실험의 도식이고, (b) 첫번째 검출 파장대에서 557-nm로 여기 했을 때, calretinin 신호만 보인다. (c) 두번째 검출 파장대에서 557-nm로 여기 했을 때, calretinin 신호와 GFAP(rabbit) 신호 모두 보인다. (d) 신호 분리된 GFAP(rabbit) 이미지, (e) 일반 간접 면역 염색법으로 얻은 GFAP(chicken) 이미지, (f) b, d, e를 합친 이미지이다.

도 15는 본 개시와 팽창 현미경(expansion microscopy, ExM)의 호환성 검증 결과이다.

도 15를 참고하면, 팽창 현미경이 적용된 쥐 뇌 절편의 신호 분리이미지이다. (a) 신호 분리 전(빨강: NeuN과 GFAP), (b) 신호 분리 후(빨강: NeuN, 초록: GFAP), (c) 신호 분리 전(빨강: Neurofilament heavy chain(NF-H)과 GluT), (d) 신호 분리 후(빨강: NF-H, 초록: GluT)이다. 스케일 바: 50 μm.

도 16은 레이저 노출 시간(exposure time)에 따른 신호 밝기의 선형성 그래프이고, 도 17은 레이저 세기(laser intensity)에 따른 신호 밝기의 선형성 그래프이다.

도 16을 참고하면, 최적화된 광학 필터를 사용하여 Andor 회전 디스크 공초점 현미경에서 10가지 형광 물질들의 레이저 노출 시간에 따른 밝기를 측정한다.

(a-c) CF405S(빨강), ATTO390(초록), CF405L(파랑) 측정 결과이다.

(d-f) CF488A(빨강), ATTO514(초록), ATTO490LS(파랑) 측정 결과이다.

(g-h) CF568(빨강), ATTO Rho101(초록) 측정 결과이다.

(i-k) CF633(빨강), CF660R(초록) 측정 결과이다.

도 17을 참고하면, 최적화된 광학 필터를 사용하여 Andor 회전 디스크 공초점 현미경에서 본 개시에 사용된 10가지 형광 물질들의 레이저 세기에 따른 밝기를 측정한다.

(a-c) CF405S(빨강), ATTO390(초록), CF405L(파랑) 측정 결과이다.

(d-f) CF488A(빨강), ATTO514(초록), ATTO490LS(파랑) 측정 결과이다.

(g-h) CF568(빨강), ATTO Rho101(초록) 측정 결과이다.

(i-k) CF633(빨강), CF660R(초록) 측정 결과이다.

도 18은 형광 물질 측정 기반 신호 분리를 설명하는 도면이다.

도 18을 참고하면, (a-d) 형광 물질 측정 기반 신호 분리에서, CF488A의 측정 α 값(도 16 및 도 17)을 이미징 시 설정했던 레이저 세기와 노출 시간을 기반으로 보정하여 신호 분리한다. (a) SV2A, (b) 신호 분리 전(SV2A와 GluT), (c) 신호 분리 후(GluT), (d) a와 c를 합친 이미지이다. 스케일 바: 50 μm.

도 19는 본 개시의 다른 다분자 이미징 기술(t-CyCIF)로의 적용을 설명하는 도면이다.

도 19를 참고하면, (a) 형광 물질 불활성화 기술(t-CyCIF )과 본 개시를 같이 적용하는 개념 모식도이다.

(b-c) 쥐 뇌 절편 해마에서의 공초점 현미경 이미지이다. (b) 첫 번째 이미징 라운드에서는 PV(CF488A, 빨강), NeuN(ATTO514, 초록), DAPI(파랑)을 표지 하였고, 상호정보량 최소화를 통해 신호 분리를 한다. (c) 형광 물질 불활성화 후, 두 번째 이미징 라운드에서 calretinin(CF488A, 빨강), GluT(ATTO514, 초록) and DAPI(파랑)을 표지 하였고, 상호정보량 최소화를 통해 신호 분리를 한다. 스케일 바: 50 μm.

도 20은 본 개시의 그람-슈미트 직교화를 통한 신호 분리 결과이다.

도 20을 참고하면, 도 7 (e-h)의 분리 전 원본 이미지들을 그람-슈미트 직교화를 통한 신호 분리로 얻은 다분자 형광 이미지이다. Lamin A/C(첫번째 검출 파장대에서 얻은 이미지), GM130(두번째 검출 파장대에서 얻은 이미지에서 첫번째 검출 파장대 이미지를 분리해 낸 후 이미지), vimentin(large stoke's shift 형광 물질로 얻은 이미지)를 타겟 하여 염색 후 신호 분리하였다. 스케일 바: 30 μm.

하기 [표 2]는 본 개시가 작동함을 검증한 1차 항체의 리스트이다.

#	Antibody	Vendor	Catalog#	Host	Clonality
Mouse brain marker
1	ABAT	ATLAS	HPA041690	Rb	Poly
2	α-internexin/NF66	EnCor	RPCA-α-Int	Rb	Poly
3	-tubulin	Abcam	ab6046	Rb	Poly
4	ARFGEF1	ATLAS	HPA023822	Rb	Poly
5	Calbindin	Abcam	ab11426	Rb	Poly
6	Calretinin	Abcam	ab702	Rb	Poly
7	CAMK2B	ATLAS	HPA026307	Rb	Poly
8	DDX3X	ATLAS	HPA001648	Rb	Poly
9	E1F1AX	ATLAS	HPA002561	Rb	Poly
10	FGF3	ATLAS	HPA012692	Rb	Poly
11	GABA-A receptor α1	SYSY	224 203	Rb	Poly
12	GAD 65/67	Millipore	AB1511	Rb	Poly
13	GFAP	HPA	HPA056030	Rb	Poly
14	GFP	Abcam	ab290	Rb	Poly
15	GluR1	Abcam	ab31232	Rb	Poly
16	Iba1	SYSY	234 003	Rb	Poly
17	INA	ATLAS	HPA008057	Rb	Poly
18	Lamin B1	Abcam	ab16048	Rb	Poly
19	Laminin	Abcam	ab11575	Rb	Poly
20	Laminin	EnCor	RPCA-Laminin	Rb	Poly
21	LHX2	ATLAS	HPA000838	Rb	Poly
22	MAP2	Abcam	ab32454	Rb	Poly
23	MBP	Abcam	ab40390	Rb	Poly
24	MBP	HPA	HPA049222	Rb	Poly
25	MBP	Aves	MBP	Chk	Poly
26	NECAB2	ATLAS	HPA013998	Rb	Poly
27	NeuN	Millipore	ABN78	Rb	Poly
28	Neurofilament 200	Sigma	N4142	Rb	Poly
29	Neurofilament-M	EnCor	RPCA-NF-M	Rb	Poly
30	Neuropeptide Y	Immunostar	22940	Rb	Poly
31	Parvalbumin	Novus	NB120-11427	Rb	Poly
32	PCP4	ATLAS	HPA005792	Rb	Poly
33	RAP1GAP	ATLAS	HPA001922	Rb	Poly
34	SLC2A1	ATLAS	HPA031345	Rb	Poly
35	Sox2	SYSY	347 003	Rb	Poly
36	Somatostatin	HPA	HPA019472	Rb	Poly
37	SV2A	Abcam	ab32942	Rb	Poly
38	TBR1	Abcam	ab31940	Rb	Poly
39	TH	Abcam	ab112	Rb	Poly
40	VAMP2	abcam	ab3347	Rb	Poly
41	ZNF3	ATLAS	HPA003719	Rb	Poly
Cell marker
42	-tubulin	Abcam	ab6046	Rb	Poly
43	Clathrin heavy chain	Abcam	ab21679	Rb	Poly
44	Collagen IV	Abcam	ab6586	Rb	Poly
45	Fibronectin	Abcam	ab2413	Rb	Poly
46	GM130	Abcam	ab52649	Rb	Mono
47	LaminB1	Abcam	ab16048	Rb	Poly
48	Pericentrin	Abcam	ab4448	Rb	Poly
Human tissue marker
49	KRT19	ATLAS	HPA002465	Rb	Poly
50	COX IV	Abcam	ab16056	Rb	Poly
51	Histone H3	Abcam	ab1791	Rb	Poly
52	Vimentin	Abcam	ab45939	Rb	Poly
53	LaminB1	Abcam	ab16048	Rb	Poly
54	Fibronectin	Abcam	ab2413	Rb	Poly
55	Collagen IV	Abcam	ab6586	Rb	Poly

상기 [표 3]은 본 개시가 테스트한 형광 물질의 리스트이다.

#	Dye	Vendor	Catalog#
1	ATTO390	ATTO-TEC	AD 390-31
2	CF405S	Biotium	#92110
3	CF405M	Biotium	#92111
4	CF405L	Biotium	#92112
5	Dylight405	Life technologies	46400
6	ATTO430LS	ATTO-TEC	AD 430LS-31
7	CF488A	Biotium	#92120
8	ATTO488	ATTO-TEC	AD 488-31
9	Alexa488	Life technologies	A20000
10	ATTO490LS	ATTO-TEC	AD 490LS-31
11	ATTO514	ATTO-TEC	AD 514-31
12	CF514	Biotium	#92103
13	ATTO532	ATTO-TEC	AD 532-31
14	Alexa546	Life technologies	A20002
15	ATTO565	ATTO-TEC	AD 565-31
16	CF568	Biotium	#92131
17	ATTO Rho101	ATTO-TEC	AD Rho101-31
18	Alexa594*	Jackson ImmunoResearch	111-587-008
19	ATTO594	ATTO-TEC	AD 594-31
20	ATTO633	ATTO-TEC	AD 633-31
21	CF633	Biotium	#92133
22	Alexa647*	Jackson ImmunoResearch	111-607-008
23	ATTO647N	ATTO-TEC	AD 647N-31
24	Alexa680*	Jackson ImmunoResearch	111-627-008
25	CF660R	Biotium	#92134
26	CF680R	Biotium	#92107

본 개시의 다양한 실시예들에 따른 전자 장치(200)의 동작 방법은, 상이한 생체 분자들에 각각 표지 되어 있는 복수의 형광 물질들에 대해, 적어도 하나의 이미지를 획득하는 단계(310), 및 획득된 이미지를 생체 분자들 각각에 대한 이미지들로 분리하는 단계(320)를 포함할 수 있다.

다양한 실시예들에 따르면, 형광 물질들 중 적어도 어느 두 개는, 유사한 파장대의 방출 스펙트럼들을 각각 나타낼 수 있다.

다양한 실시예들에 따르면, 파장대는, 방출 스펙트럼들 중 어느 하나의 일부에 대응하는 제 1 검출 파장대, 및 방출 스펙트럼들 중 어느 하나의 적어도 일부와 방출 스펙트럼들 중 다른 하나의 적어도 일부가 겹쳐져 있는 제 2 검출 파장대를 포함할 수 있다. 다양한 실시예들에 따르면, 이미지를 획득하는 단계(310)는, 제 1 검출 파장대의 제 1 이미지를 획득하는 단계, 및 제 2 검출 파장대의 제 2 이미지를 획득하는 단계를 포함할 수 있다.

다양한 실시예들에 따르면, 획득된 이미지를 분리하는 단계(320)는, 제 1 이미지를 기반으로, 제 2 이미지로부터 제 3 이미지를 획득하는 단계를 포함할 수 있다.

다양한 실시예들에 따르면, 제 1 이미지가 생체 분자들 중 어느 하나의 이미지로 검출되고, 제 3 이미지가 생체 분자들 중 다른 하나의 이미지로 검출될 수 있다.

다양한 실시예들에 따르면, 제 3 이미지를 획득하는 단계는, 제 2 이미지로부터 제 1 이미지와 제 2 이미지 사이에서 공유되는 정보를 최소화함으로써, 제 3 이미지를 획득할 수 있다.

다양한 실시예들에 따르면, 제 3 이미지를 획득하는 단계는, 제 1 검출 파장대에서의 형광 물질들 중 어느 하나의 밝기와 제 2 검출 파장대에서의 형광 물질들 중 어느 하나의 밝기에 대한 비율을 예측하는 단계, 및 비율을 기반으로, 제 2 이미지로부터 제 3 이미지를 획득하는 단계를 포함할 수 있다.

다양한 실시예들에 따르면, 비율을 기반으로, 제 3 이미지를 획득하는 단계는, 제 2 이미지로부터 비율과 제 1 이미지를 곱한 결과를 뺌으로써, 제 3 이미지를 획득하는 단계를 포함할 수 있다.

다양한 실시예들에 따르면, 이미지를 획득하는 단계(310)는, 파장대의 빛이 형광 물질들에 조사됨에 따라, 형광 물질들 중 적어도 어느 두 개의 방출 스펙트럼들에 대한 이미지를 생성하는 단계를 더 포함하고, 제 1 이미지와 제 2 이미지는 생성된 이미지로부터 각각 획득될 수 있다.

일 실시예에 따르면, 제 1 이미지와 제 2 이미지는, 대역 필터에 의해, 각각 획득될 수 있다.

다른 실시예에 따르면, 제 1 이미지와 제 2 이미지는, 스펙트랄 디텍터에 의해, 각각 획득될 수 있다.

본 개시의 다양한 실시예들에 따른 전자 장치(200)는, 메모리(240), 및 메모리(240)와 연결되고, 메모리(240)에 저장된 적어도 하나의 명령을 실행하도록 구성된 프로세서(250)를 포함하고, 프로세서(250)는, 상이한 생체 분자들에 각각 표지 되어 있는 복수의 형광 물질들에 대해, 적어도 하나의 이미지를 획득하고, 획득된 이미지를 생체 분자들 각각에 대한 이미지들로 분리하도록 구성될 수 있다.

다양한 실시예들에 따르면, 파장대는, 방출 스펙트럼들 중 어느 하나의 일부에 대응하는 제 1 검출 파장대, 및 방출 스펙트럼들 중 어느 하나의 적어도 일부와 방출 스펙트럼들 중 다른 하나의 적어도 일부가 겹쳐져 있는 제 2 검출 파장대를 포함할 수 있다.

다양한 실시예들에 따르면, 프로세서(250)는, 제 1 검출 파장대의 제 1 이미지를 획득하고, 제 2 검출 파장대의 제 2 이미지를 획득하도록 구성될 수 있다.

다양한 실시예들에 따르면, 프로세서(250)는, 제 1,2 이미지를 기반으로, 제 2 이미지로부터 제 3 이미지를 획득하고, 제 1 이미지를 생체 분자들 중 어느 하나의 이미지로 검출하고, 제 3 이미지를 생체 분자들 중 다른 하나의 이미지로 검출하도록 구성될 수 있다.

다양한 실시예들에 따르면, 프로세서(250)는, 제 2 이미지로부터 제 1 이미지와 제 2 이미지 사이에서 공유되는 정보를 최소화함으로써, 제 3 이미지를 획득하도록 구성될 수 있다.

다양한 실시예들에 따르면, 프로세서(250)는, 제 1 검출 파장대에서의 형광 물질들 중 어느 하나의 밝기와 제 2 검출 파장대에서의 형광 물질들 중 어느 하나의 밝기에 대한 비율을 예측하고, 비율을 기반으로, 제 2 이미지로부터 제 3 이미지를 획득하도록 구성될 수 있다.

다양한 실시예들에 따르면, 프로세서(250)는, 제 2 이미지로부터 비율과 제 1 이미지를 곱한 결과를 뺌으로써, 제 3 이미지를 획득하도록 구성될 수 있다.

다양한 실시예들에 따르면, 프로세서(250)는, 파장대의 빛이 형광 물질들에 조사됨에 따라, 형광 물질들 중 적어도 어느 두 개의 방출 스펙트럼들에 대한 이미지를 생성하고, 생성된 이미지로부터 제 1 이미지와 제 2 이미지를 각각 획득하도록 구성될 수 있다.

이상에서 설명한 본 개시의 실시예는 장치 및 방법을 통해서만 구현이 되는 것은 아니며, 본 개시의 실시예의 구성에 대응하는 기능을 실현하는 프로그램 또는 그 프로그램이 기록된 기록 매체를 통해 구현될 수도 있다.

이상에서 본 개시의 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 개시의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 개시의 기본 개념을 이용한 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 개시의 권리범위에 속하는 것이다.

Claims

전자 장치의 동작 방법에 있어서,
상이한 생체 분자들에 각각 표지 되어 있는 복수의 형광 물질들에 대해, 적어도 하나의 이미지를 획득하는 단계; 및
상기 획득된 이미지를 상기 생체 분자들 각각에 대한 이미지들로 분리하는 단계를 포함하고,
상기 형광 분자들 중 적어도 어느 두 개는,
유사한 파장대의 방출 스펙트럼들을 각각 나타내는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 파장대는,
상기 방출 스펙트럼들 중 어느 하나의 일부에 대응하는 제 1 검출 파장대, 및
상기 방출 스펙트럼들 중 어느 하나의 적어도 일부와 상기 방출 스펙트럼들 중 다른 하나의 적어도 일부가 겹쳐져 있는 제 2 검출 파장대를 포함하는 방법.
제 2 항에 있어서, 상기 이미지를 획득하는 단계는,
상기 제 1 검출 파장대의 제 1 이미지를 획득하는 단계; 및
상기 제 2 검출 파장대의 제 2 이미지를 획득하는 단계를 포함하는 방법.
제 3 항에 있어서, 상기 획득된 이미지를 분리하는 단계는,
상기 제 1 이미지를 기반으로, 상기 제 2 이미지로부터 제 3 이미지를 획득하는 단계를 포함하고,
상기 제 1 이미지가 상기 생체 분자들 중 어느 하나의 이미지로 검출되고,
상기 제 3 이미지가 상기 생체 분자들 중 다른 하나의 이미지로 검출되는 방법.
제 4 항에 있어서, 상기 제 3 이미지를 획득하는 단계는,
상기 제 2 이미지로부터 상기 제 1 이미지와 상기 제 2 이미지 사이에서 공유되는 정보를 최소화함으로써, 상기 제 3 이미지를 획득하는 방법.
제 4 항에 있어서, 상기 제 3 이미지를 획득하는 단계는,
상기 제 1 이미지와 상기 제 2 이미지를 직교화함으로써, 상기 제 3 이미지를 획득하는 방법.
제 4 항에 있어서, 상기 제 3 이미지를 획득하는 단계는,
상기 제 1 검출 파장대에서의 상기 형광 물질들 중 어느 하나의 밝기와 상기 제 2 검출 파장대에서의 상기 형광 물질들 중 어느 하나의 밝기에 대한 비율을 예측하는 단계; 및
상기 비율을 기반으로, 상기 제 2 이미지로부터 상기 제 3 이미지를 획득하는 단계를 포함하는 방법.
제 7 항에 있어서, 상기 비율을 기반으로, 상기 제 3 이미지를 획득하는 단계는,
상기 제 2 이미지로부터 상기 비율과 상기 제 1 이미지를 곱한 결과를 뺌으로써, 상기 제 3 이미지를 획득하는 단계를 포함하는 방법.
제 8 항에 있어서, 상기 이미지를 획득하는 단계는,
상기 파장대의 빛이 상기 형광 물질들에 조사됨에 따라, 상기 형광 물질들 중 적어도 어느 두 개의 방출 스펙트럼들에 대한 이미지를 생성하는 단계를 더 포함하고,
상기 제 1 이미지와 상기 제 2 이미지는 상기 생성된 이미지로부터 각각 획득되는 방법.
제 9 항에 있어서, 상기 제 1 이미지와 상기 제 2 이미지는,
대역 필터 또는 스펙트랄 디텍터에 의해, 각각 획득되는 방법.
전자 장치에 있어서,
메모리; 및
상기 메모리와 연결되고, 상기 메모리에 저장된 적어도 하나의 명령을 실행하도록 구성된 프로세서를 포함하고,
상기 프로세서는,
상이한 생체 분자들에 각각 표지되어 있는 복수의 형광 물질들에 대해, 적어도 하나의 이미지를 획득하고,
상기 획득된 이미지를 상기 생체 분자들 각각에 대한 이미지들로 분리하도록 구성되고,
상기 형광 분자들 중 적어도 어느 두 개는,
유사한 파장대의 방출 스펙트럼들을 각각 나타내는 장치.
제 11 항에 있어서, 상기 파장대는,
상기 방출 스펙트럼들 중 어느 하나의 일부에 대응하는 제 1 검출 파장대, 및
상기 방출 스펙트럼들 중 어느 하나의 적어도 일부와 상기 방출 스펙트럼들 중 다른 하나의 적어도 일부가 겹쳐져 있는 제 2 검출 파장대를 포함하는 장치.
제 12 항에 있어서, 상기 프로세서는,
상기 제 1 검출 파장대의 제 1 이미지를 획득하고,
상기 제 2 검출 파장대의 제 2 이미지를 획득하도록 구성되는 장치.
제 13 항에 있어서, 상기 프로세서는,
상기 제 1 이미지를 기반으로, 상기 제 2 이미지로부터 제 3 이미지를 획득하고,
상기 제 1 이미지를 상기 생체 분자들 중 어느 하나의 이미지로 검출하고,
상기 제 3 이미지를 상기 생체 분자들 중 다른 하나의 이미지로 검출하도록 구성되는 장치.
제 14 항에 있어서, 상기 프로세서는,
상기 제 2 이미지로부터 상기 제 1 이미지와 상기 제 2 이미지 사이에서 공유되는 정보를 최소화함으로써, 상기 제 3 이미지를 획득하도록 구성되는 장치.
제 14 항에 있어서, 상기 프로세서는,
상기 제 1 이미지와 상기 제 2 이미지를 직교화함으로써, 상기 제 3 이미지를 획득하도록 구성되는 장치.
제 14 항에 있어서, 상기 프로세서는,
상기 제 1 검출 파장대에서의 상기 형광 물질들 중 어느 하나의 밝기와 상기 제 2 검출 파장대에서의 상기 형광 물질들 중 어느 하나의 밝기에 대한 비율을 예측하고,
상기 비율을 기반으로, 상기 제 2 이미지로부터 상기 제 3 이미지를 획득하도록 구성되는 장치.
제 17 항에 있어서, 상기 프로세서는,
상기 제 2 이미지로부터 상기 비율과 상기 제 1 이미지를 곱한 결과를 뺌으로써, 상기 제 3 이미지를 획득하도록 구성되는 장치.
제 18 항에 있어서, 상기 프로세서는,
상기 파장대의 빛이 상기 형광 물질들에 조사됨에 따라, 상기 형광 물질들 중 적어도 어느 두 개의 방출 스펙트럼들에 대한 이미지를 생성하고,
상기 생성된 이미지로부터 상기 제 1 이미지와 상기 제 2 이미지를 각각 획득하도록 구성되는 장치.
제 19 항에 있어서, 상기 제 1 이미지와 상기 제 2 이미지는,
대역 필터 또는 스펙트랄 디텍터에 의해, 각각 획득되는 장치.