JP2010540993A - 顕微鏡および顕微鏡の操作方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、試料の様々な点に励起光が集束または送出され、励起光の強度が点固有に変更され、少なくとも１つのスペクトル域内で前記試料によって反射された光の強度が点固有かつ定量的に測定される顕微鏡を操作する方法に関する。本発明による方法は、前記試料の固有点に送出された励起光の強度および／または分光組成が、調整装置によって自動的に、前記点によってスペクトル域内で反射された光の推定強度または実際強度に関する前記試料の測定データから予め得られた情報に基づいて、画素ドウェル時間中にこの点によってスペクトル域内で反射された光の強度の積分が所定の値期間内にあるように調整さることを特徴とする。本発明は、また、顕微鏡に関する。

Description

本発明は、第１の態様において、請求項１の前提節で定義されたような顕微鏡の操作方法、および請求項２２の前提節に定義されたような顕微鏡に関する。

本発明は、第２の態様において、請求項２の前提節に定義されたような顕微鏡の操作方法、および請求項２３の前提節に定義されたような顕微鏡に関する。

本発明は、第３の態様において、請求項３の前提節に定義されたような顕微鏡の操作方法、および請求項２４の前提節に定義されたような顕微鏡に関する。

本発明は、第４の態様において、請求項４の前提節に定義されたような顕微鏡の操作方法、および請求項２５の前提節に定義されたような顕微鏡に関する。

たとえば、特許文献１に、一般的な方法と一般的な顕微鏡が開示される。前述のタイプの方法では、励起光が、試料の様々な点に集束されるか送出され、励起光の強度が、点固有に（point-specifically）変更され、試料によって反射された光の強度が、少なくとも１つのスペクトル域内で点固有かつ定量的に測定される。

一般的な顕微鏡は、以下の構成要素、すなわち、試料を顕微鏡検査するための励起光を放射するための光源と、励起光の強度を変化させるための強度変調器と、励起光を検査される試料の様々な点に導きかつ試料の前記様々な点によって反射された光を検出器に導くための顕微鏡光学素子とを含み、前記検出器は、少なくとも１つのスペクトル域内で試料によって反射された光の強度を点固有かつ定量的に検出する。

今日の光検出器のダイナミックレンジは、特にレーザ走査顕微鏡検査法では、一方のきわめて精細で暗い構造部と他方のきわめて明るい画像領域を同じ感度で同時に解像するには不十分なことが多い。したがって、蛍光顕微鏡検査法では、画像の一部分がしばしば強調されかつ／または他の部分がバックグラウンドノイズと区別できなくなる。

さらに、強い照明により細胞と組織内に生じる光損傷（photodamage）は、現在に至るまで、生体細胞の可能画像記録数と測定時間を著しく制限する大きな要素の１つである。非特許文献１と非特許文献２を参照されたい。

レーザ走査顕微鏡検査法の分野では、検出器における光退色（photobleaching）効果の最少化とレベル制御の最適化に関する限り限界に達していることが多い。これらの問題は、詳細には、光子計数の原理によって十分に取り組まれているが、高い信号対雑音比の利点は、比較的小さいダイナミックレンジによって相殺される。計数率が約１０Ｍｈｚを越えると、計数が非線形になり、計数率が約３０Ｍｈｚを越えるとほとんど修正できない。したがって、ユーザは、最高電圧で動作する光電子倍増管を損傷から守るためだけにも、試料への照射をたえず最適な範囲内に維持しなければならない。

ダイナミックレンジを拡張するには、現在、本質的に３つの技術が利用可能である。第１に、改善された検出器、すなわちカメラ、たとえばきわめて大きなダイナミックレンジを有する検出器を使用することができる。しかしながら、顕微鏡用には１６ビットの動的深度は、これまでほとんど達成されていない。きわめて大きなダイナミックレンジを有する高感度ＣＣＤカメラは、光拡散のために、レーザ走査顕微鏡検査法ではほとんど使用されていない。

更に、不十分なダイナミックレンジの問題は、異なる照度で記録され計算された幾つかの画像を作成することによって比較的容易に回避することができる。この方法の欠点は、試料にかかるきわめて大きな応力だけでなく、記録時間も必要なことである。この方法は、多くの用途、特に生体細胞に実行される測定を含む用途には使用できないか少なくとも最適ではない。

最後に、ＣＬＥＭと略記される「露光制御顕微鏡検査法（controlled light exposure microscopy）」と呼ばれる方法が、特許文献２に提案されている。レーザ走査顕微鏡検査法では、走査画像記録中に、検出器が所定のしきい値に達した後でそれぞれの画素の照明を消しそれにより露光を停止する高速フィードバック規制プロセスを使用して、露光時間が画素毎に調整される。

光損傷と光退色を減少させるための他の解決法が提案された。まず、生体細胞に実行される測定中に生じる光損傷は、色素の分子以外の分子の励起によって生じる可能性がある。非特許文献１を参照されたい。第２に、光損傷は、色素自体の励起の結果としても生じ、この色素は、特定の励起サイクル数の後で毒性産物に分解する。色素の光退色を少なくし試料の光損傷を防ぐための様々な手法がある。たとえば、色素を変更または最適化することによって改善することができる。さらに、対象物の準備中に最適化を達成することができる。さらに、検出と励起の分野の改善が可能である。本発明に重要なことは、励起の改善であり、そのために、これまでに光退色を減少させるための２つの技術的手法が開示された。第１の手法は、前述の「露光制御顕微鏡検査法」である。第２の提案された手法は、「Ｔ−ＲＥＸ照明」と呼ばれる方法である。後者の手法は、パルスレーザ照明を実現するための方法であり、励起のためのパルス繰返数は、色素の三重項状態の緩和時間に適応される。非特許文献３を参照されたい。更に、非特許文献４に、一般的な方法と一般的な顕微鏡が記載されている。

欧州特許第０９７７０６９号明細書 国際公開第２００４／１０２２４９号パンフレット

Koester HJ., Baur, D.UhI, RとHell, S.W. (1999), Biophys. J., 77(4): 2226-2236 Hopt, AとNeher, E. (2001), Biophys. J., 80 (4) 2029-2036 Donnert, G, Eggeling, C.とHell, S.W. (2007), Nat. Methods, 4(1); 81-86 OPTICS LETTERS, Vol.32, No.19, October 1, 2007

本発明の目的は、ダイナミックレンジの拡張、検査される試料、より詳細には生体細胞における光損傷の減少、および色素の光退色の減少を含む顕微鏡および顕微鏡操作方法を提供することである。

この目的は、第１の態様において、請求項１の特徴を有する方法および請求項２２の特徴を有する顕微鏡により達成される。

前述のタイプの方法は、本発明により、試料の特定点に送出された励起光の強度および／または分光組成が、調整装置によって、前記点によってスペクトル域内で反射された光の推定強度または実際強度に関する試料の測定データから予め得られた情報に応じて、画素ドウェル時間中に前記点によってスペクトル域内で反射された光の強度の積分が所定の値期間内になるように調整されるという点で開発される。

前述のタイプの顕微鏡は、更に、本発明によれば、調整装置が、強度変調器および検出器と協力し、試料の点に送出された励起光の強度および／または分光組成を、前記点によってスペクトル域内で反射された光の推定強度または実際強度に関する試料の測定データから予め得られた情報に基づいて、検出器によって前記点に関して検出されて画素ドウェル時間中にスペクトル域内で反射された光の強度の積分が、所定の値期間内になるように調整する調整装置が提供されるという点で開発される。

第２の態様において、目的は、請求項２の特徴を有する方法と請求項２３の特徴を有する顕微鏡によって達成される。

前述のタイプの方法は、更に、本発明により、試料の特定点に送出された励起光の強度および／または分光組成が、調整装置によって、前記点からのスペクトル域内で反射された光の推定強度または実際強度に関する試料の測定データから予め得られた情報に基づいて、画素ドウェル時間中に前記点によってスペクトル域内で反射された光の強度の積分が所定の値期間内になるように調整され、この調整装置は、特定点に関する励起光の強度を、ドウェル時間中に前記点によって反射された光の強度の積分がこの点に関する信号基準が満たされたときだけ値期間の範囲内になるように調整するという点で開発される。

前述のタイプの顕微鏡は、更に、本発明により、強度変調器および検出器と協力し、試料の点に送出された励起光の強度および／または分光組成を、前記点によってスペクトル域内で反射された光の推定強度または実際強度に関する試料の測定データから予め得られた情報に基づいて、検出器によって前記点に関して検出された画素ドウェル時間中にスペクトル域内で反射された光の強度の積分が所定の値期間内になるように調整し、この調整装置は、特定点の励起光の強度を、画素ドウェル時間中に前記点によって反射された光の強度の積分が、この点の信号基準が満たされたときだけ値期間の範囲内になるように調整する調整装置が提供されるという点で開発される。

前述の目的は、本発明の第３の態様において、請求項３に記載の機能を有する方法と請求項２４の特徴を有する顕微鏡によって達成される。

前述のタイプの方法は、更に、本発明により、試料の特定点に送出された励起光の強度および／または分光組成が、前記点によってスペクトル域内で反射された光の推定強度または実際強度に関する試料の測定データから予め得られた情報に基づいて、画素ドウェル時間中に前記点によってスペクトル域内で反射された光の強度の積分が所定の値期間の範囲内になるように調整装置によって自動的に調整され、励起光が、複数の異なる色素を励起するための複数の波長を含み、試料によって反射された光の強度が、複数の異なるスペクトル域内で測定されるという点で開発される。

前述のタイプの顕微鏡は、さらに、本発明により、調整装置が、強度変調器および検出器と協力して、試料の点に送出された励起光の強度および／または分光組成を、前記点によってスペクトル域内で反射された光の推定強度または実際強度に関係する試料の測定データから予め得られた情報に基づいて、検出器によって前記点に関して検出されて画素ドウェル時間中にスペクトル域内で反射された光の強度の積分が所定の値期間内になるように自動的に調整し、複数の異なる色素を励起するための光源が、複数の波長を有する励起光を放射し、複数のスペクトル域内で試料によって反射された光を定量的かつ点固有に検出するための複数の検出器が存在するという点で、開発される。

第４の態様によれば、前述の目的は、請求項４の特徴を有する方法と請求項２５の特徴を有する顕微鏡によって達成される。

前述のタイプの方法は、更に、本発明により、試料の特定点に送出された励起光の強度および／または分光組成が、調整装置によって、前記点によってスペクトル域内で反射された光の推定強度または実際強度に関する試料の測定データから予め得られた情報に基づいて、画素ドゥエル時間中に前記点によってスペクトル域内で反射された光の強度の積分が所定の値期間内になるように自動的に調整され、この調整装置は、前の画像内の前記点に関して決定された反射光の強度に基づいて特定点に送出された励起光の強度を調整するという点で開発される。

前述のタイプの顕微鏡は、更に、本発明により、強度変調器および検出器と協力して、試料の点に送出された励起光の強度および／または分光組成を、前記点によるスペクトル域内で反射された光の推定強度または実際強度に関係する試料の測定データから予め得られた情報に基づいて、検出器によって前記点に関して検出され画素ドウェル時間中にスペクトル域内で反射された光の強度の積分が所定の値期間内にあるように自動的に調整する調整装置が提供され、この調整装置は、特定点に送出された励起光強度を、前の画像内の前記点に関して決定された反射光強度に基づいて調整するという点で開発される。

本発明の方法の好ましい変形と本発明の顕微鏡の有利な例示的実施形態は、従属クレームの対象であり、更に後でより詳細に述べられる。

本発明の中心思想は、試料の照明の強度が、試料全体にわたって実質的に全く同一の強度で処理するのではなく試料の光学特性に空間的に適応されるという点で、露光制御顕微鏡検査法のものと異なる。

本発明の１つの本質的な発見は、光損傷プロセスが強度に非線形依存していることにより、励起強度の特定の適応によって試料の損傷を大幅に改善できることにある。

本発明の第２の本質的な発見は、動的変化を励起側にシフトさせることによって、使用される検出器の不十分な動的深度が、基本的に重要なものでなくなり無視できるということである。したがって、具体的には、特に良好な信号対雑音比を有する検出器を選択することができる。

したがって、本発明は、生体試料を検査するときに限定要因となる達成される画像の動的深度の大幅な改善と更に光損傷および光退色プロセスの大幅な減少を提供するイメージング方法を提供する。

本発明の目的のため、本明細書に記載される「励起光」は、顕微鏡検査法に使用される任意の種類の電磁放射を意味することを理解されたい。この放射は、可視域にあってもよいがなくてもよい。

使用される光源は、基本的に、所望のスペクトル域内の電磁放射の任意のタイプの放射線源である。この目的に適したレーザを使用することが好ましい。

試料によって反射された光は、基本的に、励起放射による前の励起に対する試料の任意のタイプの電磁応答でよい。ここで、様々なコントラスト増強原理を実施することができる。たとえば、そのような原理には、反射または散乱放射線がある。詳細には、これらの原理には、蛍光放射線、２重光子螢光またはラマン散乱、たとえばＣＡＲＳプロセスからの放射がある。

本明細書で使用される用語「点（point）」は、数学的な意味で使用されない。代わりに、この用語は、典型的な顕微鏡光学を使用して達成可能な大きさの焦点体積を指す。たとえば、当該の焦点体積内にある色素分子は、励起光によって励起され、典型的な螢光光子を放射した後で緩和する。基本的には、使用された検出器は、それぞれのスペクトル域内の検出を行える任意のものでよい。光電子倍増管は、そのきわめて優れた信号対雑音比により、使用されることが好ましい。これらは、多チャンネル・プレート型の複数の検出器でよい。代替として、ＣＣＤや他の半導体アレイなどの他の空間検出器を使用することができる。

本発明の方法の好ましい変形では、画素ドウェル時間中に点によって反射された光の強度の積分に関する値期間は、使用される検出器が、最良の感度と最良の信号対雑音比で動作できるように設定される。励起側へのシフトにより、使用される検出器の低下した動的深度の制限がなくなり、値の間の前記間隔を慎重に調整して、検出器が有利な範囲内で動作できるようになる。

基本的には、前記値期間は、検出器の有効動的深度に適応した幅を有することができる。しかしながら、特に好ましく単純な変形では、調整プロセスは、画素ドウェル時間中に点によって反射された光の強度の積分が一定になるように実行され、これは、特に、信号基準を満たす全ての点に当てはまる。たとえば、観察される焦点体積内の対象の色素濃度の逆計算（Back-computation）は、比較的単純である。

画素ドウェル時間中の特定点の励起光の強度が、調整プロセスの安定化段階後にできるだけ一定のままになるように調整プロセスを実行するとさらに有利である。したがって、光損傷プロセスの非線形依存により、試料の損傷が最小になる。

基本的に、調整装置は、全ての点に関して特定点に送出された励起光の強度を、反射光の強度積分が特定の値期間内になるように調整することができる。しかしながら、調整装置が、特定点の励起光の強度を、画素ドウェル時間中に前記点によって反射された光の強度の積分が、この点の信号基準を満たした場合だけ所定の値期間内にあるように調整する方法の変形が特に好ましい。これにより、励起光の強度が、たとえば反射光の強度がきわめて低い点で極めて高い値に調整されるのを防ぎ、たとえば、隣接した試料領域内で光損傷プロセスを引き起こすのを防ぐことができる。

さらに好ましい変形では、全ての点に同一画素ドウェル時間が使用される。この場合も、たとえば当該の色素濃度に関する評価は比較的容易である。基本的には、様々な点に異なる画素ドウェル時間を使用することができる。たとえば、信号基準を満たす全ての点に同じ画素ドウェル時間だけを使用すると有利な場合がある。詳細には、信号基準を満たさない点の画素ドウェル時間を短くすることができる。したがって、画像またはスキャンの画像記録時間も減少し、画像記録速度を高めることができる。

基本的に、信号基準は、点固有信号として外部から供給されてもよい。換言すると、特定点の信号基準は、外部から供給された点固有信号が所定の値を有するときに満たされる。

本発明の方法の特に好ましい実施形態では、当該の点の測定情報が、信号基準として使用される。特定点の信号基準は、前記点によって反射された光の推定強度または実際強度が、区別可能なバックグラウンドしきい値より大きいときに満たされる。

このように、励起強度は、たとえば点にある色素から実際に著しい強度が反射される点の場合だけ上方に調整される。このように、試料に対する光損傷をさらに減少させることができる。

本発明の方法の追加の変形は、基本的に、照明調整が実行される時点または照明調整が実行される時間間隔に関して区別することができる。たとえば、この調整プロセスは、個々の画素の露出中、すなわち画素ドウェル時間内に実行することができる。さらに、そのような調整プロセスは、走査プロセス中に可能である。詳細には、推定反射光に関する必要な情報は、直接または間接に隣り合った点の測定から得ることができる。これは、後でより詳しく説明される。最後に、当該の調整プロセスは、時系列で記録するときに個々の画像間で実行することができ、ネガ画像方式の最も単純なケースでは、前に記録された画像から既に取得されている試料に関する情報が使用される。

たとえば、個々の点によって反射された光の強度を大雑把に決定するために、試験パターンまたは試験スキャンを記録することができる。これは、本発明によって必要とされる、当該の点によって反射された光の推定強度に関する情報を提供する。そのような試験スキャンまたは試験パターンは、点によって反射された光の推定強度に関する情報が、前記点によって反射された光の強度の初期測定によって提供される場合に提供することができる。この場合、反射光の強度は、画素ドウェル時間の最初に測定される。必要とされる必要条件は、調整プロセスが十分迅速に処理されなければならなず、画素ドウェル時間内に適正な強度に適合できなければならないことである。こうして、この点の励起ビームのドウェル時間中にこの点に送出される励起光の強度が監視される。

露光時間内、すなわち画素ドウェル時間内で照度を調整するために、各画素の照度が、既に取得された情報、すなわち試料の測定データに基づく高速フィードバックによって動的に調整される。このように、画像は、一般的な方法と同じように、検出強度の支援によるだけでなく、使用される照明出力と露光時間またはこれらの組み合わせの支援によっても構成される。従来の撮像、ＣＬＥＭ法および本明細書に示された発明（ＤＩＭ法とも呼ばれる）間の照明の違いは、後で詳細に説明される。

単一光子励起では、検出器内の測定強度は、色素濃度と照明出力の積と、２重光子励起の場合には、照明出力の二乗に比例する。従来の照明において、照明出力は、次のように、画像内の全ての画素に関して空間と時間が一定である。

ここで、Ｉは検出された螢光であり、ｘは位置ベクトルであり、ｔは時間であり、ｐは送出された照明出力である。ＣＬＥＭ法では、積分限界は空間的に変更されるが、照明出力自体は、空間的に一定に維持される。

しかしながら、ＤＩＭ法では、積分限界を一定にしておくことができる。しかし、照明出力は、空間と時間に対して任意に変更される。

したがって、ＤＩＭ法は、ＣＬＥＭ法のさらなる発展と考えることができ、著しい利点を提供する。照度は、しきい値に達したときに一定からゼロに設定されるので、前述の特許に関して述べた照明の関数は、式（２）に示したように、階段関数である。これと対照的に、本発明のＤＩＭ法は、露光時間内、特に一定露光時間内で任意の照度関数とみなす。ＣＬＥＭ法より達成された特別の利点は、まず、１よりかなり大きい指数因子αを含む光損傷の依存による光退色と光損傷の大幅な減少にある。 Hopt A.およびNeher E., Biophys., J.80(4): 2029-2036と, DixitおよびCyr, The Plant Journal (2003) 36,280-290を参照されたい。

たとえば、２重光子励起の一連の実験で明かなように因子αが約２．５のとき、レーザ出力を半分にすると光損傷が５分の１以下に減少する。

したがって、本明細書に示したような本発明の方法とＣＬＥＭ技術との実質的な違いは、画素ドウェル時間の最大使用が行われ、できるだけ最小の照度出力が使用されるという点で、指数が１よりかなり大きい送出強度への光損傷および光退色プロセスのこの非線形依存の利用にある。

さらに、２重光子顕微鏡検査法における励起側へのダイナミックレンジのシフトの減少は、ＣＬＥＭ法よりかなり大きく、一定のレーザ出力で、露光時間中に約５桁の大きさのダイナミックレンジが１：１で結像される。ＤＩＭ法では、ダイナミックレンジは、平方根を含む非線形性の問題により励起側で低下する。すなわち、６桁の大きさの螢光信号を制御するには、励起側で３桁の大きさだけを達成すればよい。ＣＬＥＭ法を使用して微細構造を解像するために、画像全体に使用される一定のレーザ出力は、最も暗い部分に最適化されなければならなず、その結果、高い照明強度では、画像の明るい部分の露光時間がきわめて短くなる。しかしながら、この結果、きわめて大きな光損傷が生じる。

たとえば、調整装置は、実時間コンピュータによって構成することができる。この解決策は、高度の変動を可能にする。特に迅速な調整プロセスが必要とされるとき、たとえば、調整プロセスが画素ドウェル時間内で実行されなければならないとき、アナログ制御回路が調整装置を構成する場合に有利なことがある。調整プロセスの一部分がコンピュータによって実行され、他の機能が特別のアナログ回路によって提供される一時的な解決策が可能である。

調整プロセスの速度に課される要件があまり厳びしくないさらに他の変形例では、点によって反射された光の推定強度に関する情報は、隣接点によって反射された光の強度の、特に同一走査プロセスで実行された先行測定から抽出される。

調整装置が、特定点に送出された励起光の強度を、前の画像内のこの点に関して決定された反射光の強度に基づいて調整するとき、調整プロセスの速度に課される要求はあまり厳しくなくなる。これは、特に、いかなる場合も時系列が追跡され、したがって複数の画像が連続して記録されるときに有利である。この場合、これに応じて、照度が、画像の時系列の２つの露光時間の間で調整される。情報は、前の画像記録から抽出され、試料の光学特性に関する必要情報を含む照度プロファイルが作成される。

本明細書で述べた本発明の方法を使用して、前述のＴ−ＲＥＸ照明と組み合わせた特定の利点を得ることができる。したがって、試料は、特に好ましくは、試料が作成された色素の三重項状態の緩和時間に励起光のパルス繰返数が調整されたパルス照明を受ける。

本発明は、詳細には、走査顕微鏡で使用することができる。特定の画像率を達成するために、これらの顕微鏡は、各点にほんの少しの時間しか利用できないので比較的高い強度で動作する。したがって、本発明によって得られる利点は、特に、点走査顕微鏡と関連して、また線走査顕微鏡と関連して十分に達成される。

本発明の方法は、より低い照明出力を採用し、したがってあまり試料損傷を引き起こすことなく、より高い動的深度を有する画像を達成できるので、顕微鏡が広視野顕微鏡であるときはなどしく有利に使用することができる。

本発明は、蛍光顕微鏡検査法に特に有利に適用することができる。そのような顕微鏡は、詳細には、生物科学の分野で使用され、この場合、光損傷プロセスの問題は特に関係することである。詳細には、本発明により、「生細胞の撮像」、すなわち生体細胞の観察における観測時間を高めることができる。これにより、全く新しい研究が可能になる。詳細には、本発明は、全反射蛍光顕微鏡検査法に適用することもできる。

本質的に既知でその目的のために設計された構成要素を強度変調器として使用することができる。詳細には、強度変調器は、ＡＯＴＦ、ＡＯＭ、ポッケルス・セル、ファラデ・セルおよび／またはカー・セルを有することができる。ＡＯＴＦまたはＡＯＭは、高速を必要とする用途に使用されることが好ましい。

線スキャナを使用するとき、線内の照度を空間光変調器によって調整することができる。画像全体を走査するときに各線の照度プロファイルを再調整することができる。

また、基本的に、光源自体の強度を調整可能にしかつ／または光変調器が光源の一体部分にすることができる。

また、広視野顕微鏡検査法では、試料上の照度を最適化するために、最も単純な場合にネガ画像式に達成することができる空間光変調器を使用することができる。

そのような例示的な実施形態は、空間光変調器の光損失が比較的大きいので、空間光変調器が検出ビーム経路から遠くに配置されることが好ましい。

本発明の方法と本発明の顕微鏡は、必要に応じて、試料が実質的に１つの波長の光によって照明され、反射光が、極めて狭くてもよい実質的に１つの波長域内で検出されるときに、特に有利に使用することができる。本発明の別の大きな応用分野は、多色蛍光顕微鏡検査法の分野である。この場合、励起光は、複数の異なる色素を励起するためのいくつかの波長を有し、試料によって反射された光の強度は、複数のスペクトル域で測定される。スペクトル域は、可変幅のものでよい。さらに、様々なスペクトル域が、並置または重ねられてもよく、測定が実行されない特定の範囲だけ離間されてもよい。

このタイプの顕微鏡検査法では、顕微鏡において、適切な光帯域フィルタによって、放射の螢光の様々な色を分離することができる。これは、様々な色素または蛍光の放射スペクトルが、特定の波長範囲内でほとんど重ならないときだけ容易に可能である。通常の場合、入手可能な色素の放射スペクトルはあまり異ならないので、フィルタの組み合わせによって、あまり大きな光損失を伴うことなくクロストークを完全に防ぐことができる。いくつかの色が使用されるとき、「スペクトル非混合（spectral unmixing）」と呼ばれる方法を適用することができ、この方法は、チャネル内で収集された光子を様々な色素に割り当てるために高頻度で多重決定された一次方程式系の近似解を必要とする。

したがって、様々なスペクトル域に関して測定された強度は、それぞれの色素に関係する成分に分離され、この分離は、様々な色素の放射スペクトルに関する既知の情報に基づき、またスペクトル域の位置と幅を考慮し、スペクトル域に関係する少なくとも１つの色素強度成分と異なる各色素ごとに重み係数が決定される。

これは、各画素に実行される。したがって、各画素について、以下の形の連立方程式が解かれる。Ａ＊ｘ＝ｙ、ここで、行列Ａは、検出器チャネルのそれぞれの波長範囲内の色素の基準スペクトルから構成され、ｘは、非混合画像を示し、ｙは、個々の検出器チャネル内の画像を示す。各画素に関して各チャネルがノイズの逆数で重み付けされた重み付け線形回帰を実行することが提案されてきた。同様に、各非混合画素に関して、誤差または信号対雑音比を誤差伝播によって指定することができる。Neher and Neher, Journal of Microscopy, Volume 213, Part 1, January 2004, pp.46-62を参照されたい。

いくつかの色とスペクトルの検出を含む蛍光顕微鏡検査法では、後のスペクトル非混合に最適な検出チャネルのチャネル位置は、蛍光体のスペクトルだけでなく、その蛍光体の濃度分布または様々な検出チャネル内の信号に対する個々の蛍光体または色素の寄与にも依存する。これは、送出された様々な波長の励起強度による影響を受ける。先行技術は、色素のスペクトル特性に基づいて画像全体の励起と検出の最適化を構成する。これは、たとえば、独国特許１０２２２３５９Ｂ４号明細書に記載されている。しかし、多くの用途における個々の画素間の濃度分布により、様々なチャネル内の輝度に対する個々の色素の寄与が大きく変化するので、検出チャネルの調整は、ほとんどの画素に最適ではない。これにより、スペクトル非混合画像の個々の画素の信号対雑音比が大きくなる。

本発明の方法の多色蛍光顕微鏡検査法への適用は、実質的に、検出された螢光に対する個々の色素の寄与を最適化し、これにより非混合画像で所定の信号対雑音比を達成するために、様々な励起波長の強度を画素ごとに正確に混合することにある。調整プロセスは、システムにより、様々な波長の強度を素早く切り替えることによって実行される。基本的には、電気光学型もしくは音響光学型のもの、詳細にはポッケルスセル、ＡＯＭ、ＡＯＴＦ、または必要に応じて複数の空間光変調器などの前述の強度変調器を使用することができる。この場合も、いわゆる「プレスキャン」を前述の方式で使用することによって、画素ドウェル時間中または２つの画像間で再調整を実行することができる。したがって、前述の方法と同じように再調整が行われるが、波長の強度調整が、単一色素の寄与だけ影響を及ぼすのではなく、いくつかの色素の寄与に様々な程度に影響を及ぼす可能性があるので、再調整のアルゴリズムは複雑になる。

本発明の方法が、多色蛍光顕微鏡検査法に適用されるとき、信号対雑音比の大幅な改善と感度の明確な向上を達成することができる。さらに他の利点は、使用された様々な色素の選択性を大幅に改善できることである。この場合も、動的深度の増大や色素の光損傷と漂白の減少などの既に述べた利点は重要なものである。

したがって、試料の特定点に送出された励起光の強度および／または分光組成は、調整装置によって、様々なスペクトル域内で前記点によって反射された光の推定強度または実際強度に関する試料の測定データから予め得られた情報に応じて、画素ドウェル時間中に異なるスペクトル域内の前記点によって反射された光の強度の積分が、様々なスペクトル域に個々に区別可能な値期間内にあるように自動的に調整されることが好ましい。

重み係数は検討し操作し易い変数なので、各色素の重み係数が値期間の範囲内にあるか所定の値を有するように様々なスペクトル域の値期間が決定され、様々な色素の当該の値期間または値が各場合に個々に決定されるときに評価に特に有利である。個々の色素の重み係数の値期間または値を様々なスペクトル域内の強度積分の値期間と間違えてはならない。しかし、これらの変数は、一般に相互依存し、したがって、個々のスペクトル域内の強度積分の値は、基本的に、やはり重み係数の決定、すなわち個々の色素の強度寄与によって決定される。したがって、これらの値は、調整プロセスに関して交換可能である。

機器に関しては、これらの用途には、複数の異なる色素を励起するために光源が複数の波長の励起光を放射することが有利である。さらに、多色蛍光顕微鏡検査法には、複数のスペクトル域内で試料によって反射された光を定量的かつ点固有に検出するための複数の検出器が利用できる。

本発明の更に他の利点と特徴は、添付図面を参照して後で説明される。

本発明の顕微鏡の図表示である。 線スキャナの図表示である。 広視野顕微鏡の図表示である。 実時間コンピュータを構成する制御回路の図表示である。 組み合わされた電子変調器と検波回路を示す図表示である。 アナログ・スイッチング回路から成る調整装置の図表示である。 本発明の方法のシーケンスの一部分を構成するフローチャートである。 ＴＩＲ顕微鏡におけるビーム経路の図表示である。

本発明の顕微鏡の基本構造と本発明の方法の基本シーケンスが、以下に、図１と図７を参照して説明される。次に、追加の例示的実施形態が、図２〜図６と図８を参照して説明される。図面内の同等の構成要素は、同じ参照符号が付けられる。

図１に図示した本発明の顕微鏡１００は、点走査顕微鏡（point-scanning microscope）である。点走査顕微鏡の必須構成要素には、レーザなどの光源１０、強度変調器２０、走査装置７０、顕微鏡光学素子３０、検出器５０、および調整装置６０がある。光源１０は、試料４０を顕微鏡検査するための励起光２２を放射する。励起光２２の強度は、本発明により、強度変調器２０の支援により選択的に調整される。励起光２２は、走査装置７０、主ビーム・スプリッタ８０、および図示された顕微鏡光学素子３０を通って試料の点４１に達する。励起光２２の励起ビームは、走査装置７０の支援によりラスタ化または走査することができ、その強度は、後でより詳細に述べるように、本発明により、その都度点固有に調整される。

点４１の周囲の焦点体積は、励起光２２によって励起される。たとえば、そのような周囲にある色素分子は、電子的に励起された状態にすることができる。その結果、焦点体積は、蛍光などの電磁放射４２を放射する。

点４１から放射されたこの光４２は、顕微鏡光学素子３０、主ビームスプリッタ８０、および詳細に示されていない他の光学構成要素を順番に通って、検出器５０に達し、そこで、反射光４２の強度が定量的に測定される。検出器５０によって提供される測定データは、調整装置６０に送られる。試料４０の測定データに基づいて、調整装置６０は、励起光２２の強度を、本発明にしたがって、強度変調器２０を用いて画素ドウェル時間中に反射光の強度積分が一定になるように調整する。

その結果、点スキャナは、点ごとの照度を提供することができる。一般にＡＯＴＦである強度変調器２０のスイチッング時間を短くするために、強度変調器２０を通っているビームの直径を、本質的に既知の技術を使用して小さくすることができる。

調整プロセスでは、たとえば、検出器を制御しかつＦＰＧＡでよい論理演算ユニットが、計数率を評価し、試料に達する光強度が高すぎるか低すぎるかを判定する。このために限度値（Limiting value）を定義することができる。その上で、論理演算ユニットは、照度を調整する適切な論理演算ユニット、たとえば、ＡＯＴＦの制御ユニットに実時間伝送を生成することができる。照度を制御するプロセスは、できるだけ最少の遅延で照度を適切に調整する。同時に、記録された検出器値を後で計算しなおすことができるように、より高レベル・システムに照度の操作が通知される。これは、後で図７を参照して述べる。

一般に、シーケンスＳ１０、Ｓ２０およびＳ３０が逐次処理される。ステップＳ１０は、「システム・セットアップ」を含み、モジュールとして見たとき、レーザによる光励起に対する試料の挙動が、ステップ１１で検出され評価される。次に、ステップ１２で、作業範囲が特定され、詳細に説明される。ステップＳ２０〜Ｓ２５は、調整プロセスの詳細を含む。Ｓ２０で画素の処理が始まった後、ステップＳ２１で励起のオンライン検査が行われる。次に、ステップ２２は、計数率を測定できるかどうかに関する照会を含む。計数率を測定できる場合は、ステップ２３で、検出器に入る光子が計数される。光子を検出できない場合、調整装置は、ステップＳ２４で、強度変調器２０の設定を変更する。ステップＳ２５で強度変調器２０の設定を保存した後で、ステップＳ２１から始まるプロセスが繰り返される。画素の手順は、ステップＳ３０とＳ３１で完了し、Ｓ３１で、強度変調器２０の設定に基づいて光子計数率が計算される。

照度が変調された結果、試料は、点固有の非線形漂白効果を受ける。基本的に、影響のタイプが既知なので、漂白効果を点固有に計算することができる。

図２は、線スキャナを図示する。ここで、光源１０からの励起光２２が、スリット膜（図示せず）とレンズ２３によって集束されてスキャナ７２上に線ができる。走査対物レンズとも呼ばれるレンズ２４を用いて、励起光２２は、空間光変調器２５によって走査される。次に、チューブ・レンズ２６が、ビームを、ダイクロイック・ビーム・スプリッタである主ビームスプリッタ８０上に集束する。これは、励起光を反射し、励起光は、対物レンズ３２を通して試料４０上に線として結像される。試料４０の点４１から放射された蛍光４２は、順に、対物レンズ３２によって結像され、次にチューブ・レンズ３４を用いて空間解像検出器５０の点５１上に結像される。蛍光の波長シフトにより、蛍光４２は、主ビームスプリッタ８０を通過することができる。空間解像検出器５０は、仮想開口を介して読み取られる。したがって、たとえば、共焦点性を実現するために、点領域５１内の１つの検出器要素だけが読み出される。

試料は、対物レンズ３２の右側焦点面に位置決めされ、主ビームスプリッタ８０の中心は、対物レンズ３２の左側焦点面に位置決めされる。

図２に示した例示的な実施形態では、励起ビームと検出ビームの経路は別である。したがって、空間光変調器内の高い光損失などの有害な光学特性は、検出側に悪影響を及ぼさない。二次元空間光変調器の走査は、比較的低いスイッチング速度しか許容せず、したがって、再調整をほぼ画像ごとにしか実行できず、ほとんどの場合線内では実行できない。検出ビーム経路内の光学部品の数ができるだけ最小になるので、感度が最大になり、したがって試料内の光損傷が減少する。線スキャナは、画素ドウェル時間が長くなり、したがって励起放射の強度を低くすることができるので、フレーム率が一定の場合に点スキャナより有利である。その結果、光損傷プロセスが減少する。さらに、空間光変調器を使用することによって、この方法を、たとえば分解能を高めるために照明が構造化された他の技術と組み合わせることができる。空間光変調器２５は、各画像ごとに、たとえばカメラを含む帰還ループで、実時間コンピュータを使用して再調整される。

図３に示した広視野構成では、二次元空間分解能を有する検出器５０が使用される。他の点では、検出ビーム経路内の条件は、図２を参照して説明した線スキャナとほとんど一致する。試料領域全体が照明されるので、同じように空間光変調器２５が使用される励起ビーム経路内の配置はかなり単純である。所定のフレーム率では、広視野構成により１画素当たりの励起強度が最小になり、その理由は、この場合に露光時間を適切に長くできるからである。図２に示した例示的実施形態と同じように、図３の空間光変調器は、やはり検出ビーム経路内に配置されておらず、したがって、この点で有害な空間光変調器の特性は重要でなくなる。広視野の空間光変調器を使用するにより、動的結像によって高分解能顕微鏡検査法を実行するために、画像間の再調整と、この方法を他の構造化照明方法と組み合わせることが可能になる。

次に、図４〜図６を参照して、調整装置の様々な変形が説明される。点走査システムは、有利な制御回路を作成するいくつかの方法を提供する。たとえば、図４は、必要な制御パラメータを取得しそれを最終制御要素に送るために既存のデータ処理経路が使用される既存のモジュール式レーザ走査顕微鏡に基づく構成を示す。図４に示した調整システムの重要な構成要素には、ビーム経路１２に配置されて電子変調器回路２８を含む強度変調器２０と、電子感知器回路５８を有する検出器５０とがある。双方向矢印９０，９５によって示したように、これらの構成要素は、詳細には実時間コンピュータでよいコントローラ９２と動作可能に対話する。電子変調器回路２８は、検出器５０で取得されデータ処理経路９５を介してコントローラ９２に送られるデータに基づいて制御される。

さらに、これに応じて既存の非モジュール式レーザ走査顕微鏡を適応させることができる。そのような場合、制御パラメータをデータ転送経路を介して送信する必要がなく。その結果、反応時間を短くすることができる。そのような構成を図５に示す。この図は、双方向矢印９７によって示されコントローラ９２と動作可能に対話する組み合わされた電子変調器と検波回路の６２を示す。

最後に、図６に図示されたような調整プロセスを実行する特別なアナログ電子システム６４を開発することができる。次に、調整パラメータは、たとえばコントローラ９２によって外部から調整される。この場合、調整プロセスの反応時間は、使用される最終制御要素と検出器のみに依存する。

図８に、全反射顕微鏡におけるビーム経路が図示される。本明細書に示した本発明の方法は、たとえば、生体細胞の検査の観察時間を長くするために、このタイプの顕微鏡検査法に効果的に適用することができる。図８は、励起光の強度が本発明にしたがって空間変調されるような、顕微鏡の励起ビーム経路の主構成要素を示す。

励起光２２は、本質的に既知の手法で拡張されたレーザ・ビームとしてまたは別の光源のビームとして、励起光２２のビームのように対物レンズ３３の光学軸２９に対してわずかにずらされたレンズ２３によって共役画像側焦点面２７上に集束され、その結果、空間光変調器２５によって反射されレンズ２６によって収束された後で、励起光２２は、光学軸２９から最大距離にある焦点面３１の点に集束される。これにより、励起光２２は、対物レンズ３３から小さな射出角で出ることができ、それにより、全反射を横切るエバネセント波の浸入度が小さくなる。次に、対物レンズ３３の対物レンズ側焦点面４５の領域に試料が位置決めされる。空間光変調器２５は、対物レンズ３３とレンズ２６によって構成された中間画像内に形成され、その結果、空間光変調器２５の支援による励起光２２の本発明の空間変調が、試料４０内または試料４０上に結像される。基本的に、この構成により、図３を参照して説明された広視野構成で得られるものの同じ利点を達成することができる。

本発明は、物体を撮像するために物体または試料の光学特性に特に適するように照度が空間的に差別化されて明確に調整された新規顕微鏡と新規方法に関する。これにより、顕微鏡検査法において、詳細には、ダイナミックレンジの拡張に関する利点が得られ、検査される細胞の光損傷が減少し、更に使用される色素の漂白が減少する。本発明によって提案された構成は、少なくとも１つの光源、振幅変調器および／または偏光変調器でよい強度変調器、検出器、および検出器から強度変調器へのフィードバック調節を必要とする。次に、達成される強度に関して、上側障壁などのガイド値が確立されなければならない。したがって、本発明の調整プロセスが、検査される試料から実際に来る放射だけに有効なように、バックグラウンド基準を確立することが推奨される。これは、２つのしきい値レベルを明示的に実施する最初に述べたＣＬＥＭ法と異なる別の方法である。本発明の方法では、達成される強度は、照度調整プロセスが到達しようとするが越えなくてもよい上側障壁である。更に、バックグラウンド基準、すなわち、画素が、バックグラウンドに関係するかまたは信号であるかどうかに関する決定は、外部手段によって確立することができ、続く測定された光から、たとえば前に測定されたデータから決定されなくてもよい。

Claims (36)

1. 顕微鏡を操作する方法において、
   励起光（２２）が、試料（４０）の様々な点（４１）に集束または送出され、
   前記励起光（２２）の強度が、点固有に変更され、少なくとも１つのスペクトル域内の前記試料（４０）によって反射された光（４２）の強度が、点固有かつ定量的に測定される顕微鏡を操作する方法であって、
   前記試料の特定点（４１）に送出された励起光（２２）の前記強度および／または分光組成が、調整装置（６０）によって、前記点（４１）によって前記スペクトル域内で反射された前記光（４２）の推定強度または実際強度に関する前記試料（４０）の測定データから予め得られた情報に基づいて、画素ドウェル時間中にこの点（４１）によって前記スペクトル域内で反射された前記光（４２）の前記強度の積分が所定の値期間内にあるように自動的に調整されることを特徴とする方法。
2. 顕微鏡を操作する方法において、
   励起光（２２）が、試料（４０）の様々な点（４１）に集束または送出され、
   前記励起光（２２）の強度が、点固有に変更され、少なくとも１つのスペクトル域内の前記試料（４０）によって反射された光（４２）の強度が、点固有かつ定量的に測定される顕微鏡を操作する方法であって、
   前記試料の特定点（４１）に送出された前記励起光（２２）の前記強度および／または分光組成が、調整装置（６０）によって、前記点（４１）によって前記スペクトル域内で反射された前記光（４２）の推定強度または実際強度に関する前記試料（４０）の測定データから予め得られた情報に基づいて、画素ドウェル時間中にこの点（４１）によって前記スペクトル域内で反射された前記光（４２）の前記強度の積分が、所定の値期間内になるように自動的に調整され、
   調整装置（６０）が、特定点（４１）の前記励起光（２２）の強度を、画素ドウェル時間中に前記点（４１）によって反射された前記光（４２）の前記強度の前記積分が、この点（４１）の信号基準を満たすときだけ所定の値期間内にあるように調整することを特徴とする方法。
3. 顕微鏡を操作する方法において、
   励起光（２２）が、試料（４０）の様々な点（４１）に集束または送出され、
   前記励起光（２２）の強度が、点固有に変更され、少なくとも１つのスペクトル域内の前記試料（４０）によって反射された光（４２）の強度が、点固有かつ定量的に測定される顕微鏡を操作する方法であって、
   前記試料の特定点（４１）に送出された前記励起光（２２）の前記強度および／または分光組成が、調整装置（６０）によって、前記点（４１）によって前記スペクトル域内で反射された光（４２）の推定強度または実際強度に関する前記試料（４０）の測定データから予め得られた情報に基づいて、画素ドウェル時間中にこの点（４１）によって前記スペクトル域内で反射された前記光（４２）の前記強度の積分が、所定の値期間内にあるように自動的に調整され、
   前記励起光（２２）が、複数の異なる色素を励起するための複数の波長を含み、前記試料（４０）によって反射された前記光（４２）の前記強度が、複数の異なるスペクトル域内で測定されることを特徴とする方法。
4. 顕微鏡を操作する方法において、
   励起光（２２）が、試料（４０）の様々な点（４１）に集束または送出され、
   前記励起光（２２）の強度が、点固有に変更され、
   少なくとも１つのスペクトル域内で前記試料（４０）によって反射された光（４２）の強度が、点固有かつ定量的に測定される顕微鏡を操作する方法であって、
   強度および／または前記試料の特定点（４１）に送出された励起光（２２）の分光組成は、調整装置（６０）によって、前記点（４１）によってスペクトル域内で反射された光（４２）の推定強度または実際強度に関する前記試料（４０）の測定データから予め得られた情報に基づいて、画素ドウェル時間中に前記点（４１）によってスペクトル域内で反射された光（４２）の強度の積分が所定の値期間内になるように自動的に調整され、
   調整装置（６０）が、前の画像内の前記点（４１）に関して検出された反射光（４２）の強度に基づいて特定点（４１）に送出された励起光（２２）の強度を調整することを特徴とする方法。
5. 前記画素ドウェル時間中に点（４１）によって反射された前記光（４２）の前記強度の前記積分の前記値期間が、使用される検出器（５０）が、最大感度と最大信号対雑音比で動作できるように設定されたことを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
6. 前記調整は、特定点（４１）の前記励起光（２２）の前記強度が、画素ドウェル時間中に、前記調整プロセスの安定段階の後で最大限に一定になるように行われることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
7. 前記調整装置（６０）は、前記特定点（４１）の前記励起光（２２）の前記強度を、画素ドウェル時間中に前記点（４１）によって反射された前記光（４２）の前記強度の前記積分が、この点（４１）の信号基準が満たされたときだけ所定の値期間内になるように調整することを特徴とする、請求項１、請求項３〜６のいずれかに記載の方法。
8. 前記調整は、画素ドウェル時間中に、信号基準を満たす点（４１）、より詳細には全ての点によって反射された前記光（４２）の前記強度の前記積分が一定になるように選択されたことを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
9. 前記同じ画素ドウェル時間が、全ての点に使用されることを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
10. 前記同じ画素ドウェル時間が、信号基準を満たす全ての点に使用されることを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
11. 特定点（４１）の前記信号基準は、前記点（４１）によって反射された前記光（４２）の推定強度または実際強度が、区別可能なバックグラウンドしきい値より高い場合に満たされることを特徴とする、請求項２および請求項７〜１０のいずれかに記載の方法。
12. 特定点（４１）の前記信号基準は、外部から供給された点固有信号が、所定の値を有するときに満たされることを特徴とする、請求項２および請求項７〜１１のいずれかに記載の方法。
13. 点（４１）によって反射された前記光（４２）の前記推定強度に関する前記情報が、前記点（４１）によって反射された前記光（４２）の前記強度の初期測定によって提供されることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
14. 前記調整装置（６０）は、固有点（４１）に送出された前記励起光（２２）の前記強度を、前の画像内のこの点（４１）に関して測定された前記反射光（４２）の強度に基づいて調整することを特徴とする、請求項１〜３および請求項５〜１３のいずれかに記載の方法。
15. 点（４１）によって反射された前記光（４２）の前記推定強度に関する前記情報が、隣接点によって反射された前記光の前記強度の先行測定、より詳細には全く同一の走査プロセスにおける測定によって提供されることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
16. 個々の点（４１）によって反射された前記光（４２）の前記強度を大雑把に確認するために、試験パターンまたは試験スキャンが記録されることを特徴とする、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
17. 前記試料（４０）は、パルス照明され、
    前記励起光（２２）のパルス繰返数は、前記試料（４０）が作成された前記色素の三重項緩和時間に適応されたことを特徴とする、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
18. 前記励起光（２２）は、複数の異なる色素を励起するための複数の波長を含み、
    前記試料（４０）によって反射された前記光（４２）の前記強度は、複数の異なるスペクトル域内で測定されたことを特徴とする、請求項１、２および請求項４〜１７のいずれかに記載の方法。
19. 前記試料（４０）の特定点に送出された前記励起光（２２）の強度および／または分光組成は、前記調整装置（６０）によって、前記試料（４０）の測定データから予め得られたような前記様々なスペクトル域内のこの点（４１）によって反射された前記光（４２）の推定強度または実際強度に関する情報に基づいて、前記画素ドウェル時間中に前記様々なスペクトル域内のこの点によって反射された前記光の前記強度の前記積分が、前記様々なスペクトル域に関して個々に区別可能な各場合に値期間内にあるように自動的に調整されることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
20. 前記様々なスペクトル域に関して測定された前記強度が、前記それぞれの色素に関係する部分に分離され、
    前記分離は、前記スペクトル域の前記位置と幅を考慮しながら前記様々な色素の前記放射スペクトルに関する既知情報に基づいて実行され、
    前記様々な色素のそれぞれに関して、スペクトル域に関係する前記それぞれの色素の少なくとも１つの強度部分から重み係数がその都度決定されることを特徴とする、請求項１８または請求項１９に記載の方法。
21. 前記様々なスペクトル域の前記値期間が、各色素の重み係数が値期間内にあるかまたは所定の値を有し、この値期間または値が、様々な色素のそれぞれに個々に区別可能であるように決められたことを特徴とする、請求項１９または請求項２０に記載の方法。
22. 顕微鏡において、
    試料（４０）を微視的に調査するために励起光（２２）を放射する光源（１０）と、
    前記励起光（２２）の強度を変化させるための強度変調器（２０）と、
    前記試料（４０）の様々な点に前記励起光（２２）を導き、前記試料（４０）の前記様々な点（４１）によって反射された前記光（４２）を検出器（５０）に導くための顕微鏡光学素子（３０）とを含み、
    前記検出器（５０）が、少なくとも１つのスペクトル域内で前記試料（４０）によって反射された前記光（４２）の前記強度を点固有かつ定量的に検出する顕微鏡であって、
    前記強度変調器（２０）および前記検出器（５０）と協力し、前記試料（４０）の点（４１）に送出された前記励起光（２２）の前記強度および／または分光組成を、前記試料（４０）の測定データから予め得られ、この点（４１）によってスペクトル域内で反射された前記光（４２）の推定強度または実際強度に関する情報に基づいて、この点（４１）に関して前記検出器（５０）によって検出されるように、画素ドウェル時間中に前記スペクトル域内で反射された前記光（４２）の前記強度の積分が所定の値期間内になるように自動的に調整することを特徴とする、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法を実行する顕微鏡。
23. 顕微鏡において、
    試料（４０）を微視的に調査するための励起光（２２）を放射する光源（１０）と、
    前記励起光（２２）の強度を変化させるための強度変調器（２０）と、
    前記励起光（２２）を前記試料（４０）の様々な点に導き、前記試料（４０）の様々な点（４１）によって反射された前記光（４２）を検出器（５０）に導くための顕微鏡光学素子（３０）とを含み、前記検出器（５０）が、少なくとも１つのスペクトル域内で前記試料（４０）によって反射された前記光（４２）の前記強度を点固有かつ定量的に検出する顕微鏡であって、
    前記強度変調器（２０）および前記検出器（５０）と協力し、前記試料（４０）の点（４１）に送出された励起光（２２）の強度および／または分光組成を、前記試料（４０）の測定データからあらかじめ取得され、この点（４１）によってスペクトル域内で反射された前記光（４２）の推定強度または実際強度に関する情報に基づいて、この点（４１）の前記検出器（５０）によって検出されたように、画素ドウェル時間中に前記スペクトル域内で反射された前記光（４２）の前記強度の積分が、所定の値期間内になるように自動的に調整する調整装置（６０）が存在し、
    前記調整装置（６０）が、固有点（４１）に関する前記励起光（２２）の前記強度を、画素ドウェル時間中にこの点（４１）によって反射された前記光（４２）の前記強度の前記積分が、この点（４１）の信号基準が満たされるときだけ所定の値期間内になるように調整することを特徴とする、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法を実行する顕微鏡。
24. 顕微鏡において、
    試料（４０）の微視的に調査するための励起光（２２）を放射する光源（１０）と、
    前記励起光（２２）の強度を変化させるための強度変調器（２０）と、
    前記励起光（２２）を前記試料（４０）の様々な点に導き、前記試料（４０）の様々な点（４１）によって反射された前記光（４２）を検出器（５０）に導くための顕微鏡光学素子（３０）とを含み、
    前記検出器（５０）が、少なくとも１つのスペクトル域内の前記試料（４０）によって反射された前記光（４２）の前記強度を点固有かつ定量的に検出する顕微鏡であって、
    前記強度変調器（２０）および前記検出器（５０）と協力し、前記試料（４０）の点（４１）に送出された前記励起光（２２）の強度および／または分光組成を、前記試料（４０）の測定データから以前に取得され、この点（４１）によってスペクトル域内で反射された光（４２）の推定強度または実際強度に関する情報に基づいて、この点（４１）に関して前記検出器（５０）によって検出されるように、画素ドウェル時間中に前記スペクトル域内で反射された前記光（４２）の前記強度の前記積分が所定の値期間内になるように自動的に調整する調整装置（６０）が存在し、
    前記光源（１０）が、複数の異なる色素を励起するための複数の波長を有する励起光（２２）を放射し、
    複数のスペクトル域内で前記試料によって反射された前記光（４２）を定量的かつ点固有に決定するための複数の検出器が存在することを特徴とする、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法を実行する顕微鏡。
25. 顕微鏡において、
    試料（４０）の微視的な調査を行うための励起光（２２）を放射する光源（１０）と、
    前記励起光（２２）の強度を変化させるための強度変調器（２０）と、
    前記励起光（２２）を前記試料（４０）の様々な点に導き、前記試料（４０）の様々な点（４１）によって反射された光（４２）を前記検出器（５０）に導くための顕微鏡光学素子（３０）とを含み、
    前記検出器（５０）が、少なくとも１つのスペクトル域内の前記試料（４０）によって反射された光（４２）の強度を点固有かつ定量的に検出する顕微鏡であって、
    前記強度変調器（２０）および前記検出器（５０）と協力し、前記試料（４０）の点（４１）に送出された前記励起光（２２）の強度および／または分光組成を、前記試料（４０）の測定データから以前に取得され、この点（４１）によってスペクトル域内で反射された光（４２）の推定強度または実際強度に関する情報に基づいて、この点（４１）に関して前記検出器（５０）によって検出されるように、画素ドウェル時間中にスペクトル域内で反射された前記光（４２）の前記強度の積分が所定の値期間内になるように自動的に調整する調整装置（６０）が存在し、
    前記調整装置（６０）が、前記反射光（４２）の強度に基づいて特定点（４１）に送出された前記励起光（２２）の強度を、前の画像内のこの点（４１）に関して決定されるように調整することを特徴とする、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法を実行するための顕微鏡。
26. 前記顕微鏡が、走査顕微鏡、より詳細には点走査顕微鏡であることを特徴とする、請求項２２〜２５のいずれかに記載の顕微鏡。
27. 前記顕微鏡が、線走査顕微鏡であることを特徴とする、請求項２６に記載の顕微鏡。
28. 前記顕微鏡が、広視野顕微鏡であることを特徴とする、請求項２２〜２５のいずれかに記載の顕微鏡。
29. 前記顕微鏡が、蛍光顕微鏡、詳細には全反射蛍光顕微鏡であることを特徴とする、請求項２２〜２８のいずれかに記載の顕微鏡。
30. 前記強度変調器（２０）が、ＡＯＴＦ、ＡＯＭ、ポッケルス・セル、ファラデー・セルおよび／またはカー・セルを有することを特徴とする、請求項２２〜２９のいずれかに記載の顕微鏡。
31. 前記強度変調器が、空間光変調器（２５）を有する、請求項２２〜３０のいずれかに記載の顕微鏡。
32. 前記空間光変調器（２５）が、検出ビーム経路から遠くに配置されたことを特徴とする、請求項３１に記載の顕微鏡。
33. 前記調整装置（６０）が、実時間コンピュータによって構成されたことを特徴とする、請求項２２〜３２のいずれかに記載の顕微鏡。
34. 前記調整装置（６０）が、アナログ制御回路（６２，６４）によって構成されたことを特徴とする、請求項２２〜３３のいずれかに記載の顕微鏡。
35. 複数の異なる色素を励起するための前記光源（１０）が、複数の波長を有する励起光（２２）を放射することを特徴とする、請求項２２、２３および２５〜３４のいずれかに記載の顕微鏡。
36. 複数のスペクトル域内の前記試料によって反射された前記光（４２）の定量的かつ点固有に決定するための複数の検出器が存在することを特徴とする、請求項２２、２３および２５〜３５のいずれかに記載の顕微鏡。

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