JP6305115B2

JP6305115B2 - 走査型レーザ顕微鏡

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Publication number: JP6305115B2
Application number: JP2014042940A
Authority: JP
Inventors: 昭典顕谷; 桑原　洋平; 洋平桑原
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2013-03-21
Filing date: 2014-03-05
Publication date: 2018-04-04
Anticipated expiration: 2034-03-05
Also published as: JP2014206731A; US9494778B2; US20140285654A1

Description

本発明は、走査型レーザ顕微鏡に関するものである。

従来、生物系研究分野、特に顕微鏡を使用した研究市場において微弱な蛍光を検出することが求められており、検出器として光電子増倍管（ＰＭＴ）を備えた走査型レーザ顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照）。また、ＰＭＴは過大な光が入射すると劣化または損傷する虞があるため、過大な光による劣化や損傷を防止するための保護回路により、強い入射光に起因してＰＭＴから一定値以上の信号が所定時間出力された場合にＰＭＴの動作を停止させることが知られている。

特開２００５−３５２１００号公報

しかしながら、従来の走査型レーザ顕微鏡は、「所定時間」として瞬間的（例えば５０ｎｓｅｃ程度）な時間を設定し、実質的にはＰＭＴから一定値以上の信号が出力されると瞬時にＰＭＴの動作を停止させている。そのため、取得する信号が広いダイナミックレンジの輝度情報を有していた場合は、強度が強い一部の輝度情報によりＰＭＴの動作を停止させてしまうことになり、所望の画像を取得することができず、使用者の使い勝手を損なうという不都合がある。

本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、検出器の劣化を防止しつつ広いダイナミックレンジの輝度情報を取得して観察可能な走査型レーザ顕微鏡を提供することを目的とする。

上記課題を解決するために、本発明は以下の手段を採用する。
本発明の第１態様は、光源から発せられたレーザ光を標本上で２次元的に走査させる走査部と、該走査部によりレーザ光が走査された前記標本からの光を検出し、検出した光の輝度に相当する光強度信号を出力する光検出部と、該光検出部から出力された光強度信号を前記走査部の走査位置に対応する画素毎に輝度情報に変換して、前記標本の画像を生成する画像生成部と、前記光検出部から一定時間内に出力された光強度信号の総量に対応する光強度情報を算出する情報算出部と、該情報算出部により算出された前記光強度情報が所定の閾値を超えたか否かを判定する閾値判定部と、該閾値判定部により前記光強度情報が前記所定の閾値を超えたと判定された場合に、前記光検出部による光の検出を停止させる制御部とを備え、前記画像生成部が、画素毎に変換した輝度情報を所定のピクセルクロックで積算して画像を生成し、前記情報算出部が、前記光検出部から一定時間内に出力された光強度信号を前記画像生成部の前記ピクセルクロックよりも長い周期で積分した積分値を前記光強度情報とする走査型レーザ顕微鏡である。
本発明の第２態様は、光源から発せられたレーザ光を標本上で２次元的に走査させる走査部と、該走査部によりレーザ光が走査された前記標本からの光を検出し、検出した光の輝度に相当する光強度信号を出力する光検出部と、該光検出部から出力された光強度信号を前記走査部の走査位置に対応する画素毎に所定のピクセルクロックで積算した輝度情報に変換して、前記標本の画像を生成する画像生成部と、前記輝度情報を複数ピクセルクロック分加算し、前記光検出部から一定時間内に出力された光強度信号の総量に対応する光強度情報を算出する情報算出部と、該情報算出部により算出された前記光強度情報が所定の閾値を超えたか否かを判定する閾値判定部と、該閾値判定部により前記光強度情報が前記所定の閾値を超えたと判定された場合に、前記光検出部による光の検出を停止させる制御部とを備え、前記画像生成部が、所定のピクセルクロックの整数分の１のサンプリング周期で前記輝度情報をデジタル信号に変換するＡ／Ｄ変換部を備え、前記情報算出部が、前記サンプリング周期ごとに前記Ａ／Ｄ変換部により変換された前記輝度情報と該Ａ／Ｄ変換部によりＡ／Ｄ変換可能な上限値とを比較し、加算すべき輝度情報を決定する管理部と、該管理部により前記輝度情報が前記上限値よりも小さいと判定された場合に該輝度情報とそのサンプリング時刻とを対応付けて記憶する記憶部と、前記管理部により決定された前記加算すべき輝度情報を前記ピクセルクロックよりも長い周期で加算する加算部とを備え、前記管理部が、各前記ピクセルクロックにおける比較の結果、前記輝度情報が前記上限値よりも小さい場合にはその輝度情報を前記加算すべき輝度情報として決定し、前記輝度情報が前記上限値に等しい場合には、前記記憶部に記憶されている前記輝度情報とそのサンプリング時刻とに基づく推定値を前記加算すべき輝度情報として決定する走査型レーザ顕微鏡である。
本発明の第３態様は、光源から発せられたレーザ光を標本上で２次元的に走査させる走査部と、該走査部によりレーザ光が走査された前記標本からの光を検出し、検出した光の輝度に相当する光強度信号を出力する光検出部と、該光検出部から出力された光強度信号を前記走査部の走査位置に対応する画素毎に輝度情報に変換して、前記標本の画像を生成する画像生成部と、前記光検出部から一定時間内に出力された光強度信号の総量に対応する光強度情報を算出する情報算出部と、該情報算出部により算出された前記光強度情報が所定の閾値を超えたか否かを判定する閾値判定部と、該閾値判定部により前記光強度情報が前記所定の閾値を超えたと判定された場合に、前記光検出部による光の検出を停止させる制御部とを備え、前記画像生成部が、画素毎に変換した輝度情報を所定のピクセルクロックで加算して画像を生成し、前記情報算出部が、前記光検出部から一定時間内に出力された光強度信号を前記画像生成部の前記ピクセルクロックよりも長い周期で加算した加算値を前記光強度情報とする走査型レーザ顕微鏡である。

本発明によれば、光源からレーザ光が発せられると、走査部によりそのレーザ光が標本上で２次元的に走査され、標本からの光が光検出部によって検出されて光強度信号が出力され、画像生成部によりその光強度信号が輝度情報に変換されて標本の画像が生成される。これにより、標本の走査範囲を画像上で観察することができる。

この場合において、光電子増倍管のような光検出部は、一定時間内に入射する光の総量が一定量を超えると劣化が促進する傾向がある。これに対して、本発明は、光検出部から一定時間内に出力された光強度信号の総量に対応する光強度情報を情報算出部により算出し、算出した光強度情報が所定の閾値を超えたと閾値判定部により判定された場合に制御部により光検出部による光の検出を停止させることで、閾値以上の量の光が光検出部に入射するのを防ぐことができる。例えば、光検出部の劣化が促進される光の総量の上限値を所定の閾値として設定すれば、光検出部に過大な光が入射され続ける場合に光検出部の劣化が促進するのを防ぐことができる。

また、一定時間内に出力された光強度信号の総量に対応する光強度情報を用いることで、強度が強い一部の光強度信号に影響されずに光検出部による光の検出を制御して画像を取得することができる。例えば、標本の表面に付着した微量の蛍光試薬の蛍光により瞬間的に強度な光強度信号が出力されても、光検出部による光の検出を停止させるということがない。
したがって、光検出部の劣化を防止しつつ広いダイナミックレンジの輝度情報を取得して観察することができる。

上記第１態様においては、前記画像生成部が、画素毎に変換した輝度情報を所定のピクセルクロックで積算して画像を生成し、前記情報算出部が、前記光検出部から一定時間内に出力された光強度信号を前記画像生成部の前記ピクセルクロックよりも長い周期で積分した積分値を前記光強度情報とする。

このように構成することで、光検出部から一定時間内に出力された光強度信号の総量を正確に算出することができる。これにより、光検出部の劣化の促進を防止するのに適切な閾値を設定することができる。

上記第１態様においては、前記情報算出部が、前記走査部により前記標本上でレーザ光が走査される走査期間と前記光源からのレーザ光の発生を停止してレーザ光の走査線を元の位置へ戻す帰線期間とを通して積分処理を行うこととしてもよい。
このように構成することで、光検出部の劣化の促進を防止するのに正確な閾値を設定することができる。

上記第２態様においては、前記画像生成部が、前記光強度信号を画素毎に所定のピクセルクロックで積算した輝度情報を用いて画像を生成し、前記情報算出部が、前記輝度情報を複数ピクセルクロック分加算して前記光強度情報を算出する。

このように構成することで、画像生成部により画像を生成する輝度情報を用いて情報算出部により光強度情報を算出することができる。したがって、光強度信号を積算する回路が１つで済み、構成を簡略化することができる。

上記第２態様においては、前記画像生成部が、所定のピクセルクロックの整数分の１のサンプリング周期で前記輝度情報をデジタル信号に変換するＡ／Ｄ変換部を備え、前記情報算出部が、前記サンプリング周期ごとに前記Ａ／Ｄ変換部により変換された前記輝度情報と該Ａ／Ｄ変換部によりＡ／Ｄ変換可能な上限値とを比較し、加算すべき輝度情報を決定する管理部と、該管理部により前記輝度情報が前記上限値よりも小さいと判定された場合に該輝度情報とそのサンプリング時刻とを対応付けて記憶する記憶部と、前記管理部により決定された前記加算すべき輝度情報を前記ピクセルクロックよりも長い周期で加算する加算部とを備え、前記管理部が、各前記ピクセルクロックにおける比較の結果、前記輝度情報が前記上限値よりも小さい場合にはその輝度情報を前記加算すべき輝度情報として決定し、前記輝度情報が前記上限値に等しい場合には、前記記憶部に記憶されている前記輝度情報とそのサンプリング時刻とに基づく推定値を前記加算すべき輝度情報として決定する。

Ａ／Ｄ変換部によりＡ／Ｄ変換可能な上限値を超えるような過大な光が光検出部に入射した場合、Ａ／Ｄ変換部の出力は飽和してしまい輝度情報の正確なデジタル信号が得られない。上記構成によれば、Ａ／Ｄ変換部によりピクセルクロックでＡ／Ｄ変換された輝度情報がＡ／Ｄ変換部の上限値に等しくなった場合は、管理部が、記憶部に記憶している輝度情報とそのサンプリング時刻とに基づいて加算すべき輝度情報を推定することで、加算部により光強度情報を精度よく算出することができる。したがって、Ａ／Ｄ変換部の上限値を超えるような過大な光が光検出部に入射した場合であっても、光検出部を確実に保護することができる。

上記第３態様においては、前記画像生成部が、画素毎に変換した輝度情報を所定のピクセルクロックで加算して画像を生成し、前記情報算出部が、前記光検出部から一定時間内に出力された光強度信号を前記画像生成部の前記ピクセルクロックよりも長い周期で加算した加算値を前記光強度情報とする。
このように構成することで、光検出部から一定時間内に出力された光強度信号の総量を的確に算出することができる。

上記各態様においては、前記制御部が、前記光検出部に印加する駆動電圧をＯＮ／ＯＦＦすることとしてもよい。
このように構成することで、光検出部に印加する駆動電圧を制御部によってＯＦＦするだけで、光検出部に光が入射するのを防ぐことができる。

上記各態様においては、前記制御部が、前記光検出部に入射しようとする光を遮断可能な遮断部材を挿脱することとしてもよい。
このように構成することで、光検出部に印加する駆動電圧をＯＦＦすることなくＯＮしたままで、光検出部に光が入射するのを防ぐことができる。

本発明によれば、検出器の劣化を防止しつつ広いダイナミックレンジの輝度情報を取得して観察することができるという効果を奏する。

本発明の第１実施形態に係る顕微鏡システムの概略構成図である。図１の光検出回路の詳細を示すブロック図である。図１の顕微鏡システムによる光検出回路への入力電流の強度と時間の関係、ＰＣに送られる電圧信号の画像輝度値と時間との関係、および、検出器から一定時間内に出力される光強度信号の総量に対応する積分値と時間との関係を説明するグラフである。本発明の第１実施形態の変形例に係る顕微鏡システムの光検出回路の詳細を示すブロック図である。本発明の第２実施形態に係る顕微鏡システムの光検出回路の詳細を示すブロック図である。本発明の第３実施形態に係る顕微鏡システムの光検出回路の詳細を示すブロック図である。

〔第１実施形態〕
以下、本発明の第１実施形態に係る顕微鏡システム（走査型レーザ顕微鏡）について、図面を参照して説明する。
本実施形態に係る顕微鏡システム１００は、図１に示されるように、レーザ光を発する光源ユニット（光源）１０と、光源ユニット１０から発せられたレーザ光を標本Ｓに照射する顕微鏡装置２０と、顕微鏡装置２０によりレーザ光が照射された標本Ｓにおいて発生する蛍光を検出する光検出システム４０と、光検出システム４０により蛍光が検出された標本Ｓの画像を表示するモニタ４９とを備えている。

光源ユニット１０としては、例えば、多波長レーザ光源が用いられる。光源ユニット１０は、レーザ光を発生するスーパコンティニュムレーザ等の光源部１１Ａ，１１Ｂと、光源部１１Ａから発生されたレーザ光を反射する反射ミラー１３と、反射ミラー１３により反射されたレーザ光を透過する一方、光源部１１Ｂから発生されたレーザ光を反射し、これらの各レーザ光の光路を合成するダイクロイックミラー（ＤＭ）１５と、ダイクロイックミラー１５により光路が合成されたレーザ光を調光する音響光学素子のような調光部１７とを備えている。

この光源ユニット１０は、レーザ光源部１１Ａ，１１Ｂからレーザ光を発生させて調光部１７により各レーザ光の波長選択および強度調整を制御することによって、所定の波長域で所定の強度のレーザ光を発することができるようになっている。

顕微鏡装置２０は、標本Ｓを載置するステージ３１を有する顕微鏡本体３０と、光源ユニット１０から発せられたレーザ光を反射して標本Ｓ上で走査させるスキャナ（走査部）２１と、スキャナ２１により反射されたレーザ光を集光する瞳投影レンズ（ＰＬ）２３と、瞳投影レンズ２３により集光されたレーザ光を顕微鏡本体３０に向けて反射する反射ミラー２５とを備えている。

スキャナ２１としては、例えば、ガルバノミラー、共振スキャナ、または、ＡＯＤ（Ａｃｏｕｓｔｏ−ＯｐｔｉｃＤｅｆｌｅｃｔｏｒ、音響光学偏向素子）等を用いることができる。

顕微鏡本体３０は、ステージ３１の他に、反射ミラー２５により入射するレーザ光を平行光に変換する結像レンズ（ＴＬ）３３と、結像レンズ３３により平行光に変換されたレーザ光を標本Ｓに照射し、標本Ｓにおいて発生する蛍光を集光する複数の対物レンズ３５と、これら複数の対物レンズ３５を保持し、レーザ光の光路上に対物レンズ３５を択一的に配置可能なレボルバ３７とを備えている。

また、顕微鏡装置２０には、光源ユニット１０からのレーザ光を反射してスキャナ２１に入射させる一方、対物レンズ３５により集光されてレーザ光の光路を逆方向に戻る蛍光を透過させてレーザ光の光路から分岐させるダイクロイックミラー（ＤＭ）２７と、ダイクロイックミラー２７を透過した蛍光を集光する集光レンズ（ＣＦＬ）２９と、集光レンズ２９により集光された蛍光の一部を通過させるピンホール（ＰＨ）３７と、ピンホール３７を通過した蛍光を平行光に変換して光検出システム４０に入射させるコリメートレンズ３９とを備えている。

光検出システム４０は、コリメートレンズ３９により平行光に変換された蛍光を検出して電流信号（光強度信号）を出力する検出器（光検出部）４１と、検出器４１から出力される電流信号を処理する光検出回路５０と、光源ユニット１０やスキャナ２１、検出器４１および光検出回路５０等を制御する制御装置４３と、標本Ｓの画像を生成するＰＣ（ＰｅｒｓｏｎａｌＣｏｍｐｕｔｅｒ、画像生成部）４５とを備えている。

この光検出システム４０には、ユーザがＰＣ４５を操作する指示を入力する入力部４７と、ＰＣ４５により生成された画像を表示するモニタ４９とが接続されている。

検出器４１としては、例えば、ＰＭＴ（ＰｈｏｔｏＭｕｌｔｉｐｌｉｅｒＴｕｂｅ）やＨＰＤ（ＨｙｂｒｉｄＰｈｏｔｏＤｅｔｅｃｔｏｒ）を用いることができる。この検出器４１は、検出した光を光電変換してその光量に応じた大きさの電流信号を出力するようになっている。

光検出回路５０は、図２に示すように、検出器４１から送られてくる電流信号を電圧信号に変換する増幅器５１と、増幅器５１により変換された電圧信号を積分して積分値を出力する第１積分回路６０と、第１積分回路６０から出力された積分値をＡ／Ｄ変換するＡＤコンバータ（ＡＤＣ）５３と、増幅器５１により変換された電圧信号を積分して積分値（光強度情報）を出力する第２積分回路（情報算出部）７０と、第２積分回路７０から出力された積分値と所定の閾値（Ｒｅｆ）とを比較するコンパレータ（閾値判定部）５５と、検出器４１にＨＶを印加する高圧電源５７とを備えている。
コンパレータ５５には、所定の閾値として、例えば、検出器４１の劣化が促進される光の総量の上限値を設定する。

これらの積分回路６０，７０は、増幅器５１から送られてくる電圧信号に応じた電荷を蓄積可能なコンデンサ６１，７１と、コンデンサ６１，７１による電荷の蓄積と蓄積した電荷の放電とを切り替えるスイッチ６３，７３と、オペアンプ等の積分器（増幅回路）６５，７５とを備えている。

第１積分回路６０のスイッチ６３は、所定の制御信号（以下、「第１リセットＣＬＫ」という。）によってＯＮ／ＯＦＦ（閉／開）するようになっている。
第２積分回路７０のスイッチ７３は、第１リセットＣＬＫとは異なる所定の制御信号（以下、「第２リセットＣＬＫ」という。）によってＯＮ／ＯＦＦするようになっている。

これらのスイッチ６３，７３がＯＦＦした状態では、増幅器５１から送られてくる電圧信号に応じた電荷がコンデンサ６１，７１に蓄積され、コンデンサ６１，７１に蓄積されている電荷に応じた積分値が出力されるようになっている。一方、スイッチ６３，７３がＯＮした状態では、コンデンサ６１，７１に蓄積されている電荷が放電され、積分値出力がリセットされるようになっている。

第２積分回路７０は、第２リセットＣＬＫに従って電圧信号を積分することにより、検出器４１から一定時間内に出力された光強度信号の総量に対応する光強度情報としてその電圧信号の積分値をコンパレータ５５に送るようになっている。また、第２積分回路７０は、スキャナ２１により標本Ｓ上でレーザ光が走査される走査期間と、光源ユニット１０からのレーザ光の発生を停止してレーザ光の走査線を元の位置へ戻す帰線期間とを通して積分処理を行うようになっている。

積分器６５，７５は、反転入力端子（−）と非反転入力端子（＋）と出力端子とを備えている。積分器６５，７５の反転入力端子（−）と出力端子との間にはコンデンサ６１，７１およびスイッチ６３，７３がそれぞれ互いに並列に接続されている。非反転入力端子（＋）は接地されている。

制御装置４３は、顕微鏡装置３０を制御する顕微鏡制御部４３Ａと、光検出回路を制御する検出回路制御部４３Ｂとを備えている。
顕微鏡制御部４３Ａは、レーザ光源ユニット１０によるレーザ光の発生のＯＮ／ＯＦＦを制御したり、スキャナ２１の揺動角度を制御したりするようになっている。顕微鏡制御部４３Ａは、例えば、スキャナ２１の帰線期間中は、レーザ光源ユニット１０によるレーザ光の発生をＯＦＦするようになっている。

検出回路制御部４３Ｂは、ＡＤコンバータ５３から送られてくる電圧信号をスキャナ２１の走査位置に対応する画素毎に輝度情報に変換する演算処理部（画像生成部）８１と、第１積分回路６０に送る第１リセットＣＬＫを出力する第１リセット部８３と、第２積分回路７０に送る第２リセットＣＬＫを出力する第２リセット部８５と、コンパレータ５５の比較結果に基づいて、高圧電源５７による検出器４１へのＨＶの印加のＯＮ／ＯＦＦを切り替える高圧制御部（制御部）８７とを備えている。

演算処理部８１は変換した輝度情報をＰＣ４５に送るようになっている。
第１リセット部８３は、所定のピクセルクロックで第１リセットＣＬＫを出力し、１ピクセルごとにスイッチ６３のＯＮ／ＯＦＦを切り替えるようになっている。
第２リセット部８５は、第１リセットＣＬＫのピクセルクロックよりも長い周期、例えば、１０秒〜３０秒間隔で第２リセットＣＬＫを出力し、スイッチ６３のＯＮ／ＯＦＦの切り替えタイミングよりも長い時間間隔でスイッチ７３のＯＮ／ＯＦＦを切り替えるようになっている。

高圧制御部８７は、コンパレータ５５の比較結果に基づいて高圧制御信号を出力し、第２積分回路７０から出力される積分値が所定の閾値以下の場合は高圧電源５７をＯＮのまま維持し、その積分値が所定の閾値を超えている場合は高圧電源５７をＯＦＦするようになっている。

ＰＣ４５は、演算処理部８１から送られてくる輝度情報を１ピクセルごとに積算して標本Ｓの画像を生成するようになっている。ＰＣ４５により生成された画像は、モニタ４９に表示されるようになっている。

このように構成された顕微鏡システム１００の作用について説明する。
本実施形態に係る顕微鏡システム１００により標本Ｓの画像を取得するには、まず、ステージ３１に標本Ｓを載置し、高圧制御部８７により高圧電源５７をＯＮして検出器４１にＨＶを印加させるとともに、光源ユニット１０から所定の波長域で所定の強度のレーザ光を発生させる。

光源ユニット１０から発せられたレーザ光は、ダイクロイックミラー２７により反射された後、スキャナ２１により反射されて瞳投影レンズ２３により集光され、反射ミラー２５および結像レンズ３３を介して、対物レンズ３５により標本Ｓに照射される。

レーザ光が照射されることにより標本Ｓにおいて蛍光が発生すると、蛍光は対物レンズ３５により集光され、結像レンズ３３、反射ミラー２５、瞳投影レンズ２３、スキャナ２１を介してレーザ光の光路を戻り、ダイクロイックミラー２７を透過してレーザ光の光路から分離される。

ダイクロイックミラー２７を透過した蛍光は、集光レンズ２９により集光され、その内の標本Ｓにおける対物レンズ３５の焦点位置において発生した蛍光のみがピンホール３７を通過する。ピンホール３７を通過した蛍光は、コリメートレンズ３９により平行光に変換され、検出器４１により検出される。

検出器４１により光が検出されると、検出された光の量に応じた大きさの電流信号が検出器４１から出力され、増幅器５１により電流信号が電圧信号に変換される。増幅器５１により変換された電圧信号は第１積分回路６０および第２積分回路７０に送られる。

第１積分回路６０においては、第１リセット部８３から送られてくる第１リセットＣＬＫに基づいて、１ピクセルごとにスイッチ６３がＯＮ／ＯＦＦする。スイッチ６３がＯＦＦすると、増幅器５１から送られてくる電圧信号に応じた電荷がコンデンサ６１により蓄積され、その蓄積した電荷に応じた積分値が出力される。スイッチ６３がＯＮすると、コンデンサ６１に蓄積された電荷は放電されて、積分値出力がリセットされる。

第１積分回路６０から出力された電圧信号の積分値は、ＡＤコンバータ５３によりＡ／Ｄ変換されて検出回路制御部４３Ｂに送られ、演算処理部８１によりスキャナ２１の走査位置に対応する画素毎に輝度情報に変換されてＰＣ４５に送られる。次いで、ＰＣ４５により、その輝度情報が１ピクセルごとに積算されて標本Ｓの画像が生成される。ＰＣ４５により生成された画像はモニタ４９に表示される。

第２積分回路７０においては、第２リセット部８５から送られてくる第２リセットＣＬＫに基づいて、スイッチ６３のＯＮ／ＯＦＦの切り替えタイミングよりも長い時間間隔でスイッチ７３がＯＮ／ＯＦＦする。スイッチ７３がＯＦＦすると、増幅器５１から送られてくる電圧信号に応じた電荷がコンデンサ７１により蓄積され、その蓄積した電荷に応じた積分値が出力される。スイッチ７３がＯＮすると、コンデンサ７１に蓄積された電荷は放電され、積分値出力がリセットされる。

第２積分回路７０から出力された積分値は、コンパレータ５５により、所定の閾値として設定されている検出器４１の劣化が促進される光の総量の上限値と比較される。
例えば、図３に示すように、検出器４１から出力される電流信号、すなわち、増幅器５１に入力される入力電流の強度が強く、ＡＤコンバータ５３から出力される電圧信号の積分値における画像輝度値が画像の飽和レベルを超えると、ＰＣ４５により生成される画像が飽和する。同図において、丸（○）、四角（□）および三角（△）は、それぞれピクセルの画像輝度値を示している。

このとき、検出器４１から出力される電流信号の画像輝度値が画像飽和レベルを超えるほど高くても、画像飽和レベルを超えたのが瞬間的であり、第２積分回路７０から出力される積分値が所定の閾値以下であれば、高圧制御部８７により高圧電源５７がＯＮのまま維持され、検出器４１による光の検出が続けられる。

一方、仮に、第２リセットＣＬＫの周期で第２積分回路７０の積分値出力がリセットされるまでの間に、検出器４１に過大な光が入射され続けることにより、第２積分回路７０から出力される積分値が所定の閾値を超えると、高圧制御部８７により高圧電源５７がＯＦＦされ、検出器４１による光の検出が停止する。

以上説明したように、本実施形態に係る顕微鏡システム１００によれば、検出器４１から一定時間内に出力された電流信号の総量に対応する積分値を第２積分回路７０により算出し、算出した積分値が所定の閾値を超えた場合に検出器４１による光の検出を高圧制御部８７により停止させることで、所定の閾値以上の量の光による検出器４１内での光電子増加を防ぎ、検出器４１へのダメージを防ぐことができる。

したがって、光電子増倍管のような検出器は一定時間内に入射する光の総量が一定量を超えると劣化が促進する傾向があるが、検出器４１の劣化が促進される光の総量の上限値を所定の閾値として設定したことで、一定時間内に検出器４１に過大な光が入射され続けて検出器４１の劣化が促進するのを防ぐことができる。

また、一定時間内に出力された電流信号の総量に対応する積分値を光強度情報として用いることで、強度が強い一部の電流信号に影響されずに検出器４１による光の検出を制御して画像を取得することができる。例えば、顕微鏡視野内の一部が高濃度に蛍光試薬で染色されている場合の観察において、検出器４１から瞬間的に強度な電流信号が出力されても、検出器４１による光の検出を停止させるということがない。

また、第２積分回路７０において、スキャナ２１の走査期間と帰線期間とを通して積分処理を行うことで、検出器４１の劣化の促進を防止するのに正確な閾値を設定することができる。
したがって、本実施形態によれば、検出器４１の劣化を防止しつつ、広いダイナミックレンジの輝度情報を取得して標本Ｓを観察することができる。

本実施形態は以下のように変形することができる。
本実施形態においては、増幅器５１により変換した電圧信号を第１積分回路６０および第２積分回路７０によりそれぞれ積分することとしたが、これに代えて、例えば、図４に示すように、検出器４１から出力された電流信号を電圧信号に変換する前に第１積分回路６０により積分することとしてもよい。

そして、第１積分回路６０により積分した積分値は、第２積分回路７０により積分してコンパレータ５５に送るとともに、増幅器５１により電圧信号に変換してＡＤコンバータ５３に送ることとしてもよい。
このようにすることで、検出器４１から出力された直後の電流信号を積分するので、Ｓ／Ｎ比が高い画像を生成することができる。

本実施形態においては画像を取得している状態、つまり第１リセットＣＬＫが動作している場合を記載しているが、走査を停止している状態、つまり第１リセットＣＬＫが動作していない場合においても第２積分回路７０は動作し続けられるため、同様の保護動作を実施することができる。

〔第２実施形態〕
次に、本発明の第２実施形態に係る顕微鏡システム（走査型レーザ顕微鏡）について図面を参照して説明する。
本実施形態に係る顕微鏡システム１００は、検出器４１から一定時間内に出力された光強度信号の総量に対応する光強度情報として、電圧信号を積分した積分値に代えて電圧信号を加算した加算値を用いる点で第１実施形態と異なる。
以下、第１実施形態に係る顕微鏡システム１００と構成を共通する箇所には、同一符号を付して説明を省略する。

本実施形態に係る光検出回路１５０は、図５に示すように、検出器４１から送られてくる電流信号を電圧信号に変換する増幅器５１と、増幅器５１により変換された電圧信号をＡ／Ｄ変換するＡＤコンバータ５３と、検出器４１にＨＶを印加する高圧電源５７とを備えている。ＡＤコンバータ５３によりＡ／Ｄ変換された電圧信号は検出回路制御部１４３Ｂに送られるようになっている。

検出回路制御部１４３Ｂは、ＡＤコンバータ５３から送られてくる電圧信号を加算する第１加算器１６５および第２加算器（情報算出部）１７５と、第１加算器１６５により加算された加算値をスキャナ２１の走査位置に対応付けて１ピクセルごとに画像輝度データに変換するデータ変換部（画像生成部）１８１と、第２加算器１７５により加算された加算値（光強度情報）を所定の閾値（Ｒｅｆ）とを比較するコンパレータ（閾値判定部）１５５と、第１加算器１６５に第１リセットＣＬＫを送る第１リセット部８３と、第２加算器１７５に第２リセットＣＬＫを送る第２リセット部８５とを備えている。

第１加算器１６５は、第１リセット部８３から送られてくる第１リセットＣＬＫにより、加算した電圧信号の加算値をリセットするようになっている。
第２加算器１７５は、第２リセット部８５から送られてくる第２リセットＣＬＫにより、加算した電圧信号の加算値をリセットするようになっている。

第１リセット部８３は、所定のピクセルクロックで第１リセットＣＬＫを出力し、１ピクセルごとに第１加算器１６５をリセットするようになっている。
第２リセット部８５は、第１リセットＣＬＫのピクセルクロックよりも長い周期、例えば、１０秒〜３０秒間隔で第２リセットＣＬＫを出力し、第１加算器１６５のリセットタイミングよりも長い時間間隔で第２加算器１７５をリセットするようになっている。

このように構成された顕微鏡システム１００の作用について説明する。
本実施形態に係る顕微鏡システム１００により標本Ｓの画像を取得する場合は、検出器４１から出力される電流信号が増幅器５１により電圧信号に変換され、その電圧信号がＡＤコンバータ５３によりＡ／Ｄ変換されて検出回路制御部１４３Ｂに送られる。

検出回路制御部１４３Ｂに送られた電圧信号は第１加算器１６５および第２加算器１７５に入力される。第１加算器１６５においては、１ピクセルごとに電圧信号が加算されてその加算値がデータ変換部１８１に送られ、第１リセット部８３から送られてくる第１リセットＣＬＫにより加算値がリセットされる。

次いで、データ変換部１８１により、第１加算器１６５から送られてくる加算値がスキャナ２１の走査位置に対応付けられて１ピクセルごとに画像輝度データに変換され、ＰＣ４５に送られる。これにより、ＰＣ４５において、入力された画像輝度データが１ピクセルごとに積算されて標本Ｓの画像が生成され、モニタ４９に表示される。

第２加算器１７５においては、第１加算器１６５のリセットタイミングよりも長い時間間隔で電圧信号が加算されてその加算値がコンパレータ１５５に送られ、第２リセット部８５から出力される第２リセットＣＬＫにより加算値がリセットされる。

次いで、コンパレータ１５５により、第２加算器１７５から送られてくる加算値が、所定の閾値として設定されている検出器４１の劣化が促進される光の総量の上限値と比較される。そして、高圧制御部８７により、コンパレータ１５５の比較結果に基づいて高圧電源５７のＯＮ／ＯＦＦが切り替えられる。

以上説明したように本実施形態に係る顕微鏡システム１００によれば、検出器４１から一定時間内に出力された光強度信号の総量に対応する光強度情報として電圧信号を積分した積分値を用いる場合と同様に、検出器４１から一定時間内に出力された電流信号の総量を的確に算出し、検出器４１の劣化を防止しつつ広いダイナミックレンジの輝度情報を取得して観察することができる。

本実施形態は以下のように変形することができる。
本実施形態の一変形例としては、増幅器５１とＡＤコンバータ５３との間の光路上に、電圧信号からノイズを除去するローパスフィルタ（図示略）を配置することとしてもよい。この場合、検出回路制御部１４３Ｂが第１加算器１６５を備えず、ＡＤコンバータ５３から出力された電圧信号を加算せずにデータ変換部１８１により画像輝度データに変換することとしてもよい。

〔第３実施形態〕
次に、本発明の第３実施形態に係る顕微鏡システム（走査型レーザ顕微鏡）について図面を参照して説明する。
本実施形態に係る顕微鏡システム１００は、図６に示すように、光検出回路２５０が、情報算出部として、第２積分回路７０に代えて、ＡＤコンバータ５３から出力されたデジタル信号の積分値（第１輝度情報）を処理する信号処理部２７０と、信号処理部２７０により処理された積分値を加算して加算値（第２輝度情報）を光強度情報として出力する加算器（加算部）２７５を備える点で第１実施形態と異なる。
以下、第１実施形態に係る顕微鏡システム１００と構成を共通する箇所には、同一符号を付して説明を省略する。

Ａ／Ｄコンバータ５３は、所定のピクセルクロックの整数分の１のサンプリング周期で積分値をＡ／Ｄ変換し、デジタル信号の積分値を演算処理部８１および信号処理部２７０に送るようになっている。Ａ／Ｄコンバータ５３のサンプリング周期は信号処理部２７０にも送られるようになっている。
第１リセット部８３は、所定のピクセルクロックで出力した第１リセットＣＬＫを積分回路６０および信号処理部２７０に送るようになっている。

信号処理部２７０は、Ａ／Ｄコンバータ５３から送られてくるデジタル信号の積分値の内、加算器２７５により加算すべき加算用積分値を決定する管理部２７１と、Ａ／Ｄコンバータ５３から送られてきた積分値とそのサンプリング時刻とを記憶する記憶部２７３とを備えている。

管理部２７１は、Ａ／Ｄコンバータ５３によりＡ／Ｄ変換可能な上限値を記憶している。この管理部２７１は、サンプリング周期ごとにＡ／Ｄコンバータ５３により変換されたデジタル信号の積分値をＡ／Ｄコンバータ５３の上限値と比較するようになっている。

また、管理部２７１は、比較の結果、積分値がＡ／Ｄコンバータ５３の上限値よりも小さいと判定した場合は、その積分値とそのサンプリング時刻とを対応付けて記憶部２７３に時系列に記憶させるようになっている。また、管理部２７１は、比較の結果、積分値がＡ／Ｄコンバータ５３の上限値に等しい場合は、その積分値およびサンプリング時刻を記憶部２７３に記憶させないようになっている。

また、管理部２７１は、Ａ／Ｄコンバータ５３により第１リセットＣＬＫに同期するタイミングでＡ／Ｄ変換された積分値と上限値とを比較した場合に、積分値がＡ／Ｄコンバータ５３の上限値よりも小さいときはその積分値を加算用積分値として決定して加算器２７５に送るようになっている。

また、管理部２７１は、第１リセットＣＬＫに同期するタイミングでＡ／Ｄ変換された積分値と上限値とを比較した場合に、積分値がＡ／Ｄコンバータ５３の上限値に等しいときは、記憶部２７３に記憶している積分値とそのサンプリング時刻とに基づいて、Ａ／Ｄコンバータ５３の上限値を超える実際のデジタル信号の積分値を推定するようになっている。そして、管理部２７１は、その推定値を加算用積分値として決定して加算器２７５に送るようになっている。例えば、管理部２７１は、サンプリング周期ごとに時系列に記憶部２７３に記憶している積分値の傾きから推定値を算出するようになっている。

管理部２７１による加算用積分値としての推定値の計算方法としては、例えば、最小二乗法や比例式で算出する方法などを採用してもよい。比例式で算出する方法については、例えば、特開２００５−３３８４６５号公報の図３に記載されている方法などがある。この方法において、Ａ／Ｄコンバータ５３の出力が飽和した時のサンプリング数をＳＡＭＰＬＩＭ、１ピクセルあたりのサンプリング数をＳＡＭＰＭＡＸ、Ａ/Ｄコンバータ５３の閾値をＶＭＡＸ、推定値をＶＬＡＳＴとすると、ＶＬＡＳＴ＝ＶＭＡＸ×ＳＡＭＰＭＡＸ／ＳＡＭＰＬＩＭで算出することができる。

また、管理部２７１は、第１リセット部８３から送られてくる第１リセットＣＬＫにより、Ａ／Ｄコンバータ５３から入力された積分値およびそのサンプリング時刻をリセットするようになっている。
記憶部２７３も同様に、第１リセットＣＬＫにより、記憶した積分値およびそのサンプリング時刻をリセットするようになっている。

加算器２７５は、管理部２７１から送られてくるデジタル信号の積分値をピクセルクロックの整数倍の周期で加算して、加算値をコンパレータ５５に送るようになっている。また、加算器２７５は、第２リセット部８５から送られてくる第２リセットＣＬＫにより、加算した電圧信号の加算値をリセットするようになっている。

コンパレータ５５は、加算器２７５により加算された加算値とデジタル化した所定の閾値（Ｒｅｆ）とを比較するようになっている。

このように構成された顕微鏡システム１００の作用について説明する。
本実施形態に係る顕微鏡システム１００により標本Ｓの画像を取得する場合は、第１積分回路６０から出力された電圧信号の積分値がＡ／Ｄコンバータ５３によりサンプリング周期でデジタル信号に変換されて、演算処理部８１と信号処理部２７０とに送られる。

信号処理部２７０においては、管理部２７１により、サンプリング周期ごとにＡ／Ｄコンバータ５３により変換されたデジタル信号の積分値をＡ／Ｄコンバータ５３の上限値と比較される。そして、管理部２７１により積分値が上限値よりも小さいと判断されると、記憶部２７３によりその積分値とそのサンプリング時刻とが対応付けられて時系列に記憶される。第１リセット部８３から第１リセットＣＬＫが送られてくるまで、信号処理部２７０によりこの処理が繰り返される。

第１リセット部８３から第１リセットＣＬＫが出力されると、管理部２７１において、Ａ／Ｄコンバータ５３により第１リセットＣＬＫに同期して変換された積分値と上限値とが比較される。この場合において、積分値が上限値よりも小さいと、管理部２７１によりその積分値が加算用積分値として決定されて加算器２７５に送られる。

一方、第１リセットＣＬＫに同期して変換された積分値がＡ／Ｄコンバータ５３の上限値に等しくなると、管理部２７１により記憶部２７３に記憶している積分値とサンプリング時刻とに基づいてＡ／Ｄコンバータ５３の上限値を超える実際のデジタル信号の積分値が推定される。そして、管理部２７１により、その推定値が加算用積分値として決定されて加算器２７５に送られる。

次いで、加算器２７５により、ピクセルクロックの整数倍の周期で、管理部２７１から送られてくる積分値が加算され、その加算値がコンパレータ５５に送られる。加算器２７５は、第２リセット部８５から出力される第２リセットＣＬＫにより加算値がリセットされる。

次いで、コンパレータ５５により、加算器２７５から送られてくる加算値が、所定の閾値として設定されている検出器４１の劣化が促進される光の総量の上限値と比較される。そして、高圧制御部８７により、コンパレータ５５の比較結果に基づいて高圧電源５７のＯＮ／ＯＦＦが切り替えられる。

したがって、本実施形態に係る顕微鏡システム１００によれば、画像を生成する輝度情報を用いて信号処理部２７０および加算器２７５により光強度情報を算出することで、光強度信号を積算する回路が１つで済み、構成を簡略化することができる。

この場合において、Ａ／Ｄコンバータ５３によりＡ／Ｄ変換可能な上限値を超えるような過大な光が検出器４１に入射すると、Ａ／Ｄコンバータ５３の出力が飽和してしまい積分値の正確なデジタル信号が得られない。これに対し、本実施形態に係る顕微鏡システム１００によれば、Ａ／Ｄコンバータ５３によりピクセルクロックでＡ／Ｄ変換された積分値がＡ／Ｄコンバータ５３の上限値に等しくなった場合は、管理部２７１が、記憶部２７３に記憶している積分値とサンプリング時刻とに基づいて加算用積分値を推定する。これにより、Ａ／Ｄコンバータ５３の上限値を超えるような過大な光が検出器４１に入射した場合であっても、加算器２７５により光強度情報を精度よく算出して検出器４１を確実に保護することができる。

本実施形態は以下のように変形することができる。
すなわち、本実施形態においては、増幅器５１により変換した電圧信号を第１積分回路６０により積分することとしたが、これに代えて、第１実施形態の変形例と同様に、検出器４１から出力された電流信号を積分回路６０により積分してから増幅器５１で電圧信号に変換することしてもよい。
また、本実施形態においては、信号処理部２７０、加算器２７５およびコンパレータ５５が、検出回路制御部４３Ｂに含まれることとしてもよい。

以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。例えば、本発明を上記各実施形態および変形例に適用したものに限定されることなく、これらの実施形態および変形例を適宜組み合わせた実施形態に適用してもよく、特に限定されるものではない。

また、上記各実施形態においては、第２積分回路７０から出力された積分値または第２加算器から出力された加算値が所定の閾値を超えた場合に、検出器４１に印加するＨＶを高圧制御部８７によりＯＦＦすることとした。これに代えて、例えば、第２積分回路７０から出力された積分値または第２加算器から出力された加算値が所定の閾値を超えた場合に検出器４１に入射しようとする光を遮断することとしてもよい。

具体的には、検出器４１に入射しようとする光を遮断可能なシャッタ（遮断部材、図示略）と、シャッタを挿脱する制御部（図示略）とを採用することとしてもよい。そして、コンパレータ５５，１５５により積分値または加算値が所定の閾値を超えたと判定された場合に、制御部がシャッタを挿入して検出器４１に入射しようとする光を遮断させることとしてもよい。

このようにすることで、検出器４１にＨＶを印加する高圧電源５７をＯＦＦすることなく、検出器４１に光が入射するのを防ぐことができる。シャッタは、例えば、光検出器４１が備えることとしてもよいし、光検出器４１の手前に挿脱可能に配置することとしてもよい。

また、上記各実施形態においては、コンパレータ５５，１５５に設定される所定の閾値として、検出器４１の劣化が促進される光の総量の上限値を例示して説明したが、検出器４１の劣化が促進するのを防ぐことができればよく、これに限定されるものではない。

１０光源ユニット（光源）
２１スキャナ（走査部）
４１検出器（光検出部）
４５ＰＣ（画像生成部）
５５、１５５コンパレータ（閾値判定部）
７０第２積分回路（情報算出部）
８１演算処理部（画像生成部）
８７高圧制御部（制御部）
１００顕微鏡システム（走査型レーザ顕微鏡）
１７５第２加算器（情報算出部）
１８１データ変換部（画像生成部）
２７１管理部
２７３記憶部
２７５加算器（加算部）

Claims

光源から発せられたレーザ光を標本上で２次元的に走査させる走査部と、
該走査部によりレーザ光が走査された前記標本からの光を検出し、検出した光の輝度に相当する光強度信号を出力する光検出部と、
該光検出部から出力された光強度信号を前記走査部の走査位置に対応する画素毎に輝度情報に変換して、前記標本の画像を生成する画像生成部と、
前記光検出部から一定時間内に出力された光強度信号の総量に対応する光強度情報を算出する情報算出部と、
該情報算出部により算出された前記光強度情報が所定の閾値を超えたか否かを判定する閾値判定部と、
該閾値判定部により前記光強度情報が前記所定の閾値を超えたと判定された場合に、前記光検出部による光の検出を停止させる制御部とを備え、
前記画像生成部が、画素毎に変換した輝度情報を所定のピクセルクロックで積算して画像を生成し、
前記情報算出部が、前記光検出部から一定時間内に出力された光強度信号を前記画像生成部の前記ピクセルクロックよりも長い周期で積分した積分値を前記光強度情報とする走査型レーザ顕微鏡。
前記情報算出部が、前記走査部により前記標本上でレーザ光が走査される走査期間と前記光源からのレーザ光の発生を停止してレーザ光の走査線を元の位置へ戻す帰線期間とを通して積分処理を行う請求項１に記載の走査型レーザ顕微鏡。
光源から発せられたレーザ光を標本上で２次元的に走査させる走査部と、
該走査部によりレーザ光が走査された前記標本からの光を検出し、検出した光の輝度に相当する光強度信号を出力する光検出部と、
該光検出部から出力された光強度信号を前記走査部の走査位置に対応する画素毎に所定のピクセルクロックで積算した輝度情報に変換して、前記標本の画像を生成する画像生成部と、
前記輝度情報を複数ピクセルクロック分加算し、前記光検出部から一定時間内に出力された光強度信号の総量に対応する光強度情報を算出する情報算出部と、
該情報算出部により算出された前記光強度情報が所定の閾値を超えたか否かを判定する閾値判定部と、
該閾値判定部により前記光強度情報が前記所定の閾値を超えたと判定された場合に、前記光検出部による光の検出を停止させる制御部とを備え、
前記画像生成部が、所定のピクセルクロックの整数分の１のサンプリング周期で前記輝度情報をデジタル信号に変換するＡ／Ｄ変換部を備え、
前記情報算出部が、前記サンプリング周期ごとに前記Ａ／Ｄ変換部により変換された前記輝度情報と該Ａ／Ｄ変換部によりＡ／Ｄ変換可能な上限値とを比較し、加算すべき輝度情報を決定する管理部と、該管理部により前記輝度情報が前記上限値よりも小さいと判定された場合に該輝度情報とそのサンプリング時刻とを対応付けて記憶する記憶部と、前記管理部により決定された前記加算すべき輝度情報を前記ピクセルクロックよりも長い周期で加算する加算部とを備え、
前記管理部が、各前記ピクセルクロックにおける比較の結果、前記輝度情報が前記上限値よりも小さい場合にはその輝度情報を前記加算すべき輝度情報として決定し、前記輝度情報が前記上限値に等しい場合には、前記記憶部に記憶されている前記輝度情報とそのサンプリング時刻とに基づく推定値を前記加算すべき輝度情報として決定する走査型レーザ顕微鏡。
光源から発せられたレーザ光を標本上で２次元的に走査させる走査部と、
該走査部によりレーザ光が走査された前記標本からの光を検出し、検出した光の輝度に相当する光強度信号を出力する光検出部と、
該光検出部から出力された光強度信号を前記走査部の走査位置に対応する画素毎に輝度情報に変換して、前記標本の画像を生成する画像生成部と、
前記光検出部から一定時間内に出力された光強度信号の総量に対応する光強度情報を算出する情報算出部と、
該情報算出部により算出された前記光強度情報が所定の閾値を超えたか否かを判定する閾値判定部と、
該閾値判定部により前記光強度情報が前記所定の閾値を超えたと判定された場合に、前記光検出部による光の検出を停止させる制御部とを備え、
前記画像生成部が、画素毎に変換した輝度情報を所定のピクセルクロックで加算して画像を生成し、
前記情報算出部が、前記光検出部から一定時間内に出力された光強度信号を前記画像生成部の前記ピクセルクロックよりも長い周期で加算した加算値を前記光強度情報とする走査型レーザ顕微鏡。
前記制御部が、前記光検出部に印加する駆動電圧をＯＮ／ＯＦＦする請求項１、請求項３および請求項４のいずれかに記載の走査型レーザ顕微鏡。
前記制御部が、前記光検出部に入射しようとする光を遮断可能な遮断部材を挿脱する請求項１、請求項３および請求項４のいずれかに記載の走査型レーザ顕微鏡。