CN109856789B - 高内涵超分辨一体化显微成像系统及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高内涵超分辨一体化显微成像系统及方法，该系统包括：超分辨显微成像照明模块、高内涵成像照明模块、照明光路切换装置、显微成像模块及自动扫描与对焦模块；所述照明光路切换装置用于将所述超分辨显微成像照明模块或高内涵成像照明模块切换进系统中。本发明同时具备高内涵成像和超分辨显微成像两种工作模式，具备智能细胞识别筛选与快速定位功能和二维、三维超分辨图像重构功能。本发明通过大视场显微物镜对样品进行毫米级的“宏观”图像观测，系统对高通量图像进行精准分区编码、智能细胞筛选及感兴趣区域自动标记定位；随后切换到超分辨显微成像模式，采用结构光照明显微成像技术获得超分辨图像。

Description

高内涵超分辨一体化显微成像系统及方法

技术领域

本发明涉及光学成像技术领域，特别涉及一种高内涵超分辨一体化显微成像系统及方法。

背景技术

生命科学在各领域所取得的巨大进展，特别是细胞生物学的突破性成就，使生命科学在自然科学中的位置发生了革命性的变化。由于生命科学是一门实验学科，这些前沿方向的研究，莫不依赖创新的技术和仪器设备。高内涵细胞分析仪和超分辨显微成像分析仪就是当前和未来细胞生物学研究中不可或缺的高端仪器装备。对最直观清晰的成像技术发展而言，科研人员既需要使用高内涵成像技术观察细胞的宏观形态，又需要在保持细胞结构和功能完整的前提下，使用超分辨显微成像技术获取活细胞的动态超分辨微观图像。

现阶段进行细胞生物学类相关研究时，研究人员需先用高内涵分析设备对细胞组进行大视场(分辨率为几个微米)常规显微成像，筛选出感兴趣的特殊细胞，这样可以保证细胞的筛选速度；然后使用高分辨率(100nm)、小视场(几十微米)的超分辨显微系统对这些细胞进行超分辨成像，分析研究感兴趣细胞内部结构和物质分布等信息。

要完成上述实验过程，需要将待测细胞样品从高内涵大视场设备转移到超分辨小视场设备，这个过程存在两个天然缺陷：1)转移过程中无法保证活细胞培养环境一致，导致细胞生理状态变化甚至死亡；2)转移前后，缺乏对待测样品感兴趣细胞或区域的定位基准，高内涵设备标记的感兴趣细胞位置在转移后已经失效，研究人员只能根据大概位置重新寻找感兴趣细胞，耗时费力，极易导致实验失败。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种高内涵超分辨一体化显微成像系统及方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种高内涵超分辨一体化显微成像系统，包括：超分辨显微成像照明模块、高内涵成像照明模块、照明光路切换装置、显微成像模块及自动扫描与对焦模块；

所述超分辨显微成像照明模块包括超分辨显微成像光源模块和超分辨显微成像调制模块，所述超分辨显微成像调制模块用于对所述超分辨显微成像光源模块产生的光进行调制，提供超分辨显微成像光；

所述高内涵成像照明模块用于产生高内涵成像光；

所述照明光路切换装置用于将所述超分辨显微成像照明模块或高内涵成像照明模块切换进系统中。

优选的是，所述照明光路切换装置通过控制插入和抽出反射镜将所述超分辨显微成像照明模块或高内涵成像照明模块切换进系统中，以进行超分辨显微成像或高内涵成像。

优选的是，该系统还包括依次设置的第一透镜和第二透镜；当插入反射镜时，所述高内涵成像照明模块进入系统，其发出的光经所述反射镜反射，再依次经第一透镜、第二透镜后进入所述显微成像模块，进行高内涵成像；当抽出反射镜时，所述超分辨显微成像照明模块进入系统，其发出的光依次经第一透镜、第二透镜后进入所述显微成像模块，进行超分辨显微成像。

优选的是，所述高内涵成像照明模块采用高亮度LED科勒照明。

优选的是，所述显微成像模块包括机架、设置于所述机架上的物镜切换模块、二向色镜、倍率转换器、管镜和多通道sCMOS成像模块。

优选的是，所述物镜切换模块包括大视场显微物镜、大数值孔径显微物镜、升降台和三维移动台；所述大视场显微物镜和升降台均设置于所述三维移动台上，所述大数值孔径显微物镜设置于所述升降台上；

进入所述显微成像模块的光束经所述二向色镜反射后进入所述显微成像模块的主光路，然后经所述大视场显微物镜或大数值孔径显微物镜后照射到待测样品上，待测样品发出的光再透射所述二向色镜后经所述倍率转换器放大、所述管镜聚焦后进入所述多通道sCMOS成像模块。

优选的是，当进行高内涵成像时，先插入反射镜，将所述高内涵成像照明模块切换进系统中，再通过所述三维移动台将所述大视场显微物镜移动至主光路中，进行高内涵成像；

当进行超分辨显微成像时，先抽出反射镜，将所述超分辨显微成像照明模块切换进系统中，再通过所述三维移动台带动所述大视场显微物镜和大数值孔径显微物镜整体下降，并平移所述大数值孔径显微物镜将其切换至主光路中，然后通过所述升降台带动所述大数值孔径显微物镜上升至工作位置，进行超分辨显微成像。

优选的是，所述自动扫描与对焦模块包括样品台及用于驱动所述样品台移动的三维位移台；所述三维位移台包括XY平移台和Z轴压电位移台。

优选的是，该系统还包括电控模块、图像处理及数据分析模块。

优选的是，该系统的成像方法包括以下步骤：

1)先进行高内涵成像：插入所述反射镜将所述高内涵成像照明模块切换进系统中，利用所述大视场显微镜对待测样品进行毫米级图像观测；

2)系统对高通量的样品图像进行分类、识别、筛选；

3)用户选择感兴趣的细胞，系统定位感兴趣细胞区域并进行区域编码，移动样品台将感兴趣区域移至光路中心；

4)切换到超分辨成像模式：抽出所述反射镜，将所述超分辨显微成像照明模块切换进系统中，利用大数值孔径显微镜对感兴趣细胞进行二维、三维超分辨成像。

本发明的有益效果是：本发明的高内涵超分辨一体化显微成像系统同时具备高内涵成像和超分辨显微成像两种工作模式，具备智能细胞识别筛选与快速定位功能和二维、三维超分辨图像重构功能。本发明通过照明光路切换装置和物镜切换模块实现高内涵成像和超分辨显微成像模式的切换；本发明通过大视场显微物镜对样品进行毫米级的“宏观”图像观测，系统对高通量图像进行精准分区编码、智能细胞筛选及感兴趣区域自动标记定位；随后切换到超分辨显微成像模式，采用结构光照明显微成像技术获得超分辨图像。本发明的成像方法简单高效，便于操作。

附图说明

图1为本发明的高内涵超分辨一体化显微成像系统的结构示意图；

图2为本发明的超分辨显微成像照明模块的结构示意图。

附图标记说明：

1—超分辨显微成像照明模块；2—高内涵成像照明模块；3—照明光路切换装置；4—显微成像模块；5—自动扫描与对焦模块；6—第一透镜；7—第二透镜；10—超分辨显微成像光源模块；11—超分辨显微成像调制模块；30—反射镜；40—机架；41—物镜切换模块；42—二向色镜；43—倍率转换器；44—管镜；45—多通道sCMOS成像模块；50—样品台；51—XY平移台；52—Z轴压电位移台；110—准直扩束单元；111—衍射调制单元；112—空间滤波与偏振调制单元；410—大视场显微物镜；411—大数值孔径显微物镜；412—升降台；413—三维移动台。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

如图1-2所示，本实施例的一种高内涵超分辨一体化显微成像系统，包括：超分辨显微成像照明模块1、高内涵成像照明模块2、照明光路切换装置3、显微成像模块4及自动扫描与对焦模块5。

超分辨显微成像照明模块1包括超分辨显微成像光源模块10和超分辨显微成像调制模块11，超分辨显微成像调制模块11用于对超分辨显微成像光源模块10产生的光进行调制，提供超分辨显微成像光。

在一种实施例中，超分辨显微成像光源模块10包括至少1个激光器、声光调制器(AOM)、声光可调谐滤波器(AOTF)、第一半波片和第一光纤耦合器。

进一步优选的，超分辨显微成像光源模块10包括波长分别为405nm、488nm、561nm、638nm的4个激光器，其中，405nm、488nm和638nm激光器为半导体激光器，通过控制激光头电路通断控制这三路激光器的通断；561nm激光器为半导体泵浦的固体激光器，这个激光器需要一直保持开启状态，其上连接声光调制器(AOM)，利用声光调制器偏转光束方向来实现光路的通断。4个激光器产生的激光合并后依次经声光可调谐滤波器(AOTF)、第一半波片和第一光纤耦合器后经保偏单模光纤向外传输。通过控制声光可调谐滤波器实现对出射光波长和出射光强的调制，从而控制了照明光的波长与照明光强。

在一种实施例中，超分辨显微成像调制模块11包括准直扩束单元110、衍射调制单元111和空间滤波与偏振调制单元112，该模块用于产生正弦调制的照明光和实现正弦条纹的周期调节、相位平移、方向旋转。准直扩束单元110包括依次设置的第二光纤耦合器和扩束镜。衍射调制单元111包括依次设置的第二半波片、滤光片、偏振分光镜、第三半波片和空间光调制器。空间滤波与偏振调制单元112包括傅里叶透镜、第四半波片和针孔板。超分辨显微成像光源模块10出射的激发光依次经第二光纤耦合器、扩束镜、第二半波片、滤光片、偏振分光镜、第三半波片后射入空间光调制器发生衍射，从而实现对光束的亮暗二阶调制；衍射光束再经傅里叶透镜聚光、第四半波片和针孔板后射出到达照明光路切换装置3。其中，激发光经经准直扩束镜及半波片后，传输至偏振分光镜中，这一过程主要用于产生具有合适口径的线偏振光束。衍射光束经傅里叶透镜聚光并经过一个偏振调制单元，用于调制衍射光的偏振方向，保证大照明角度情况下样品面上的条纹调制度。

在一种实施例中，高内涵成像照明模块2用于产生高内涵成像光；

照明光路切换装置3用于将超分辨显微成像照明模块1或高内涵成像照明模块2切换进系统中。

在一种实施例中，照明光路切换装置3通过控制插入和抽出反射镜30将超分辨显微成像照明模块1或高内涵成像照明模块2切换进系统中，以进行超分辨显微成像或高内涵成像。

其中，该系统还包括依次设置的第一透镜6和第二透镜7；当插入反射镜30时，高内涵成像照明模块2进入系统，其发出的光经反射镜30反射，再依次经第一透镜6、第二透镜7后进入显微成像模块4，进行高内涵成像；当抽出反射镜30时，超分辨显微成像照明模块1进入系统，其发出的光依次经第一透镜6、第二透镜7后进入显微成像模块4，进行超分辨显微成像。

在一种实施例中，高内涵成像照明模块2采用高亮度LED科勒照明。

其中，显微成像模块4包括机架40、设置于机架40上的物镜切换模块41、二向色镜42、倍率转换器43、管镜44和多通道sCMOS成像模块45。物镜切换模块41包括大视场显微物镜410、大数值孔径显微物镜411、升降台412和三维移动台413；大视场显微物镜410和升降台412均设置于三维移动台413上，大数值孔径显微物镜411设置于升降台412上；三维移动台413带动大视场显微物镜410和升降台412进行三维移动，升降台412带动大数值孔径显微物镜411在三维移动台413上上下移动。

进入显微成像模块4的光束经二向色镜42反射后进入显微成像模块4的主光路，然后经大视场显微物镜410或大数值孔径显微物镜411后照射到待测样品上，待测样品发出的光再透射二向色镜42后经倍率转换器43放大、管镜44聚焦后进入多通道sCMOS成像模块45。

该系统同时具备高内涵成像模式和超分辨显微成像模式：当进行高内涵成像时，先插入反射镜30，将高内涵成像照明模块2切换进系统中，再通过三维移动台413将大视场显微物镜410移动至主光路中，进行高内涵成像；

当进行超分辨显微成像时，先抽出反射镜30，将超分辨显微成像照明模块1切换进系统中，再通过三维移动台413带动大视场显微物镜410和大数值孔径显微物镜411整体下降，并平移大数值孔径显微物镜411将其切换至主光路中，然后通过升降台412带动大数值孔径显微物镜411上升至工作位置，进行超分辨显微成像。

在一种实施例中，自动扫描与对焦模块5包括样品台50及用于驱动样品台50移动的三维位移台；三维位移台包括XY平移台51和Z轴压电位移台52。XY平移台51需具备高速扫描能力和小于3微米的高精度定位性能。Z轴压电位移台52由一个闭环压电控制器驱动控制，重复定位精度要求纳米级，用于实现显微成像自动对焦功能及三维图像采集。样品自动扫描对焦系统工作时必须有一个固定的参考坐标系，这样才能明确计算出各轴的运动量，从而完成感兴趣细胞的定位和超分辨成像。整个系统的基准轴线是滤光器至显微物镜的主光路的轴线，选取基准轴线与XY平移台51基准平面(下端面)的交点作为系统坐标系的原点，以XY平移台51的移动方位作为系统的X、Y轴，主光路轴线作为系统的Z轴，建立系统三维工作坐标系。因为XY平移台51上有样品台50的装夹基准面，所以当XY平移台51X、Y轴及Z轴压电位移台52运动回归到零位后，样品台50相对于系统原点的位置是唯一确定的。每次系统开机或者更换样品的时候，各轴将归零位，从而保证样品台50上的微孔板的每个孔位相对于系统原点坐标唯一确定，这样可以记录高内涵显微成像寻找到的感兴趣细胞所在的区域位置，然后通过移动平移台完成感兴趣细胞的定位。

该系统还包括电控模块、图像处理及数据分析模块。电控模块用于各个组件的控制，图像处理及数据分析模块能利用智能细胞识别筛选算法对高通量的样品数据进行分类、识别、筛选，以及对感兴趣细胞区域并进行区域编码等。

该高内涵超分辨一体化显微成像系统的成像方法包括以下步骤：

1)先进行高内涵成像：插入反射镜30将高内涵成像照明模块2切换进系统中，利用大视场显微镜对待测样品进行毫米级图像观测；

2)系统利用智能细胞识别筛选算法对高通量的样品图像进行分类、识别、筛选；

3)用户选择感兴趣的细胞，系统定位感兴趣细胞区域并进行区域编码，移动样品台50将感兴趣区域移至光路中心；

4)切换到超分辨成像模式：抽出反射镜30，将超分辨显微成像照明模块1切换进系统中，利用大数值孔径显微镜对感兴趣细胞进行二维、三维超分辨成像。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。

Claims (6)

1.一种高内涵超分辨一体化显微成像系统，其特征在于，包括：超分辨显微成像照明模块、高内涵成像照明模块、照明光路切换装置、显微成像模块及自动扫描与对焦模块；

所述超分辨显微成像照明模块包括超分辨显微成像光源模块和超分辨显微成像调制模块，所述超分辨显微成像调制模块用于对所述超分辨显微成像光源模块产生的光进行调制，提供超分辨显微成像光；

所述高内涵成像照明模块用于产生高内涵成像光；

所述照明光路切换装置用于将所述超分辨显微成像照明模块或高内涵成像照明模块切换进系统中；

所述照明光路切换装置通过控制插入和抽出反射镜将所述超分辨显微成像照明模块或高内涵成像照明模块切换进系统中，以进行超分辨显微成像或高内涵成像；

该系统还包括依次设置的第一透镜和第二透镜；当插入反射镜时，所述高内涵成像照明模块进入系统，其发出的光经所述反射镜反射，再依次经第一透镜、第二透镜后进入所述显微成像模块，进行高内涵成像；当抽出反射镜时，所述超分辨显微成像照明模块进入系统，其发出的光依次经第一透镜、第二透镜后进入所述显微成像模块，进行超分辨显微成像；

所述显微成像模块包括机架、设置于所述机架上的物镜切换模块、二向色镜、倍率转换器、管镜和多通道sCMOS成像模块；

该高内涵超分辨一体化显微成像系统的成像方法包括以下步骤：

1)先进行高内涵成像：插入所述反射镜将所述高内涵成像照明模块切换进系统中，利用大视场显微镜对待测样品进行毫米级图像观测；

2)系统对高通量的样品图像进行分类、识别、筛选；

3)用户选择感兴趣的细胞，系统定位感兴趣细胞区域并进行区域编码，移动样品台将感兴趣区域移至光路中心；

4)切换到超分辨成像模式：抽出所述反射镜，将所述超分辨显微成像照明模块切换进系统中，利用大数值孔径显微镜对感兴趣细胞进行二维、三维超分辨成像。

2.根据权利要求1所述的高内涵超分辨一体化显微成像系统，其特征在于，所述高内涵成像照明模块采用高亮度LED科勒照明。

3.根据权利要求2所述的高内涵超分辨一体化显微成像系统，其特征在于，所述物镜切换模块包括大视场显微物镜、大数值孔径显微物镜、升降台和三维移动台；所述大视场显微物镜和升降台均设置于所述三维移动台上，所述大数值孔径显微物镜设置于所述升降台上；

进入所述显微成像模块的光束经所述二向色镜反射后进入所述显微成像模块的主光路，然后经所述大视场显微物镜或大数值孔径显微物镜后照射到待测样品上，待测样品发出的光再透射所述二向色镜后经所述倍率转换器放大、所述管镜聚焦后进入所述多通道sCMOS成像模块。

4.根据权利要求3所述的高内涵超分辨一体化显微成像系统，其特征在于，当进行高内涵成像时，先插入反射镜，将所述高内涵成像照明模块切换进系统中，再通过所述三维移动台将所述大视场显微物镜移动至主光路中，进行高内涵成像；

当进行超分辨显微成像时，先抽出反射镜，将所述超分辨显微成像照明模块切换进系统中，再通过所述三维移动台带动所述大视场显微物镜和大数值孔径显微物镜整体下降，并平移所述大数值孔径显微物镜将其切换至主光路中，然后通过所述升降台带动所述大数值孔径显微物镜上升至工作位置，进行超分辨显微成像。

5.根据权利要求4所述的高内涵超分辨一体化显微成像系统，其特征在于，所述自动扫描与对焦模块包括样品台及用于驱动所述样品台移动的三维位移台；所述三维位移台包括XY平移台和Z轴压电位移台。

6.根据权利要求5所述的高内涵超分辨一体化显微成像系统，其特征在于，还包括电控模块、图像处理及数据分析模块。

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