CN112114422A - 基于并行STED和4Pi的三维超分辨显微成像方法和装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于并行STED和4Pi的三维超分辨显微成像方法和装置，该方法包括：照明光激光器产生宽场光，经过50％分束镜通过样品上下的两个显微物镜对样品进行照明激发；损耗光激光器产生激光进入并行受激发射损耗显微损耗模块，产生并行损耗光图样后，经过50％分束镜通过样品上下的两个显微物镜投射在样品表面；样品发出的荧光被两个显微物镜采集，通过照明光原光路返回，经二向色镜后被工业相机采集；本发明通过双物镜照明的方式，使用4Pi技术提高成像图片的轴向分辨率；虽然获得样品全部的三维信息需要通过层切实现，但是由于二维图像成像速度极快，提高了系统总体的成像速度，并且对可观测的样品深度无限制。

Description

基于并行STED和4Pi的三维超分辨显微成像方法和装置

技术领域

本发明涉及光学超分辨显微成像领域，具体地说，涉及一种基于并行受激发射损耗显微镜(STED)和4Pi的三维超分辨显微成像方法和装置。

背景技术

光学显微镜是生命科学等领域用于观察研究微观结构的重要手段。但是由于光的衍射效应，光学系统的有限孔径限制了普通光学显微镜的分辨率，无法对尺寸小于半波长的样品进行准确观测，这极大的阻碍了生命科学的发展。

为了突破这个限制，科学家们提出了多种超分辨成像技术方法，来实现对纳米级的微小结构的观察研究。单分子定位技术，包括随机光学重构显微镜和光激活定位显微镜，通过对视野内的分子逐个定位实现分辨率的突破，所以具有因为成像速度慢而无法观测分子动态的缺点，并且对样品表现出较大的光毒性，很难观测活细胞。结构光照明显微镜则使用余弦条纹进行照明，通过调制样品的空间频率来采集包含样品细节的高频信息，再通过已知的照明条纹进行后期算法还原，来实现超分辨率成像。结构光照明显微镜入射光功率低不易漂白，但是其分辨率相对受限。

受激发射损耗显微术则是通过损耗光使部分被激发的荧光分子受激辐射而猝灭，通过控制损耗光的空洞来降低自发辐射的荧光点扩散函数的宽度，进而实现超分辨率显微成像。虽然技术使用的高功率的损耗光有一定的光毒性，但是相比单分子定位技术，它在成像速度上有着显著的优势，分辨率相较结构光照明显微镜又有较大的提升。

但是受激发射损耗显微镜的高速成像依赖于标记密集的标本、相对较低的空间分辨率和相当小的视野。所以快速点扫描通常需要高重复率激光器，这会增强样品的光漂白和光损伤。所以科学家们在这基础上引入了并行受激发射损耗显微镜，可以在同样的扫描域和分辨率下以倍数降低扫描时间，进而实现大视野下低光损伤的快速扫描。然而这种情况只适用于二维扫描，只能获取样品的横向分布信息，而无法得到准确的轴向结构信息。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供了一种基于并行受激发射损耗显微镜和4Pi技术的三维超分辨显微成像方法和装置，可实现较大厚度样品的三维超分辨显微成像。

为了实现上述目的，本发明提供的一种基于并行STED和4Pi的三维超分辨显微成像方法，包括以下步骤：

1)照明光激光器产生宽场光，经过50％分束镜，通过样品上下的两个显微物镜以垂直于样品的方向对样品进行照明激发，形成4Pi照明；

2)损耗光激光器产生激光进入使用电光调制器移相的并行受激发射损耗显微损耗模块，产生并行的损耗光图样后，同样经过50％分束镜分束后通过样品上下的两个显微物镜垂直投射在样品表面；

3)样品发出的荧光被两个显微物镜采集，通过照明光原光路返回，经过二向色镜后被工业相机采集；

4)通过电光调制器移动损耗光图样，对照明范围内的样品进行扫描，工业相机相应采集到一组图像；

5)对获得的图像组中的每张图像分别进行对应的针孔滤波再将其叠加在一起，获得该轴向位置下的高轴向分辨率的二维超分辨图像；

6)对样品进行三维扫描时，保持样品上下两个显微物镜位置不变，即显微物镜的聚焦位置不变，仅通过压电调整平台平移样品进而改变显微镜扫描的样品薄层，通过层切的方法还原样品的三维结构。

进一步地，照明光激光器使用波长638纳米的激光，损耗光激光器使用波长775纳米的激光。

为了实现上述方法，本发明提供的成像装置包括：照明光激光器、损耗光激光器、并行受激发射损耗显微损耗模块、二向色镜、50％分束镜、若干反射镜、两个显微物镜、滤光片、成像透镜和工业相机；

所述照明光激光器用于产生激发光；所述损耗光激光器用于产生损耗光；所述并行受激发射损耗显微损耗模块用于产生并行损耗光图样，其使用电光调制器移相；所述滤波片用于滤去杂散光，所述成像透镜用于将样品荧光信号成像，所述工业相机用于接收样品荧光信号；

所述照明光激光器产生宽场光，通过50％分束镜分成强度完全相同的两束光，通过样品上下的两个显微物镜以垂直于样品的方向对样品进行照明激发；

所述损耗光激光产生激光进入并行受激发射损耗显微损耗模块，并行受激发射损耗显微损耗模块产生并行的损耗光图样，通过50％分束镜分成完全相同的两个图样，通过样品上下的两个显微物镜垂直投射在样品表面；

两个显微物镜分别采集样品发出的荧光，通过照明光原光路返回，两束光在50％分束镜合束，经二向色镜、滤光片、成像透镜后照射在工业相机上。

进一步地，成像装置还包括用于传输激光的单模光纤，用于反射和准直的透镜组。

进一步地，关于并行受激发射损耗显微损耗模块，目的是产生阵列的甜甜圈形损耗图案，只要能实现该功能的器件均可使用；常用的方法是将损耗光分束加不同偏振再分束，产生两组方向垂直的干涉条纹，叠加后刚好能形成所需的损耗空洞。

进一步地，为了提升并行受激发射损耗显微镜的成像速度，区别于其他并行受激发射损耗显微镜中运用压电致动器直接移动条纹对样品面进行扫描，本发明中使用电光调制器来移相，通过改变施加在电光调制器上的电压改变相干光的相位，进而使干涉条纹发生移动，阵列损耗空洞随之发生移动。电光调制器相较压电致动器一方面更加便宜，减少了设备总成本，另一方面移动速率也更高，使得采集速率仅受限于相机的刷新速率。

由于并行受激发射损耗显微镜取消了传统受激发射损耗显微镜中的滤波针孔，所以对于每一组损耗空洞所获得的图像，需要在对应损耗空洞的位置进行针孔滤波后，再对图像组进行叠加，这样有利于降低图像的噪声。

进一步地，显微物镜为了能最大限度的收集样品发出的全部荧光信号，宜采用较大数值孔径，数值孔径NA需大于等于1.49；两个显微物镜必须完全相同，并且，两个显微物镜前的光路需要严格等光程，即50％分束镜分光之后，两路光线虽然经过不同的两个反射镜反射后照射在样品上，但其光路长度必须严格相等，并且保证条纹的聚焦平面在同一平面上。

进一步地，由于要求两个显微物镜的照明光程严格相等，聚焦位置也不发生改变，故在实验过程中不能移动两个显微物镜。所以，对样品的层切通过压电控制的样品平台进行调整。

进一步地，该系统要求放置的样品载玻片和盖玻片都是透明的，具体厚度无要求，调整时使上下光路等光程即符合成像要求。

本发明的有益效果是：本发明装置简单，操作方便；保留了受激发射损耗显微镜高分辨率的特点；并行损耗和电光调制器的使用使得成像速度非常快，仅受相机的刷新速率限制，可用于观察活细胞；通过双物镜照明的方式，使用4Pi技术提高成像图片的轴向分辨率；虽然获得样品全部的三维信息需要通过层切实现，但是由于二维图像成像速度极快，提高了系统总体的成像速度，并且对可观测的样品深度无限制，能够对较大厚度的生物细胞实现高分辨率三维成像。

附图说明

图1为本发明实施例的基于并行STED和4Pi的三维超分辨显微成像装置示意图；

图2为本发明实施例的并行受激发射损耗显微损耗模块示意图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

以下给出本发明的一个具体实现示例，但不限于此。本示例的基于并行STED和4Pi的三维超分辨显微成像装置如图1，包括第一激光器1、第一二向色镜2、第二二向色镜3、第二激光器4、并行受激发射损耗显微损耗模块5、50％分束镜6、第一反射镜7、第二反射镜8、第一显微物镜9、压电调整平台10、第三反射镜11、第四反射镜12、第二显微物镜13、第五反射镜14、滤光片15、成像透镜16和工业相机17。其中第一激光器1和第二激光器4均包含激光器以及用于扩束准直调节光束方向的透镜组和反射镜等器件。

其中并行受激发射损耗显微损耗模块5如图2所示，扩束准直后的损耗光进入模块5后，通过第一1/2波片5-3后用第一偏振分光棱镜5-4分光。分光后的两束光分别通过相似的两组干涉装置。第一组干涉装置包括第二1/2波片5-1-1、第二偏振分光棱镜5-1-2、第三1/2波片5-1-3、第一电光调制器5-1-4、反射镜5-1-5、反射镜5-1-6、反射镜5-1-7、第四1/2波片5-1-8；第二组干涉装置包括第五1/2波片5-2-1、第三偏振分光棱镜5-2-2、第六1/2波片5-2-3、第二电光调制器5-2-4、反射镜5-2-5、反射镜5-2-6、反射镜5-2-7和第七1/2波片5-2-8；第一偏振分光棱镜5-4的透射光经过第二1/2波片5-1-1后由第二偏振分光棱镜5-1-2分光，其透射路经过第三1/2波片5-1-3、第一电光调制器5-1-4、反射镜5-1-5、反射镜5-1-6和第四1/2波片5-1-8，其反射路由反射镜5-1-7反射。从第一组干涉装置中出射的两束光线，分别经反射镜5-5和反射镜5-6反射后进入第四偏振分光棱镜5-8后被反射。第一偏振分光棱镜5-4的反射光经过反射镜5-7反射后，经过第五1/2波片5-2-1后由第三偏振分光棱镜5-2-2分光，其透射路经过第六1/2波片5-2-3、第二电光调制器5-2-4、反射镜5-2-5和反射镜5-2-6，其反射路依次通过反射镜5-2-7和第七1/2波片5-2-8。如图2虚线框内所示，反射镜5-2-6与系统其他部分不在同一平面上，故不会遮挡来自反射镜5-2-7的反射光。从第二组干涉装置中出射的两束光线，透射第四偏振分光棱镜5-8。偏振分光棱镜5-8出射的所有光投射在样品上发生干涉形成损耗图样。

装置工作时，第一激光器1产生的扩束准直后的激光，经第一二向色镜2、第二二向色镜3后，通过50％分束镜6分成强度完全相同的两束光。透射路经由第一反射镜7、第二反射镜8和第一显微物镜9后照射在压电调整平台10上的样品上；反射路则经由第三反射镜11、第四反射镜12和第二显微物镜13后照射在压电调整平台10上的样品上。其中，透射路和反射路到样品的光程严格相等。第一显微物镜9和第二显微物镜13分别从样品上方和下方以垂直于样品的方向对样品进行照明，形成4Pi照明。

第二激光器4产生的扩束准直后的激光进入并行受激发射损耗显微损耗模块5，通过第一1/2波片5-3后用第一偏振分光棱镜5-4分光。分光后的两束光分别通过相似的两组干涉装置，此处以透射路光的第一组干涉装置进行详细说明。第一偏振分光棱镜5-4分光后的透射光经过第二1/2波片5-1-1后由第二偏振分光棱镜5-1-2分光，其透射路经过第三1/2波片5-1-3、第一电光调制器5-1-4、反射镜5-1-5、反射镜5-1-6和第四1/2波片5-1-8，其反射路由反射镜5-1-7反射。从第一组干涉装置中出射的两束光线，分别经反射镜5-5和反射镜5-6反射后进入第四偏振分光棱镜5-8后被反射，在样品平面上形成干涉条纹。第一偏振分光棱镜5-4分光后的反射光经由反射镜5-7反射后进入相似的第二组干涉装置。第一组干涉装置和第二组干涉装置的区别在于，第一组干涉装置后的反射镜5-5和反射镜5-6反射后的光线和光轴同高但分别位于光轴两侧。而在第二组干涉装置中，反射镜5-2-6和系统其他部分不在同一高度上，其光线是高于光轴的，故不会遮挡来自反射镜5-2-7的反射光，对应的，反射镜5-2-7的反射光是低于光轴的。反射路的两束光在透射偏振分光棱镜5-8后也发生干涉，在样品平面上形成与透射路干涉条纹方向垂直的干涉条纹。这两组干涉条纹交错形成网状空洞，即阵列式的甜甜圈形损耗光斑。扫描时，通过改变施加在两个电光调制器上的电压来进行相位调制，进而实现干涉条纹的移动，其中，透射路中的第一电光调制器5-1-4电压变化频率较快，干涉条纹移动也较快，对应行方向的扫描，反射路中的第二电光调制器5-2-4电压变化频率较慢，干涉条纹移动也较慢，对应列方向的扫描。并行受激发射损耗显微损耗模块5产生的损耗图样，也通过50％分束镜6分成完全相同的两个图样。透射路经由第一反射镜7、第二反射镜8和第一显微物镜9；反射路则经由第三反射镜11、第四反射镜12和第二显微物镜13，透射路和反射路到样品的光程严格相等，两路光照射在样品上分别形成两个完全相同的网格状损耗图样，使部分已激发的染料分子猝灭，仅有空洞部分的染料分子产生荧光。

染料分子产生的荧光分别从第一显微物镜9和第二显微物镜13经由原照明光路返回，被第一显微物镜9采集的荧光通过第二反射镜8和第一反射镜7反射后进入50％分束镜6；被第二显微物镜13采集的荧光通过第四反射镜12和第三反射镜11反射后进入50％分束镜6，两束光被50％分束镜6合束后，强度为原先的一半。合束后的光被第二二向色镜3反射，透射第一二向色镜2后进入探测路，经由第五反射镜14、滤光片15和成像透镜16后照射在工业相机17上。在电光调制器调制实现损耗条纹移动时，对该样品选取的区域下每个损耗条纹，工业相机17拍摄一幅图像。变换多个照明条纹后，得到一组图像。

对该组的每一幅图像进行针孔滤波，即对每张图上的阵列损耗光斑的中心，以一个爱丽斑大小进行滤波。对于工业相机17拍摄得到的图像组，在针孔滤波后进行反卷积运算，再将多幅图像直接叠加，得到该轴向位置下的高轴向分辨率的二维超分辨成像结果。对样品进行三维扫描时，保持样品上下两个显微物镜位置不变，即显微物镜的聚焦位置不变，仅通过放置样品的压电调整平台10调整样品的轴向位置，即可改变显微镜扫描的样品薄层，通过层切的方法还原样品的三维结构。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何的简单修改、等同变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。

Claims (9)

1.一种基于并行STED和4Pi的三维超分辨显微成像方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)照明光激光器产生宽场光，经过50％分束镜，通过样品上下的两个显微物镜以垂直于样品的方向对样品进行照明激发，形成4Pi照明；

2)损耗光激光器产生激光进入使用电光调制器移相的并行受激发射损耗显微损耗模块，产生并行的损耗光图样后，同样经过50％分束镜分束后通过样品上下的两个显微物镜垂直投射在样品表面；

3)样品发出的荧光被两个显微物镜采集，通过照明光原光路返回，经过二向色镜后被工业相机采集；

4)通过电光调制器移动损耗光图样，对照明范围内的样品进行扫描，工业相机相应采集到一组图像；

5)对获得的图像组中的每张图像分别进行对应的针孔滤波再将其叠加在一起，获得该轴向位置下的高轴向分辨率的二维超分辨图像；

6)对样品进行三维扫描时，保持样品上下两个显微物镜位置不变，即显微物镜的聚焦位置不变，仅通过压电调整平台平移样品进而改变显微镜扫描的样品薄层，通过层切的方法还原样品的三维结构。

2.根据权利要求1所述的一种基于并行STED和4Pi的三维超分辨显微成像方法，其特征在于，所述步骤1)中，激光经过50％分束镜后分成强度完全相同的两束光，透射路经由第一反射镜、第二反射镜和样品上方的第一显微物镜后照射在压电调整平台上的样品上；反射路经由第三反射镜、第四反射镜和样品下方的第二显微物镜后照射在压电调整平台上的样品上；透射路和反射路到样品的光程严格相等。

3.根据权利要求2所述的一种基于并行STED和4Pi的三维超分辨显微成像方法，其特征在于，所述步骤2)中，并行受激发射损耗显微损耗模块产生的损耗图样通过50％分束镜分成完全相同的两个图样，透射路经由第一反射镜、第二反射镜和第一显微物镜；反射路经由第三反射镜、第四反射镜和第二显微物镜；透射路和反射路到样品的光程严格相等，两路光照射在样品上分别形成两个完全相同的损耗图样。

4.根据权利要求1所述的一种基于并行STED和4Pi的三维超分辨显微成像方法，其特征在于，所述步骤4)中，使用电光调制器来移相，通过改变施加在电光调制器上的电压改变相干光的相位，进而使干涉条纹发生移动，阵列损耗空洞随之发生移动。

5.一种基于并行STED和4Pi的三维超分辨显微成像装置，其特征在于，包括：照明光激光器、损耗光激光器、并行受激发射损耗显微损耗模块、二向色镜、50％分束镜、若干反射镜、两个显微物镜、滤光片、成像透镜和工业相机；

所述并行受激发射损耗显微损耗模块用于产生并行损耗光图样，其使用电光调制器移相；

所述照明光激光器产生宽场光，通过50％分束镜分成强度完全相同的两束光，通过样品上下的两个显微物镜以垂直于样品的方向对样品进行照明激发；

所述损耗光激光产生激光进入并行受激发射损耗显微损耗模块，并行受激发射损耗显微损耗模块产生并行的损耗光图样，通过50％分束镜分成完全相同的两个图样，通过样品上下的两个显微物镜垂直投射在样品表面；

两个显微物镜分别采集样品发出的荧光，通过照明光原光路返回，两束光在50％分束镜合束，经二向色镜、滤光片、成像透镜后照射在工业相机上。

6.根据权利要求5所述的一种基于并行STED和4Pi的三维超分辨显微成像装置，其特征在于，所述并行受激发射损耗显微损耗模块用于产生阵列的甜甜圈形损耗图案，实现方式包括：是将损耗光分束加不同偏振再分束，产生两组方向垂直的干涉条纹，叠加后刚好能形成所需的损耗空洞。

7.根据权利要求5所述的一种基于并行STED和4Pi的三维超分辨显微成像装置，其特征在于，所述显微物镜用于最大限度的收集样品发出的全部荧光信号，数值孔径NA需大于等于1.49。

8.根据权利要求5所述的一种基于并行STED和4Pi的三维超分辨显微成像装置，其特征在于，由于要求两个显微物镜的照明光程严格相等，聚焦位置也不发生改变，在实验过程中不能移动两个显微物镜，对样品的层切通过压电调整平台进行调整。

9.根据权利要求5所述的一种基于并行STED和4Pi的三维超分辨显微成像装置，其特征在于，放置的样品载玻片和盖玻片均是透明的，调整时使上下光路等光程。

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