CN111781173A - 基于并行sted和超临界角成像的三维超分辨显微成像方法和装置 - Google Patents

基于并行sted和超临界角成像的三维超分辨显微成像方法和装置 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于并行STED和超临界角成像的三维超分辨显微成像方法和装置，该装置包括并行受激发射损耗显微模块和超临界角荧光探测模块，并行受激发射损耗显微以宽场激发和阵列损耗扫描样品成像，超临界角荧光探测模块通过超临界角荧光强度随染料分子距分界面距离的指数衰减变化关系还原每个像素点的轴向位置信息。本发明装置简单，操作方便；保留了受激发射损耗显微镜高分辨率的特点；并行损耗和电光调制器的使用使得成像速度非常快，仅受相机的刷新速率限制，可用于观察活细胞；无需层切，仅通过对二维图像的算法处理还原三维信息，可快速有效的实现三维空间内的高分辨率显微成像。

Description

基于并行STED和超临界角成像的三维超分辨显微成像方法和 装置
技术领域
本发明涉及光学超分辨显微成像领域，具体地说，涉及一种基于并行受激发射损耗显微镜(STED)和超临界角成像的三维超分辨显微成像方法和装置。
背景技术
光学显微镜是生命科学等领域用于观察研究微观结构的重要手段。但是由于光的衍射效应和光学系统的有限孔径，普通光学显微镜的分辨率被限制在半波长左右，无法对小于200纳米尺度的样品进行探测。
为了突破这个限制，科学家们提出了多种超分辨成像技术方法，来实现对纳米级的微小结构的观察研究。另一类技术如随机光学重构和光激活定位显微镜，运用单分子定位技术实现超分辨显微成像。这类技术需要使用高强度的激光漂白已被正确定位的分子，且需循环上百次才能得到最终结果。所以这一类技术除了也存在和之前受激发射损耗显微术相同的限制以外，更具有因为成像速度慢而无法观测分子动态的缺点。结构光照明显微镜不同于之前提到的两类显微镜，它通过改变照明系统，在样品表面投射条纹，通过调制样品的空间频率来采集包含样品细节的高频信息，再通过后期算法还原，来实现超分辨率成像。结构光照明显微镜有着无需高荧光标记密度和特异荧光染料成像速度快，入射光功率低不易漂白，成像速度快可实时观测等优点，但是其分辨率相对受限。
受激发射损耗显微术是通过高功率的损耗光使部分被激发的荧光分子受激辐射而猝灭，从而降低自发辐射的荧光点扩散函数的宽度，来实现超分辨率显微成像的技术。虽然技术使用的高功率的损耗光较容易对样品造成漂白，但是相比单分子定位技术，它在成像速度上有着显著的优势，分辨率相交结构光照明显微镜又有较大的提升。
但是受激发射损耗显微镜的高速成像依赖于标记密集的标本、相对较低的空间分辨率和相当小的视野。所以快速点扫描通常需要高重复率激光器，这会增强样品的光漂白和光损伤。所以科学家们在这基础上引入了并行受激发射损耗显微镜，可以在同样的扫描域和分辨率下以倍数降低扫描时间，进而实现大视野下低光损伤的快速扫描。然而这种情况只适用于二维扫描，只能获取样品的横向分布信息，而无法得到准确的轴向结构信息，通过层切实现的三维结构光显微镜又无法实现快速成像，这限制了其在生命科学领域的应用。
发明内容
本发明提供了一种基于并行受激发射损耗显微镜和超临界角成像的三维超分辨显微成像方法和装置，可实现三维超分辨显微成像。
为了实现上述目的，本发明提供的一种基于并行受激发射损耗显微镜和超临界角成像的三维超分辨显微成像方法，包括以下步骤：
1)照明光激光器以宽场光对样品进行照明激发；
2)损耗光激光器产生激光进入使用电光调制器移相的受激发射损耗显微损耗模块，产生并行的损耗光图样后投射在样品表面；
3)通过显微物镜收集样品受激发出的荧光信号，用分束镜分为两路光线，第一路光完整投射在工业相机上，第二路光经过放置在物镜等效后焦面上的光阑再投射在另一个工业相机上；
4)移动并行损耗光图样对照明范围内的样品进行扫描，对两路工业相机采集到的多幅图像分别进行对应的针孔滤波；对第一路光采集到的图像结果进行反卷积后叠加，即为样品的二维超分辨图像结果；
5)对步骤4)中针孔滤波后的两组图像，其中第一路光的图像包括样品的超临界角荧光分量和亚临界角荧光分量，第二路光的图像仅包括样品的亚临界角荧光分量；根据这两组图像得到归一化后的样品染料分子超临界角荧光的强度分布，通过超临界角荧光强度随染料分子距分界面距离的指数衰减变化关系还原每个针孔中心点的轴向位置信息；
6)将还原的轴向位置信息与步骤4)获得的二维超分辨图像相结合，得到样品的三维分布信息。
进一步地，照明光激光器使用波长638纳米的激光，损耗光激光器使用波长775纳米的激光。
进一步地，步骤3)中光阑的大小满足ρ＝nofsinθc，其中no是显微物镜浸入介质的折射率，f是物镜的焦距，θc＝arcsin(nm/ng)，其中nm为样品介质的折射率，ng为玻璃界面的折射率。
进一步地，对于离平面较远的荧光分子的探测光，其中只包含亚临界角荧光成分而不包含超临界角荧光成分，由一个放置在物镜等效后焦面上的CCD获取亚临界角荧光的角分布直径大小，再根据角分布直径大小设计光阑直径大小，再把CCD替换成光阑，将光阑放入光路中，调整光阑位置使得光阑与光路共轴。
进一步地，步骤5)中，根据针孔滤波后的图像得到归一化后的样品染料分子超临界角荧光的强度分布，具体为：
对步骤4)中每一张图像，图像上每一个针孔对应的范围内的所有点的平均值即为这个针孔中心点的测量值，对第一路光图像和第二路光图像的测量值分别叠加成完整图像，用第一路光的测量结果与第二路光的测量结果做差分，得到样品荧光的超临界角荧光分量，再用该差分结果除以第二路光的测量结果，得到归一化后的超临界角荧光比值分布，其随样品分子离开分界面的轴向距离成指数递减。
为了实现上述方法，本发明提供的成像装置包括：
横向超分辨模块即并行受激发射损耗显微镜：包括用于产生激发光的照明光激光器；用于产生损耗光的损耗光激光器；用于传输激光的单模光纤；用于反射和准直的透镜组；用于产生并行损耗光图样的并行受激发射损耗显微损耗模块，该模块为核心部分。
轴向超分辨模块：包括用于收集样品发出的荧光信号的显微物镜；用于透射照明光，反射荧光信号的二向色镜；用于获取轴向位置信息的超临界角荧光探测模块，该模块为核心部分，包括用于获取物镜等效后焦面的4f透镜组，用于分束的半透半反镜，用于限制光束的光阑(仅第二路光路中使用)，用于滤去杂散光的滤波片，用于将样品荧光信号成像的透镜，用于接收样品荧光信号的工业相机。
进一步地，关于横向超分辨模块中的并行受激发射损耗显微损耗模块，目的是产生阵列的甜甜圈形损耗图案，只要能实现该功能的器件均可使用。常用的方法是将损耗光分束加不同偏振再分束，产生两组方向垂直的干涉条纹，叠加后刚好能形成所需的损耗空洞。
进一步地，为了提升并行受激发射损耗显微镜的成像速度，区别于其他并行受激发射损耗显微镜中运用压电致动器直接移动条纹对样品面进行扫描，本发明中使用电光调制器来移相，通过改变施加在电光调制器上的电压改变相干光的相位，进而使干涉条纹发生移动，阵列损耗空洞随之发生移动。电光调制器相较压电致动器一方面更加便宜，减少了设备总成本，另一方面移动速率也更高，使得采集速率仅受限于相机的刷新速率。
由于并行受激发射损耗显微镜取消了传统受激发射损耗显微镜中的滤波针孔，所以对于每一组损耗空洞所获得的图像，需要在对应损耗空洞的位置进行针孔滤波后，再对图像组进行叠加，这样有利于降低图像的噪声。
进一步地，显微物镜为了能最大限度的收集样品发出的全部荧光信号，宜采用较大数值孔径，数值孔径NA需大于等于1.49。
进一步地，关于轴向位置计算的方法，主要是通过单个染料分子超临界角荧光(SAF)强度沿轴变化的关系来还原每个像素点上荧光的空间位置。单个染料分子受激所发出的荧光包含亚临界角荧光(UAF)部分和超临界角荧光(SAF)部分。单个染料分子所发出的亚临界角荧光(UAF)强度不随轴向距离发生变化，而超临界角荧光(SAF)是倏逝波，其强度与离开分界面的轴向距离成指数递减。
单个染料分子所发出的亚临界角荧光(UAF)和超临界角荧光(SAF)可以在显微物镜的后焦面上区分开来。由于物镜满足阿贝正弦关系：光发射角θ在后焦面上表现为一个半径为ρ＝nofsinθ的圆，其中no是显微物镜浸入介质的折射率，f是物镜的焦距。因此，UAF光位于半径为nofsinθc的圆内，θc＝arcsin(nm/ng)(其中m表示介质，g表示玻璃界面)，SAF光部分则是围绕着UAF光的半径为f·NA的环形。所以用一个半径为nofsinθc的光阑即可在后焦面上阻挡荧光中的超临界角荧光分量。实验装置中我们设计一个符合上述要求的光阑，对于离平面较远的荧光分子的探测光，其中只包含亚临界角荧光成分而不包含超临界角荧光成分，所以可以由一个放置在物镜等效后焦面上的CCD获取亚临界角荧光的角分布直径大小，再根据角分布直径大小设计光阑直径大小，再把CCD替换成光阑，将光阑放入光路中，调整光阑位置使得光阑与光路共轴。装置探测路中第一路光不设光阑，工业相机所采集的信号包含了亚临界角荧光(UAF)强度信号和超临界角荧光(SAF)强度信号；装置探测路中第二路光设有光阑，工业相机所采集的信号只含有亚临界角荧光(UAF)强度信号。所以对两路信号做差分即可得到超临界角荧光(SAF)分量。
由于每个染料分子所受激发强度不同，所发荧光强度也各有不同，所以必须对图像进行归一化处理。考虑到噪声带来的影响，使用每个针孔范围内所有像素强度的平均值代表这个针孔中心点的测量值。由于单个染料分子所发出的亚临界角荧光(UAF)强度不随轴向距离发生变化，而超临界角荧光(SAF)强度与离开分界面的轴向距离成指数递减。所以用每个针孔中心点的超临界角荧光(SAF)强度测量值除以亚临界角荧光(UAF)强度测量值，即可得到归一化后的超临界角荧光(SAF)比值，其随染料分子离开分界面的轴向距离成指数递减。然后通过这个指数递减关系可以一一对应，根据每个针孔中心点超临界角荧光(SAF)比值对应得到每个像素点的轴向位置。
本发明的有益效果是：本发明装置简单，操作方便；保留了受激发射损耗显微镜高分辨率的特点；并行损耗和电光调制器的使用使得成像速度非常快，仅受相机的刷新速率限制，可用于观察活细胞；无需层切，仅通过对二维图像的算法处理还原三维信息，可快速有效的实现三维空间内的高分辨率显微成像。
附图说明
图1为本发明实施例的三维超分辨显微成像装置示意图；
图2为本发明实施例的并行受激发射损耗显微损耗模块示意图；
图3为本发明实施例的超临界角荧光探测示意图；
图4为染料分子荧光发光示意图；
图5为染料分子超临界角荧光强度随轴向位置的变化示意图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
本发明提供的一种基于并行受激发射损耗显微镜和超临界角成像的三维超分辨显微成像方法，包括以下步骤：
1)照明光激光器以宽场光对样品进行照明激发；
2)损耗光激光器产生激光进入使用电光调制器移相的受激发射损耗显微损耗模块，产生并行的损耗光图样后投射在样品表面；
3)通过显微物镜收集样品受激发出的荧光信号，用分束镜分为两路光线，第一路光完整投射在工业相机上，第二路光经过放置在物镜等效后焦面上的光阑再投射在另一个工业相机上；
4)移动并行损耗光图样对照明范围内的样品进行扫描，对两路工业相机采集到的多幅图像分别进行对应的针孔滤波；对第一路光采集到的图像结果进行反卷积后叠加，即为样品的二维超分辨图像结果；
5)对步骤4)中针孔滤波后的两组图像，其中第一路光的图像包括样品的超临界角荧光分量和亚临界角荧光分量，第二路光的图像仅包括样品的亚临界角荧光分量；根据这两组图像得到归一化后的样品染料分子超临界角荧光的强度分布，通过超临界角荧光强度随染料分子距分界面距离的指数衰减变化关系还原每个针孔中心点的轴向位置信息；
6)将还原的轴向位置信息与步骤4)获得的二维超分辨图像相结合，得到样品的三维分布信息。
进一步地，照明光激光器使用波长638纳米的激光，损耗光激光器使用波长775纳米的激光。
进一步地，步骤3)中光阑的大小满足ρ＝nofsinθc，其中no是显微物镜浸入介质的折射率，f是物镜的焦距，θc＝arcsin(nm/ng)，其中nm为样品介质的折射率，ng为玻璃界面的折射率。
进一步地，对于离平面较远的荧光分子的探测光，其中只包含亚临界角荧光成分而不包含超临界角荧光成分，由一个放置在物镜等效后焦面上的CCD获取亚临界角荧光的角分布直径大小，再根据角分布直径大小设计光阑直径大小，再把CCD替换成光阑，将光阑放入光路中，调整光阑位置使得光阑与光路共轴。
进一步地，步骤5)中，根据针孔滤波后的图像得到归一化后的样品染料分子超临界角荧光的强度分布，具体为：对步骤4)中每一张图像，图像上每一个针孔对应的范围内的所有点的平均值即为这个针孔中心点的测量值，对第一路光图像和第二路光图像的测量值分别叠加成完整图像，用第一路光的测量结果与第二路光的测量结果做差分，得到样品荧光的超临界角荧光分量，再用该差分结果除以第二路光的测量结果，得到归一化后的超临界角荧光比值分布，其随样品分子离开分界面的轴向距离成指数递减。
为了实现上述方法，本发明提供的成像装置包括：
横向超分辨模块即并行受激发射损耗显微镜：包括用于产生激发光的照明光激光器；用于产生损耗光的损耗光激光器；用于传输激光的单模光纤；用于反射和准直的透镜组；用于产生并行损耗光图样的并行受激发射损耗显微损耗模块，该模块为核心部分。
轴向超分辨模块：包括用于收集样品发出的荧光信号的显微物镜；用于透射照明光，反射荧光信号的二向色镜；用于获取轴向位置信息的超临界角荧光探测模块，该模块为核心部分，包括用于获取物镜等效后焦面的4f透镜组，用于分束的半透半反镜，用于限制光束的光阑(仅第二路光路中使用)，用于滤去杂散光的滤波片，用于将样品荧光信号成像的透镜，用于接收样品荧光信号的工业相机。
进一步地，关于横向超分辨模块中的并行受激发射损耗显微损耗模块，目的是产生阵列的甜甜圈形损耗图案，只要能实现该功能的器件均可使用。常用的方法是将损耗光分束加不同偏振再分束，产生两组方向垂直的干涉条纹，叠加后刚好能形成所需的损耗空洞。
进一步地，为了提升并行受激发射损耗显微镜的成像速度，区别于其他并行受激发射损耗显微镜中运用压电致动器直接移动条纹对样品面进行扫描，本发明中使用电光调制器来移相，通过改变施加在电光调制器上的电压改变相干光的相位，进而使干涉条纹发生移动，阵列损耗空洞随之发生移动。电光调制器相较压电致动器一方面更加便宜，减少了设备总成本，另一方面移动速率也更高，使得采集速率仅受限于相机的刷新速率。
由于并行受激发射损耗显微镜取消了传统受激发射损耗显微镜中的滤波针孔，所以对于每一组损耗空洞所获得的图像，需要在对应损耗空洞的位置进行针孔滤波后，再对图像组进行叠加，这样有利于降低图像的噪声。
进一步地，显微物镜为了能最大限度的收集样品发出的全部荧光信号，宜采用较大数值孔径，数值孔径NA需大于等于1.49。
进一步地，关于轴向位置计算的方法，主要是通过单个染料分子超临界角荧光(SAF)强度沿轴变化的关系来还原每个像素点上荧光的空间位置。单个染料分子受激所发出的荧光包含亚临界角荧光(UAF)部分(如图4灰色区域，即发光角度与光轴夹角小于全反射临界角的部分)和超临界角荧光(SAF)部分(如图4划线区域，即发光角度与光轴夹角大于全反射临界角的部分)。单个染料分子所发出的亚临界角荧光(UAF)强度不随轴向距离发生变化，而超临界角荧光(SAF)是倏逝波，其强度与离开分界面的轴向距离成指数递减。
单个染料分子所发出的亚临界角荧光(UAF)和超临界角荧光(SAF)可以在显微物镜的后焦面上区分开来。由于物镜满足阿贝正弦关系：光发射角θ在后焦面上表现为一个半径为ρ＝nofsinθ的圆，其中no是显微物镜浸入介质的折射率，f是物镜的焦距。因此，UAF光位于半径为nofsinθc的圆内，θc＝arcsin(nm/ng)(其中m表示介质，g表示玻璃界面)，SAF光部分则是围绕着UAF光的半径为f·NA的环形。所以用一个半径为nofsinθc的光阑即可在后焦面上阻挡荧光中的超临界角荧光分量。实验装置中我们设计一个符合上述要求的光阑，对于离平面较远的荧光分子的探测光，其中只包含亚临界角荧光成分而不包含超临界角荧光成分，所以可以由一个放置在物镜等效后焦面上的CCD获取亚临界角荧光的角分布直径大小，再根据角分布直径大小设计光阑直径大小，再把CCD替换成光阑，将光阑放入光路中，调整光阑位置使得光阑与光路共轴。装置探测路中第一路光不设光阑，工业相机所采集的信号包含了亚临界角荧光(UAF)强度信号和超临界角荧光(SAF)强度信号；装置探测路中第二路光设有光阑，工业相机所采集的信号只含有亚临界角荧光(UAF)强度信号。所以对两路信号做差分即可得到超临界角荧光(SAF)分量。
由于每个染料分子所受激发强度不同，所发荧光强度也各有不同，所以必须对图像进行归一化处理。考虑到噪声带来的影响，使用每个针孔范围内所有像素强度的平均值代表这个针孔中心点的测量值。由于单个染料分子所发出的亚临界角荧光(UAF)强度不随轴向距离发生变化，而超临界角荧光(SAF)强度与离开分界面的轴向距离成指数递减。所以用每个针孔中心点的超临界角荧光(SAF)强度测量值除以亚临界角荧光(UAF)强度测量值，即可得到归一化后的超临界角荧光(SAF)比值，其随染料分子离开分界面的轴向距离成指数递减(如图5所示)。然后通过这个指数递减关系可以一一对应，根据每个针孔中心点超临界角荧光(SAF)比值对应得到每个像素点的轴向位置。
以下给出本发明的一个具体实现示例，但不限于此。本示例的三维超分辨显微成像装置如图1，包括第一激光器1、第一二向色镜2、第二二向色镜3、第二激光器4、并行受激发射损耗显微损耗模块5、反射镜6、显微物镜7、样品8和超临界角荧光探测模块9。其中第一激光器1和第二激光器3均包含激光器以及用于扩束准直调节光束方向的透镜组和反射镜等器件。
其中并行受激发射损耗显微损耗模块5如图2所示，扩束准直后的损耗光进入模块5后，通过第一1/2波片5-3后用第一偏振分光棱镜5-4分光。分光后的两束光分别通过相似的两组干涉装置。第一组干涉装置包括第二1/2波片5-1-1、第二偏振分光棱镜5-1-2、第三1/2波片5-1-3、第一电光调制器5-1-4、反射镜5-1-5、反射镜5-1-6、反射镜5-1-7、第四1/2波片5-1-8；第二组干涉装置包括第五1/2波片5-2-1、第三偏振分光棱镜5-2-2、第六1/2波片5-2-3、第二电光调制器5-2-4、反射镜5-2-5、反射镜5-2-6、反射镜5-2-7和第七1/2波片5-2-8；第一偏振分光棱镜5-4的透射光经过第二1/2波片5-1-1后由第二偏振分光棱镜5-1-2分光，其透射路经过第三1/2波片5-1-3、第一电光调制器5-1-4、反射镜5-1-5、反射镜5-1-6和第四1/2波片5-1-8，其反射路由反射镜5-1-7反射。从第一组干涉装置中出射的两束光线，分别经反射镜5-5和反射镜5-6反射后进入第四偏振分光棱镜5-8后被反射。第一偏振分光棱镜5-4的反射光经过反射镜5-7反射后，经过第五1/2波片5-2-1后由第三偏振分光棱镜5-2-2分光，其透射路经过第六1/2波片5-2-3、第二电光调制器5-2-4、反射镜5-2-5和反射镜5-2-6，其反射路依次通过反射镜5-2-7和第七1/2波片5-2-8。如图2虚线框内所示，反射镜5-2-6与系统其他部分不在同一平面上，故不会遮挡来自反射镜5-2-7的反射光。从第二组干涉装置中出射的两束光线，透射第四偏振分光棱镜5-8。偏振分光棱镜5-8出射的所有光投射在样品上发生干涉形成损耗图样。
其中超临界角荧光探测模块9如图3所示，通过第一透镜9-1后，分束镜9-2将探测光平分为两路，第一路依次经过第二透镜9-3、第一滤光片9-4和第一成像透镜9-5，在第一工业相机9-6处成像，其中第一透镜9-1和第二透镜9-3组成了4f系统；第二路依次经过第二反射镜9-7、第三透镜9-8、光阑9-9、第二滤光片9-10和第二成像透镜9-11，在第二工业相机9-12处成像，其中第一透镜9-1和第三透镜9-8组成了4f系统，光阑9-9放置在显微物镜7的等效后焦面上。两光路中的滤光片、成像透镜和工业相机均相同。
装置工作时，第一激光器1产生的扩束准直后的激光，经第一二向色镜2、第二二向色镜3和反射镜6反射，由显微物镜7聚焦后以宽场光的形式照明激发样品8。第二激光器4产生的扩束准直后的激光进入并行受激发射损耗显微损耗模块5，通过第一1/2波片5-3后用第一偏振分光棱镜5-4分光。分光后的两束光分别通过相似的两组干涉装置，此处以透射路光的第一组干涉装置进行详细说明。第一偏振分光棱镜5-4分光后的透射光经过第二1/2波片5-1-1后由第二偏振分光棱镜5-1-2分光，其透射路经过第三1/2波片5-1-3、第一电光调制器5-1-4、反射镜5-1-5、反射镜5-1-6和第四1/2波片5-1-8，其反射路由反射镜5-1-7反射。从第一组干涉装置中出射的两束光线，分别经反射镜5-5和反射镜5-6反射后进入第四偏振分光棱镜5-8后被反射，在样品平面上形成干涉条纹。第一偏振分光棱镜5-4分光后的反射光经由反射镜5-7反射后进入相似的第二组干涉装置。第一组干涉装置和第二组干涉装置的区别在于，第一组干涉装置后的反射镜5-5和反射镜5-6反射后的光线和光轴同高但分别位于光轴两侧。而在第二组干涉装置中，反射镜5-2-6和系统其他部分不在同一高度上，其光线是高于光轴的，故不会遮挡来自反射镜5-2-7的反射光，对应的，反射镜5-2-7的反射光是低于光轴的。反射路的两束光在透射偏振分光棱镜5-8后也发生干涉，在样品平面上形成与透射路干涉条纹方向垂直的干涉条纹。这两组干涉条纹交错形成网状空洞，即阵列式的甜甜圈形损耗光斑。扫描时，通过改变施加在两个电光调制器上的电压来进行相位调制，进而实现干涉条纹的移动，其中，透射路中的电光调制器5-1-4电压变化频率较快，干涉条纹移动也较快，对应行方向的扫描，反射路中的第二电光调制器5-2-4电压变化频率较慢，干涉条纹移动也较慢，对应列方向的扫描。
并行受激发射损耗显微损耗模块5产生的损耗图样，由第二二向色镜3透射经反射镜6和显微物镜7打在样品8表面上，使部分已激发的染料分子猝灭，仅有空洞部分的染料分子产生荧光。染料分子产生的全部荧光经显微物镜7和反射镜6后被第二二向色镜3反射，透射第一二向色镜2后进入超临界角荧光探测模块9中，而照明激发光和损耗光分别被两个二向色镜阻拦不影响成像。
进入超临界角荧光探测模块9的探测光经过第一透镜9-1被分束镜9-2平分为上下两路，第一路透射路经过第二透镜9-3，由第一滤光片9-4滤去杂散光后，由第一成像透镜9-5成像在第一工业相机9-6上，第一工业相机9-6拍摄的图像包含了全部的UAF和SAF信息；第二路反射路经反射镜9-7后经过第三透镜9-8，通过光阑9-9，滤去其中的SAF光，再经第二滤光片9-10滤去杂散光后，由第二成像透镜9-11成像在第二工业相机9-12上，第二工业相机9-12拍摄的图像仅包含UAF信息。
在电光调制器调制实现损耗条纹移动时，对该样品选取的区域下每个损耗条纹，第一工业相机9-6和第二工业相机9-12分别拍摄一幅图像。变换多个照明条纹后，得到两组图像。
首先，对每一幅图像进行针孔滤波。即对每张图上的阵列损耗光斑的中心，以一个爱丽斑大小进行滤波。对于第一工业相机9-6拍摄得到的图像组，在针孔滤波后进行反卷积运算，再将多幅图像直接叠加，得到受激发射损耗显微镜的二维超分辨成像结果。
对于针孔滤波后的第一工业相机9-6和第二工业相机9-12的图像组，第一工业相机9-6图像组包含了样品染料分子所发射的荧光的UAF和SAF部分，而第二工业相机9-12的图像组仅包含了样品染料分子所发射的荧光的UAF部分。但是考虑到单个像素受噪声影响较大，对于每个针孔滤波后的爱丽斑，取爱丽斑内所有像素点强度的平均值作为中心像素点的测量值，再将每组仅包含测量值的图像叠加，得到测量值点状图。将第一工业相机9-6计算得到的测量值点状图和第二工业相机9-12计算得到的测量值点状图做差分即可得到样品染料分子所发射的荧光的SAF部分的测量值点状图。用SAF部分强度除以UAF部分强度得到SAF信号的比值，再由图5对应得到每个像素点的轴向位置信息。把每个像素点的轴向位置信息加载到第一工业相机9-6图像组得到的二维超分辨成像结果上，就可以得到样品的三维分布信息。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何的简单修改、等同变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。

Claims (9)

1.一种基于并行STED和超临界角成像的三维超分辨显微成像方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)照明光激光器以宽场光对样品进行照明激发。
2)损耗光激光器产生激光进入使用电光调制器移相的受激发射损耗显微损耗模块，产生并行的损耗光图样后投射在样品表面。
3)通过显微物镜收集样品受激发出的荧光信号，用分束镜分为两路光线，第一路光完整投射在工业相机上，第二路光经过放置在物镜等效后焦面上的光阑再投射在另一个工业相机上。
4)移动并行损耗光图样对照明范围内的样品进行扫描，对两路工业相机采集到的多幅图像分别进行对应的针孔滤波；对第一路光采集到的图像结果进行反卷积后叠加，即为样品的二维超分辨图像结果。
5)对步骤4)中针孔滤波后的两组图像，其中第一路光的图像包括样品的超临界角荧光分量和亚临界角荧光分量，第二路光的图像仅包括样品的亚临界角荧光分量；根据这两组图像得到归一化后的样品染料分子超临界角荧光的强度分布，通过超临界角荧光强度随染料分子距分界面距离的指数衰减变化关系还原每个针孔中心点的轴向位置信息。
6)将还原的轴向位置信息与步骤4)获得的二维超分辨图像相结合，得到样品的三维分布信息。
2.根据权利要求1所述的一种基于并行STED和超临界角成像的三维超分辨显微成像方法，其特征在于，所述照明光激光器使用波长638纳米的激光，损耗光激光器使用波长775纳米的激光。
3.根据权利要求1所述的一种基于并行STED和超临界角成像的三维超分辨显微成像方法，其特征在于，步骤3)中光阑的大小满足ρ＝nofsinθc，其中no是显微物镜浸入介质的折射率，f是物镜的焦距，θc＝arcsin(nm/ng)，其中nm为样品介质的折射率，ng为玻璃界面的折射率。
4.根据权利要求1所述的一种基于并行STED和超临界角成像的三维超分辨显微成像方法，其特征在于，对于离平面较远的荧光分子的探测光，其中只包含亚临界角荧光成分而不包含超临界角荧光成分，由一个放置在物镜等效后焦面上的CCD获取亚临界角荧光的角分布直径大小，再根据角分布直径大小设计光阑直径大小，再把CCD替换成光阑，将光阑放入光路中，调整光阑位置使得光阑与光路共轴。
5.根据权利要求1所述的一种基于并行STED和超临界角成像的三维超分辨显微成像方法，其特征在于，步骤5)中，根据针孔滤波后的图像得到归一化后的样品染料分子超临界角荧光的强度分布，具体为：对步骤4)中每一张图像，图像上每一个针孔对应的范围内的所有点的平均值即为这个针孔中心点的测量值，对第一路光图像和第二路光图像的测量值分别叠加成完整图像，用第一路光的测量结果与第二路光的测量结果做差分，得到样品荧光的超临界角荧光分量，再用该差分结果除以第二路光的测量结果，得到归一化后的超临界角荧光比值分布，其随样品分子离开分界面的轴向距离成指数递减。
6.一种基于并行STED和超临界角成像的三维超分辨显微成像装置，其特征在于，包括：
横向超分辨模块即并行受激发射损耗显微镜：包括用于产生激发光的照明光激光器；用于产生损耗光的损耗光激光器；用于传输激光的单模光纤；用于反射和准直的透镜组；用于产生并行损耗光图样的并行受激发射损耗显微损耗模块；
轴向超分辨模块：包括用于收集样品发出的荧光信号的显微物镜；用于透射照明光，反射荧光信号的二向色镜；用于获取轴向位置信息的超临界角荧光探测模块，包括用于获取物镜等效后焦面的4f透镜组，用于分束的半透半反镜，用于限制光束的光阑，用于滤去杂散光的滤波片，用于将样品荧光信号成像的透镜，用于接收样品荧光信号的工业相机。
7.根据权利要求6所述的一种基于并行STED和超临界角成像的三维超分辨显微成像装置，其特征在于，所述横向超分辨模块中的并行受激发射损耗显微损耗模块用于产生阵列的甜甜圈形损耗图案，实现方式包括：将损耗光分束加不同偏振再分束，产生两组方向垂直的干涉条纹，叠加后刚好能形成所需的损耗空洞。
8.根据权利要求6所述的一种基于并行STED和超临界角成像的三维超分辨显微成像装置，其特征在于，使用电光调制器来移相，通过改变施加在电光调制器上的电压改变相干光的相位，进而使干涉条纹发生移动，阵列损耗空洞随之发生移动。
9.根据权利要求6所述的一种基于并行STED和超临界角成像的三维超分辨显微成像装置，其特征在于，所述显微物镜用于最大限度的收集样品发出的全部荧光信号，数值孔径NA需大于等于1.49。
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