CN108593620B

CN108593620B - 一种应用于4pi显微架构的多色超分辨成像系统

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Publication number: CN108593620B
Application number: CN201810519407.3A
Authority: CN
Inventors: 李旸晖; 李雨雪; 周辉; 刘小煜; 夏成樑
Original assignee: China Jiliang University
Current assignee: China Jiliang University
Priority date: 2018-05-28
Filing date: 2018-05-28
Publication date: 2021-02-26
Anticipated expiration: 2038-05-28
Also published as: CN108593620A

Abstract

本发明公开了一种应用于4pi显微架构的多色超分辨成像系统，包括光源模块、样品台、上显微镜头、下显微镜头、第一四分之一波片、第二四分之一波片、第一二色镜、第二二色镜、第一光路折转匹配单元、第二光路折转匹配单元、第一变形反射镜、第二变形反射镜、第一巴俾涅补偿器、第二巴俾涅补偿器、分束器立方体、第三光路折转匹配单元、第四光路折转匹配单元、偏振分束器立方体、第十一反射镜、第十二反射镜、第九透镜、第十透镜、直角棱镜、第三二色镜、第十一透镜、第十二透镜、第一成像器件、第二成像器件。该系统利用单分子定位技术和不同荧光分子间的串扰，结合4pi显微技术实现对整个细胞的多色三维超分辨成像。

Description

一种应用于4pi显微架构的多色超分辨成像系统

技术领域

本发明涉及光学超分辨显微成像领域，具体涉及一种应用于4pi显微架构的多色超分辨成像系统。

背景技术

在生命科学、生物医学、化学科学、材料科学等领域中，对目标物质成像是一种重要的研究方法，随着研究的深入，被成像目标的尺寸也变得越来越小。然而，常规的宽场显微镜，属于远场成像方法，由于受到衍射极限的限制，分辨率只有200nm，远不能达到分辨亚细胞结构的能力。近场成像技术，例如电子显微镜、扫描隧道显微镜、原子力显微镜等，能得到0.1nm的超高分辨率，但是由于这些近场成像技术使用的实验设备复杂、价格昂贵，并且对样品的制备有很高的要求，不适于活细胞成像等原因，限制了近场成像技术在科学研究和医学等领域的适用性。

2006年，哈佛大学教授庄小威提出随机光学重建显微技术(STORM)，Eric Betzig提出光激活定位显微技术(PALM)和Samuel T.Hess提出的荧光激活定位显微术(FPALM)将荧光显微镜的分辨率提高10倍，极大的扩大了荧光显微镜在细胞生物领域的应用范围。STORM、PALM和FPALM在原理上都属于基于单分子定位技术的超分辨显微成像，而基于单分子定位的超分辨技术的核心是，通过对衍射极限内的多个荧光分子多次定位成像，再将每个分子的位置信息进行叠加，从而得到衍射极限距离内分子的位置信息，实现对光学衍射极限的突破。而利用荧光探针标记细胞内不同的目标物进行多色超分辨成像，不仅可以获得单个目标物的超分辨信息，还可以精确分析不同目标物的空间结构与相互关系，极大地加强人们对细胞内复杂的生命现象与过程的探索能力。

目前，由于单分子定位显微术工作方式的特殊性，已产生了数个不同原理的多色成像方法，并广泛地应用到生命科学各个研究领域中。其中基于分光技术的多色成像应用较为广泛，该方法已应用于随机光学重建显微技术(STORM)，光激活定位显微技术(PALM)和受激发射损耗显微技术(STED)。基于分光技术的多色成像是指采用不同发射谱的荧光探针标记样品，然后经同一个激发光辐照，发射出的混合荧光被二色镜分为透射和反射两路光，再分别被透镜聚焦到同一个CCD靶面左右两侧进行成像。但该方法只适用于双色成像，且特别是在待成像物密度较高的情况下两个颜色间的串扰严重，会造成实验假象。

发明内容

本发明针对现有超分辨显微系统对生物样品实现三维成像时，存在在深度方向的分辨率低且限于薄样品和只能实现双色成像且容易产生串扰、假象等问题，提出了一种应用于4pi显微架构的多色超分辨成像系统。该系统利用单分子定位技术和不同荧光分子间的串扰，结合4pi显微技术实现对整个细胞的多色三维超分辨成像。

本发明还提供一种利用上述成像系统进行成像的方法，该方法能够对所需观测样品进行精确定位，提高了成像精度。

一种应用于4pi显微架构的多色超分辨成像系统，包括光源模块、样品台、上显微镜头、下显微镜头、第一四分之一波片、第二四分之一波片、第一二色镜、第二二色镜、第一光路折转匹配单元(第一透镜、第一反射镜、第三透镜、第三反射镜)、第二光路折转匹配单元(第二透镜、第二反射镜、第四透镜、第四反射镜)、第一变形反射镜、第二变形反射镜、第一巴俾涅补偿器、第二巴俾涅补偿器、分束器立方体、第三光路折转匹配单元(第五透镜、第五反射镜、第一正方形孔径、第七反射镜、第九反射镜、第七透镜)、第四光路折转匹配单元(第六透镜、第六反射镜、第二正方形孔径、第八反射镜、第十反射镜、第八透镜)、偏振分束器立方体、第十一反射镜、第十二反射镜、第九透镜、第十透镜、直角棱镜、第三二色镜、第十一透镜、第十二透镜、第一成像器件、第二成像器件；

所述光源模块包括用于荧光激活的第一激光器和用于荧光激发或漂白的第二激光器以及用于在两激光器之间切换的选频切换模块；

由第一激光器输出激活光，经过第一二色镜反射、第一四分之一波片和上显微镜头后照射到样品上激活荧光蛋白；

由选频切换模块切换为第二激光器输出的激发光经过第一二色镜反射、第一四分之一波片和上显微镜头后照射到样品上激发荧光，荧光散射的光同时被上显微镜头和下显微镜头收集，然后形成两个光路，分别为第一光路和第二光路，第一光路中：由上显微镜头收集的荧光经过第一四分之一波片后，再经第一二色镜的透射、第一光路折转匹配单元、第一变形反射镜和第一巴俾涅补偿器后进入到分束器立方体；第二光路中：由下显微镜头收集的荧光经过第二四分之一波片后，再经第二二色镜的透射、第二光路折转匹配单元、第二变形反射镜和第二巴俾涅补偿器后进入分束器立方体；第一光路的荧光和第二光路的荧光在分束器立方体相遇并产生干涉，产生干涉光；

所述干涉光经过分束器立方体后被分为两束光，然后通过第三光路和第四光路入射至偏振分束器立方体的对应接受面，即：偏振分束器立方体出射的两束光分别经过第三光路折转匹配单元和第四光路折转匹配单元后在偏振分束器立方体再次相遇，并且偏振分束器立方体将入射的两束光中的s和p两个分量分离形成两束光出射，从偏振分束器立方体出射的一路光(上光路，或者第五光路中)经过第五光路折转匹配单元(第十一反射镜、第九透镜)和另一路光(下光路，或者第六光路中)经过第六光路折转匹配单元(第十二反射镜、第十透镜)后分别经直角棱镜两个面反射后入射到第三二色镜上，经第三二色镜透射的荧光经过第十一透镜后进入第一成像器件成像，经第三二色镜反射的荧光经过第十二透镜后进入第二成像器件成像；

继续利用激发光对样品进行宽场照明来漂白已经成像的荧光光子，使他们不能够被下一轮的激光再激活出来，重复利用激活光和激发光来激活、激发和漂白荧光光子，多次成像后，同时联合样品台的移动，将这些荧光光子的图像合成到一张图上实现对样品的精确定位。

本发明中，所述的选频切换模块为声光可调谐滤波器，光源模块在使用不同光源对荧光蛋白进行激活或者淬灭时，需要通过声光可调谐滤波器进行选频切换，以输出不同的激光光束。作为进一步优选，所述光源模块包括第一激光器、第二激光器、第十三反射镜、第四二色镜、第十四反射镜、声光可调谐滤波器、挡光板、第十五反射镜、第十六反射镜和单模光纤，其中：第一激光器发射的激光经过第十三反射镜反射、第四二色镜透射、第十四反射镜反射后到达声光可调谐滤波器；第二激光器发射的激光经过第四二色镜反射第十四反射镜反射后到达声光可调谐滤波器；声光可调谐滤波器的当前选定的激光经过第十五反射镜反射、第十六反射镜后通过单模光纤输出；声光可调谐滤波器出射的其他激光被挡光板遮挡。

本发明中，所述上显微镜头和下显微镜头的设置主要用于实现高通量荧光信号采集，提高荧光采集效率，获得光谱数据的同时不影响空间定位分辨率。

本发明中，第一四分之一波片用于将光源模块输出的线偏光转化为圆偏光，第二四分之一波片用于调整下光路的光程，使上下两个光路的光程一致。

本发明中，所述第一二色镜对激发光和激活光表现为高反，对荧光表现为高透。所述第二二色镜对荧光表现为高透，对激发光和激活光表现为高反。所述的高透，是指透射率在98％以上；所述的高反，是指反射率在98％以上，具体为98％～99.9％。

本发明中，所述第一光路折转匹配单元主要用于缩小上显微镜头的出瞳大小，使其与第一可变形反射镜的活动区域相匹配；第二光路折转匹配单元主要用于缩小下显微镜头的出瞳大小，使其与第二可变形反射镜的活动区域相匹配。

作为优选，所述第一光路折转匹配单元包括按照光路依次设置的第一透镜、第一反射镜、第三透镜、第三反射镜；所述第一二色镜透射的荧光入射至所述第一透镜，所述第三反射镜反射的荧光照射至所述第一变形反射镜。所述第二光路折转匹配单元包括按照光路依次设置的第二透镜、第二反射镜、第四透镜、第四反射镜。所述第二二色镜透射的荧光入射至所述第二透镜，所述第四反射镜反射的荧光照射至所述第二变形反射镜。

本发明中，所述第一变形反射镜和第二变形反射镜用于校正样品表面不平整性和内部折射率分布不均匀性产生的荧光的波前变化，以及对荧光进行相位补偿，改变点扩散函数的形状(延展或拉伸)，从而达到当单分子与上显微物镜和下显微物镜同轴时，即当样品台在上显微物镜和下显微物镜的同轴上移动时，通过辨识成像器件中的图像形状来达到单分子精确定位的目的。

本发明中，所述第一巴俾涅补偿器和第二巴俾涅补偿器用于调节s光和p光两个分量之间的相位差，使得s光和p光的相位相差π/2。

本发明中，由于所述第一光路和第二光路无光程差，所述分束器立方体用于让两条光路的荧光产生相长干涉，光强为原来的四倍，并将相干光束均匀地分为两束光。

本发明中，所述第三光路折转匹配单元和第四光路折转匹配单元主要用于实现对光路的导向以及光路的匹配，同时进一步优化了系统的构建，提高了整个系统的紧凑性。

作为优选，所述第三光路折转匹配单元包括按照光路依次设置的第五透镜、第五反射镜、第一正方形孔径、第七反射镜、第九反射镜、第七透镜；所述分束器立方体出射的一束荧光照射至所述第五透镜，所述第七透镜出射的荧光照射至所述偏振分束器立方体的一个接收面。第四光路折转匹配单元包括按照光路依次设置的第六透镜、第六反射镜、第二正方形孔径、第八反射镜、第十反射镜、第八透镜；所述分束器立方体出射的另一束荧光照射至所述第六透镜，所述第八透镜出射的荧光照射至所述偏振分束器立方体的另一个接收面。其中第一正方形孔径和第二正方形孔径用于滤除杂散光。

作为优选，所述第五光路折转匹配单元包括按照光路依次设置的第十一反射镜和第九透镜，所述偏振分束器立方体出射的一束光照射至所述第十一反射镜，所述第九透镜的出射光照射至直角棱镜的一个接收面；所述第六光路折转匹配单元包括按照光路依次设置的第十二反射镜和第十透镜，所述偏振分束器立方体出射的另一束光照射至所述第十二反射镜，所述第十透镜的出射光照射至直角棱镜的另一个接收面。

本发明中，所述偏振分束器立方体用于让入射的两束光中相差π/2相位的s光和p光两个分量均产生相长干涉和相消干涉，并将s光和p光分量分离，从而形成四个分量，其中两个s光分量最终形成的是两个中间相位分别为π/2和3π/2的图像，两个p光分量最终形成的是两个端点相位0和π的图像，且四个分量的光强与原来入射到偏振分束器立方体的两束光光强等同，这样每个荧光分子最终得到四个图像，分别为s光和p光干涉的两对信号，这四个点的荧光强度随着Z轴的变化而变化，他们之间的相位差为π/2，这样通过这四个点的荧光强度值同样可以求得荧光分子的Z轴位置。

本发明中，所述直角棱镜用于改变光的进行方向，从而调整其成像位置，将两路光(上光路和下光路)包含的四个分量展开，进而形成四束光。并经过第三二色镜的透射和反射后分别进入第一成像器件和第二成像器件进行成像。

本发明中，所述第三二色镜用于高反低于截止波长的荧光而高透高于截止波长的荧光。

本发明在实际检测时，需要预先采用至少两种荧光染料对样品进行标记。用荧光染料标记样品前，先对每种荧光染料分别进行预先标定，即将荧光直接置于样品台上，利用激发光激发荧光按照上述光路入射到第三二色镜时，第三二色镜高透高于截止波长的荧光经过第十一透镜会聚后进入第一成像器件进行成像，高反低于截止波长的荧光经过第十二透镜会聚后进入第二成像器件成像，利用上述成像原理对荧光光子进行反复标定，并将每种荧光光子的位置绘制成图像。然后用这些荧光染料去标记样品，由于用的是同一束激发光和激活光，所选用的是发射波长相近(即荧光光谱峰值约相差12nm到25nm)的荧光染料，荧光染料可以是两种或者两种以上(比如可以采用AF647、CF660C和CF680三种荧光染料进行标记)，当荧光染料被激发成像时，荧光染料光谱重叠部分会产生串扰，利用荧光染料间的串扰，即通过对比荧光染料光谱重叠部分经过第三二色镜高反和高透两个通道的荧光信号的强弱进行比例成像来标定荧光光子的位置，之后对照前面绘制的荧光光子的图像来判定荧光染料的颜色对所需观测样品进行精确定位，实现多色超分辨成像，该方法仅用于单分子定位成像系统。

作为优选，所述第三二色镜高反与高透对应的截止波长为685nm。

作为优选，所述第一激光器的中心波长为405nm；所述第二激光器1的中心波长为633nm。

作为优选，所述分束器立方体的分光比为50：50。

作为优选，所述偏振分束器立方体的分束镀膜的波长范围为620nm到1000nm，消光比为T_p:T_s＞1000:1。

本发明的样品台可以在水平方向和垂直方向上按照设定速度进行往复移动，对样品实现多区域的逐层扫描以便实现对整个样品的三维超分辨成像。相对于现有技术，本发明具有以下有益的技术效果：

1、本发明引入变形反射镜灵活地补偿样品造成的波前的变化，实现相位补偿，从而达到当单分子与上显微物镜和下显微物镜同轴时，即当样品台在上显微物镜和下显微物镜的同轴上移动时，通过辨识成像器件中的图像形状来定位单分子的目的，从而提高轴向成像精度。

2、本发明属于同步采集方式，只需要一个激发光源，一个激活光源，一次数据采集过程同时获得多个颜色通道的数据，不仅节省时间，图片叠加也不需要进行额外位置校正。

3、本发明选用一个系列的荧光染料或者光谱峰值相近的荧光染料进行标记，利用一片二色镜和不同荧光分子间的串扰，即通过对比荧光染料光谱重叠部分经过第三二色镜高反和高透两个通道的荧光信号的强弱进行比例成像来标定荧光光子的位置，对照先前标定的荧光光子的图像来判定荧光染料的颜色对所需观测样品进行精确定位，从而实现对样品的多色超分辨成像，有效避免了不同荧光分子间的串扰造成的假象，同时简化系统的复杂程度。

因此，本发明的技术方案与原有技术相比，该系统利用单分子定位技术和不同荧光分子间的串扰，结合4pi显微技术实现对整个细胞的多色三维超分辨成像。

附图说明

图1为本发明：一种应用于4pi显微架构的多色超分辨成像系统的一个实施例的光路图；

其中：光源模块1、样品台2、上显微镜头3、下显微镜头4、第一四分之一波片5、第二四分之一波片6、第一二色镜7、第二二色镜8、第一透镜9、第二透镜10、第一反射镜11、第二反射镜12、第三透镜13、第四透镜14、第三反射镜15、第四反射镜16、第一变形反射镜17、第二变形反射镜18、第一巴俾涅补偿器19、第二巴俾涅补偿器20、分束器立方体21、第五透镜22、第六透镜23、第五反射镜24、第六反射镜25、第一正方形孔径26、第二正方形孔径27、第七反射镜28、第八反射镜29、第九反射镜30、第十反射镜31、第七透镜32、第八透镜33、偏振分束器立方体34、第十一反射镜35、第十二反射镜36、第九透镜37、第十透镜38、直角棱镜39、第三二色镜40、第十一透镜41、第十二透镜42、第一成像器件43、第二成像器件44。

图2为本发明：光源模块的结构示意图；

其中：第一激光器1(A)、第二激光器1(B)、第十三反射镜45、第四二色镜46、第十四反射镜47、声光可调谐滤波器48、挡光板49、第十五反射镜50、第十六反射镜51、单模光纤52。

图3为AF647、CF660C和CF680三种染料的预先标定结果。

具体实施方式

下面结合说明书附图来详细说明本发明，但本发明并不限于此。

如图1所示是本发明一种应用于4pi显微架构的多色超分辨成像系统的一个实施例的光路图，该实施例的系统包括：

光源模块1、样品台2、上显微镜头3、下显微镜头4、第一四分之一波片5、第二四分之一波片6、第一二色镜7、第二二色镜8、第一透镜9、第二透镜10、第一反射镜11、第二反射镜12、第三透镜13、第四透镜14、第三反射镜15、第四反射镜16、第一变形反射镜17、第二变形反射镜18、第一巴俾涅补偿器19、第二巴俾涅补偿器20、分束器立方体21、第五透镜22、第六透镜23、第五反射镜24、第六反射镜25、第一正方形孔径26、第二正方形孔径27、第七反射镜28、第八反射镜29、第九反射镜30、第十反射镜31、第七透镜32、第八透镜33、偏振分束器立方体34、第十一反射镜35、第十二反射镜36、第九透镜37、第十透镜38、直角棱镜39、第三二色镜40、第十一透镜41、第十二透镜42、第一成像器件43、第二成像器件44。

图2是本发明光源模块的结构示意图，包括：第一激光器1(A)、第二激光器1(B)、第十三反射镜45、第四二色镜46、第十四反射镜47、声光可调谐滤波器48、挡光板49、第十五反射镜50、第十六反射镜51、单模光纤52。

其中，第一激光器1(A)为Coherent公司的PowerLine连续光半导体激光器，中心波长为405nm。第二激光器1(B)为武汉东隆科技有限公司的飞秒激光器，中心波长为633nm。

首先由光源模块1中的第一激光器1(A)输出激活光，经过第一二色镜7反射到达第一四分之一波片5，第一四分之一波片5将第一激光器1(A)输出的线偏光变为圆偏光并通过上显微镜头3照射到样品上激活荧光蛋白；此时光源模块1中由声光可调谐滤波器48产生声光衍射机制进行选频切换为第二激光器1(B)输出的激发光经过第一二色镜7反射到达第一四分之一波片5，第一四分之一波片5将第二激光器1(B)输出的线偏光变为圆偏光并通过上显微镜头3后照射到样品上激发荧光，荧光散射的光同时被上显微镜头3和下显微镜头4收集；此后形成两个光路，分别为第一光路和第二光路，第一光路中由上显微镜头3收集的荧光经过第一四分之一波片5后，再经第一二色镜7的透射、第一透镜9、第一反射镜11反射、第三透镜13、第三反射镜15反射、第一变形反射镜17对荧光进行相位补偿和第一巴俾涅补偿器19调节荧光中的s和p两个分量之间的相位差为π/2后进入到分束器立方体21；第二光路中由下显微镜头4收集的荧光经过第二四分之一波片6后，再经第二二色镜8的透射、第二透镜10、第二反射镜12反射、第四透镜14、第四反射镜16反射、第二变形反射镜18对荧光进行相位补偿和第二巴俾涅补偿器20调节荧光中的s和p两个分量之间的相位差为π/2后进入到分束器立方体21；第一光路的荧光和第二光路的荧光在分束器立方体21相遇并产生干涉，得到的干涉光经过分束器立方体21后被分为两束荧光，其中一束荧光进入第三光路，经过第五透镜22、第五反射镜24反射、第一正方形孔径26滤光、第七反射镜28反射、第九反射镜30反射、第七透镜32后进入偏振分束器立方体34；另一束荧光进入第四光路，经过第六透镜23、第六反射镜25反射、第二正方形孔径27滤光、第八反射镜29反射、第十反射镜31反射、第九透镜33后进入偏振分束器立方体34，偏振分束器立方体34让出射的两束光中相差π/2相位的s光和p光两个分量均产生相长干涉和相消干涉，并将s光和p光分量分离；从偏振分束器立方体34出射的上光路经过第五光路的第十一反射镜35反射、第九透镜37和下光路经过第六光路的第十二反射镜36反射、第十透镜38后分别经直角棱镜39两个面反射后入射到第三二色镜40上，经第三二色镜40透射的荧光经过第十一透镜41后进入第一成像器件43成像，经第三二色镜40反射的荧光经过第十二透镜42后进入第二成像器件44成像；继续利用激发光对样品进行宽场照明来漂白已经成像的荧光光子，使他们不能够被下一轮的激光再激活出来，重复利用激活光和激发光来激活、激发和漂白荧光光子，多次成像后，将这些荧光光子的图像合成到一张图上实现对样品的精确定位；最后通过调整样品台在水平方向和垂直方向上按照设定速度进行往复移动，即对样品实现多区域的逐层扫描以便实现对整个样品的三维超分辨成像。

本实施例中，如图2，光源模块1包括用于激活的第一激光器1(A)和用于荧光激发的第二激光器1(B)，其中第一激光器1(A)发射的激光经过第十三反射镜45反射、第四二色镜透射46、第十四反射镜47反射后到达声光可调谐滤波器48；第二激光器1(B)发射的激光经过第四二色镜46反射、第十四反射镜47反射后到达声光可调谐滤波器48；声光可调谐滤波器48的当前选定的激光经过第十五反射镜50反射、第十六反射镜51后通过单模光纤52输出；声光可调谐滤波器出射的其他激光被挡光板49遮挡。由第十三反射镜45、第十四反射镜47以及第四二色镜46将第一激光器1(A)和第二激光器1(B)输出的两束激光传播路径调整重叠，并由声光可调谐滤波器48产生的声光衍射机制进行选频，最后通过第十五反射镜50和第十六反射镜51将出射光耦合进单模光纤52中；光源模块1在使用不同光源对荧光蛋白进行激活或者淬灭时，需要通过声光可调谐滤波器48进行选频切换，而挡光板用于遮挡0级衍射光。

本实施例中，用荧光染料标记样品前，先对每种荧光染料分别进行预先标定，即利用激发光激发荧光按照上述光路入射到第三二色镜40时，第三二色镜40高透高于截止波长的荧光经过第十一透镜41后进入第一成像器件43进行成像，高反低于截止波长的荧光经过第十二透镜42后进入第二成像器件44成像，对比两个成像器件上的荧光信号的强弱来标定荧光光子的位置，利用上述成像原理对荧光光子进行反复标定，并将每种荧光光子的位置绘制成图像，然后用这些荧光染料去标记样品，当荧光染料被激发成像时，对照前面绘制的荧光光子的图像来进行精确定位，实现多色超分辨成像。选用高反与高透对应的截止波长为685nm的第三二色镜40。

本实施例中，上显微镜头3和下显微镜头4均选用奥林巴斯公司生产的型号为XLPN25XSVMP的专用物镜，放大倍率为25倍，数值孔径为1.0，工作距离4mm。

本实施例中，选用了三种荧光染料进行预先标定，分别为AF647、CF660C和CF680，标定结果如图3所示。

本实施例中，声光可调谐滤波器48为AUNION TECH公司的多通道声光调制器，允许波长范围为350nm到850nm。

本实施例中，第一变形反射镜17和第二变形反射镜18用于校正样品表面不平整性和内部折射率分布不均匀性产生的荧光的波前变化，以及对荧光进行相位补偿，改变点扩散函数的形状(延展或拉伸)，从而达到当单分子与上显微物镜和下显微物镜同轴时，即当样品台在上显微物镜和下显微物镜的同轴上移动时，通过辨识成像器件中的图像形状来达到单分子精确定位的目的。

本实施例中，第一巴俾涅补偿器19和第二巴俾涅补偿器20用于调节s和p两个分量之间的相位差，使得s光和p光的相位相差π/2。第一巴俾涅补偿器19和第二巴俾涅补偿器20均选用美国THORLABS公司的索累-巴俾涅补偿器。

本实施例中，分束器立方体21用于将第一光路和第二光路中的荧光产生的干涉光分为两束光。分束器立方体21选用美国THORLABS公司的非偏振立方体分束器，分光比为50：50。偏振分束器立方体34用于让出射的两束光中相差π/2相位的s光和p光两个分量均产生相长干涉和相消干涉，并将s光和p光分量分离，从而形成四个分量，其中两个s光分量最终形成的是两个中间相位分别为π/2和3π/2的图像，两个p光分量最终形成的是两个端点相位0和π的图像，且四个分量的光强与原来入射到偏振分束器立方体的两束光光强等同，这样每个荧光分子最终得到四个图像，分别为s光和p光干涉的两对信号，这四个点的荧光强度随着Z轴的变化而变化，他们之间的相位差为π/2，这样通过这四个点的荧光强度值同样可以求得荧光分子的Z轴位置。偏振分束器立方体34选用美国THORLABS公司的宽带偏振立方体分束器，分束镀膜的波长范围为620nm到1000nm，消光比为T_p:T_s＞1000:1。

本实施例中，直角棱镜39选用美国THORLABS公司的直角棱镜。

本实施例中，第三二色镜40高反与高透对应的截止波长为685nm。

本实施例中，第一成像器件43和第二成像器件44均选用为Hamamatsu公司的ORCA-Flash4.0 C13440-20CU型S-CMOS相机。

本实施例中，样品台可以在水平方向和垂直方向上按照设定速度进行往复移动，对样品实现多区域的逐层扫描以便实现对整个样品的三维超分辨成像。

最后需要说明的是，以上实施方式仅用以说明本发明的技术方案而非限制，本领域的普通技术人员来说不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干变型和改进，这也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种应用于4pi显微架构的多色超分辨成像系统，其特征在于，包括：能够单独提供激活光和激发光的光源模块、能够进行三维移动的样品台、上显微镜头、下显微镜头、第一四分之一波片、第二四分之一波片、第一二色镜、第二二色镜、第一光路折转匹配单元、第二光路折转匹配单元、第一变形反射镜、第二变形反射镜、第一巴俾涅补偿器、第二巴俾涅补偿器、分束器立方体、第三光路折转匹配单元、第四光路折转匹配单元、偏振分束器立方体、第十一反射镜、第十二反射镜、第九透镜、第十透镜、直角棱镜、第三二色镜、第十一透镜、第十二透镜、第一成像器件、第二成像器件；

所述光源模块输出的激活光，经过第一二色镜反射、第一四分之一波片和上显微镜头后照射到样品上激活荧光蛋白；所述光源模块输出的激发光经过第一二色镜反射、第一四分之一波片和上显微镜头后照射到样品上激发荧光，荧光散射的光同时被上显微镜头和下显微镜头收集；

上显微镜头收集的荧光经过第一四分之一波片后，再经第一二色镜的透射、第一光路折转匹配单元的光路匹配、第一变形反射镜的相位补偿、和第一巴俾涅补偿器调节后进入到分束器立方体；由下显微镜头收集的荧光经过第二四分之一波片后，再经第二二色镜的透射、第二光路折转匹配单元的光路匹配、第二变形反射镜的相位补偿和第二巴俾涅补偿器调节后进入分束器立方体；两束荧光在分束器立方体相遇并产生干涉，得到干涉光；

所述干涉光经过分束器立方体后被分为两束光，两束光分别进入第三光路折转匹配单元和第四光路折转匹配单元后在偏振分束器立方体再次相遇，偏振分束器立方体将入射的两束光中的s和p两个分量分离，形成两路光出射；

从偏振分束器立方体出射的两路光分别经过第五光路折转匹配单元和第六光路折转匹配单元后，分别照射至直角棱镜两个面，经直角棱镜两个面反射后得到四束光，然后入射到第三二色镜上，经第三二色镜透射的荧光经过第十一透镜后进入第一成像器件成像，经第三二色镜反射的荧光经过第十二透镜后进入第二成像器件成像；

重复利用激活光和激发光来激活、激发和漂白荧光光子，多次成像，同时配合所述样品台的移动，将得到若干荧光光子的图像合成到一张图上实现对样品的成像；

所述光源模块包括用于荧光激活的第一激光器和用于荧光激发的第二激光器以及用于在两激光器之间切换的选频切换模块，所述选频切换模块为声光可调谐滤波器；

所述第一光路折转匹配单元包括按照光路依次设置的第一透镜、第一反射镜、第三透镜、第三反射镜，所述第一二色镜透射的荧光入射至所述第一透镜，所述第三反射镜反射的荧光照射至所述第一变形反射镜；所述第二光路折转匹配单元包括按照光路依次设置的第二透镜、第二反射镜、第四透镜、第四反射镜，所述第二二色镜透射的荧光入射至所述第二透镜，所述第四反射镜反射的荧光照射至所述第二变形反射镜；

所述第三光路折转匹配单元包括按照光路依次设置的第五透镜、第五反射镜、第一正方形孔径、第七反射镜、第九反射镜、第七透镜，所述分束器立方体出射的一束荧光照射至所述第五透镜，所述第七透镜出射的荧光照射至所述偏振分束器立方体的一个接收面；所述第四光路折转匹配单元包括第六透镜、第六反射镜、第二正方形孔径、第八反射镜、第十反射镜、第八透镜，所述分束器立方体出射的另一束荧光照射至所述第六透镜，所述第八透镜出射的荧光照射至所述偏振分束器立方体的另一个接收面；

所述第三二色镜高反与高透对应的截止波长为685nm；

所述第一激光器的中心波长为405nm；所述第二激光器的中心波长为633nm；

所述第一变形反射镜和第二变形反射镜用于校正折射率不均匀导致的像差，以及对荧光进行相位补偿；通过第一变形反射镜和第二变形反射镜改变点扩散函数的形状，从而达到当单分子与上显微物镜和下显微物镜同轴时，即当样品台在上显微物镜和下显微物镜的同轴上移动时，通过辨识成像器件中的图像形状来达到单分子精确定位的目的。

2.根据权利要求1所述的应用于4pi显微架构的多色超分辨成像系统，其特征在于，所述第五光路折转匹配单元包括按照光路依次设置的第十一反射镜和第九透镜，所述偏振分束器立方体出射的一束光照射至所述第十一反射镜，所述第九透镜的出射光照射至直角棱镜的一个接收面；所述第六光路折转匹配单元包括按照光路依次设置的第十二反射镜和第十透镜，所述偏振分束器立方体出射的另一束光照射至所述第十二反射镜，所述第十透镜的出射光照射至直角棱镜的另一个接收面。

3.根据权利要求1所述的应用于4pi显微架构的多色超分辨成像系统，其特征在于，所述分束器立方体的分光比为50：50；所述偏振分束器立方体的分束镀膜的波长范围为620nm到1000nm，消光比为T_p: T_s＞1000:1。

4.一种利用权利要求1所述的应用于4pi显微架构的多色超分辨成像系统进行成像的方法，其特征在于，包括：用荧光染料标记样品前，先对每种荧光染料分别进行预先标定，并将每种荧光光子的位置绘制成图像，然后再用这些荧光染料去标记样品，利用权利要求1所述的成像系统进行成像后，对照前面绘制的荧光光子的图像来判定荧光染料的颜色对所需观测样品进行精确定位，实现多色超分辨成像；标记用的荧光染料为发射波长相差12nm到25nm的两种或这两种以上的荧光染料。