CN106461925A - 用于具有自适应光学系统的拉曼散射光学显微镜的系统和方法 - Google Patents
用于具有自适应光学系统的拉曼散射光学显微镜的系统和方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种用于拉曼散射显微镜的光学设备，该光学设备包括：激光源(10)，其适于以激发波长λ发射激光束(11)；显微镜物镜(14)，其适于接收激光束(11)，并且将激光束聚焦到显微镜物镜(14)的像平面中，所聚焦的激光束(21)旨在照射样品(20)；光学系统，其适于收集拉曼散射光束(22)；以及检测部件(16，17)，其适于检测收集的拉曼散射束(22)。更特别地，本发明提出了拉曼散射显微镜设备，其进一步包括自适应光学系统(31，32，33)，该自适应光学系统(31，32，33)位于激发激光束(11)的光路上，位于拉曼散射束(22)的光路上，或位于对激发激光束(11)和拉曼散射光束(22)公用的光路上。
Description
技术领域
本发明涉及用于材料或生物样品的分析的光学显微镜或拉曼显微测谱术的领域。
背景技术
在拉曼显微镜中，样品由一般是激光束的激发束照射，并且观察到以与激发束的波长不同的波长散射的光。拉曼显微镜因而不同于传统的显微镜技术，在传统的显微镜技术中观察到由样品以相同波长反射、透射或弹性散射的光。
存在拉曼显微镜设备，其包括例如光学显微镜、激光源、显微镜物镜和光谱仪。显微镜物镜将激光束聚焦在样品上的焦点处，并形成散射束。散射束包括称为在激发激光的波长处的弹性散射分量或瑞利散射分量的分量，以及称为在与激发激光的波长不同并且取决于样品的性质和结构的波长处的拉曼散射分量的分量。瑞利散射的强度比拉曼散射的强度高得多，其中强度比一般约为106。选择性波长滤波器，例如陷波滤波器，允许拉曼散射与瑞利散射分离，以便允许检测并分析拉曼散射束的光谱。
拉曼显微镜在材料的微量分析和生物芯片分析中具有多种用途，在生物芯片分析中大量的生物细胞在载玻片上以矩阵形式放置。
自适应光学系统是已知的，其具有可以以电子方式修改以例如实时校正某些光学干扰或像差的影响的反射或折射的光学特性。存在包含反射镜或微镜的自适应光学系统，其中微致动器允许反射光学表面被引导或变形。同样存在经由透射起作用的自适应光学系统，例如包含液晶的调制器(SLM或空间光调制器)，其允许束的分量根据强度、相位和/或偏振而在空间上修改。
特别是具有可变形反射镜的自适应光学系统已经在天文学上使用了数年，例如以实时校正在望远镜中的光学像差。
最近以来，自适应光学系统已经在传统的光学显微镜中实现，以校正显微镜本身的光学像差或由样品中的非均匀性导致某些光学像差。
2007年365期的2829-843的英国皇家学会生物科学的出版物booth，M.J.的“在显微镜中的自适应光学装置”(The publication Booth,M.J.,“Adaptive optics inmicroscopy”,Phil.Trans.R.Soc.A 2007 365,2829-843)公开了在共焦荧光显微镜中可变形反射镜(DM)的实施，以校正由样品导致的变形。
国际光学工程学会会议记录2008-02-07第6860卷第68600T-1-68600T-9、XP55139955的出版物Girkin、John M等人的“应用到相干反斯托克斯拉曼散射显微镜的自适应光学装置”(The publication Girkin,John M.et al.,“Adaptive optics appliedto coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy”,Proc.SPIE,vol.6860,2008-02-07,pages68600T-1-68600T-9,XP55139955)公开了一种相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)显微镜，其包括具有位于两个激发激光束的路径上的可变形反射镜的自适应光学系统。
此外，专利文献US 2013/278744A1描述了包括自适应光学装置的共焦光学显微镜设备。
然而，已知的是，自适应光学系统引起了某些困难：它们使用起来非常复杂，并且需要波前检测器或复杂的信号处理算法。在一般情况下，自适应光学系统的使用需要非常复杂的校准程序。自适应光学系统本身导致同样需要进行补偿的光学像差。在束成形用途中，激光束的尺寸必须适配于可变形反射镜的大小、具有可调节焦距的液体透镜的大小，或液晶反射镜的大小，因为在样品上的衍射图案的分辨率取决于该尺寸。最后，透射自适应光学系统被配置成在相当宽的波长范围内操作，但并不覆盖从紫外线(UVB)到近红外(NIR)的整个光谱范围，该整个光谱范围是拉曼光谱测定法的光谱范围。
在现有技术的拉曼显微测谱术设备中获得令人满意的信噪比的困难对本领域的技术人员是已知的。因此，任何附加光学系统必然导致经由反射或透射的损耗。
诸如相位调制系统的某些自适应光学系统具有不相互补偿的缺点：在前向路径上导致的相移没有由返回路径的相移补偿。因此，有必要在入射激光束的路径上放置相位调制系统，并且在拉曼束的路径上放置另一个相位调制系统，这将使困难和装置的成本加倍。
此外，拉曼信号对其穿过的光学材料特别敏感，并且玻璃有时在光谱中引入荧光或寄生峰，污染样品的分析。
本领域的技术人员因此通常受阻于将附加光学系统(特别是复杂的自适应光学系统)插入到激发激光束或拉曼散射束的光路中，因为该光学系统可进一步减少拉曼显微测谱术信号的信噪比。
然而，在一般情况下，期望提高拉曼散射显微测谱术设备的亮度、空间分辨率和光谱分辨率，以便允许样品的更精确分析，或允许(就像落射萤光)获得具有更好的空间分辨率和较小的采集时间的拉曼地图(拉曼映射)，这是因为它们带来更好的功率密度同时限制光学像差。
此外，拉曼显微测谱术设备对可随温度上或振动上的变化出现的光学对准缺陷非常敏感。存在基于平面反射镜用于校正光学未对准的系统，该平面反射镜的取向根据参考光谱的拉曼信号的强度可自动调节。然而，这种系统不允许实时校正所有的光学对准缺陷。
发明内容
为了克服现有技术的上述缺点，本发明提出了一种拉曼显微镜设备或拉曼显微测谱设备，包括：激光源，其适于以激发波长λ发射激光束；显微镜物镜，其适于接收激光束，并且将激光束聚焦到显微镜物镜的像平面中，所聚焦的激光束旨在照射样品；光学系统，其适于收集在样品上的拉曼散射光束；检测部件，其适于检测收集的拉曼散射束；以及滤波部件，其适于接收散射光束并且将散射光束分离成瑞利散射束和拉曼散射束。
更特别地，本发明提出了拉曼显微镜或拉曼显微测谱设备，其进一步包括自适应光学系统，该自适应光学系统位于激发激光束的光路上，位于拉曼散射束的光路上，或位于对激发激光束和拉曼散射光束公用的光路上。
有利地，本发明允许提高拉曼显微镜或拉曼显微测谱设备的空间分辨率(PSF或点扩散函数)，和/或获得拉曼散射信号的更好信噪比。本发明还允许执行样品的形态分析。
根据各种实施例的特定和有利的方面：
-拉曼显微镜或拉曼显微测谱设备是共焦的并包括位于显微镜物镜和检测部件之间的共焦孔，以及所述自适应光学系统位于共焦孔的上游和/或下游的拉曼散射束的光路上。
-激光束具有高斯横截面，共焦孔具有非圆形或角形状，并且所述自适应光学系统被配置成在共焦孔的平面中将在样品上聚焦的激光束的横截面适配于共焦孔的形状。
-拉曼显微镜或拉曼显微测谱设备进一步包括位于由样品反射的激光束的光路上的波前检测器，该波前检测器位于与显微镜物镜的像平面光学共轭的平面中，以及该波前检测器适于检测在显微镜物镜的像平面中的样品的位置。
-所述自适应光学系统包括串联地位于在激光源和显微镜物镜之间的激光束的光路上的至少两个自适应反射镜，所述自适应反射镜每一个具有可变焦距，并且以形成具有可变横向放大率的聚焦自适应光学系统或具有可变放大率的远焦自适应光学系统的这种方式被定位，并且自适应光学系统被配置成根据显微镜物镜的入口光瞳的直径和/或根据激发波长来修改在显微镜物镜的入口光瞳上的激光束的直径。
-所述自适应光学系统位于激光源和显微镜物镜的像平面之间，并且自适应光学系统被配置成在空间上调制在显微镜物镜的像平面中的激光束的强度。
-所述自适应光学系统被配置成根据分析的样品来动态调制在显微镜物镜的像平面中或在显微镜物镜的光瞳平面中的激光束的强度和/或相位和/或偏振。
-拉曼散射显微镜设备包括适于接收并测量拉曼散射束的拉曼光谱仪，所述自适应光学系统位于显微镜物镜和拉曼光谱仪之间的拉曼散射束的光路上，以及所述自适应光学系统被配置成动态调制在拉曼光谱仪的入口处的拉曼散射束的强度和/或相位和/或偏振，以便在检测到的拉曼信号中减少光学像差，诸如由拉曼光谱仪导致的像散。
-所述自适应光学系统位于共焦孔与光谱仪的入口狭缝之间的拉曼散射束的光路上，以及所述自适应光学系统被配置成在光谱仪的入口狭缝上形成共焦孔的图像。
本发明同样涉及一种拉曼显微或拉曼显微测谱方法，包括以下步骤：
-以激发波长λ发射激光束；
-将激光束聚焦到显微镜物镜的像平面中，聚焦的激光束旨在照射样品；
-收集散射光束；
-以将所述束分离成弹性散射束或瑞利散射束和拉曼散射束或荧光束的这种方式，将散射光束滤波；以及
-检测收集的拉曼散射束。
根据本发明，该方法进一步包括如下步骤：以校正由在显微镜和光谱仪之间的耦合导致的所有形式的像差的方式，修改自适应光学系统的光学特性，该自适应光学系统位于激发激光束的光路上，位于拉曼散射束的光路上，或位于对激发激光束和拉曼散射光束公用的光路上。
本发明可特别有利地用在用于拉曼显微测谱术和/或荧光的设备和方法中。
本发明同样涉及在以下描述中提到的特征，其应单独或以其所有技术上可能的组合来考虑。
附图说明
参考附图，给定为非限制性示例的该描述将使得更容易理解本发明如何实现，在附图中：
-图1示意性表示根据本发明的实施例的拉曼光学显微测谱设备；
-图2示意性表示根据本发明的实施例的配置成形成在共焦孔上的高斯激光束的图像的自适应光学系统；
图3示出根据本发明的特定实施例的光学显微镜设备中的自动聚焦系统；
图4示意性表示根据本发明的另一实施例的配置成校正激发激光束的波前的自适应光学系统。
具体实施方式
装置
图1示意性表示该类型拉曼显微测谱设备的光学显微镜设备100。光学显微镜设备100包括激光源10，其适于以激发波长λ发射激光束11。激光源可以选自激光二极管、气体激光器、固态激光器和二极管泵浦激光器。根据激光器的材料和类型，所发射的波长可以在远紫外(244nm，266nm)中，在近紫外范围(325nm)中，在可见光范围(405，473，532，633，785和830nm)中，或在近红外(1064nm)中。根据激光源的类型和期望的用途，激光束11可以是连续的或脉冲的。
有利地，光学系统12位于激光源10和显微镜物镜14之间的激光束11的光路上。光学系统12可用于经由自适应光学可变扩束器系统将激光束的大小适配于物镜的光瞳的大小，以便提高在焦点处的空间分辨率并更接近艾里图案(Airy pattern)。光学系统12同样可以用于将一般具有圆形对称的激光束11的形状适配于特定的光瞳形状，例如对于透镜物镜的圆形，或对于卡塞格林物镜(Cassegrain objective)的环形，以便特别在低功率束的情况下(例如在UV中)防止在物镜的入口处的能量损耗。
显微镜物镜14接收激光束11，并形成在显微镜物镜14的像平面中聚焦的激光束21。样品20被放置为接近显微镜物镜14的像平面。聚焦的激光束21因而在具有理想地接近艾里图案的横向尺寸或1.22λ/NA的点处照射样品20，其中NA表示显微镜物镜14的数值孔径。
在如在图1中所示的后向散射配置中，显微镜物镜14收集在关于照射激光束的相反方向上传播的后向散射束22。
一种注入抑制(injection-rejection)滤波器13，例如高通二向色滤波器(边缘滤波器)或带阻滤波器(陷波滤波器)，允许后向散射束22在空间上分离成在激发激光束的波长λ处的瑞利散射束，以及在与波长λ不同的波长处的拉曼散射束220。
共焦孔仅位于拉曼散射束220的路径上。光学系统15位于显微镜物镜14和共焦孔之间的拉曼散射束220的光路上，以便形成在共焦孔上的聚焦的点的图像。另一个光学系统一般形成在光谱仪16的入口狭缝上的共焦孔的图像。光谱仪16可以是衍射光谱仪或色散光谱仪。光谱仪16在空间上将拉曼散射束220分离成各种光谱分量221、223、223。检测器17根据波长或拉曼频率检测一个或多个光谱分量221、222、223的强度。然后，分析系统允许处理并分析光谱分量221、222、223，以便从其中推断样品分析。
在透射配置(未示出)中，光学系统收集通过样品散射并且在与照射激光束的相同方向中传播的束。
最后，在另一个配置中，在与激发激光束的方向横向的方向上收集散射束。
有利地，相同的单显微镜或显微测谱设备可被配置成允许后向散射和正向散射和/或横向散射的测量。
此外，以已知的方式，在扫描显微镜的某些实施例中，显微镜设备进一步包括用于激光束的角位移的部件，其例如由具有一个或两个轴的扫描仪组成，其中聚焦激光束扫描在样品表面上的区域。激光扫描允许创建具有显微分辨率的拉曼图像。在其它用途中，在激光束的扫描期间集成信号，以便平均化在样品区域内的拉曼信号。
在图1中所示的拉曼显微镜设备100包括至少一个自适应光学系统31、32和/或33。
自适应光学系统31位于激光源10和注入抑制滤波器13之间，仅在激发激光束11的光路上。在图1中所示的示例中，自适应光学系统31是经由反射操作的光学系统，例如自适应反射镜光学系统。
自适应光学系统32位于注入抑制滤波器13和显微镜物镜14之间，在对激发激光束11和散射束22(包括瑞利散射和拉曼散射)公用的光路上。在图1中所示的示例中，自适应光学系统32是经由透射操作的光学系统，例如空间光调制器，或SLM。
自适应光学系统33位于注入抑制滤波器13和光谱仪16之间，仅在拉曼散射束220的光路上。在图1中所示的示例中，自适应光学系统33是经由反射操作的光学系统，例如自适应反射镜光学系统。
自适应光学系统31、32和33可以彼此独立地、成对组合或全部一起使用。
在各种光路上的自适应光学系统的位置、数量和类型有利地允许选择与自适应光学系统中的一个相关联的功能，或组合多个自适应光学系统的功能。
自适应光学系统31、32、33可用于根据用途来校正在显微测谱设备中和/或样品中的光学像差。
我们将特别相对于图2-4详细描述几个实施例。
图2示意性地示出了第一实施例，其中自适应光学系统33位于共焦拉曼显微镜中。在一般情况下，在拉曼显微测谱术中，使用具有整体的非圆形形状(例如具有用于拉曼显微测谱术的菱形的形状，或具有在荧光显微镜中的六边形的形状)的共焦孔19。共焦孔19在不透明的基板中制成。然而，来自激光源的激光束11通常是具有圆形横截面的高斯光束。在一般情况下，拉曼散射光束220同样具有关于光轴旋转对称的横截面。
在现有技术中，具有透镜或反射镜的传统光学系统以以下方式在共焦孔19的平面中形成拉曼束的束腰的图像，即以激光束11的直径覆盖共焦孔19的表面全体的方式。当仅期望亮度而不期望共焦时，该图像形成经由在共焦孔19的边缘处渐晕而导致在激光束强度上的损耗，其中孔打开到最大。
在有利的特定第一实施例中，使用自适应光学系统33A，并且该系统被配置成形成用于分析在共焦孔19的平面中的共焦孔的平面中的样品的图像，并且将束的形状适配于共焦孔19的形状。在一个实施例中，自适应光学系统33A由仅位于拉曼散射路径上的自适应光学反射镜组成。该自适应光学反射镜修改入射场的相位或强度，以模型化在孔上的光束的形状使得不同于离开激光源的束的形状。例如，在某些情况下，当孔具有与在焦点21处的图像相同的大小时(具有不引起任何信号损耗的优点，但导致低的共焦性)，因此生成以菱形形状的能量分布。在另一个示例中，在共焦孔内部生成具有椭圆形状的能量分布，该共焦孔敞开并且以如下方式成像在光谱仪的入口狭缝上，即在狭缝高度方向上获得能量分布，而没有在光谱仪的入口狭缝上的渐晕。
在该第一实施例的变型中，另一个自适应光学系统33B位于共焦孔19和光谱仪的入口狭缝之间，在拉曼散射束220的光路上。有利地，另一个自适应光学系统33B在光谱仪的入口狭缝27上形成拉曼散射束220的图像。例如，自适应光学系统33B被配置成将共焦孔的菱形形状适配于光谱仪的入口狭缝27的细长矩形形状，以便最大化检测到的拉曼散射信号的强度。在另一个示例中，自适应光学系统33B被配置成将拉曼散射束220的圆形或椭圆形形状适配于光谱仪的入口狭缝27的细长矩形形状。
该第一实施例提供了在拉曼散射束的亮度上的增益，并且同样允许在孔上和/或在光谱仪的入射狭缝上的再对准，即使共焦特性相对低。
图3示意性示出进一步包括自动聚焦(auto-focusing)或自动聚焦(autofocus)装置的拉曼显微镜或拉曼显微测谱设备的变型。
在现有技术的显微镜设备中，自动聚焦装置通常包括针孔和诸如光电二极管的传感器。分束器或分束器立方体向显微镜物镜14传送激光束的一部分，并向针孔发送由样品表面反射的激光束的一部分，通常为10％。具有例如100微米的直径的针孔位于与显微镜物镜的像平面光学共轭的平面中。传感器位于针孔的后面。透镜将样品表面的图像聚焦到光电二极管。透镜的焦距以这种方式来限定，即，以便具有用于在Z(束的轴)上的良好分辨率以及因此自动聚焦的良好精度的足够放大率。在一般情况下，测微机动系统允许在样品和显微镜物镜之间的相对轴向运动。传感器根据该轴向运动检测反射信号的强度。由光电二极管检测到的最大强度指示在物镜的像平面中样品的反射表面的位置。自动聚焦系统因而允许以这样的方式控制样品承载台的相对轴向运动以及反射到传感器上的信号的采集，即以将样品放置在显微镜物镜的焦平面中的方式。然而这种自动聚焦装置和方法对散焦的方向并不敏感，因为反射束的强度一般在像平面的任一侧上对称减小。在像平面周围来回的至少一个运动是必需的。自动聚焦装置和方法因此一般相当缓慢并且有时收敛困难，因为需要完美的对准，特别是当从远离显微镜物镜的像平面的样品的初始位置起始时。
图3示出了拉曼散射显微镜设备的细节，并且更具体地是在这种显微镜设备中的自动聚焦装置。图3示出了显微镜物镜14、显微镜物镜14的像平面(或焦平面)P1、位于显微镜物镜与像平面P1之间的平面P2，以及位于超出像平面P1的平面P3。
分束器23，例如具有10％的反射系数和90％的透射系数的分束器，向显微镜物镜14传送激光束11，并且向波前检测器18(例如夏克-哈特曼(Shack-Hartmann)传感器或相机)发送由样品表面反射的激光束的一部分31。反射光束的分析允许例如将信号分解成泽尼克多项式(Zernike polynomials)。
第二多项式Z2 0是特别关注的。当样品的反射表面在像平面P1中时，检测到具有确定的形状(例如平坦)的波前信号181。当样品的反射表面在像平面P2中时，检测到具有相对于信号181的曲线的波前信号182。当样品的反射表面在像平面P3中时，检测到在与波前信号182的曲线的方向相反的方向上具有相对于波前信号181的另一个曲线的波前信号183。因此，波前检测器允许以更精确和更快的方式来检测在显微镜物镜的像平面P1中的样品的位置。
此外，泽尼克模式(第二多项式Z2 0)的分析允许检测到在波前的曲线方向上的变化，从而允许检测到相对于像平面P1的样品的散焦方向。自动聚焦算法可因此比采用强度传感器收敛更快。
作为替代或补充，可以使用其它的泽尼克模式。因此，第一泽尼克模式可以允许样品是否倾斜的分析。
更一般地，自适应光学装置和波前检测器的使用允许拉曼光谱仪与表面形态技术相结合。
另一个有利的特定实施例使用如下的自适应光学系统，该自适应光学系统包括：经由透射或反射操作的两个自适应光学部件，例如具有可变形膜的反射镜，或以串联的方式位于激光束11的光路上的x2液体透镜的系统。两个自适应光学部件以形成远焦自适应光学系统的这种方式定位。在该实施例中，两个自适应光学部件被配置成具有彼此不同的曲率半径，以便形成自适应光学系统，例如具有1以外的放大率的远焦系统。
在第一变型中，自适应光学系统可以如下方式修改，即反射镜中的一个或两个的焦距改变，同时保持远焦系统布置，以便形成具有优选大于1的可变放大率的远焦光学系统。
这种远焦自适应光学系统具有多种用途。
在第一用途中，可变放大率远焦自适应光学系统位于激光源10与显微镜物镜14之间的激光束11的光路上，或在公共路径上。两个自适应光学部件的两种焦距联合改变，这允许适配在每一个物镜的光瞳处的激光大小，而无论波长。该系统提高了空间分辨率，以便达到衍射极限(艾里图案)。
自适应光学系统的可变放大率允许形成可变扩束器。该自适应光学系统允许激光束的直径适配于物镜的光瞳的直径，从而限制了在激发激光束中强度上的损耗。这种可变放大率远焦自适应光学系统允许改变激发激光，例如以便改变波长λ，同时优化从激光源到显微镜物镜的强度转移。
在另一种变型中，自适应光学系统可以以改变反射镜中的一个或两个的焦距的这种方式来修改，以便形成具有可变横向放大率的聚焦光学系统。
在另一种用途中，自适应光学系统仅位于公共路径上。然后，自适应光学系统以会聚在物镜光瞳上并且因而照射样品的更大区域的这种方式而故意误调节。该配置允许关注的区域经由通过矩阵相机成像被定位，并且在粗略检查之后在这些关注区域上执行拉曼分析。该配置省去了扫描样品的整个表面以便定位关注的区域的需求。
在另一个有利的特定实施例中，位于激光源10与显微镜物镜14之间的激光束的光路上的自适应光学系统31用于修改在样品20上聚焦的束能量的空间分布。
以特别有利的方式，用于粒子的形态识别的软件(诸如提供为具有来自HORIBA的拉曼分析软件LabSpec6的选项的“粒子取景(particle finder)”软件模块)与自适应光学系统耦合，以便在空间上根据要分析的粒子形状将激光器的形状结构化。
例如，相位调制自适应光学系统(空间光调制器)计算图像(例如通过粒子的样品的图像)的傅立叶变换，并将该全息图施加到液晶相位调制自适应光学系统上。在该相位调制自适应光学系统上激光束的反射之后，在相位调制自适应光学系统的输出处的束再产生初始图像(参见自然方法|第5卷，第9期|2008年9月的文章“笼神经递质的全息分析”)(cf.the article“Holographic analysis of caged neurotransmitter”,NATUREMETHODS|VOL.5NO.9|SEPTEMBER 2008)，或甚至更好，并沿着光谱仪的入口狭缝的高度的方向将照射粒子再成像，其允许经由单个CCD读数同时分析多个粒子。
困难在于如下事实：在拉曼散射路径上需要在单个共焦孔中同时重组所有的照射粒子的第二自适应光学系统(第一个仅位于激光器路径上)。事实上，在公共路径上的单个相位调制自适应光学系统不起作用，因为这种自适应光学系统是不可逆的，并且前向路径上改变的相位将在返回路径上加倍，而不是补偿。该实施例的优点是，仅照射关注的区域，而不照射对信噪比不利的周围区域。
该实施例允许避免在样品上不需要的区域，仅聚集在光场的有用部分上的激光束的能量。因此消除来自周围粒子或来自基板的不需要的信号。
在另一个变型中，自适应光学系统31用于校正激光的波前的空间分布，以便降低在焦点处的激光束的空间扩展(或用于点扩散函数的PSF)和/或校正特别由在样品本身中折射率的变化导致的光学像差，以便提高显微镜设备的空间分辨率。
图4示出在激发激光束中的波前校正的示例。图4A示出了在束腰周围(也就是说，在聚焦区域周围)的激光束11的纵向截面。在没有自适应光学系统310的变形情况下，激光束包括由显微镜设备和/或样品导致的光学像差导致的干扰。图4B示出了自适应光学系统的变形311的效果，其被配置成补偿激光束的波前的干扰。由此配置的自适应光学系统31允许消除激光束的干扰(图4C)。该实施例因而允许提高在激光束的焦点处的空间分辨率。
在另一个实施例中，自适应光学系统33位于滤波器13和光谱仪16之间，在拉曼散射束22的光路上。有利地，自适应光学系统33被配置成补偿在光谱仪中的光学像差。因此，例如，通过调制光束来校正像散缺陷，如由柱面透镜进行的，其分解矢状和切向平面并且仅修改这些平面中的一个。在自适应光学反射镜的单个方向中创建曲率半径，而不影响其它方向。该实施例允许创建在单个方向中具有可变焦距的柱面透镜，以便补偿散光缺陷的振幅。
更具体地，自适应光学系统33被配置成补偿由光谱仪的反射镜导致的像散缺陷，以便消除在检测器17上的像散缺陷，同时获得在检测到的能量方面的较好密度。例如，以如下方式控制自适应光学系统33，即所述系统在光谱仪的入口狭缝之前引入为光谱仪16的缺陷的逆向的像散缺陷。
光谱的线对应于采用CCD检测器成像的点。为了使线要细(良好的光谱分辨率)，光谱仪内部的凹面镜以具有尽可能细的CCD上的图像点的这种方式绘制。由此获得垂直的椭圆点，并且因而存在根据高度的损失。通过创建在检测器上的点的CCD图像，该像散缺陷可以非常好地可视化，并且该缺陷通过在狭缝前放置补偿该缺陷的柱面透镜并产生逆向缺陷来部分地校正。
该实施例消除了使用专用于每一个光谱仪16的唯一被动光学系统的需求。
在另一个实施例中，一个或多个自适应光学部件在拉曼显微镜设备中使用，以便相对于温度变化或振动而自动稳定拉曼显微镜设备的光学对准以及在样品上的焦点稳定性。因此，采用在特定条件中的参考样品获取控制光谱，以便获得仪器的整体状态的指示。对于经受扩张的高度分散的系统(其一般对应于具有长焦距的大型设备)，自适应光学装置用于补偿信号损失，而不损失高精度的出厂对准。在该情况下，比提高性能的功能更多的是，自适应光学装置具有保持设备的质量的功能。
Claims (10)
1.一种拉曼显微镜或拉曼显微测谱设备(100)，包括：
-激光源(10)，其适于以激发波长λ发射激光束(11)；
-显微镜物镜(14)，其适于接收所述激光束(11)，并且将所述激光束聚焦到所述显微镜物镜(14)的像平面中，所聚焦的激光束(21)旨在照射样品(20)；
-光学系统(14)，其适于收集在所述样品上的散射光束(22)；
-滤波部件，其适于接收所述散射光束(22)并且将所述散射光束(22)分离成瑞利散射束和拉曼散射束(220)；以及
-检测部件(16，17)，其适于检测收集的所述拉曼散射束(220)，
其特征在于，所述拉曼显微镜或拉曼显微测谱术设备(100)进一步包括：
-自适应光学系统(31，32，33，33A，33B)，其位于所述激光束(11)的光路上，位于所述拉曼散射束(220)的光路上，和/或位于对所述激光束(11)和所述拉曼散射光束(220)公用的光路上。
2.根据权利要求1所述的拉曼显微镜或拉曼显微测谱设备，其中所述显微镜设备是共焦的，并包括位于所述显微镜物镜(14)和所述检测部件(16，17)之间的共焦孔(19)，以及所述自适应光学系统(33，33A，33B)位于所述共焦孔(19)的上游和/或下游的所述拉曼散射束(220)的所述光路上。
3.根据权利要求2所述的拉曼显微镜或拉曼显微测谱设备，其中所述激光束(11)具有高斯横截面，所述共焦孔(19)具有非圆形或角形状，并且所述自适应光学系统(33A)被配置成在所述共焦孔(19)的平面中将在所述样品上聚焦的所述激光束的横截面适配于所述共焦孔(19)的所述形状。
4.根据权利要求1至3中一项所述的拉曼显微镜或拉曼显微测谱设备，进一步包括位于由所述样品(20)反射的所述激光束(31)的光路上的波前检测器(18)，其中所述波前检测器(18)位于与所述显微镜物镜(14)的所述像平面(P1)光学共轭的平面中，以及所述波前检测器(18)适于检测在所述显微镜物镜(14)的像平面(P1)中的所述样品的位置。
5.根据权利要求1至4中一项所述的拉曼显微镜或拉曼显微测谱设备，其中所述自适应光学系统(31)包括串联地位于在所述激光源和所述显微镜物镜之间的所述激光束的所述光路上的至少两个自适应反射镜，所述至少两个自适应反射镜每一个具有可变焦距并且以形成具有可变放大率的聚焦自适应光学系统或具有可变放大率的远焦自适应光学系统的这种方式被定位，并且所述自适应光学系统被配置成根据所述显微镜物镜(14)的所述入口光瞳的直径来修改在所述显微镜物镜(14)的所述入口光瞳上的所述激光束(11)的直径。
6.根据权利要求1至5中一项所述的拉曼显微镜或拉曼显微测谱设备，其中所述自适应光学系统(31，32)位于所述激光源和所述显微镜物镜的所述像平面之间，并且所述自适应光学系统(31，32)被配置成在空间上调制在所述显微镜物镜(14)的所述像平面(P1)中的所述激光束(11，21)的强度。
7.根据权利要求6所述的拉曼显微镜或拉曼显微测谱设备，其中所述自适应光学系统(31，32)被配置成根据分析的所述样品(20)来动态调制在所述显微镜物镜(14)的所述像平面中或在所述显微镜物镜的所述光瞳平面中的所述激光束(11，21)的强度和/或相位。
8.根据权利要求1至7中一项所述的拉曼显微镜或拉曼显微测谱设备，包括适于接收并测量拉曼散射束(220)的光谱仪(16，17)，其中所述自适应光学系统(33，33A，33B)位于所述显微镜物镜(14)和所述光谱仪(16，17)之间的所述拉曼散射束的所述光路上，以及所述自适应光学系统(33，33A，33B)被配置成动态调制在所述光谱仪(16，17)的所述入口处的拉曼散射束(22)的强度和/或相位，以便在所检测到的拉曼信号中减少所述光学像差，诸如由所述光谱仪(16，17)导致的像散。
9.根据权利要求2和8所述的拉曼显微镜或拉曼显微测谱设备，其中所述自适应光学系统(33B)位于所述共焦孔(19)与所述光谱仪(17)的入口狭缝(27)之间的所述拉曼散射束(220)的所述光路上，以及所述自适应光学系统(33B)被配置成在所述光谱仪的所述入口狭缝(27)上形成所述共焦孔(19)的所述图像。
10.一种拉曼显微或拉曼显微测谱方法，包括以下步骤：
-以激发波长λ发射激光束(11)；
-将所述激光束(11)聚焦到显微镜物镜(14)的像平面中，所述聚焦的激光束(21)旨在照射样品(20)；
-收集散射光束(22)；
-以将所述束分离成弹性散射束或瑞利散射束和拉曼散射束(220)或荧光束的这种方式，将所述散射光束(22)滤波；以及
-检测收集的所述拉曼散射束(220)，
其特征在于，所述方法进一步包括如下步骤：
-以修改在样品(20)上的激光束的空间分辨率、亮度、空间分布和/或检测到的所述拉曼散射束的透射的方式，修改自适应光学系统(31，32，33，33A，33B)的光学特性，所述自适应光学系统(31，32，33，33A，33B)位于所述激发激光束(11)的光路上，位于所述拉曼散射束(220)的光路上，或位于对所述激发激光束(11)和所述拉曼散射光束(220)公用的光路上。
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