CN110537131B - 样品表面成像的方法和装置 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种借助共焦显微镜检查对具有形貌的样品表面成像的方法，特别是共焦拉曼和/或荧光显微镜，其中提供了一种用于产生拉曼散射光和/或荧光的激励辐射的装置，特别是第一光源，优选地第一激光光源，以及第二装置，特别是第二光源，优选地第二激光光源或具有独立于第一光源控制的焦点位置的超冷光二极管(SLED)。本发明的特征在于‑所述第一光源发射第一波长范围内的光；‑所述第二光源发射第二波长范围的光；其中所述第一和第二光源的第一和第二波长范围不重叠，并且‑所述第二光源的焦平面借助通过单独控制的焦点位置进入/进入到样品表面上，使得，‑借助所述第二光源的焦点位置信号建立所述样品的形貌，和/或基于该信号使所述样品进入所述第一光源的焦平面。

Description

样品表面成像的方法和装置

技术领域

本发明涉及一种用于表面成像的方法和装置，特别地通过使用共焦显微镜检查扫描大量表面区域的具有形貌的样品的表面。在共焦显微镜检查中，表面区域的共焦图像由位于成像平面上的检测器生成。特别地，本发明涉及所谓的共焦拉曼和/或荧光显微镜或用于共焦荧光和/或拉曼显微检查的装置，但不限于它们。

除了用于表面成像的方法外，特别地具有形貌的样品表面，还描述了一种使用共焦显微镜检查或共焦拉曼和/或荧光显微镜检查对样品成像的装置。拉曼测量或荧光测量可用于用光源激励样品激励，以及基于样品激励出的光对样品的不同材料进行化学成像。

背景技术

在共聚焦显微镜检查中，来自光源的光在到达样品的路径上被引导通过物镜，并且从而聚焦在样品表面的一个基本点状的区域(艾里斑)上。同时，物镜可用于收集样品发射的光，特别是所发射的拉曼光或荧光，并将其传输到检测器。因此，借助物镜可以在本质上垂直于照明和/或检测光束路径对样品的区域或基本点状区域进行共焦成像。如果移动了样品或物镜或照明，就有可能在x-y-方向上进行扫描，从而扫描整个样品。在共焦成像中，光源(优选为基本点状光源，优选为激光光源)在由于光的波动性质或基本点状区域所产生的焦点上成像(阿贝条件)，理想地为样品的一个点。然后，优选地通过用相同的光学元件，即用相同的物镜，将该像素聚焦在检测器前面的针孔上。检测器本身也可以表示针孔，而无需在检测器前面放置单独的针孔。如果共焦成像用于显微镜检查，可以获得图像对比度的相当大提高，因为只有来自物镜焦平面的光有助于成像。关于共聚焦光学显微镜检查，请参考DE 199 02 234 A1，其中详细介绍了一种具有共焦物镜的显微镜。

共焦测量在许多应用中具有优点，例如拉曼和/或荧光测量，由于现有的散射光背景被非常强烈地抑制。由于仅测量来自焦平面的光，共焦显微镜检查也可以在透明样品的情况下测量在实际样品表面以下的样品区域。

从后公开的DE 10 2009 015 945 A1中已知一种共焦拉曼和/或荧光显微镜。

然而，共焦测量或共焦显微镜检查中的问题是，由于漂移、形貌、样品不均匀性、粗糙度，以及样品的倾斜度，在扫描样品时，要成像的平面或区域，特别是表面，往往不能保持在焦平面内。

因此，为了获得满意的结果，许多应用需要扩展的方法和装置用于聚焦稳定或聚焦跟踪待测表面。

从US5,581,082 B1中已知一种与共焦显微镜结合的原子力显微镜或扫描隧道显微镜。利用AFM或STM尖端，还可以特别地沿z方向扫码样品。

对于US 5,581,082 B1，借助AFM尖端获得了深度信息。在AFM测量中，特别是AFM形貌测量中，也记录了光学信号，使得从AFM形貌测量获得的形貌数据可与光学数据相关联。对于US 5,581,082，共焦测量总是与形貌测量同时进行。US 5,581,082的一个缺点是有限的扫描范围，其在x-y平面上处于从100μm至最大300μm的范围。。此外，AFM尖端在z方向上只能提供在5至10μm最大的范围内的深度信息。US 5,581,082 B1因此并不允许样品区域的测量>300μm以及粗糙度>10μm。在共焦显微镜检查中，特别是在表面上的共焦拉曼显微镜检查和/或荧光显微镜检查中，特别是在更大的样品区域(特别是>300μm)上以及在工艺表面上，由于通常不存在足够的平坦样品形貌，出现了图像很难获取的问题。在给定平面中的扫描过程中，即所谓的x-y扫描，样品表面反复地离开显微镜的焦平面，从而样品表面或样品的简单完整图像是不可能的。

WO 2011/131311 A1描述了一种方法和装置，其可以首先确定用于共聚焦显微镜检查的样品的表面形貌，再借助表面形貌值将需要成像的表面转移至共焦平面上。WO2011/131311 A1为此提出了一种带有表面形貌传感器的装置。该表面形貌传感器可以是具有光学系统的共焦传感器，优选地具有反射和/或衍射组件。替代地，WO 2011/131311 A1指定了触觉传感器，例如轮廓仪、原子力显微镜、白光干涉仪、三角测量传感器或激光扫描系统。WO 2011/131311 A1系统的一个缺点是首先确定整个样品的表面形貌然后考虑所确定的表面形貌进行实际的荧光或拉曼测量。这导致在形貌测量与荧光或拉曼测量之间的较大时间差。一种装置或样品漂移或时变样品(例如，由于样品的蒸发或干燥)会导致这种方法的很大困难。

作为上述顺序测量的替代方案，即形貌确定后的拉曼或荧光测量，WO 2011/131311 A1也描述了一种单程方法。在这种情况下，首先借助表面形貌传感器在每个光栅点进行距离测量，特别是彩色传感器，从其确定了表面形貌的距离信号特征，然后，在下一个光栅点重复该周期之前，将该距离信号直接用于这一个光栅点，从而跟踪共焦显微镜的焦平面或共焦平面，特别是共焦拉曼显微镜。这意味着，在每个光栅点首先测量形貌，以及仅在完成该测量之后以及在完成形貌跟踪后才开始共聚焦测量，特别是共焦拉曼或荧光测量。在周期的很大时间范围内没有检测到共焦拉曼或荧光信号，特别是在整个形貌测量过程中和样品从一个光栅点移动到下一个光栅点的过程中。

总之，WO 2011/131 311A1中描述的单程方法也由多种测量模式和测量周期的复杂来回切换所表征。这与很大的时间间隔有关，在所述时间间隔内无法检测到共焦信号，特别是拉曼或荧光信号。此外，该方法非常缓慢和复杂。

WO 2011/131 311A1中列出的方法中存在的另一缺点是，例如，所使用的共焦彩色传感器，因其测量原理需要一个尽可能宽频带的并且同时非常密集的白光源，以便用很短的测量时间实现足够的形貌分辨率。与通常用于例如激光的拉曼或荧光测量的单色光源相比，密集的宽频带光源通常不是点光源，但具有清晰的宏观延伸。然而，仅点光源的光能投射到一个最低限度小的衍射限制焦点上。与实际中的衍射限制的拉曼或荧光测量相比，这将通过共焦彩色传感器进行的形貌测量的可实现横向分辨率限制在约10μm。形貌测量的横向分辨率与衍射限制的拉曼和/或荧光测量的横向分辨率之间的明显差异约一个数量级，特别是在精细结构或粗糙、多孔表面的高分辨率测量中，导致了不能通过横向的小样品形貌正确地跟踪用于拉曼或者荧光测量的共焦平面。

进一步不利的是，特别是如果通过相同的透镜进行拉曼或荧光测量与形貌测量，如在WO 2011/131 311A1中建议的，拉曼和荧光测量以及共焦彩色形貌测量占据了尽可能宽的光谱频率范围，理想地实际上整个可见光谱范围。因此很难避免光谱重叠。如果形貌测量与拉曼和荧光测量的波长范围需要分离成两个相互不重叠的光谱范围，如WO 2011/131311 A1中所述，由于对于整个合成光谱范围优化了透镜，这对普通光学器件的涂层提出了极高的要求。

因此，WO 2011/131 311 A1还介绍了一种被称为扩展焦点法的更进一步的更简单的单程方法。除第一激励光源外，表面检测不需要其他光源。相反，样品沿z方向进行调节调制，并记录了反射罗利光的信号特性。如果样品在焦点上，会检测到最大的罗利光。然后在调制过程中罗利光的信号特性用于跟踪样品的平均z位置，围绕所述z位置调节发生样品形貌的调制。因此，至少中间的z位置保持在焦点。拉曼或荧光测量在整个调制期间进行。这意味着样品可能相对长时间处于拉曼或荧光信号的实际焦点之外，使得很长时间检测不到或仅检测到不期望的拉曼或荧光信号，导致拉曼或荧光信号很弱并且模糊。同时，调节调制破坏了测量的共焦性，因为目标样品表面上方和下方的区域也有助于被测量的拉曼或荧光信号。

在这种方法中因此丧失了共焦光学显微镜检查的已被证实的优点，诸如更高的空间分辨率和高视野深度。

发明内容

因此，本发明的目的是提供一种方法和装置，通过所述方法和装置可以避免现有技术的缺点，特别是WO 2011/131 311 A1中所提出的缺点。特别是，应提供一种能够即使在不平坦的样品表面上也能进行简单、快速的拉曼和/或荧光测量的方法和装置。此外，本发明应该可以共焦地成像平面或表面，特别是样品的表面，即借助共焦显微镜检查。这要求样品在整个测量过程中始终保持在焦点内，即使样品形貌不够平坦，例如弯曲的样品。

根据本发明，通过一种用于平面或表面成像的方法解决了该目的，特别是通过共焦显微检查对具有形貌的表面成像，特别是共焦拉曼和/或荧光显微镜检查，其中，用于实现所述方法的装置发射一种用于产生拉曼和/或荧光显微镜检查的激励辐射的第一光源，以及一种用于在窄波长范围内产生辐射的同时有源的第二光源，激励所述窄波长范围并不与第一光源的波长范围或与被检测到的波长范围一致，诸如拉曼/荧光。同时在本申请中意味着第一和第二光源同时发光到样品上，即一起，并且一方面用于聚焦跟踪的样品的形貌测量，以及另一方面拉曼或荧光测量可因此同时工作。此外，第二光源的焦平面通过单独可控的焦点位置进入/进入到样品表面上，并且从可控焦点位置的控制信号使用以这种方式确定的样品的形貌，以控制/调节第一光源的焦平面。对于根据本发明的方法，拉曼和/或荧光测量始终保持活性和聚焦，并且不受用于聚焦跟踪的样品的同时进行的形貌测量影响。该方法的特征在于，同时进行拉曼和/或荧光测量和形貌测量。第一光源和第二光源都可以不受限制地是激光光源。作为光源的超冷光二极管(SLED)也是可能的。和激光二级管一样，超冷光二级管也基于p-n结，并且在贯穿方向上运行。所发射的平均波长基于带隙，并可以通过选择不同的半导体材料(诸如砷化铟(InAs)、砷化铟镓(InGaAs)或磷化铟(InP))而受影响。与激光二极管相比，SLED并不具有谐振器，所述谐振器通过反射镜表示光学反馈。

在根据本发明的方法中，使用了两个近似相同尺寸的横向焦点，即第一焦点和第二焦点的焦点尺寸近似相同，从而可以评估相同的样品区域。第一焦点是第一光源的焦点，即用于拉曼或荧光激励的激光光源。第二焦点是第二光源的焦点，并且用于确定形貌。第二光源的焦平面通过单独可控的焦点位置进入样品表面。此单独可控的焦点位置可调节，例如通过电聚焦透镜。透镜的周期性激励是特别优选的，其在z方向上周期性地改变焦点位置。每当第二光源的焦点位于样品表面的平面中时，就会检测到信号。这是因为共焦原理的结果，仅当第二光源的焦点位于表面时，光才会反射回到具有足够强度的检测器上，因此检测到信号。从可控焦点位置的控制信号确定的样品形貌用于将样品转移到共焦拉曼和/或荧光显微镜检查的焦平面上。根据本发明，因此通过不断地评估第二光源的焦平面，可以使样品永久地保持在拉曼光谱和/或荧光测量的共焦平面中。同时，拉曼和/或荧光测量不受形貌的确定和调节的干扰，并且可以永久保持活性。与通过仅代表跟踪系统的根据WO2011/131 311A1的控制系统所获得的相比，这非常大地增强了拉曼和/或荧光信号。根据本发明的方法，因此可以补偿技术和/或机械漂移，因此与从WO 2011/131 311 A1中已知的方法相比，更长的测量时间是可能的，因为热量和/或机械漂移得到了补偿。也通过形貌和拉曼和/或荧光测量的可比较横向分辨率极大地改进了高分辨率测量或者多孔或粗糙样品上的测量。例如，在测量或液体蒸发过程中干燥的样品的拉曼和/或荧光测量也是可能的，因为根据本发明的调节调节提供了对表面的连续跟踪。

根据本发明，此指定的调节/控制用于将样品保持在焦平面内以进行拉曼和/或荧光测量。

借助一种用于平面或表面(特别是表面)区域的共焦成像的装置，通过扫描平面或表面(特别是表面)的多个区域实现了通过共焦显微镜检查(特别是拉曼和/或荧光显微镜检查)的平面或表面(特别特别是样品表面)的成像。

在本申请中通过表面形貌或通过样品形貌所意味的将作为共焦拉曼显微镜的示例来描述，但不是决定性的。在这种布置中，样品形貌意味着样品的不平坦度大于1nm，特别是大于10nm，优选地大于100nm。样品的不规则性是样品表面在z方向上的偏差，其也称为粗糙度。被扫描的平面是x/y平面。拉曼显微镜和荧光显微镜的x/y平面的分辨率为至少0.1μm，优选地至少1μm，优选地1μm-50μm。

根据本发明，连续地确定第二光源的焦平面的位置。为此，例如借助电聚焦透镜改变第二光源的焦点位置，其中该透镜优选地被周期性地激励，例如在200Hz到800Hz的频率下。除了其焦点可通过电改变的透镜之外，还可以周期性地机械地移动透镜。被指定从200Hz到800Hz的替代频率范围是50kHz到1MHz的频率范围。当通过改变第二光源的焦点位置来确定焦平面的位置时，需要调节焦点的调制深度，或粗糙度的焦点位置或样品的形貌。

在借助第二光源(例如电聚焦透镜)确定第二光源的共焦平面的基础上，样品被转移到共焦拉曼或荧光显微镜的共焦平面。因此，引入到拉曼/荧光显微镜的共焦平面与第二光源的焦点位置的测量同时进行。

借助第二光源(特别是第二激光光源)，并且通过借助电聚焦透镜穿过第二光源的焦点，例如可以将拉曼显微镜永久地保持在拉曼显微镜检查的焦平面或共焦平面上，从而即使在具有明显的(即非平面的)样品形貌的情况下也可以操作共焦拉曼显微镜检查。

在本发明的一个特别优选实施例中，假设例如通过改变显微镜物镜和样品之间的距离进行拉曼和/或荧光显微镜检查的第一光源的焦平面的重新调节。这可以通过移动样品平台和/或显微镜物镜来实现。

本发明的另一个优选实施例是，来自第一和第二光源的光被引导通过相同的显微镜物镜。

如果可以基本上控制第二光源的焦点位置，使得第二光源的焦点沿显微镜的光轴移动，就可以实现一种特别简单的光学设置。

如果第二光源的焦点位置是周期性改变，并且通过第二光源的反射或散射光的强度的最大值的时间进程确定样品的形貌，对样品形貌的简单确定是可能的。

如果通过光束路径中的聚焦透镜控制第二光源的焦点位置，这是有利的，其仅影响第二光源的光束路径。一种其中通过施加电压或通过电流确定焦距的电聚焦透镜是一种可用于改变焦点位置的特别简单设计。

替代地，可以使用滑动透镜或多个透镜控制第二光源的焦点位置。

如果第二光源的横向焦点尺寸基本对应于第一光源的横向焦点尺寸，则是特别优选的。这具有的优点是，一方面形貌确定以及另一方面拉曼或荧光测量评估相同的样品范围和相同的样品体积。如果，另一方面，两个光源的横向焦点尺寸相差很大，特别是如果第一光源的焦点尺寸明显地大于第二光源的焦点尺寸，小于第一光源的焦点尺寸的所有形貌细节，例如样品上的孔或颗粒，由于它们的小尺寸而会避开形貌确定，并且因此在这些样品位置的拉曼或荧光测量无法保持在焦点内。由于第一光源和第二光源的基本相同的横向焦点尺寸，实现了理想的形貌补偿，因为调节或平衡了完全相同的形貌细节，其也可以通过拉曼或荧光测量解决。

通过控制/调节所确定的在显微镜物镜与样品之间距离的必要改变可以通过沿显微镜的光轴方向移动样品来实现。替代地，可以沿显微镜的光轴方向移动显微镜，或可以沿显微镜的光轴方向移动显微镜物镜。

如果第二光源的波长范围不与待检测的拉曼散射光和/或荧光的波长范围重叠，则是特别优选的。

除了该方法之外，本发明还提供了一种通过扫描在x/y平面内的表面的多个区域用于样品表面成像的装置，，包括用于使焦平面中的表面区域共焦成像到检测器上的设备，其中，所述装置具有第一光源和第二光源。

共焦拉曼和/或荧光显微镜的光，即根据本发明第一光源的光位于第一波长范围内，并且第二光源的光位于第二波长范围内，其中第一波长范围与第二波长范围不重叠。第一波长范围通常被选定，使得第一波长范围由待研究样品的所发出的冷光和/或拉曼光谱的极限限定，第二波长范围在第一波长范围之上或之下，而与第一波长范围不重叠。例如，待检测样品的所发出的冷光或拉曼光谱的第一波长范围可从350nm至1000nm，优选地500nm至1000nm，特别是532nm至650nm。第二波长范围从1000nm至2000nm，优选地1000nm至1500nm。

如上所述，在共焦显微镜检查中，用于拉曼和/或荧光测量的单色第一光源的光在到达样品的途中被引导通过物镜，从而基本上聚焦在样品表面的一个点上。在该装置特别是共焦拉曼显微镜的情况下，可以假设光谱仪对由样品发射的光(即拉曼或者荧光)进行光谱分解。这种光谱分解可以在光谱仪中例如用光栅或棱镜进行。如果用CCD相机记录这样被分解的光，那么可以记录被样品散射的拉曼或荧光的完整光谱。在拉曼显微镜中对拉曼光进行光谱分解的优点是，例如，通过旋转光谱仪中的光栅，可以对于检测器选择任意的光谱范围进行测量。

该装置，特别是共焦显微镜，优选地共焦拉曼和/或共焦荧光显微镜，可具有一个可沿x/y方向移动并且其例如可通过扫描样品使样品表面成像的样品平台。替代地或此外，可以移动物镜或显微镜本身来获得样品的图像。还可以记录样品的光谱特性的空间图。特别是通过共焦成像可以获得非常高的深度分辨率。

根据本发明，借助第二光源，特别是结合电聚焦透镜，通过单独可控的焦点位置可使第二光源的焦平面进入/进入在样品表面上。从可控焦点位置的控制信号确定了样品的形貌，以控制用于拉曼显微镜的第一光源的焦平面。这种控制/调节在扫描过程中允许样品表面始终保持在共焦拉曼显微镜检查的共焦平面内。为此，样品的x-y扫描扩展到x-y-z扫描，其中z扫描用于补偿样品的形貌。为此，样品平台和/或透镜可沿除x/y方向之外的z方向移动。

与WO 2011/131 311 A1相比，在根据本发明的方法中，不需要首先记录样品形貌用于控制/调节，从而随后跟踪样品平面进入焦点。相反，借助第二光源对焦点位置的连续确定允许样品同时进入共焦拉曼和/或荧光显微镜检查的物镜的焦平面。这具有获得与WO2011/131311 A1中仅跟踪相比更强的拉曼和/或荧光信号的优点。

附图说明

下面将参照实施例示例详细地描述本发明，其中：

图1a示出了具有第一光源和第二光源的拉曼显微镜的主要结构，其中绘制了第一光源和第二光源的光束路径；

图1b示出了具有第一光源和第二光源的拉曼显微镜的主要结构，其中用于拉曼测量的第一光源的激励焦点被引导通过与第二光源的焦点相同的物镜；

图2a-2b示出了电聚焦透镜的调制和第二光源的检测信号；图2c示出了第一光源和第二光源的焦点和不平坦的样品表面的主要图示；

图3示出了待检测样品的形貌。

图4示出了根据图3的未经调节的样品成像，其使样品进入拉曼和/或荧光显微镜检查的共焦平面；图5示出了图3的经调节的样品成像，其使样品进入拉曼和/或荧光显微镜检查的共焦平面；图6示出了具有调节和无调节的拉曼信号的强度剖面，以及样品的表面形貌。

具体实施方式

虽然下文中通过参照一种用于样品表面成像的装置的实施例示例描述了本发明，特别是使用散射的拉曼光，所谓的共焦拉曼显微镜，但本发明并不限于此。相反，它包括所有的共焦显微镜，特别是共焦光学显微镜或荧光显微镜。一种具有电聚焦透镜的第二光源也可用于这种共焦显微镜，从而根据表面形貌使样品进入拉曼显微镜的共焦平面内。

图1a中示出了用于记录样品表面的拉曼共焦显微镜的第一实施例的主要结构。共焦拉曼显微镜检查可用于分析高达约200纳米的受衍射限制的分辨率范围的液体和固体组分的化学特性质和相位。无需用诸如荧光显微镜检查中所使用的荧光物质来标记样品。例如，共焦结构提供了一种允许在无需制作切口的情况下对样品进行深度分析的深度分辨率。在共焦显微镜检查中，点状光源，优选地激光，在样品的一个点上成像。然后，优选地用相同的光学元件将该像素聚焦到检测器前面的针孔上。针孔的孔径尺寸必须与照明图像的受衍射限制的图像相适应。现在通过扫描样品上的测量点，即逐点地扫描样品，生成该图像。对于这类图像，由于仅透镜的焦平面有助于成像，实现了图像对比度的极大提高。另外，由于衍射点与针孔孔径的折叠，分辨率可减少

到约λ/3。此外，用约一个波长的轴向分辨率可以得到样品结构的三维图像。例如，关于共焦显微镜检查，参考199 02 234 A1。

图1a中示出了共焦显微镜的一种可能结构，例如德国的WITec GmbH,D-89081Ulm的阿尔法300R显微镜。对于共焦显微镜1，第一光源10的光沿样品16的方向在分光镜12在光束扩展器14之后被引导到样品平台18上。第一光源的光，特别是第一激光，优选地为用于拉曼或荧光辐射的激励光，并且处于从350nm至1000nm的波长范围内，优选地500nm至1000nm。激励光的偏转光束19通过适当的光学系统21被聚焦到样品16上的基本点状区域20上。第一光源的光，特别是第一激光光源10，与样品16的物质相互作用。一方面，产生了具有与入射光相同的波长的反向散射瑞利光。该光通过分束器12偏转到边缘滤波器或陷波滤波器13，并且不到达检测光学元件。具有与由样品发射的瑞利光不同频率的光，即拉曼光，通过分束器12。在分束器12的后面，拉曼光用附图标号22标记。拉曼光22通过针孔(未示出)喷射进入光纤30内并且到达光谱仪40。在光谱仪40中，拉曼光的光束通过一种适合的光学系统再次被加宽，从而形成光束42，其击中光栅光谱滤波器44。光栅光谱滤波器44根据其波长在不同的方向中使光衍射，因此根据位置可在CCD芯片50上接收光谱信号。例如，CCD芯片50具有1024个通道，使得CCD芯片的总共1024个通道可以吸收不同波长的光。

通过在x/y平面沿箭头130的方向扫描形成了样品的图像。

白光源120的光也可以喷射到样品16上进行调节或观察。

共焦显微镜1还包括第二光源80。第二光源80在共焦拉曼显微镜1的第一光源之外。第二光源，如图1a所示，包括其自身的独立光束路径，所述光束路径通过反射镜82耦合到透镜的光学元件21中。第二光源的光束路径作为第一激光光源的拉曼和/或荧光测量的激励光束路径经由相同的光学元件21照射到样品上，并且经由反射镜82被引导到分束器，所述分束器允许第二光源的光沿反射镜82和光学元件21的方向传播，并且对通过光学元件21从表面反射回来的光解耦，使得从样品表面反射回来的光被引导到光电二极管86。在那里，所反射的信号被检测并反馈到评估单元(未示出)。评估单元根据反射信号确定光电二极管信号的最大值相对于电聚焦透镜84的激励信号的相位位置。该相位位置是用于样品表面的高度变化的测量。根据该相位位置，样品平台根据不同的相位移动，使得样品连续地位于拉曼和/或荧光显微镜的焦平面上。根据该相位位置控制或调节样品平台的程序。此外，在第二光源80之后，电聚焦透镜84插入光束路径中，其用于改变第二光源80的焦点位置。例如，该电聚焦透镜可以是电动可调的，即来自Optotune Switzerland AG,Bernstrasse388,CH-8953Dietikon的聚焦透镜EL-16-40-TC，，其允许在30℃下在-2到+3屈光度的范围内失谐。该透镜还可用于将透镜调节到所需位置。电聚焦透镜EL-16-40-TC的孔径为16mm，在波长范围内的透射率为450nm～950nm，并且超过90％。所述的电透镜是示例性的，并且不受限制。本申请的公开内容包括Optotune Switzerland AG公司关于电调谐透镜的技术数据表的公开内容。电聚焦透镜优选地被周期性地激励，特别是用在200至500Hz范围内的频率。其他频率也是可能的。第二光源的焦点位置通过电聚焦透镜的周期性激励而周期性地改变。每当焦平面静止在样品中/上时，就会在光电二极管86检测到信号。光电二极管信号相对于电聚焦透镜的激励信号的相位可以从该信号确定，从而从样品形貌推断出。然后，根据相位位置移动该样品平台，使得样品的表面形貌保持平衡并且样品始终处于拉曼和/或荧光显微镜的共焦平面中。图2a-2b详细地描述了这一点。

图1b中示出了共焦拉曼显微镜的主要结构，其中第一光源2010的光或者用于拉曼测量的激光与用于形貌测量的第二光源2080平行地被引导。与先前图1a中相同的组件标记有增加2000的附图标号。在图1b所示的拉曼显微镜2001中，用于激励拉曼效应的第一光源2010的光和第二光源2080的光通过同一光学元件2029聚焦在样品2016的基本相同的横向区域2020上。拉曼测量的焦点位置，即第一光源2010的激励激光的共焦焦点，被选择用于拉曼效应的激励。第一光源2010的光通过分束器2012.1喷射到样品2016内。光束2019沿样品2016的方向在分束器2012.1中被重新定向并通过进一步的分束器2012.2。由样品的相互作用所产生的拉曼光通过分束器2012.1和分束器2012.2，并且在分束器2012.2之后用附图标号2022指定。在分束器2012.2之后，光束2022被聚焦在检测器(未示出)前面的针孔2013上。第二光源的光束路径被标记有附图标号2092。在从第二光源2080到样品2016的光束路径上布置有电聚焦透镜2094。

除了用于激励样品中拉曼效应的光源2010的光之外，该进一步的分束器2012.2引导第二光源2092的光通过与用于激励拉曼效应的光相同的光学元件2029到样品2016上。该光束被标记有附图标号2019。辐射到样品上的第二光源2080的光被样品反射。所反射的光2089再次经由该进一步的分束器2012.2被引导到分束器上，并从那里到二极管2096上。由二极管2096记录的信号被反馈至评估单元2100。该评估单元2100同时调节扫描仪，其根据光电二极管的信号沿z方向移动。

例如，用于接收光信号的二极管2096可以是InGaAs二极管。

为了使用于激励拉曼效应的光和第二光源的光都通过同一光学元件，使用不同的光谱范围或一种时分多路复用装置是有利的。例如，第二光源的光可在1000nm至2000nm的波长范围内，并且用于激励拉曼效应的光波长可以是532nm，即在350nm至1000nm的波长范围内。这种构象允许拉曼光谱的记录通常高于532nm。当然，选择其他波长也是可以想到的。

图1b中示出的结构能够使样品表面借助第二光源2080和聚焦透镜2094(特别是电聚焦透镜)以调节的方式移动至用于拉曼测量的共焦平面。可通过调节器和/或控制器对扫描仪进行调节和/或控制。

除了用于拉曼测量的调节/控制之外，单独的纯形貌测量也是可能的。非接触式形貌测量特别适合于灵敏的或者其形貌对于AFM已经过高的(>5μm)或者其横向结构比典型的压电扫描器的范围(例如100μm)大得多的样品。

图2a中示出了第二光源的透镜焦点的正弦调制。本示例中所选择的调制频率是400Hz。由于透镜焦点的正弦调制，如图2a所示，第二光源的焦点位置也正弦地通过。在图2a中，待研究表面的两个高度被绘制到正弦调制过程中。第一高度标记为H₁，第二高度标记为H₂。如果第二光源的正弦焦点在高度H₁的样品表面上，则满足共焦条件，并且可在二极管处检测到图2b中所示的信号1000。该信号1000的相位位置约是15°。如果样品的高度增加，例如由于热膨胀，高度由H₁转移到H₂。现在检测到信号1100而不是信号1000。如图2b所示，信号1100相对于信号1000移动到右侧，信号1100的相位位置为30°，并且第一信号与第二信号的相位位置差为15°。当第二光源的焦点位于高度为H₂的表面上时，信号1100被再次检测到。在二极管处检测到的第二光源的信号的相移因此是样品高度如何变化的测量并且可用作调节或控制样品的调节或控制变量以补偿样品的高度差，以及将样品转移至第一光源的焦平面进行拉曼和/或荧光显微镜检查。如图2b中所示，在从1000到1100的高度变化H₁至H₂，光电二级管的信号移动到右侧(信号组1)以及到左侧(信号组2)。然而，仅沿一个方向的位移用于调节，在这种情况下根据信号组1向右的位移。

图2c中示出了具有高度H_样品的样品，其中，H_样品低于用于拉曼显微镜检查的聚焦高度H_焦点。例如，第二光源的焦点用附图标号4000指定，其在4100至4200的捕获范围内被正弦地调制。这允许从第二光源的焦点位置确定样品高度H_样品。如果该高度如在所示的示例中降低，例如由于H_焦点在H_样品之后的加深，拉曼测量的焦点5000将位于样品之外。由于在第二光源的焦点位置的极限4100-4200之间的正弦调制，检测到了H_样品，并且由于该相位位置，通过控制或调节使样品返回到拉曼测量的焦点5000处。从H_样品到H_焦点的移动被标记为附图标号10000。

图3示出了样品的形貌。该样品具有沿x方向的5000μm的延伸部。在z方向，样品弯曲有±30μm的深度。

图4示出了用共焦拉曼显微镜检查使具有图3所示的高度轮廓的样品成像，其中该样品没有移动并且也没有将样品调节至共焦平面内。可以清楚地看到，仅样品的一个狭窄边缘区域在拉曼测量的焦点中，因此仅对该区域清晰地成像。被成像该清晰区域为明亮区域，模糊区域为暗的。图5示出了在图3所示表面上的拉曼测量，其中，与图4相比，样品以一种可控的方式通过第二光源的焦点进入共焦平面。结果是一个完整清晰，明亮的图像。

图6示出了根据本发明的调节效果。图6示出了具有附图标号2000的样品表面的过程。样品表面在7000μm的延伸上具有100μm的深度或z偏差。曲线2100表示未经调节的拉曼强度。从曲线2100上可以看出，仅当样品处于共焦平台中用于拉曼测量时，才会产生拉曼信号。这正是两个表面值的情况。表面的更高或更低区域都处于共焦平面之外，并且没有示出信号。然而，借助第二光源，借助根据本发明的调节对第二光源的焦点位置的评估，可以将表面一直保持在拉曼和/或荧光测量的共焦平面内，因此在整个样品上检测到拉曼信号2200。

如图中所示，经调制的拉曼信号2200的强度与两个峰值2100一样强，在未经调节的情况下将样品移动至焦点内时检测所述两个峰值。这意味着不管在调节过程中表面进程2000如何，在整个样品上获得了与焦点处的样品信号相对应的信号。

本发明首先提供了一种允许使用共焦显微镜快速和简单地获得样品表面上信息的装置。特别地，这借助第二激励和检测路径实现，其使得即使对于最困难的样品也可以使共焦主测量永久地保持聚焦。通过调制聚焦透镜优选地确定了表面形貌，其仅影响第二激励和检测路径。

Claims (27)

1.一种通过共焦拉曼和荧光显微检查对具有形貌的样品表面成像的方法，其中提供了一种用于产生拉曼散射光和/或荧光的激励辐射的第一光源，以及第二光源，

其特征在于：

-所述第一光源发射第一波长范围内的光，其中，所述第一波长范围的极限由待检测样品的所发出的荧光光谱和/或拉曼光谱的极限所确定，

-所述第一光源的光通过光学元件被引导到所述样品上，

-所述第二光源发射第二波长范围内的光，其中，所述第二波长范围位于所述第一波长范围之上或之下，而与所述第一波长范围不重叠；并且

-通过光学元件和周期性激励透镜的所述第二光源的光进入到所述样品的表面上，产生周期性焦点，使得

-借助控制/调节装置，从所述第二光源的焦平面的信号以及所述第二光源的被检测光确定所述样品的形貌，并且基于该信号通过光学元件跟踪所述第一光源的焦点并使其应用到所述样品，基于该信号通过光学元件跟踪所述第二光源的周期性焦点的调制范围。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：通过改变显微镜物镜与样品之间的距离，将所述第一光源引入到焦平面。

3.根据权利要求1-2任意一项所述的方法，其特征在于：所述第一光源和第二光源的光均被引导通过相同的显微镜物镜。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述第二光源的焦平面周期性地改变，并且从在样品表面上的第二光源反射和/或散射光的强度的最大值的时间进程确定所述样品的形貌。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述周期性激励的透镜是电聚焦透镜，其中通过施加电压或通过电流控制焦距。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：通过沿显微镜的光轴方向移动样品进行了在显微镜物镜与样品之间距离的改变。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：用于产生拉曼散射光和/或荧光的激励辐射的第一光源，与第二光源，同时发射辐射。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述辐射为光。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：对通过所述第一光源激励的拉曼散射光和/或荧光的测量，以及借助所述第二光源对所述样品形貌的测量基本上同时进行。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述第一光源包括具有第一焦点尺寸的第一焦点，所述第二光源包括具有第二焦点尺寸的第二焦点，并且所述第一焦点尺寸与所述第二焦点尺寸基本相同。

11.根据权利要求1所述的方法，用于高分辨率测量的使用。

12.根据权利要求11所述的方法，用于拉曼和/或荧光信号在多孔和/或粗糙样品上的使用。

13.根据权利要求1所述的方法，用于测量的使用。

14.根据权利要求13所述的方法，用于拉曼和/或荧光信号在具有热漂移和/或机械漂移的样品上的使用。

15.根据权利要求1所述的方法，用于测量的使用。

16.根据权利要求15所述的方法，用于拉曼和/或荧光信号在干燥的样品或蒸发的液体上的使用。

17.根据权利要求1所述的方法用于同步测量样品上的拉曼和/或荧光信号及表面形貌的使用。

18.一种通过共焦拉曼和荧光显微检查对具有形貌的样品表面成像的装置(1)，包括：

用于拉曼散射光和/或荧光的第一光源，以及第二光源，

其特征在于：

-所述第一光源发射第一波长范围内的光，其中，所述第一波长范围的极限由待检测样品的所发出的荧光光谱和/或拉曼光谱的极限所确定，

-所述第二光源发射第二波长范围内的光，其中，所述第二波长范围位于所述第一波长范围之上或之下，而与所述第一波长范围不重叠；

-所述第一光源和第二光源的光均被引导通过相同的显微镜物镜，并且

-所述装置包括一种用于使所述第二光源的焦平面进入/进入到样品表面上的聚焦透镜；以及

-控制/调节装置，其根据所述第二光源的焦平面的信号确定所述样品的形貌，并且基于该信号以及所述第二光源的被检测光，将所述样品移动至所述第一光源的焦平面内。

19.根据权利要求18所述的装置，其特征在于：所述装置是下列装置之一：

共焦拉曼显微镜；

共焦荧光显微镜；

共焦拉曼/荧光显微镜。

20.根据权利要求19所述的装置，其特征在于：所述装置为共焦拉曼显微镜和/或荧光显微镜，借助第一光源在样品中激励光发射，并且所述装置包括一种用于检测由所述样品发出的光子的检测器，特别是所发出的拉曼和/或荧光光子。

21.根据权利要求19-20中任意一项所述的装置，其特征在于：所述共焦拉曼和/或荧光显微镜包括光学元件，所述第一光源和/或第二光源的光用所述光学元件聚焦在所述样品上。

22.根据权利要求21所述的装置，其特征在于：所述光学元件是物镜(2029)。

23.根据权利要求18所述的装置，其特征在于：所述聚焦透镜是电聚焦透镜或机械式位移透镜。

24.根据权利要求18所述的装置，其特征在于：所述第一波长范围包括350nm～1000nm的波长，所述第二波长范围包括1000nm～2000nm的波长。

25.根据权利要求24所述的装置，其特征在于，所述第一波长范围为500nm～1000nm。

26.根权利要求24所述的装置，其特征在于，所述第二波长范围为1000nm～1500nm。

27.根据权利要求18所述的装置，其特征在于：所述装置包括升降台和/或带有压电元件的平台。

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