JP6489326B2 - 焦点維持装置及び顕微鏡 - Google Patents

Description

本発明は、焦点維持装置及び顕微鏡に関する。

近年、焦点維持装置を有する顕微鏡が市場を拡大しつつある。常に標本に合焦し続ける焦点維持装置は、長時間のタイムラプス観察や試薬投与に伴う観察画像のボケやユレを効果的に除去することができる。

焦点維持の手法の一つとして、アクティブ方式がある。この手法は、標本（カバーガラスなど）に照射した光（以下「ＡＦ光」と呼ぶ）の反射光から、標本のｚ位置（光軸方向位置）を検出するものである（例えば、特許文献１参照）。具体的には、図１６（ａ）に示すように、対物レンズ１２の瞳の半分の領域を通過させてカバーガラス２０にＡＦ光Ｌを照射し、その反射光Ｌ′を遮光部７を介して集光レンズ８で集光し、この集光した反射光Ｌ′を光検出器９で検出することにより、この光検出器９上での光強度分布によりｚ位置情報を算出する。

米国発行特許発明第７，０７１，４５１号明細書

図１７は、カバーガラス２０で覆われた試料３０に対して、顕微鏡の対物レンズ１２を介して、ＡＦ光Ｌと試料３０の観察のための顕微鏡励起光（以下、「照明光Ｌｅ」と呼ぶ）とを照射する構成を示している。なお、この図１７に示す顕微鏡は、対物レンズ１２を介して試料３０に照明光Ｌｅを照射し、この照明光Ｌｅで励起した試料３０から放射される蛍光（信号光）を観察する光路に対して、ダイクロイックミラー６を配置し、ＡＦ光Ｌをこのダイクロイックミラー６で反射させて光路上に重畳し、対物レンズ１２を介してカバーガラス２０又は試料３０に照射するように構成されている。図１７（ａ）に示すように、オフセットレンズなどによりＡＦ光Ｌの瞳にデフォーカス量（位相）を付与し、対物レンズ１２で集光されるこのＡＦ光Ｌの焦点位置が照明光Ｌｅより手前になるように設定することで、ＡＦ光Ｌは焦点維持制御（以下、「ＡＦ制御」とも呼ぶ）の基準となる反射面（カバーガラス２０の下面と空気、浸液等の媒質との界面）に焦点を結び、照明光Ｌｅはユーザー所望のｚ位置に焦点を結ぶ。このＡＦ光Ｌの焦点面と照明光Ｌｅの焦点面との光軸方向のオフセット量Δｚを大きくすることで、顕微鏡観察光（信号光）により、標本３０のより深部を観察することが可能となる。

このとき、観察条件によって、カバーガラス２０の両面がＡＦ光Ｌの反射面となる場合がある。試料３０に対して下から照明光Ｌｅを照射する倒立顕微鏡では、２つの反射面が存在する場合がある。ドライ観察の場合、一方は、空気とカバーガラス２０の下面の界面であり、他方は、カバーガラス２０の上面と試料３０の界面である。また、液浸観察の場合、一方は、水とカバーガラス２０の下面の界面であり、他方は、カバーガラス２０の上面と試料３０の界面である。このような条件下においては、参照している面からの反射光に他方の面からの反射光が混入し、両者の信号の識別ができなくなった結果、他方の面を新たな参照面と見なして焦点維持機能が働いてしまう場合がある。すなわち、正しくはカバーガラス２０の下面が参照面であったのに（図１７（ａ））、カバーガラス２０の上面が参照面となってしまう（図１７（ｂ））。その結果、顕微鏡の観察面（照明光Ｌｅの集光位置）も光軸方向にずれてしまい、ユーザー所望の位置を観察することが困難になる。

上述した図１６を用いてこの現象を更に詳細に説明する。図１６ではドライ観察を行っている。ドライ観察では、カバーガラス２０の下面を参照面とすることが多い。これは、下面からの反射光の方が光強度が大きいからである。カバーガラス２０の上面はガラスと試料３０の界面であり、カバーガラスの下面は、空気とガラスの界面である。空気の屈折率を１とし、ガラス（カバーガラス２０）の屈折率を１．５とし、試料３０の屈折率を１．３とすると、垂直入射の場合のカバーガラス２０の上面及び下面の反射率Ｒ_u，Ｒ_bはそれぞれ、次式（１）及び（２）から求められる。

よって、カバーガラス２０への入射光の強度をＩ₀とし、カバーガラス２０の下面で反射した光の強度をＩ_bottomとすると、Ｉ_bottom＝Ｒ_bI₀＝０．０４Ｉ₀となる。一方、カバーガラス２０の下面を透過し、上面で反射し、再び下面を透過した光の強度をＩ_topとすると、Ｉ_top＝（１−Ｒ_b）²×Ｒ_u＝０．００５Ｉ₀となる。そして、Ｉ_bottomとＩ_topとの比をとると、Ｉ_bottom／Ｉ_top＝８となる。このようにドライ観察では、カバーガラス２０の下面からの反射光は上面に比べておよそ１桁大きい。

以下，カバーガラス２０と試料３０とを合わせて標本４０と呼ぶことにする。標本４０が基準位置にあるときは、参照面と光検出器９のセンサ面とが共役となるので、図１６（ａ）に示すように、光検出器９ではシャープな信号が検出される。ピークを中心として光検出器９のセンサ面を左右２分割し、各ピクセルで光強度を算出する。その左右の差から焦点ズレの方向を判断し、差がゼロになるように対物レンズ１２と標本４０との相対距離を変化させることで、焦点ずれを補正することができる。

図１６（ｂ）に示すように、標本４０が対物レンズ１２からΔｚだけ離れると、光検出器９ではデフォーカス信号が検出される。遮光部７により瞳の半分を遮光することで、検出信号は対称ではなくなる。その信号から焦点ズレの方向を検知することができる。しかし、図１６（ｃ）に示すように、標本４０が対物レンズ１２にΔｚだけ近づいた場合、カバーガラス２０の上面からの信号（反射光Ｌ″）がカバーガラス２０の下面からの信号（反射光Ｌ′）と競合することがある。前述したように、光強度は下面からの反射光Ｌ′のほうが大きいが、Δｚが大きくなることで下面のデフォーカス量（位相）が大きくなると、光検出器９に入射する反射光の光密度が低下するので、各ピクセルで検出される信号強度が低下する。一方、カバーガラス２０の上面からの反射光Ｌ″はΔｚが大きくなるにつれて、デフォーカス量（位相）は小さくなる。従って、両面からの信号が競合するようになる。特に、ドライ観察で用いられる対物レンズ１２は焦点深度が大きいので（１０倍でＮＡ０．３の対物レンズの場合、〜１０μｍ）、この問題が顕著になる。

本発明は、このような課題に鑑みてなされたものであり、観察光に依存せず、安定して対物レンズの焦点を所望の位置に維持させる焦点維持装置及びこの焦点維持装置を有する顕微鏡を提供することを目的とする。

前記課題を解決するために、本発明の第一の態様に係る焦点維持装置は、第１の光と第２の光との間に位相差を付与する部材を有し、第１の光を標本の第１の位置に集光させ、第２の光を前記標本の前記第１の位置とは異なる第２の位置に集光させる第１光学系と、前記第１の位置で反射した第１の光と、前記第２の位置で反射した第２の光とを検出する検出部と、前記検出部により検出された検出情報に基づいて対物レンズと前記標本との相対位置関係を変化させることで、前記対物レンズの焦点面を前記標本の所定の位置に維持する制御部と、を有する。

本発明に係る焦点維持装置及び顕微鏡を以上のように構成することにより、２つの参照面からの信号を両方検出することができ、これにより、参照面が切り替わったことを検知して対物レンズの焦点を所望の位置に維持させることができる。

第１の実施例に係る焦点維持装置を有する顕微鏡の構成を示す説明図である。 位相マスクで付与されるデフォーカス量（位相）を説明するための説明図である。 基準位置にあるときの焦点維持装置の状態を説明するための説明図であって、（ａ）は対物レンズ部におけるＡＦ光の状態を示し、（ｂ）はセンサ部におけるＡＦ光の状態を示し、（ｃ）はその検出結果を示す。 カバーガラスが対物レンズから離れたときの焦点維持装置の状態を説明するための説明図であって、（ａ）は対物レンズ部におけるＡＦ光の状態を示し、（ｂ）はセンサ部におけるＡＦ光の状態を示し、（ｃ）はその検出結果を示す。 図４の状態における２つの光検出部の検出結果を示す説明図であって、（ａ）はズレが小さいときを示し、（ｂ）は正しい焦点維持制御の状態を示し、（ｃ）はズレが大きいときを示し、（ｄ）は正しくない焦点維持制御の状態を示す。 図５において、正しくない焦点維持制御のときの対物レンズ部におけるＡＦ光の状態を示す説明図である。 カバーガラスが対物レンズに近づいたときの焦点維持装置の状態を説明するための説明図であって、（ａ）は対物レンズ部におけるＡＦ光の状態を示し、（ｂ）はセンサ部におけるＡＦ光の状態を示し、（ｃ）はその検出結果を示す。 図７の状態における２つの光検出部の検出結果を示す説明図であって、（ａ）はズレが小さいときを示し、（ｂ）は正しい焦点維持制御の状態を示し、（ｃ）はズレが大きいときを示し、（ｄ）は正しくない焦点維持制御の状態を示す。 図８において、正しくない焦点維持制御のときの対物レンズ部におけるＡＦ光の状態を示す説明図である。 制御部による第１の制御パターンのフローチャートである。 制御部による第２の制御パターンのフローチャートである。 第１の実施形態の焦点維持装置の変形例の構成を示す説明図である。 第１の実施形態の焦点維持装置の別の変形例の構成を示す説明図である。 第２の実施例に係る焦点維持装置を有する顕微鏡の構成を示す説明図である。 第２の実施例において、デフォーカス付与機構で付与されるデフォーカス量（位相）を説明するための説明図である。 従来の焦点維持装置におけるＡＦ光の状態を示す説明図である。 従来の焦点維持装置における焦点維持方法を説明するための説明図である。

以下、本発明の好ましい２つの実施形態について図面を参照して説明する。

［第１の実施形態］
まず、図１〜図１１を用いて、第１の実施形態に係る焦点維持装置を有する顕微鏡について説明する。図１に示すように、この顕微鏡１００は、照明光学系１２０及び観察光学系１３０と、これらの光学系１２０，１３０に含まれる対物レンズ１２の焦点位置を標本４０の所望の位置に維持する焦点維持装置１１０と、から構成される。

照明光学系１２０は、光源１５と、この光源１５から放射された照明光を集光して略平行光束とするコンデンサレンズ１６と、このコンデンサレンズ１６から出射した照明光を反射する第３ダイクロイックミラー１７と、この第３ダイクロイックミラー１７で反射した照明光を標本４０上に集光する対物レンズ１２とを有している。また、観察光学系１３０は、標本４０側から順に、上述の対物レンズ１２及び第３ダイクロイックミラー１７と、標本４０から出射して、対物レンズ１２で略平行光束に集光され、第３ダイクロイックミラー１７を透過した蛍光（観察光）を撮像素子１４の撮像面上に集光する結像レンズ１３とを有している。なお、この第３ダイクロイックミラー１７は、照明光の波長の光を反射し、信号光の波長の光を透過する性質を有している。

また、焦点維持装置１１０は、ＡＦ光を放射するＡＦ用光源１と、このＡＦ用光源１から放射されたＡＦ光を略平行光束にするコリメータレンズ２と、カラーフィルタ３ａ及び位相マスク３ｂからなる変調部３と、この変調部３を通過したＡＦ光をリレーする瞳リレーレンズ４と、瞳リレーレンズ４を通過したＡＦ光の一部を透過し、残りを反射するハーフミラー５と、照明光学系１２０及び観察光学系１３０の共通光路上に配置され、ハーフミラー５を透過したＡＦ光を対物レンズ１２に導く第１ダイクロイックミラー６と、このＡＦ光が標本４０で反射し、対物レンズ１２で再びコリメートされて、第１ダイクロイックミラー６で反射されたＡＦ光の反射光のうち、ハーフミラー５で反射された反射光の一部の波長の光を透過し残りを反射する第２ダイクロイックミラー１０と、第２ダイクロイックミラー１０を透過した光の光束の半分を遮光する第１遮光部７ａと、この第１遮光部７ａを通過した反射光を集光する第１集光レンズ８ａと、第１集光レンズ８ａの焦点面上若しくはその近傍に配置され、第１集光レンズ８ａで集光された反射光の強度を検出する第１光検出器９ａと、第２ダイクロイックミラー１０で反射した光を反射するミラー１１と、このミラー１１で反射した反射光の光束の半分を遮光する第２遮光部７ｂと、この第２遮光部７ｂを通過した反射光を集光する第２集光レンズ８ｂと、第２集光レンズ８ｂの焦点面上若しくはその近傍に配置され、第２集光レンズ８ｂで集光された反射光の強度を検出する第２光検出器９ｂと、を有している。なお、ＡＦ用光源１はＬＥＤやＬＤで構成される。また、瞳リレーレンズ４は、対物レンズ１２の射出瞳を変調部３の位相マスク３ｂ上にリレーする。すなわち、対物レンズ１２の射出瞳と変調部３の位相マスク３ｂとは略共役関係を有している。また、第１及び第２光検出器９ａ，９ｂは、ラインＣＣＤ、ＰＳＤ（光位置センサ），ＱＰＤ（４分割フォトダイオード）等で構成されている。また、照明光学系１２０はクリティカル照明に限定する必要はなく、ケーラー照明でも、その他の照明方式でも良い。

また、この焦点維持装置１１０は、第１及び第２光検出器９ａ，９ｂからの出力信号を処理して、顕微鏡１００に設けられた駆動部６０の作動を制御をして、対物レンズ１２と標本４０との相対位置を変化させるように構成されている。この駆動部６０は、対物レンズ１２を光軸方向に移動させるように構成しても良いし、標本４０が載置された図示しないステージを光軸方向に移動させるように構成しても良い。

カラーフィルタ３ａは、分離部に相当し、図１に示すように、光軸を含む境界で対物レンズの射出瞳（対物レンズの射出瞳そのもの、及びリレーレンズでリレーした瞳も含む）を２分割し（円形の瞳に対して、光軸を含む２つの半円の領域に分割し）、それぞれの領域は互いに異なる波長の光のみを通過させるように構成されている。例えば、本実施形態においては、照明光学系１２０の照明光の波長、標本４０から発生する蛍光の波長と分離可能なように、一方の領域は赤色の光（例えば、８００ｎｍ）のみを通過させ、他方の領域は青色の光（例えば、７００ｎｍ）のみを通過させるように構成されている。また、位相マスク３ｂはデフォーカス情報付与部に相当し、カラーフィルタ３ａで分離された光に位相差（光路長差）を付与する、つまりそれぞれ異なるデフォーカス量（位相）を付与する。例えば、青色の光には、標本面の上側にフォーカスするようなデフォーカス量（位相）を、赤色の光には標本面の下側にフォーカスするようなデフォーカス量（位相）を付与する。ここで、ＡＦ光の波長をλとし、対物レンズ１２の開口数をＮＡとし、瞳座標をρとすると、デフォーカス量（位相）Δφと、蛍光（観察光）の焦点位置）に対するＡＦ光の焦点位置のオフセット量Δｚ₀との関係は、次式（３）のように表される。但し、｜ρ｜≦１とする。

この式（３）に基づいて、青色の光に付与するデフォーカス量（位相）をφ_Bとし、赤色の光に付与するデフォーカス量（位相）をφ_Rとしたときの、瞳座標ρとデフォーカス量（位相）φとの関係を図２に示す。このように、ＡＦ光の波長により、デフォーカス量（位相）が異なるので、これらのデフォーカス量（位相）Δφ_R及びΔφ_Bの差を制御することで、オフセット量Δｚ₀を制御することができる。すなわち、赤色の光と青色の光の間のデフォーカス量（位相）の差Δφ_B−Δφ_Rは、次式（４）に示すように、屈折率がｎで、厚みがＬのカバーガラス２０が付与する光位相に等しくなるように設定する。

なお、位相マスク３ｂとしては、厚みや屈折率が、上述の式（３），（４）で決まるデフォーカス量（位相）と、カバーガラス２０の厚みを満たすように設計された素子を用いても良いし、位相型の空間光変調器（Spatial Light Modulator：ＳＬＭ）を用いても良い。ＳＬＭでは、光位相を自由に可変できるので、オフセット量や厚みの補正が容易で有り、固定の素子に比べて優れている。また、試料３０を保持するサンプルホルダとしてカバーガラス２０を例に説明しているが、これに限定されることはなく、例えば、プラスティックディッシュや９６ｗｅｌｌでも良い。その際は、プラスティックの厚みと屈折率に基づいて、上述の式（４）で決まる適切な位相差を位相マスク３ｂに設定する必要がある。

変調部３を構成するカラーフィルタ３ａ及び位相マスク３ｂを透過したＡＦ光は、瞳リレーレンズ４を通過し、ハーフミラー５を透過し、第１ダイクロイックミラー６で反射されて対物レンズ１２に導かれる。そして、この対物レンズ１２によって、ＡＦ光のうち、赤色の光はカバーガラス２０の下面に結像され、青色の光はカバーガラス２０の上面に結像される。カバーガラス２０のこれらの反射面（上面及び下面）で反射したＡＦ光は再び対物レンズ１２を通り，第１ダイクロイックミラー６で反射され、さらにハーフミラー５で反射されて結像光学系に導かれる。この結像光学系において、第２ダイクロイックミラー１０は、ＡＦ光を構成する赤色の光と青色の光とを波長分離する。すなわち、ＡＦ光の反射光のうち、青色の光は第２ダイクロイックミラー１０を透過し、第１集光レンズ８ａで第１光検出器９ａ上に集光される。なお、第１遮光部７ａはノイズとなる余分な光をカットする役目を果たす。また、ＡＦ光の反射光のうち、赤色の光は第２ダイクロイックミラー１０で反射され、さらに、ミラー１１で反射され、第２集光レンズ８ｂで第２光検出器９ｂ上に集光される。なお、第２遮光部７ｂはノイズとなる余分な光をカットする役目を果たす。これらの第１光検出器９ａ又は第２光検出器９ｂで検出された信号を用いて焦点ズレの方向を検知し、対物レンズ１２と標本４０との相対位置を補正する。なお，焦点維持にはカバーガラス２０の上下面どちらの信号を用いても良い。

図３（ａ）に示すように、ＡＦ光のうち、青色の光Ｌｂは、光軸の右側を通りカバーガラス２０の上面で反射する。また、赤色の光Ｌｒは、光軸の左側を通りカバーガラス２０の下面で反射する。そして、図３（ｂ）に示すように、青色の光Ｌｂの反射光Ｌｂ′は第１光検出器９ａ上に集光され、また、赤色の光Ｌｒの反射光Ｌｒ′は第２光検出器９ｂ上に集光される。このとき、標本面（カバーガラス２０の上面及び下面）と第１及び第２光検出器９ａ，９ｂとは共役であるため、標本面からの反射光は、第１及び第２光検出器９ａ，９ｂの中心部に結像しており、図３（ｃ）に示すように、これらの第１及び第２光検出器９ａ，９ｂの中心部にピークを持つシャープな信号が観察されることになる。

図４は、基準位置（図３に示すように、カバーガラス２０の上下面と第１及び第２光検出器９ａ，９ｂとが共役なとき）に対して、標本（カバーガラス２０）と対物レンズ１２との距離が離れた場合を示している。ここで、カバーガラス２０の厚みをｄとし、赤色の光Ｌｒの基準位置をカバーガラス２０の下面、青色の光Ｌｂの基準位置をカバーガラス２０の上面とする。赤色の光Ｌｒにとって、第２光検出器９ｂと共役な位置（焦点ズレがないときのカバーガラス２０の下面）と焦点ズレ（Δｚ）が生じた時のカバーガラス２０の上下面との間隔はそれぞれ、ｄ＋Δｚ、Δｚとなる。したがって、カバーガラス２０の下面からの反射光Ｌｒ′の方が共役な位置に対してデフォーカス量（位相）が少ないので、第２光検出器９ｂで観測される信号は下面からの反射光Ｌｒ′が支配的になる。図４（ｂ）に示すように、このカバーガラス２０の下面からの反射光Ｌｒ′は、図４（ｃ）に示すように、第２光検出器９ｂの左側にピークを持つ左右非対称な信号として観測される。

一方，青色の光Ｌｂにとって、第１光検出器９ａと共役な位置（焦点ズレがないときのカバーガラス２０の上面）とカバーガラス２０の上下面との間隔はそれぞれ、Δｚ、ｄ−Δｚとなる。ここで、Δｚ＝ｄ／２となったときには、カバーガラス２０の上下面からの反射光の共役な位置に対するデフォーカス量（位相）は等しくなる。このようにΔｚが大きくなると、図４（ｃ）に示すように、カバーガラス２０の上面で反射した青色の光Ｌｂ′は第１光検出器９ａの右側に片寄った信号となり、下面で反射した青色の光Ｌｂ″は第１光検出器９ａの左側に片寄った信号となる。

焦点ズレが小さく、青色の入射光Ｌｂがカバーガラス２０の下面で反射した光Ｌｂ″による信号の強度が無視できる場合には、図５（ａ）に示すように、赤色の光Ｌｒ′は第２光検出器９ｂの左側で検出され、青色の光Ｌｂ′（青色の入射光Ｌｂがカバーガラス２０の上面で反射した反射光）は第１光検出器９ａの右側で検出される。この状態では、図５（ｂ）に示すように、赤色の信号に基づいて焦点制御しても、青色の信号に基づいて焦点制御しても、両者の信号は中心にピークを持つことになる。

一方、焦点ズレが大きくなり、青色の入射光Ｌｂがカバーガラス２０の下面で反射した光Ｌｂ″による信号が支配的になった場合には、図５（ｃ）に示すように、カバーガラス２０の上面で反射した青色の光Ｌｂ′は第１光検出器９ａの右側で検出され、カバーガラス２０の下面で反射した青色の光Ｌｂ″は第１光検出器９ａの左側で検出される。また、赤色の光Ｌｒ′は同様に第２光検出器９ｂの左側で検出される。このとき、赤色の光Ｌｒ′を検出する第２光検出器９ｂの信号に基づいて焦点維持制御した場合は、標本（カバーガラス２０）と対物レンズ１２との距離が近づくので、正しく焦点補正され、図５（ｂ）に示すように、第１光検出器９ａ、第２光検出器９ｂともに、左右対称なシャープな信号が検出される。しかし、青色の光Ｌｂ′を検出する第１光検出器９ａの信号に基づいて焦点維持制御をした場合には、カバーガラス２０の下面で反射した青色の光Ｌｂ″による信号が支配的なので、標本（カバーガラス２０）と対物レンズ１２との距離がさらに離れることになる。その結果、図５（ｄ）に示すように、第１光検出器９ａでは、カバーガラス２０の下面で反射した青色の光Ｌｂ″がシャープに観測されるが、第２光検出器９ｂの赤色の信号Ｌｒ′はデフォーカス量（位相）が大きくなるため観測が困難になる。このときは、対物レンズ１２とカバーガラス２０との関係は図６のようになっており、ユーザーが望む観察位置と異なる面を見ていることになる。

図５（ｄ）に示すように、焦点維持制御の結果、第１及び第２光検出器９ａ，９ｂの両方でシャープな信号が観測されないときは、正しい焦点維持制御できていないという判断を得ることができる。このように本手法を用いることで、誤った焦点維持が発生した場合に、それを検出することができる。

また、図５（ｄ）の状態を検出した後、対物レンズ１２と標本（カバーガラス２０）との相対距離を図５（ｃ）から図５（ｄ）に至る過程の逆方向に変化させることで、正しい焦点維持制御に戻すことができる。図５（ｄ）及び図６に示す状態では、図５（ｃ）から図５（ｄ）に至る過程で対物レンズ１２と標本（カバーガラス２０）との相対距離がより離れている。そのため、標本（カバーガラス２０）と対物レンズ１２との相対距離を近づけることで、図５（ｃ）の状態を経て、図５（ｂ）の状態に到達し、正しい焦点維持制御を回復することができる。

従って、対物レンズ１２と標本（カバーガラス２０）との相対距離が近づいたか、離れたか、という情報は、どちらの色の信号、つまり、どちらの面の信号が消失あるいは検出されているかで判断することができ、カバーガラス２０の下面から赤色の光の反射光、つまり第２光検出器９ｂの赤色の信号Ｌｒ′が検出されない場合（これも赤色の光が反射した結果得られる情報に含む）は、対物レンズ１２と標本（カバーガラス２０）との相対距離が（間違った方向に）より離れていることがわかる。

このように、本手法を用いることで、異常な焦点維持制御が生じた場合の検知、及びその自動補正を実現することができる。

次に、標本（カバーガラス２０）と対物レンズ１２とが近づいた場合の制御について述べる。図７は基準位置（図３の状態）に対して、標本（カバーガラス２０）と対物レンズ１２との距離が近づいた場合である。カバーガラス２０の厚みをｄとし、赤色の光Ｌｒの基準位置をカバーガラス２０の下面とし、青色の光Ｌｂの基準位置をカバーガラス２０の上面とする。

青色の光Ｌｂにとって、第１光検出器９ａと共役な位置（焦点ズレがないときのカバーガラス２０の上面）と焦点ズレが生じたときのカバーガラス２０の上下面との間隔はそれぞれ、Δｚ、ｄ＋Δｚとなる。したがって、カバーガラス２０の上面からの反射光Ｌｂ′の方が共役な位置に対してデフォーカス量（位相）が少なく、第１光検出器９ａで観測される信号はこの上面からの反射光Ｌｂ′が支配的になる。このとき、図７（ｃ）に示すように、この信号は第１光検出器９ａの左側に片寄った左右非対称な信号として観測される。

一方，赤色の光Ｌｒにとって、第２光検出器９ｂと共役な位置（焦点ズレがないときのカバーガラス２０の下面）とカバーガラス２０の上下面との間隔はそれぞれ、ｄ−Δｚ、Δｚとなる。ここで、Δｚ＝ｄ／２となったときには、カバーガラス２０の上下面からの反射光の共役な位置に対するデフォーカス量（位相）は等しくなる。このようにΔｚが大きくなると、カバーガラス２０の上面で反射した光Ｌｒ″は、図７（ｃ）に示すように、第２光検出素子９ｂの左側に片寄った信号となり、カバーガラス２０の下面で反射した光Ｌｒ′は第２光検出器９ｂの右側に片寄った信号となる。

焦点ズレが小さく、赤色の入射光Ｌｂがカバーガラス２０の上面で反射した赤色の光Ｌｒ″による信号の強度が無視できるので、カバーガラス２０の下面で反射した赤色の光Ｌｒ′は、図８（ａ）に示すように、第２光検出器９ｂの右側に、青色の光Ｌｂ′は左側に検出される。この状態では、赤色の光Ｌｒ′による信号に基づいて焦点制御しても、青色の光Ｌｂ′による信号に基づいて焦点制御しても、図８（ｂ）に示すように、両者の信号は中心にピークを持つことになる。

一方、焦点ズレが大きくなり、赤色の入射光Ｌｂがカバーガラス２０の上面で反射した赤色の光Ｌｒ″の信号が支配的になった場合には、図８（ｃ）に示すように、カバーガラス２０の下面で反射した赤色の光Ｌｒ′は第２光検出器９ｂの右側で検出され、カバーガラス２０の上面で反射した赤色の光Ｌｒ″は第２光検出器９ｂの左側で検出される。また、青色の光Ｌｂ′は同様に第１光検出器９ａの左側で検出される。このとき、第１光検出器９ａの信号に基づいて焦点維持した場合は、標本（カバーガラス２０）と対物レンズ１２との距離が遠ざかるので、正しく焦点補正され、図８（ｂ）に示すように、第１及び第２光検出器９ａ，９ｂともに左右対称なシャープな信号が検出される。しかし、第２光検出器９ｂの信号に基づいて焦点維持制御した場合は、カバーガラス２０の上面で反射した赤色の光Ｌｒ″による信号が支配的なので、標本（カバーガラス２０）と対物レンズ１２との距離がさらに近づくことになる。この場合、図８（ｄ）に示すように、第２光検出器９ｂでは、カバーガラス２０の上面で反射した赤色の光Ｌｒ″がシャープに観測されるが、第１光検出器９ａの青色の光Ｌｂ′による信号はデフォーカス量（位相）が大きくなるため観測が困難になる。このときは、対物レンズ１２とカバーガラス２０との関係は図９のようになっており、ユーザーが望む観察位置と異なる面を見ていることになる。

このように、焦点維持制御の結果、第１及び第２光検出器９ａ，９ｂの両方でシャープな信号が観測されない場合（図８（ｄ）の場合）は、正しい焦点維持制御ができていないという判断を得ることができる。このように本手法を用いることで，誤った焦点維持が発生した場合に，それを検出することができる。

また、図８（ｄ）の状態を検出した後、対物レンズ１２と標本（カバーガラス２０）との相対距離を図８（ｃ）から図８（ｄ）に至る過程の逆方向に変化させることで、正しい焦点維持制御に戻すことができる。図８（ｄ）及び図９の状態では、図８（ｃ）から図８（ｄ）に至る過程で対物レンズ１２と標本（カバーガラス２０）との相対距離が近づいている。そのため、標本（カバーガラス２０）と対物レンズ１２との相対距離を遠ざけることで、図８（ｃ）の状態を経て、図８（ｂ）の状態に到達し、正しい焦点維持制御を回復することができる。

従って、対物レンズ１２と標本（カバーガラス２０）との相対距離が近づいたか、離れたか、という情報は、どちらの色の信号、つまり、どちらの面の信号が消失あるいは検出されているかで判断することができ、カバーガラス２０の上面から青色の光の反射光、つまり第１光検出器９ａの青色の信号Ｌｂ′が検出されない場合（これも青色の光が反射した結果得られる情報に含む）は、対物レンズ１２と標本（カバーガラス２０）との相対距離が（間違った方向に）より近づいていることがわかる。

このように、本手法を用いることで、異常な焦点維持制御が生じた場合の検知及びその自動補正を実現することができる。

それでは、このような構成の焦点維持装置１１０を用いて制御部５０による焦点維持制御について説明する。上述したように、対物レンズ１２に対する標本（カバーガラス２０）が基準位置から遠ざかる場合に、第１光検出器９ａにより焦点維持制御をすると、第２光検出器９ｂで赤色の反射光Ｌｒ′を検出することができなくなる場合があり、反対に、対物レンズ１２に対する標本（カバーガラス２０）が基準位置から近づく場合に、第２光検出器９ｂにより焦点維持制御をすると、第１光検出器９ａで青色の反射光Ｌｂ′を検出することができなくなる。そのため、第１及び第２光検出器９ａ，９ｂのいずれか一方からの信号に基づいて焦点維持制御を行い、他方の信号が検出されない場合に、補正することにより、正確な焦点維持制御が可能となる。

まず、図１０を用いて第１の制御パターンについて説明する。制御部５０は、第１光検出器９ａの信号を取得し（ステップＳ２００）、この信号を解析し（ステップＳ２０１）、焦点ズレがあるか否かを判断する（ステップＳ２０２）。そして、制御部５０は、このステップＳ２０２で焦点ズレがあると判断すると、この第１光検出器９ａの信号に基づいて駆動部６０を作動させ、対物レンズ１２と標本（カバーガラス２０）との距離を調整する（ステップＳ２０３）。制御部５０は、第１光検出器９ａの出力のピークが中心に位置するまで、すなわち、焦点ズレがなくなったと判断するまで、このステップＳ２００〜ステップＳ２０３までの処理を繰り返す。さらに、制御部５０は、ステップＳ２０２で焦点ズレがないと判断すると、第２光検出器９ｂの信号を取得し（ステップＳ２０４）、この信号を解析し（ステップＳ２０５）、第２光検出器９ｂから合焦信号（左右対称で、ある強度閾値を有した信号）が出力されているか否かを判断する（ステップＳ２０６）。このステップＳ２０６で第２光検出器９ｂから信号が出力されていないということは、図５を用いて説明したように、カバーガラス２０の下面で反射した青色の光Ｌｂ″により焦点維持制御をした結果、対物レンズ１２と標本（カバーガラス２０）との距離が離れ過ぎてしまったことにより発生したものである。したがって、制御部５０は、駆動部６０を作動させ、対物レンズ１２とカバーガラス２０との距離を近づけ（ステップＳ２０７）、第２光検出器９ｂにより信号が取得できるまで、ステップＳ２０４〜ステップＳ２０７を繰り返す。これにより、第１光検出器９ａで検出される反射光Ｌｂ′，Ｌｂ″のうち、カバーガラス２０の上面で反射した反射光Ｌｂ′が支配的となり、再度、ステップＳ２００〜ステップＳ２０３の処理を行うことにより、正確な焦点維持制御が可能となる。

次に、図１１を用いて第２の制御パターンについて説明する。制御部５０は、第２光検出器９ｂの信号を取得し（ステップＳ２１０）、この信号を解析し（ステップＳ２１１）、焦点ズレがあるか否かを判断する（ステップＳ２１２）。そして、制御部５０は、このステップＳ２１２で焦点ズレがあると判断すると、この第２光検出器９ｂの信号に基づいて駆動部６０を作動させ、対物レンズ１２と標本（カバーガラス２０）との距離を調整する（ステップＳ２１３）。制御部５０は、第２光検出器９ｂの出力のピークが中心に位置するまで、すなわち、焦点ズレがなくなったと判断するまで、このステップＳ２１０〜ステップＳ２１３までの処理を繰り返す。さらに、制御部５０は、ステップＳ２１２で焦点ズレがないと判断すると、第１光検出器９ａの信号を取得し（ステップＳ２１４）、この信号を解析し（ステップＳ２１５）、第１光検出器９ａから合焦信号（左右対称で、ある強度閾値を有した信号）が出力されているか否かを判断する（ステップＳ２１６）。このステップＳ２１６で第１光検出器９ａから信号が出力されていないということは、図８を用いて説明したように、カバーガラス２０の上面で反射した赤色の光Ｌｒ″により焦点維持制御をした結果、対物レンズ１２と標本（カバーガラス２０）との距離が近づき過ぎてしまったことにより発生したものである。したがって、制御部５０は、駆動部６０を作動させ、対物レンズ１２とカバーガラス２０とを距離を離し（ステップＳ２１７）、第１光検出器９ａにより信号が取得できるまで、ステップＳ２１４〜ステップＳ２１７を繰り返す。これにより、第２光検出器９ｂで検出される反射光Ｌｒ′，Ｌｒ″のうち、カバーガラス２０の下面で反射した反射光Ｌｒ′が支配的となり、再度、ステップＳ２１０〜ステップＳ２１３の処理を行うことにより、正確な焦点維持制御が可能となる。

第１の実施形態で説明した変調部３の位相マスク３ｂに代えて、レンズの軸上色収差を利用しても良い。このとき、例えば、赤と青の２色を用いるとして、赤と青の軸上色収差の差が、カバーガラス２０の厚さに相当するように設定するのが望ましい。

なお、以上の第１の実施形態の説明として、標本（カバーガラス２０）の上下面に焦点を結ぶ光の分離方法として、カラーフィルタ３ａを用いた波長による分離を例に挙げて述べたが、この手法に限定されることはない。例えば、図１２に示す焦点維持装置１１０′のように、カラーフィルタ３ａの代わりに、分割された２つの領域の偏光方向が略直交する偏光板３ａ′を用いることもできる。なおこの場合は、第２ダイクロイックミラー１０の代わりに、偏光ビームスプリッタ（ＰＢＳ）１０′を用い、Ｐ偏向成分の光を透過させて第１光検出器９ａに導き、Ｓ偏向成分の光を反射させて第２光検出器９ｂに導くように構成することが必要である。

また、図１３に示す焦点維持装置１１０″のように、ＡＦ用光源１からの光を第４ダイクロイックミラー１０１で２分割し、分離した光路の各々の中で、遮光板１０２，１０５によりビームプロファイルの半分を遮光し、デフォーカス機構１０４，１０７により適切なデフォーカス量（位相）を与えても良い。この図１３のように構成すると、市販の一般的な光学素子を用いることができる。ここで、デフォーカス機構１０４，１０７としては、前述した位相マスク３ｂを用いても良いし、ＳＬＭ（空間光変調器）で位相量を可変できるようにしても良い。また、正レンズと正レンズ、あるいは負レンズと正レンズといった２枚のレンズを用いて、そのレンズ間隔を変えることで、所望のデフォーカス量（位相）を付与しても良い。なお、図１３において、第４のダイクロイックミラー１０１で分離した２つの光路は、各々の光路に設けられたミラー１０３，１０６により光路が折り曲げられ、第５のダイクロイックミラー１０８で重ね合わされてリレーレンズ４に導かれるように構成されている。

また、この図１３に示す焦点維持装置１１０″では、ＡＦ光源１からの光を第４のダイクロイックミラー１０１により波長分離しているが、この第４のダイクロイックミラー１０１の代わりに、偏光ビームスプリッタ（ＰＢＳ）を用いて偏光情報に基づいて光を分離しても良い。その場合は、偏光ビームスプリッタの前にλ／２板を設置し、偏光ビームスプリッタを透過するＰ偏光成分と、偏光ビームスプリッタで反射するＳ偏光成分の光強度を適切に調整してやることが望ましい。なおこの場合は、第２ダイクロイックミラー１０の代わりに、偏光ビームスプリッタ（ＰＢＳ）１０′を用い、Ｐ偏光成分の光を透過させて第１光検出器９ａに導き、Ｓ偏光成分の光を反射させて第２光検出器９ｂに導くように構成することが必要である。

また、図１３に示す焦点維持装置１１０″では、一つのＡＦ光源１の光を分離しているが、光源を二つ用いて、それぞれの光源に対して適切な遮光とデフォーカス量（位相）を与えた後に、波長や偏光情報を用いて合波しても良い。また、ロックイン検出技術を用いて、２つの光をそれぞれ異なる変調周波数で変調し、それらをそれぞれロックイン検出しても良い。この場合、波長や偏光は同じで良い。検出器としてはフォトダイオードアレイなど、周波数帯域の比較的広いものを使うことが望ましい。

［第２の実施形態］
この第２の実施形態に係る焦点維持装置２１０は、デフォーカス機構により付与するデフォーカス量（位相）を、カバーガラス２０の下面と上面で高速に切り替え、そのタイミングに同期して検出系を制御するように構成されている。なお、第１の実施形態で説明した顕微鏡１００及び焦点維持装置１１０と同じ構成は、同一の符号を付し、詳細な説明を省略する。

図１４に示すように、ＡＦ用光源１から放射されたＡＦ光は、コリメータレンズ２により略平行光束にされ、遮光部２１１によりこの平行光束の半分が遮光される。その後、瞳リレーレンズ４により対物レンズ１２の瞳共役位置に設置されたデフォーカス機構２１２により、デフォーカス量（位相）が付与される。このとき付与されるデフォーカス量（位相）は、図１５に示すように、２つのデフォーカス量（位相）ΔΦ₁及びΔΦ₂を有し、これらΔΦ₁，ΔΦ₂を、制御部５０から制御して高速に切り替える。この２つのデフォーカス量（位相）ΔΦ₁，ΔΦ₂のうち、ΔΦ₁は標本面（カバーガラス２０）の下面に結像するようなデフォーカス量（位相）に対応し、ΔΦ₂は標本面（カバーガラス２０）の上面に結像するようなデフォーカス量（位相）に対応する。ここで、前者をモード１と呼び、後者をモード２と呼ぶこととする。また、デフォーカス付与機構２１２としては、例えば上述したＳＬＭのような液晶素子を用いる。

制御部５０は、内部のクロック信号に基づいて、所定の時間間隔で、デフォーカス付与機構２１２で付与されるデフォーカス量（位相）ΔΦ₁，ΔΦ₂（モード１及びモード２）を切り替える。また、制御部５０は同時に、同一のクロック信号に基づいて、光検出器９から信号を取得し、モード毎の検出値として処理する。このように、デフォーカス付与機構（ＳＬＭ）２１２と光検出器９の出力の取得とを、制御部５０により同期制御させることで、デフォーカス付与機構（ＳＬＭ）２１２がモード１のときはカバーガラス２０の下面で反射した光を検出し、デフォーカス付与機構（ＳＬＭ）２１２がモード２のときはカバーガラス２０の上面で反射した光を検出することができる。信号検出後の制御は、上述した第１の実施形態と同様である。

なお、デフォーカス付与機構２１２は、ＳＬＭの代わりに、電圧制御により焦点距離を可変できる液体レンズを用いても良い。また、第１の実施形態で示した位相量の異なる位相マスクを２枚用意し、それらを高速で切り替えても良い。

このように、この第２の実施形態に係る焦点維持装置２１０においても、反射面が２つある場合に、参照面が切り替わるという異常な焦点維持制御が生じたとしても、それを検知し、自動的に補正することができる。

なお、上述の各実施形態の要件は、適宜組み合わせることができる。また、一部の構成要素を用いない場合もある。また、法令で許容される限りにおいて、上述の各実施形態及び変形例で引用した装置などに関する全ての公開公報及び米国特許の開示を援用して本文の記載の一部とする。

前記課題を解決するために、本発明に係る焦点維持装置は、顕微鏡の対物レンズの焦点面を標本の所定の位置に維持する焦点維持装置であって、光源から放射された光を分離情報によって２つに分離する分離部と、分離した光のそれぞれに、当該光を対物レンズの光軸方向の互いに異なる位置に集光させるデフォーカス情報を付与するデフォーカス情報付与部と、標本が有する２つの参照面のうち、少なくとも一つの参照面で分離した光がそれぞれ反射した結果得られる情報を検出情報として分離した光毎に出力する検出部と、検出情報に基づいて対物レンズと標本との相対位置関係を変化させることで、対物レンズの焦点面を標本の所定の位置に維持する制御部と、を有することを特徴とする。
このような焦点維持装置において、分離部は、分離情報によって、前記光を対物レンズの瞳面において、空間的に、２つに分割するように構成されていることが好ましい。
また、このような焦点維持装置において、分離情報は、前記光の波長であり、検出部は、分離した光の波長毎に、検出情報を出力することが好ましい。
また、このような焦点維持装置において、分離情報は、前記光の偏光方向であり、検出部は、分離した光の偏光方向毎に、検出情報を出力することが好ましい。
また、このような焦点維持装置において、分離情報は、前記光を変調する変調周波数であり、検出部は、分離した光の変調周波数毎に、検出情報を出力することが好ましい。
また、このような焦点維持装置において、分離情報は、時刻情報であり、検出部は、分離した光のそれぞれが、標本に照射された時刻毎に、検出情報を出力することが好ましい。
また、このような焦点維持装置において、デフォーカス情報付与部は、分離した光の位相をそれぞれ変化させることが好ましい。
また、このような焦点維持装置において、デフォーカス情報付与部は、位相マスクであることが好ましい。
また、このような焦点維持装置において、デフォーカス情報付与部は、空間光変調器であることが好ましい。
また、このような焦点維持装置において、デフォーカス情報付与部は、レンズによって構成されることが好ましい。
また、このような焦点維持装置において、制御部は、分離した光毎に出力される検出情報のうちの一方により、対物レンズと標本との相対位置関係を変化させて対物レンズの焦点面を標本の所定の位置に移動させた状態で、他方の検出情報が検出できないときは、この他方の検出情報が検出できるまで、一方の検出情報に基づいて変化させた方向とは逆方向に相対位置関係を変化させ、再度、一方の検出情報により、相対位置関係を変化させて対物レンズの焦点面を標本の所定の位置に移動させるように構成されていることが好ましい。
また、本発明に係る顕微鏡は、上述の焦点維持装置のいずれかを有することを特徴とする。

１ ＡＦ用光源 ３ａ カラーフィルタ（分離情報付与部）
３ｂ 位相マスク（デフォーカス情報付与部） ９（９ａ，９ｂ） 光検出部
１２ 対物レンズ ４０ 標本 ５０ 制御部 １００ 顕微鏡
１１０ 焦点維持装置

Claims (15)

1. 第１の光と第２の光との間に位相差を付与する部材を有し、第１の光を標本の第１の位置に集光させ、第２の光を前記標本の前記第１の位置とは異なる第２の位置に集光させる第１光学系と、
   前記第１の位置で反射した第１の光と、前記第２の位置で反射した第２の光とを検出する検出部と、
   前記検出部により検出された検出情報に基づいて対物レンズと前記標本との相対位置関係を変化させることで、前記対物レンズの焦点面を前記標本の所定の位置に維持する制御部と、
   を有する焦点維持装置。
2. 前記第１の光は第１の波長を有し、
   前記第２の光は第２の波長を有する
   請求項１に記載の焦点維持装置。
3. 前記第１の光は第１の偏光方向を有し、
   前記第２の光は第２の偏光方向を有する
   請求項１に記載の焦点維持装置。
4. 前記第１の光は第１の光源から射出された光であり、
   前記第２の光は第２の光源から射出された光である
   請求項１に記載の焦点維持装置。
5. 前記第１の光は第１の変調周波数で変調された光であり、
   前記第２の光は第２の変調周波数で変調された光である
   請求項１に記載の焦点維持装置。
6. 前記第１の光の射出と前記第２の光の射出とが切り換えられる
   請求項１に記載の焦点維持装置。
7. 光源から放射された光を前記第１の光と前記第２の光とに分離する分離部材を有する
   請求項１に記載の焦点維持装置。
8. 前記分離部材は、前記光を前記対物レンズの瞳面において分離する
   請求項７に記載の焦点維持装置。
9. 前記分離部材は、第１の波長を有する前記第１の光と、第２の波長を有する前記第２の光とに分離する
   請求項７または８に記載の焦点維持装置。
10. 前記分離部材は、第１の偏光方向を有する前記第１の光と、第２の偏光方向を有する前記第２の光とに分離する
    請求項７または８に記載の焦点維持装置。
11. 前記部材は、位相マスクにより位相差を付与する
    請求項１〜１０のいずれか一項に記載の焦点維持装置。
12. 前記部材は、空間光変調器により位相差を付与する
    請求項１〜１０のいずれか一項に記載の焦点維持装置。
13. 前記部材は、レンズにより位相差を付与する
    請求項１〜１０のいずれか一項に記載の焦点維持装置。
14. 前記第１の位置はカバーガラスの上面であり、
    前記第２の位置はカバーガラスの下面である
    請求項１〜１３のいずれか一項に記載の焦点維持装置。
15. 請求項１〜１４のいずれか一項に記載の焦点維持装置と、
    前記標本の第１の位置及び第２の位置と異なる第３の位置に第３の光を照射する第２光学系と、を有し、
    前記第１光学系と前記第２光学系との共通光路に前記対物レンズを有する
    顕微鏡。

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