CN116068745A - 一种角度连续可调超分辨显微镜照明装置及相应成像方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种角度连续可调超分辨显微镜照明装置及相应成像方法。所述角度连续可调超分辨显微镜照明装置包括：准直扩束激光光源、光栅、偏振分光棱镜、L3透镜、空间滤波器、连续变倍装置、L2透镜、L1透镜与物镜，所述准直扩束激光光源发出的光束通过偏振分光棱镜反射到光栅上，L3透镜位于与光栅成1倍焦距处，起到傅里叶透镜的作用，将衍射光束汇聚到共轭面2上，在共轭面2上形成光栅条纹的点状频谱；共轭面2的频谱分布依次通过电动变倍扩束镜、L2透镜、L1透镜共轭至物镜后焦面上，通过连续变倍装置对显微镜物镜后焦面的共轭面进行连续变倍缩放，实现显微镜照明角度的连续调节。

Description

一种角度连续可调超分辨显微镜照明装置及相应成像方法

技术领域

本发明涉及显微镜光源系统，尤其是结构光超分辨显微镜照明光源系统，特别是涉及一种角度连续可调超分辨显微镜照明装置及TIRF-SIM层切成像方法。

背景技术

现有的结构光超分辨成像技术通常设计固定的多个离散角度来实现不同角度照明，如：2D-SIM、GI-SIM、TIRF-SIM。SIM为结构光超分辨显微镜(Structured IlluminationMicroscopy)。TIRF或TIRFM是指全内反射荧光显微成像技术(Total Internal ReflectionFluorescence Microscopy)。也就是说，现有技术的超分辨显微镜照明装置中，照明角度无法自由调节，照明角度是多个固定的离散角度。但是成像环境是复杂可变，会造成在一定条件下满足全反射的照明光随临界角变化而不满足全反射。例如冬天和夏天的温差可达20℃以上，这会造成样本、镜油、光学元件折射率变化，进而影响特定照明深度对于照明角度要求的变化。再例如，不同样本类型折射率也不一样，活细胞培养液折射率约1.34，细胞内部折射率约1.4，固定样本的固定剂折射率约1.5，不同工况的折射率不同会造成照明临界角变化。

因此需要一种照明角度连续可调的超分辨结构光照明方法以适应现实中复杂多变的成像环境。

发明内容

本发明的目的在于提供一种角度连续可调超分辨显微镜照明装置来克服或至少减轻现有技术的上述缺陷中的至少一个。

为实现上述目的，本发明提供一种可实现照明角度连续调节的超分辨显微镜照明装置。

根据本发明实施例的角度连续可调超分辨显微镜照明装置包括：准直扩束激光光源、光栅、偏振分光棱镜、L3透镜、空间滤波器、连续变倍装置、L2透镜、L1透镜与物镜，

所述准直扩束激光光源发出的光束通过偏振分光棱镜反射到光栅上，

L3透镜位于与光栅成1倍焦距处，起到傅里叶透镜的作用，将衍射光束汇聚到共轭面2上，在共轭面2上形成光栅条纹的点状频谱；空间滤波器在光路上位于L3透镜与共轭面2之间；

共轭面2的频谱分布依次通过连续变倍装置、L2透镜、L1透镜共轭至物镜后焦面上，通过连续变倍装置对显微镜物镜后焦面的共轭面进行连续变倍缩放，实现显微镜照明角度的连续调节。

通过对显微镜物镜后焦面的共轭面进行变倍缩放，实现显微镜照明角度的连续调节。结构光超分辨显微镜通常使用双光束干涉形成结构光照明，双光束的照明角度取决于物镜后焦面及其共轭平面上频谱点位置的半径，本发明采用通过连续变倍装置，对共轭面进行缩放，可改变频谱点位置半径，从而改变物镜照明光束的角度，实现超分辨显微镜照明角度的连续调节。例如，解决当前超分辨成像技术因照明角度固定无法适应不同折射率成像场景的问题。

优选地，所述连续变倍装置为电动变倍扩束镜或楔形棱镜阵列，其中，所述楔形棱镜阵列既能够用于2D-SIM成像，也能够用于3D-SIM成像。

优选地，通过改变频谱点位置半径，从而改变物镜照明光束的角度。

优选地，所述光栅为闪耀光栅、空间光调制器SLM或数字微镜阵列DMD。

优选地，在光路上，在L2透镜、L1透镜之间设置有反射镜。

优选地，空间光调制器SLM或数字微镜阵列DMD只需要载入与r_min对应的一组光栅图片，而空间滤波器只需要一组滤波针孔，不需要变换孔距。

使用电动变倍扩束镜后，通常SLM或DMD只需要载入r_min对应的一组光栅图片，而空间滤波器只需要一组滤波针孔

优选地，使用环形音圈电机、步进电机或电动位移台调整成对的2块楔形棱镜阵列的间距，以实现输出双光束间距的电动连续调节。

优选地，所述电动变倍扩束镜在光路上放在共轭面2后面，光路中共轭面2与电动变倍扩束镜之后的共轭面1共轭，再与物镜后焦面直接共轭。

优选地，所述楔形棱镜阵列在光路上直接放在共轭面2后面，光路中共轭面2与物镜后焦面直接共轭。

本发明还提供一种基于照明角度可调的TIRF-SIM层切成像方法，所述基于照明角度可调的TIRF-SIM层切成像方法采用的显微镜照明装置为如上所述的角度连续可调超分辨显微镜照明装置，且所述基于照明角度可调的TIRF-SIM层切成像方法包括下述步骤：

步骤1、基于下式计算TIRF照明深度范围[Zmin，Zmax]

其中，λ为照明波长，n为介质折射率，θ为所述显微镜照明装置在TIRF-SIM成像时的照明角度；

θmax为所述显微镜照明装置的在TIRF-SIM成像时的最大照明角度，θmax与连续变倍装置的最大变倍值Mmax对应，与Zmin对应；

θmin为所述显微镜照明装置在TIRF-SIM成像时的最小照明角度，θmin与连续变倍装置的最小变倍值Mmin对应，与Zmax对应，

M为连续变倍装置的与照明角度θ对应的倍率，所述连续变倍装置的倍率范围为[Mmin，Mmax]，

步骤2、将TIRF照明深度范围等距分为k层，并基于式1计算与每一层照明深度对应的照明角度，对于每一层照明深度对应的照明角度，调节连续变倍装置的变倍值，实现所述每一层照明深度对应的照明角度，并进行Z轴扫描成像，得到X、Y、Z三维分布的TIRF-SIM层切成像数据。

TIRF-SIM本身是一种2D成像模式，通过使用连续变倍装置，可以实现三维成像。而且，可以采用电动变倍扩束镜或常规楔形棱镜阵列，而无需使用特制的带有中央孔的楔形棱镜阵列。

附图说明

图1是根据本发明一实施例的角度连续可调超分辨显微镜照明装置的示意图。

图2示意性示出±1级衍射光与光轴成对称分布，透过物镜在物平面上形成双光束干涉，形成结构光条纹。

图3为共轭面上的频谱点示意图。

图4为变倍扩束镜作用的示意图。

图5a和图5b示意性图示楔形棱镜阵列的变倍原理。通过调整成对楔形棱镜之间的距离来实现变倍，而不改变光束的能量密度，也就是说，两个光束之间的距离调整，但是光束本身的粗细不变。

图6a和图6b为棱镜阵列的示意图。

图7a和图7b为中央处带有小孔的棱镜阵列的示意图。

图8是根据本发明另一实施例的角度连续可调超分辨显微镜照明装置的示意图。

附图标记：

1	准直扩束激光源	62	楔形棱镜阵列
				2	光栅	7	L2透镜
3	偏振分光棱镜	8	L1透镜
				4	L3透镜	9	物镜
5	空间滤波器
				61	电动变倍扩束镜

具体实施方式

在附图中，使用相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面结合附图对本发明的实施例进行详细说明。

结构光超分辨显微镜(Structured Illumination Microscopy,SIM)是一种基于结构光调制信息进行计算超分辨成像的技术，具有光毒性低、成像速度快的特点。结构光超分辨显微镜通常使用多光束干涉或者晶格衍射等方式实现条纹或方格的结构光照明。照明的角度决定了结构光条纹的空间频率与照明深度。

通常照明角度越大结构光空间频率越高，显微镜分辨率越高。同时照明角度也与成像深度相关，通常照明角度越大，照明深度越低，在使用油镜或水镜时，当照明角度大于全反射临界角θ_c，形成全反射照明。结构光超分辨显微镜的照明角度小于全反射角照明模式的称为2D-SIM，结构光超分辨显微镜的照明角度大于全反射角照明模式的称为TIRF-SIM。

全内反射荧光显微成像技术(Total Internal Reflection FluorescenceMicroscopy,TIRFM)，是一种利用光在全反射时形成的倏逝波对荧光样本进行照明，激发荧光分子以观察荧光标定样品的极薄区域，观测的动态范围通常在200nm以下。当光从折射率较高n₁光密介质入射到折射率较低n₂的光疏介质表面时(n₁>n₂)，如果入射角θ₁>θ_c＝arcsin(n₂/n₁)，入射光满足全反射条件，界面上的所有光都会反射回光密介质。

发生全反射时，在光疏介质表面形成随深度衰减的倏逝波，穿透深度为：

具体地，当光从折射率较高n₁光密介质入射到折射率较低n₂的光疏介质表面时(n₁>n₂)，式1中的n是指折射率较高n₁光密介质的折射率。

因为倏逝波强度随穿透深度呈指数衰减的特性，只有极靠近全反射面的样本区域会产生荧光反射，大大降低了背景光噪声干扰观测标的，故此项技术广泛应用于细胞表面物质的动态观察。TIRF-SIM是一种将TIRFM与SIM相结合形成的全内反射超分辨成像技术。

在SIM超分辨成像中，改变入射角度可以改变TIRF-SIM的倏逝波穿透深度，从而获得不同厚度的照明。当入射角靠近临界角时可同时实现成像背景较低，同时成像深度较深的优点。因此TIRF照明角度需要根据全反射临界角设计。

因为全反射临界角θ_c＝arcsin(n₂/n₁)，取决于折射率n₂与n₁，在常用倒置荧光显微镜中，n₁通常指镜油和玻片的折射率，n₂通常指样本培养液或细胞的折射率。物质的折射率通常会随温度变化而改变，例如全国大多数地区冬天与夏天温差达20℃以上，活细胞成像通常会使用加热装置，而固定细胞则不用加热，环境与实验温度的不同，造成镜油与样本的折射率发生变化，从而导致全反射临界角θ_c发生改变。在使用不同NA的物镜时，不同的镜油折射率同样会引起全反射临界角发生改变。

现有结构光超分辨成像技术通常设计固定的多个离散角度实现不同角度照明，如：2D-SIM、GI-SIM、TIRF-SIM，但是照明角度无法自由调节，照明角度是固定的，但是成像环境是复杂可变，会造成在一定条件下满足全反射的照明光随临界角变化而不满足全反射。因此需要一种照明角度连续可调的超分辨结构光照明方法以适用现实中复杂多变的成像环境。

本发明实施例用于实现结构光照明超分辨显微镜照明角度的连续调节。

根据本发明第一实施例的角度连续可调超分辨显微镜照明装置如图1所示。图1中所示的显微镜照明装置为基于变倍扩束镜(例如电动变倍扩束镜)的可调超分辨显微镜照明装置。所述显微镜照明装置包括：准直扩束激光光源1、光栅2、PBS(偏振分光棱镜)3、L3透镜4、空间滤波器5、变倍扩束镜、L2透镜7、L1透镜8、物镜9。

图中还示出了反射镜。发射镜在光路上位于L2透镜与L1透镜之间。发射镜不是必须的。例如，如果L1透镜、L2透镜的光轴共线时，不需要反光镜。反光镜的角度设置，例如根据物镜光轴与变倍装置光轴之间的夹角来设置。

L1透镜、L2透镜与L3透镜是处于不同位置的透镜，用L1、L2与L3进行区分，也可以相应称为第一透镜、第二透镜、第三透镜。在光路上，第一透镜、第二透镜、第三透镜与物镜之间的距离依次增大。也就是说，第一透镜临近物镜；第三透镜临近光源或偏振分光棱镜；而第二透镜处于中间位置。

准直扩束激光光源1例如是激光器输出的激光经过扩束准直后形成的光束直径较宽的平行光(平行激光)，或者提供所述平行光的装置或单元。所述准直扩束激光光源1发出的光通过偏振分光棱镜3反射到光栅2上。

空间滤波器在光路上位于L3透镜与共轭面2之间。空间滤波器5用于只允许选定的衍射光透过。

光栅可以采用任何适当的形式，例如可以为闪耀光栅、空间光调制器SLM、数字微镜阵列DMD等。平行激光照射到光栅上后，衍射出0级、±1级、±2级…等多级光束。L3透镜位于与光栅成1倍焦距处，起到傅里叶透镜的作用，可以将衍射光束汇聚到共轭面2上，在共轭面2上形成光栅条纹的点状频谱。在共轭面2附近使用空间滤波器5可以只允许±1级衍射光透过。

图2示意性示出±1级衍射光与光轴成对称分布，透过物镜在物平面上形成双光束干涉，形成结构光条纹。例如，虚线表示的I₁为一组双光束，实线表述的I₂为另一组双光束。在图2中，照明角度(入射角)定义为：光线与界面(虚线)的法线(虚线的垂线，即竖直方向)的夹角。

图3为共轭面上的频谱点位置示意图。共轭面1、共轭面2和后焦面为共轭关系。共轭面2上的频谱点分布会通过电动变倍扩束镜61、L2透镜7、L1透镜8共轭至物镜后焦面上，而物镜后焦面上光束的中心位置决定了物镜出射光角度，如图2所示。±1级衍射光与光轴成对称分布，透过物镜在物平面上形成双光束干涉，形成结构光条纹。

在结构光照明超分辨显微镜光路中可知，物镜后焦面上频谱点位置决定了中心光的位置，而中心光的位置决定了物镜出射光的角度。因此通过改变物镜后焦面上频谱点的位置则可以改变物镜出射光的角度。

如图3所示，虚线表示的I₁光束对应物镜后焦面上位置半径为r₁的频谱点，而实线表示的I₂光束对应物镜后焦面上位置半径为r₂的频谱点。因r₂>r₁，则就物镜出射光与光轴之间的角度而言，I₂光对应的角度大于I₁光对应的角度。因为物镜后焦面与共轭面1、共轭面2为共轭关系，使用电动变倍扩束镜61对共轭面1频谱点位置半径进行变倍调节可改变共轭面2频谱点位置半径。

如图4所示，变倍扩束镜的作用是基于变焦望远镜原理，将平行光，按倍率扩束为宽光束，扩束倍率通常为1-N倍。电动变倍扩束镜61作用是在传统手动扩束镜的基础上，使用电机代替手动移动透镜变焦，可以实现自动控制，并进一步提高控制精度。

图1所示装置的具体工作流程如下。根据物镜NA_obj设计出结构光照明角度，结构光照明角度定义为θ_ill。由θ_ill可以计算出物镜后焦面频谱点位置半径r，当照明结构光角度达到物镜NA_obj时，频谱半径为r_max，通常r_min定义为0.5r_max。r_min至r_max则是变倍扩束镜的放大范围。例如当r_min＝0.5r_max时，变倍扩束镜的放大倍率为1～2倍。因此需要设计光栅的光栅常数，使得在变倍扩束镜的放大倍率为1时，衍射光频谱在共轭面2上的位置半径为r_min。通过改变变倍扩束镜的放大倍率，可以改变共轭面1和物镜后焦面上的频谱点的位置半径，使其在r_min与r_max之间变化。

NA_obj为物镜的参数，即物镜的数值孔径。物镜上通常都会标出来，例如100X/1.5，40X/0.95，这个40X指的是物镜放大率为40倍，数值孔径为0.95。一个光学系统收集光的角度是有限的，在显微镜中，物镜收集光的最大角度由NA(数值孔径，NA＝n*sinθ)决定，所以当照明角度达到物镜NA时，这时照明角度最大。

在现有技术的照明装置光路中，没有变倍装置，r的切换通过改变光栅常数与空间滤波器上小孔的半径，基于SLM或DMD的光栅只能设定有限数量的光栅常数，且无法随时更改。因为SLM与DMD是通过预先载入图片的方式切换光栅图案，容量有限且载入速度较慢，而共轭面1对应的空间滤波器因机械加工成形无法变换孔距(通常刻蚀多个离散的孔距)，因此无法做到根据成像需要连续实时调节角度。

使用电动变倍扩束镜后，通常SLM或DMD只需要载入r_min对应的一组光栅图片，而空间滤波器只需要一组滤波针孔，不需要变换孔距，通过后面的变倍扩束镜可实现频谱位置半径的无级连续调节。

在上一实施例中使用电动变倍扩束镜实现了结构光照明角度的连续调节。本发明的发明人注意到，变倍镜在改变放大倍率的同时会改变光束直径，因此使用电动变倍扩束镜的时候，要保证物镜出射光束最小直径大于成像视场大小。但在某些成像场景下，增大光束直径会减少光能量密度。

因此本发明的第二实施例提供一种基于楔形棱镜阵列的超分辨显微镜照明装置。楔形棱镜阵列可以在不改变光束直径的情况下实现变倍功能。

楔形棱镜阵列是利用楔形平板对光的折射作用，改变光的传播方向，进一步改变双光束的间距。如图5a和图5b所示，单个楔形棱镜因光的折射作用使光发生倾斜，而使用成对且方向相反的折射面平行的楔形平板组合时，可以使得出射光线与入射光线平行，作用与平行平板相似。对于双光束，则使用两对楔形棱镜，可以起到扩大双光束间距的作用。而双光束扩大的倍率正比于两对楔形平板的距离，距离越远则倍率越大。但就单个光束而言，其直径并不会变大，也不会因此而减小光能量密度。

应用于结构光照明超分辨显微镜系统中时，通常需要3个方向的双光束照明，因此一共需要6束对称分布的照明光，其频谱如图3所示6点对称分布。因此，需要使用6组楔形棱镜组成楔形阵列。如图6a所示。为使得入射光和出射光平行，需要两块相反，且斜面平行的楔形棱镜阵列成对使用，如图6b。在图6a中，光线方向为穿透纸面的方向；在图6b中，光线方向为左右方向。

对于结构光超分辨显微镜中三维结构照明需求，通常需要三光束进行干涉，即0级光，±1级光。因此，如图7a和7b所示，在楔形棱镜阵列的基础上，中心开一小孔，让0级光透过，实现改变±1级光的间距，但不改变0级光的传播方向。

因为楔形棱镜只改变光束传播方向但不改变光束直径的性质，应用于结构光超分辨显微成像系统，可实现改变结构光照明角度，但不改变照明光场大小，保证光能量不损失。

楔形棱镜阵列可以使用环形音圈电机、步进电机、电动位移台等调整成对的2块楔形棱镜阵列的间距，实现输出双光束间距的电动调节。

楔形棱镜阵列应用于结构光照明超分辨显微镜系统的结构如图7所示。该系统的具体工作流程如下。根据物镜NA_obj设计出照明结构光的角度，结构光照明角度定义为θ_ill。由θ_ill可以计算出物镜后焦面频谱点位置半径r，当照明结构光角度达到物镜NA_obj时，频谱半径为r_max。通常r_min定义为0.5r_max。根据r_min至r_max范围，楔形棱镜的倾斜角，计算出两块楔形棱镜阵列间距的调整范围。

因为楔形棱镜不改变光束直径，因此在光路中楔形棱镜阵列直接放在共轭面2后面，如图8所示，光路中共轭面2与物镜后焦面直接共轭。通过改变楔形棱镜的阵列的间距，可以改变物镜后焦面频谱点的位置半径，从而改变物镜出射光的角度。使用音圈电机控制两块楔形棱镜的间距，可以实现物镜出射光束角度的连续调节。

在实际成像场景中，可以在物面放置荧光标记生物细胞样本，使用结构光照明，同时在相机上可以采集到荧光样本的图像，通过上位机实时控制音圈电机调节楔形棱镜阵列的角度可以观测到因照明角度变化引起的样本照明深度变化，实现不同深度的2D-SIM、3D-SIM、TIRF-SIM照明，从而适应现实超分辨成像应用中复杂多变的成像环境。

本发明的实施例还提供一种基于照明角度可调的TIRF-SIM层切成像方法。所述基于照明角度可调的TIRF-SIM层切成像方法采用的显微镜照明装置为如上所述的角度连续可调超分辨显微镜照明装置。

在一个实施例中，所述基于照明角度可调的TIRF-SIM层切成像方法包括下述步骤：

步骤1、基于下式计算TIRF照明深度范围[Zmin，Zmax]

其中，λ为照明波长，n为介质折射率，θ为所述显微镜照明装置在TIRF-SIM成像时的照明角度；

θmax为所述显微镜照明装置的在TIRF-SIM成像时的最大照明角度，θmax与连续变倍装置的最大变倍值Mmax对应，与Zmin对应。

θmin为所述显微镜照明装置在TIRF-SIM成像时的最小照明角度，θmin与连续变倍装置的最小变倍值Mmin对应，与Zmax对应。θmin大于全反射临界角θ_c，或者等于全反射临界角θ_c。

M为连续变倍装置的与照明角度θ对应的倍率，所述连续变倍装置的倍率范围为[Mmin，Mmax]。

根据式1能够确定，当改变照明角度θ时，倏逝波照明深度Z也会随之改变，因此，通过连续调节照明角度可实现不同深度照明TIRF-SIM成像。在角度连续可调超分辨显微镜照明装置中，TIRF-SIM照明角度调节可以通过连续变倍装置实现。在实际成像中，首先根据照明波长、介质折射率计算出TIRF照明深度范围。例如，在可见光波长范围内，倏逝波穿透深度通常为100-500nm。然后调节连续变倍装置，找到照明深度的上下界。将照明深度的调节范围转换为连续变倍装置的变倍范围，然后连续变倍装置的扫描与物镜成像焦距扫描同步控制，实现不同深度层切成像。整个系统的成像需要连续变倍装置、物镜焦面调节、相机在时序上同步控制。

步骤2、将TIRF照明深度范围等距分为k层，并基于式1计算与每一层照明深度对应的照明角度，对于每一层照明深度对应的照明角度，调节连续变倍装置的变倍值，实现所述每一层照明深度对应的照明角度，并进行Z轴扫描成像，得到X、Y、Z三维分布的TIRF-SIM层切成像数据。

照明深度范围为100-500nm。将照明深度范围为100-500nm以50nm分为9层，驱动连续变倍装置将调节范围细分为9个位点，该9个位点对于9层照明深度，以及9层物镜焦面深度，通过同步控制物镜与连续变倍装置进行Z轴扫描成像。得到X、Y、Z三维分布的TIRF-SIM层切成像数据。

因为倏逝波照明可有效减少背景荧光，但会少量带入前景荧光。通过相邻照明深度的差别，可通过算法有效减少前景荧光干扰，进一步提升TIRF-SIM层切成像质量。

TIRF-SIM本身是一种2D成像模式，通过使用连续变倍装置，可以实现三维成像。而且，可以采用电动变倍扩束镜或常规楔形棱镜阵列，而无需使用特制的带有中央孔的楔形棱镜阵列。

在SIM成像中，3D-SIM通常比2D-SIM难实现，3D-SIM通常需要透过7束光，2D-SIM只需要透过6束光，因此在结构上，3D-SIM能兼容2D-SIM，但是2D-SIM不能兼容3D-SIM。具体体现在图6和图7的差异。

最后需要指出的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制。本领域的普通技术人员应当理解：可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种角度连续可调超分辨显微镜照明装置，其特征在于，包括：准直扩束激光光源、光栅、偏振分光棱镜、L3透镜、空间滤波器、连续变倍装置、L2透镜、L1透镜与物镜，

所述准直扩束激光光源发出的光束通过偏振分光棱镜反射到光栅上，

L3透镜位于与光栅成1倍焦距处，起到傅里叶透镜的作用，将衍射光束汇聚到共轭面2上，在共轭面2上形成光栅条纹的点状频谱；空间滤波器在光路上位于L3透镜与共轭面2之间；

共轭面2的频谱分布依次通过连续变倍装置、L2透镜、L1透镜共轭至物镜后焦面上，通过所述连续变倍装置对显微镜物镜后焦面的共轭面进行连续变倍缩放，实现显微镜照明角度的连续调节。

2.如权利要求1所述的角度连续可调超分辨显微镜照明装置，其特征在于，所述连续变倍装置为电动变倍扩束镜或楔形棱镜阵列，其中，所述楔形棱镜阵列既能够用于2D-SIM成像，也能够用于3D-SIM成像。

3.如权利要求2所述的角度连续可调超分辨显微镜照明装置，其特征在于，通过改变频谱点位置半径，从而改变物镜照明光束的角度。

4.如权利要求2所述的角度连续可调超分辨显微镜照明装置，其特征在于，所述光栅为闪耀光栅、空间光调制器SLM或数字微镜阵列DMD。

5.如权利要求2所述的角度连续可调超分辨显微镜照明装置，其特征在于，在光路上，在L2透镜、L1透镜之间设置有反射镜。

6.如权利要求1所述的角度连续可调超分辨显微镜照明装置，其特征在于，空间光调制器SLM或数字微镜阵列DMD只需要载入与r_min对应的一组光栅图片，而空间滤波器只需要一组滤波针孔，不需要变换孔距。

7.如权利要求1所述的角度连续可调超分辨显微镜照明装置，其特征在于，使用环形音圈电机、步进电机或电动位移台调整成对的2块楔形棱镜阵列的间距，以实现输出双光束间距的电动连续调节。

8.如权利要求1所述的角度连续可调超分辨显微镜照明装置，其特征在于，所述电动变倍扩束镜在光路上放在共轭面2后面，光路中共轭面2与电动变倍扩束镜之后的共轭面1共轭，再与物镜后焦面直接共轭。

9.如权利要求1所述的角度连续可调超分辨显微镜照明装置，其特征在于，所述楔形棱镜阵列在光路上放在共轭面2后面，光路中共轭面2与物镜后焦面直接共轭。

10.一种基于照明角度可调的TIRF-SIM层切成像方法，其特征在于，所述基于照明角度可调的TIRF-SIM层切成像方法采用的显微镜照明装置为如权利要求1-9中任一项所述的角度连续可调超分辨显微镜照明装置，且所述基于照明角度可调的TIRF-SIM层切成像方法包括下述步骤：

步骤1、基于下式计算TIRF照明深度范围[Zmin，Zmax]

其中，λ为照明波长，n为介质折射率，θ为所述显微镜照明装置在TIRF-SIM成像时的照明角度；

θmax为所述显微镜照明装置的在TIRF-SIM成像时的最大照明角度，θmax与连续变倍装置的最大变倍值Mmax对应，与Zmin对应；

θmin为所述显微镜照明装置在TIRF-SIM成像时的最小照明角度，θmin与连续变倍装置的最小变倍值Mmin对应，与Zmax对应，

M为连续变倍装置的与照明角度θ对应的倍率，所述连续变倍装置的倍率范围为[Mmin，Mmax]，

步骤2、将TIRF照明深度范围等距分为k层，并基于式1计算与每一层照明深度对应的照明角度，对于每一层照明深度对应的照明角度，调节连续变倍装置的变倍值，实现所述每一层照明深度对应的照明角度，并进行Z轴扫描成像，得到X、Y、Z三维分布的TIRF-SIM层切成像数据。

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