JP5508901B2 - レーザ顕微鏡装置の作動方法 - Google Patents

Description

本発明は、レーザ顕微鏡装置の作動方法に関するものである。

従来、フェムト秒パルスレーザ光を射出するレーザ光源と、該フェムト秒パルスレーザ光を２つの光路に分岐するビームスプリッタとを備え、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光および多光子励起による蛍光の観察を同一の装置において両立するレーザ顕微鏡装置が知られている（例えば、特許文献１参照）。

上記のレーザ顕微鏡装置は、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光の観察では、ビームスプリッタにより分岐したパルスレーザ光に、周波数変換装置により標本中の分子の特定の振動周波数に略等しい周波数差を与えて、標本に照射するようになっている。これにより、標本中の分子からコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させ、この散乱光を検出することで標本の観察を行うようになっている。

また、多光子励起による蛍光の観察では、フェムト秒パルスレーザ光を標本に集光することで、標本の焦点面近傍の光子密度を高めて蛍光物質を多光子励起し、発生した蛍光を検出することで標本の観察を行うようになっている。

特開２００９−２８１９２３号公報

上記のレーザ顕微鏡装置において、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光の観察を行う際には、２つの光路を通るパルスレーザ光の周波数差の調整は、一対のリフレクタから構成されるパルスタイミング調節手段により行われる。すなわち、一方の光路を通るパルスレーザ光の光路長（時間的タイミング）を、パルスタイミング調節手段により変化させることで、２つの光路を通るパルスレーザ光の周波数差を調整している。

しかしながら、上記の方法では、２つの光路を通るパルスレーザ光の周波数差の調整幅は、２つの光路を通るパルスレーザ光の周波数帯域によって制限され、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生に利用できる分子振動の周波数が限定されてしまうという不都合がある。また、パルスタイミング調整手段により分子の特定の分子振動の周波数に一致するように２つの光路を通るパルスレーザ光の周波数差を調整した結果、２つの光路を通るパルスレーザ光の強度のピークが時間的にずれている場合には、これらパルスレーザ光の強度の高い領域をコヒーレントアンチストークスラマン散乱光の発生に用いることができず、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光の強度が低下してしまうという不都合がある。

本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、２つのパルスレーザ光の周波数差の調整幅を広げることができ、強度の高いコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を得ることができるレーザ顕微鏡装置の作動方法を提供することを目的とする。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を採用する。
本発明は、レーザ光源から発せられたパルスレーザ光を分岐手段によって２つの光路に分岐し、前記２つの光路の少なくとも一方に設けられた周波数変換手段によって、前記２つの光路を導光されるパルスレーザ光に前記標本中の分子の特定の振動周波数に略等しい周波数差を与え、前記２つの光路を導光されてきたパルスレーザ光を合波手段によって合波し、該合波手段により合波されたパルスレーザ光を照射手段によって標本に照射し、前記レーザ光源の波長が調整可能な波長指示手段によって、前記標本中の分子の特定の振動周波数に応じて前記レーザ光源の波長変更を指示するレーザ顕微鏡装置の作動方法を採用する。

本発明に係るレーザ顕微鏡装置の作動方法によれば、レーザ光源から発生したパルスレーザ光（例えばフェムト秒パルスレーザ光）が、分岐手段により２つの光路に分岐される。そして、少なくとも一方の光路を導光されるパルスレーザ光について、光路中に設置された周波数変換手段により周波数変換を行い、２つの光路を導光されてきたパルスレーザ光は合波手段により合波され、合波されたパルスレーザ光が照射手段により標本に照射されることで、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光観察と多光子蛍光観察が行われる。

コヒーレントアンチストークスラマン散乱光観察時には、周波数変換手段により、２つの光路を導光される各パルスレーザ光に、標本中の分子の特定の振動周波数に略等しい周波数差を与えることで、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させることができる。

この場合において、波長指示手段によりレーザ光源の波長（周波数と同義）を調整することで、２つの光路を導光される各パルスレーザ光の周波数差を変化させることができる。これにより、標本中の分子の特定の振動周波数に応じて、各パルスレーザ光の周波数差を調節して、該分子からコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させることができる。すなわち、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させることが可能な分子振動の周波数範囲を広げることができ、標本中の様々な分子に対してコヒーレントアンチストークスラマン散乱光観察を行うことができる。

また、このように各パルスレーザ光の周波数差を調節することで、特定の分子振動の周波数に一致するように２つの光路を通るパルスレーザ光の周波数差を調整し、かつ、２つの光路を通るパルスレーザ光の強度のピークを時間的に合わせることができる。つまり、各パルスレーザ光の強度の高い周波数領域を用いることができる。これにより、強度の高いコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を得ることができ、観察精度を向上することができる。

上記発明において、前記２つの光路の少なくとも一方に設けられた周波数分散調節手段によって、導光されるパルスレーザ光の周波数分散量を調節することとしてもよい。
周波数分散調節手段により、２つの光路を導光される各パルスレーザ光に略同等の周波数分散量を与えることで、時間軸上の各時刻において、２つのパルスレーザ光の周波数差を一定にすることができる。これにより、２つのパルスレーザ光のエネルギーを効率的にコヒーレントアンチストークスラマン散乱光の発生に用いることができる。
また、多光子蛍光観察時には、周波数分散調節手段により、標本面上において略フーリエ限界パルスに近づくように周波数分散量を調節することで、多光子励起効果を効率的に発生させることが可能となる。

上記発明において、前記２つの光路の少なくとも一方に設けられたパルスタイミング調節手段によって、前記標本面上におけるパルスレーザ光の時間的タイミングを調節することとしてもよい。
このようにすることで、パルスタイミング調節手段により、標本面上において２つのパルスレーザ光のタイミングを調整して、２つの光路を導光される各パルスレーザ光の周波数差を微調整することができる。

また、このように、波長指示手段とパルスタイミング調節手段とを併用することで、標本中の分子の特定の振動周波数に一致させるように２つの光路を導光される各パルスレーザ光の周波数差を調節することができ、効率的にコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させることが可能となる。また、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させることができる分子振動の周波数範囲を広げることができる。

上記発明において、パルスタイミング指示手段によって、前記標本中の観察したい分子の振動周波数に応じて、前記パルスタイミング調節手段の調節量を指示することとしても良い。
このようにすることで、パルスタイミングの調整を自動で行うことができる。さらには、調整量を適宜変えて２つの光路を導光される各パルスレーザ光の周波数差を調節しながら、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光を検出することで、標本中の観察したい分子の特定の分子振動のスペクトルを取得することが可能となる。

上記発明において、前記周波数変換手段が、フォトニッククリスタルファイバであることとしてもよい。
周波数変換手段としてフォトニッククリスタルファイバを用いることにより、簡易かつ安価に、周波数分散が与えられた広い周波数スペクトル帯域を有するパルスレーザ光を得ることが可能となる。また、用いるフォトニッククリスタルファイバの種類を選定することで、様々な周波数スペクトル成分および帯域を有するパルスレーザ光を得ることができる。このため、標本中の分子のさまざまな振動周波数に一致させるように、２つのパルスレーザ光の周波数差を調整することが可能となる。

上記発明において、前記フォトニッククリスタルファイバの異常分散波長帯域の少なくとも一部が、９００ｎｍから１１００ｎｍの範囲に含まれることとしてもよい。
多光子励起型のレーザ顕微鏡において、標本を標識するための蛍光物質としてｅＧＦＰ（enhanced Green Fluorescent Protein）、ＹＦＰ（Yellow Fluorescent Protein）、ＲＦＰ（Red Fluorescent Protein）といった蛍光タンパクが使用される。これらの蛍光タンパクを効率よく励起できる励起波長は９００ｎｍから１１００ｎｍの範囲である。また、９００ｎｍから１１００ｎｍの範囲の波長を有する観察光は、生体内での光散乱の影響も少ないため、特に生体の深部観察に適している。したがって、レーザ光源により射出されるパルスレーザ光の波長を９００ｎｍから１１００ｎｍの範囲とすることで、ｅＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ等の蛍光タンパクを効率よく励起し、多光子蛍光観察が行える。

また、ＳＨＧ（第二次高調波光）観察時においても、検出器の最適（高効率）観察波長帯域として４００ｎｍから６００ｎｍで設定されている場合が多い。したがって、レーザ光源により射出されるパルスレーザ光の波長を９００ｎｍから１１００ｎｍの範囲とすることで、効率良くＳＨＧ観察を行うことができる。

上記発明において、前記周波数変換手段が、互いに異なる周波数を与える複数の周波数変換素子と、前記複数の周波数変換素子を切替える切り替え手段とを備えることとしても良い。
こうすることで、標本中の観察したい分子の特定の分子振動の周波数に応じて、適切な周波数変換手段を選択することが可能となる。これにより、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させることができる分子の範囲をさらに広げることができる。

上記発明において、前記複数の周波数変換手段が、複数のフォトニッククリスタルファイバで構成されることとしても良い。
こうすることで、簡易かつ安価に、周波数分散が与えられた広い周波数スペクトル帯域を有するパルスレーザ光を得ることが可能となる。また、異なる種類のフォトニッククリスタルファイバを選定しておくことで、様々な周波数スペクトル成分および帯域を有するパルスレーザ光を得ることができる。このため、標本中の分子のさまざまな振動周波数に一致させるように、２つのパルスレーザ光の周波数差を調整することが可能となる。

上記発明において、前記複数のフォトニッククリスタルファイバの異常分散波長帯域の少なくとも一部が、９００ｎｍから１１００ｎｍの範囲に含まれることとしても良い。
こうすることで、レーザ光源により射出されるパルスレーザ光の波長を９００ｎｍから１１００ｎｍの範囲とすることで、ｅＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ等の蛍光タンパクを効率よく励起して多光子蛍光観察を行うことができる。

本発明によれば、２つのパルスレーザ光の周波数差の調整幅を広げることができ、強度の高いコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を得ることができるという効果を奏する。

本発明の一実施形態に係るレーザ顕微鏡装置の全体構成を示すブロック図である。 図１のレーザ顕微鏡装置の２つの光路を伝達されるパルスレーザ光の周波数の時間分布を示すグラフであり、（ａ）調整前、（ｂ）調整後をそれぞれ示している。 図１のレーザ顕微鏡装置の２つの光路を伝達されるパルスレーザ光の周波数帯域を示すグラフであり、（ａ）フォトニッククリスタルファイバの分散特性を示すグラフ上での２つの光路を伝達されるパルスレーザ光の周波数帯域、（ｂ）２つの光路を伝達されるパルスレーザ光の周波数帯域の時間分布（スペクトログラム）、をそれぞれ示している。 図１のレーザ顕微鏡装置の２つの光路を伝達されるパルスレーザ光のパルスの調整後の周波数の時間分布を示すグラフである。 比較例として示す、図１のレーザ顕微鏡装置において時間的タイミングのみを調節した場合の、２つの光路を伝達されるパルスレーザ光の周波数帯域を示すグラフであり、（ａ）フォトニッククリスタルファイバの分散特性を示すグラフ上での２つの光路を伝達されるパルスレーザ光の周波数帯域、（ｂ）２つの光路を伝達されるパルスレーザ光の周波数帯域の時間分布（スペクトログラム）、をそれぞれ示している。 図１のレーザ顕微鏡装置の２つの光路を伝達されるパルスレーザ光の周波数の時間分布を示すグラフであり、多光子励起の蛍光観察時におけるパルスレーザ光の周波数分散量の（ａ）調整前、（ｂ）調節後のそれぞれの状態を示している。 図１の変形例に係るレーザ顕微鏡装置の全体構成を示すブロック図である。

本発明の一実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１は、図１に示されるように、レーザ光源装置２と、レーザ光源装置２からのレーザ光を標本Ａに照射して標本Ａを観察するための顕微鏡本体（照射・観察手段）３とを備えている。

レーザ光源装置２は、フェムト秒パルスレーザ光を出射する単一の波長可変レーザ光源４と、波長可変レーザ光源（レーザ光源）４から発せられたフェムト秒パルスレーザ光を２つに分岐するビームスプリッタ（分岐手段）５と、ビームスプリッタ５により分岐された２つのパルスレーザ光Ｌ１，Ｌ２をそれぞれ通過させる２つの光路６，７と、該２つの光路６，７を通過してきた２つのパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’を合波するレーザコンバイナ（合波手段）８と、波長指示装置（波長指示手段）２１とを備えている。

第１の光路６には、ビームスプリッタ５により分岐されたフェムト秒パルスレーザ光Ｌ１に与える周波数分散量を調節する周波数分散調節装置（周波数分散調節手段）９と、周波数分散調節装置９を通過後のパルスレーザ光Ｌ１’の光路長を調節する光路調節装置（パルスタイミング調節手段）１１とが設けられている。

周波数分散調節装置９は、例えば、相互の間隔を調節可能な一対のプリズム（図示略）と、ミラー（図示略）とを備えている。一対のプリズムを通過したパルスレーザ光Ｌ１は、ミラーによって折り返された後に再度プリズム対を通過し同一の光路上に戻されるようになっている。この場合に、プリズムの間隔を調節することにより、周波数分散調節装置９を通過するパルスレーザ光Ｌ１に与える周波数分散量を調節することができるようになっている。また、上記プリズム対の代わりに回折格子対（図示略）を用いてもよい。

また、周波数分散調節装置９は、多光子蛍光観察時には、光路６を導光されるパルスレーザ光Ｌ１が、標本Ａ面上において略フーリエ限界パルスに近づくような周波数分散量を設定することができるようになっている。具体的には、周波数分散調節装置９は、パルスレーザ光Ｌ１が周波数分散調節装置９から標本Ａまでに経験する周波数分散量を減じるようになっている。これにより、波長可変レーザ光源４から標本Ａまでの全光路において生じる周波数分散によってパルスレーザ光Ｌ１のパルス幅の広がりを補償することができ、標本Ａ上に集光される時点でのパルスレーザ光Ｌ１が、略フーリエ限界に近いパルス幅を達成することができるようになっている。

波長指示装置２１は、例えばパソコン本体とモニタから構成されており、観察したい標本中の分子の特定の振動周波数に基づき、必要に応じて、観察するために必要な波長可変レーザ光源４の波長を表示および／または指示できるようになっている。
光路調節装置１１は、例えば、少なくとも２組以上のミラー（リフレクタ）により構成されている（図示略）。これらリフレクタを用いてパルスレーザ光Ｌ１’の光路を折り返し、これらリフレクタの間隔を調節することで、パルスレーザ光Ｌ１’の光路長を変化させるようになっている。これによって、パルスレーザ光Ｌ１’のパルスの時間的タイミングを調整することができる。

第２の光路７には、フェムト秒パルスレーザ光Ｌ２の周波数帯域を変換するフォトニッククリスタルファイバ（周波数変換手段）１０が設けられている。
フォトニッククリスタルファイバ１０は、導光されるパルスレーザ光Ｌ２の周波数帯域を変更および／または拡大したパルスレーザ光Ｌ２’を生成し、光路６，７を導光されるパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’に標本Ａ中の分子の特定の振動周波数に略等しい周波数差を与えるようになっている。

フォトニッククリスタルファイバ１０を通過したパルスレーザ光Ｌ２’は、フォトニッククリスタルファイバの種類および通過させるフェムト秒パルスレーザ光の条件に応じた周波数分散をもった状態となっている。
なお、周波数変換手段としてフォトニッククリスタルファイバ１０の代わりに、例えば、同様の機能・作用を持つ、バルク、薄膜、フィルム、フォトニック結晶構造体のいずれかを用いても良い（図示略）。

レーザコンバイナ８は、２つの光路６，７を通過してきた２つのパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’を合波する合波部（図示略）と、パルスレーザ光Ｌ２’から所望の周波数帯域の成分を切り出すフィルタ（図示略）とを備えている。このフィルタにパルスレーザ光Ｌ２’を通過させることで、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させるに際して不要な周波数成分を除去することができる。

顕微鏡本体３は、例えばレーザ走査型顕微鏡であって、レーザ光源装置２から出射されたパルスレーザ光Ｌ３を２次元的に走査するスキャナ１２およびレンズ群２０と、スキャナ１２により走査されたパルスレーザ光Ｌ３を標本Ａ面に集光する集光レンズ１３と、標本Ａにおいて発生し、集光レンズ１３によって集光された蛍光を検出する第１の光検出器１４と、標本Ａを透過する方向に発生するコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を集光する集光レンズ１５と、集光レンズ１５により集光されたコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を検出する第２の光検出器１６とを備えている。

図中、符号１７はダイクロイックミラー、符号１８はステージ、符号１９はミラーである。また、標本Ａにおいて発生した蛍光は、集光レンズ１５により集光され、第２の検出器１６で検出されてもよい。また、標本Ａにおいて発生したコヒーレントアンチストークスラマン散乱光は、集光レンズ１３により集光され、第１の光検出器１４で検出されてもよい。

上記のように構成されたレーザ顕微鏡装置１の作用について以下に説明する。
まず、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１を使用して、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光による標本Ａの観察を行う場合について以下に説明する。
波長可変レーザ光源４を作動させてフェムト秒パルスレーザ光を出射させると、波長可変レーザ光源４から発せられたフェムト秒パルスレーザ光は、ビームスプリッタ５により２つの光路６，７に分岐される。

第１の光路６に分岐されたフェムト秒パルスレーザ光Ｌ１は、第１の光路６上に配置された周波数分散装置９を通過することで、所定の周波数分散量を与えられ、パルスレーザ光Ｌ１’となる。また、光路調節装置１１によりフェムト秒パルスレーザ光Ｌ１’の時間的タイミングが調節される。これらの詳細な処理については後述する。

一方、第２の光路７に分岐されたフェムト秒パルスレーザ光Ｌ２は、ミラー１９によって偏向された後、フォトニッククリスタルファイバ１０を通過させられることにより、第１の光路６のパルスレーザ光Ｌ１に比べて周波数スペクトルが変更および／または拡大された広帯域光（パルスレーザ光Ｌ２’）となる。また、パルスレーザ光Ｌ２’には、フォトニッククリスタルファイバ１０を通過することにより所定の周波数分散が与えられる。

ここで、パルスレーザ光Ｌ１’の周波数分散量と、パルスレーザ光Ｌ２’の周波数分散量とが相違する場合、図２（ａ）に示されるように、時間軸上においてパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数分布の傾きが相違する。この場合、２つの光路６，７を通過してきたパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数差Ω’は、時間軸上の各時刻において異なる状態となる。この状態においては、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’のエネルギーを、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させるために効率よく利用することができない。

そこで、周波数分散調節装置９を作動させて、第１の光路６を通過するパルスレーザ光Ｌ１’の周波数分散量が、第２の光路７のフォトニッククリスタルファイバ１０を通過したパルスレーザ光Ｌ２’の周波数分散量と標本Ａ面上において略同等となるように調節する。すなわち、図２（ａ）の矢印Ｐ１に示されるように、時間軸方向の周波数分布の傾きを変化させる。

また、２つのパルスレーザ光Ｌ１，Ｌ２’の周波数差Ω’を時間軸上で一定に保った状態でも、パルスレーザ光Ｌ１，Ｌ２’のパルスの時間的タイミングによっては、図２（ｂ）に示されるように、パルスレーザ光Ｌ１，Ｌ２’の周波数差Ω’が標本Ａ中の分子の特定の振動周波数Ωに一致しない場合がある。

そこで、波長指示装置２１を作動させて、第１の光路６を通過するパルスレーザ光Ｌ１’の波長域（周波数帯域）を変更する。この際の処理について図３（ａ）および図３（ｂ）を用いて説明する。
図３（ａ）において、曲線２５は第２の光路７に配置されたフォトニッククリスタルファイバ１０の２次分散の波長特性を示している。曲線２５と波長軸（横軸）との交点は、零分散波長を示しており、短波長側と長波長側の零分散波長をそれぞれ、λzero_short，λzero_long（λzero_short≦λzero_long）と表記されている。一般に、λ＜λzero_shortおよびλ＞λzero_longの領域を正常分散領域、λzero_short＜λ＜λzero_longの領域を異常分散領域２６と呼ばれる。

また、λｐ、λ’ｐは波長可変レーザ光源４から発せられたフェムト秒パルスレーザ光（ポンプ光）の波長であり、λ’ｐは、波長指示装置２１の作動により波長が変更された後のポンプ光の波長を示している。λｓはフォトニッククリスタルファイバ１０通過後のパルスレーザ光Ｌ２’（ストークス光）の波長を示している。

ここで、波長可変レーザ光源４から発せられたフェムト秒パルスレーザ光（ポンプ光、パルスレーザ光Ｌ１’）の波長を、波長指示装置２１により異常分散帯域２６内において調整する。異常分散領域内２６においてポンプ光の波長を調整する場合、フォトニッククリスタルファイバ１０通過後のパルスレーザ光Ｌ２’（ストークス光）の周波数帯域は大きく変更しない。このため、波長指示装置２１を作動させて、パルスレーザ光Ｌ１’（ポンプ光）の波長をλｐからλ’ｐに変化させると、図３（ｂ）に示すように、パルスレーザ光Ｌ１’（ポンプ光）とパルスレーザ光Ｌ２’（ストークス光）の周波数差Ω’を、Ω_２に調節することができる。

この状態において、図３（ｂ）に示すように、さらに光路調節装置１１を作動させて、パルスレーザ光Ｌ１’（ポンプ光）を時間軸方向にΔｔ遅延させる。これにより、パルスレーザ光Ｌ１’（ポンプ光）とパルスレーザ光Ｌ２’（ストークス光）の周波数差Ω_２を、Ω_３に調節することができる。

上記のようにすることで、図４に示すように、パルスレーザ光Ｌ１’（ポンプ光）とパルスレーザ光Ｌ２’（ストークス光）の周波数差Ω’を、標本Ａ中の分子の特定の振動周波数Ωに一致させることができる。
その後、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’は、レーザコンバイナ８によって合波され、パルスレーザ光Ｌ３となる。

このように合波されたパルスレーザ光Ｌ３は、顕微鏡本体３に入射させられ、スキャナ１２によって２次元的に走査された後、レンズ群２０と集光レンズ１３を介して標本Ａ面上に集光される。これにより、パルスレーザ光Ｌ３が集光された各位置において、標本Ａ中の分子の特定の振動周波数Ωからコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させることができる。

標本Ａにおいて発生したコヒーレントアンチストークスラマン散乱光は、標本Ａを挟んで集光レンズ１３とは反対側に配置された集光レンズ１５によって集光され、第２の光検出器１６により検出される。そして、パルスレーザ光Ｌ３の標本Ａ面上での集光位置の座標と、第２の光検出器１６により検出されたコヒーレントアンチストークスラマン散乱光の光強度とを対応づけて記憶することにより、２次元的なコヒーレントアンチストークスラマン散乱光画像を得ることができる。

ここで、比較例として、光路調節装置１１のみを用いてパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数差Ω’を調節する場合について、図５（ａ）および図５（ｂ）を用いて説明する。
この場合には、光路調節装置１１により、第１の光路６を通過するパルスレーザ光Ｌ１’を時間軸方向にΔｔ遅延させることで、パルスレーザ光Ｌ１’（ポンプ光）とパルスレーザ光Ｌ２’（ストークス光）の周波数差Ω’を調節する。

この場合には、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数差Ω’を、Ω_２からΩ_１の範囲でしか調節することができない。
また、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数差Ω’を時間軸方向にΔｔ遅延させて調整できる限界付近とした場合（周波数差Ω’をΩ_２またはΩ_１の近くで調節した場合）には、パルスレーザ光Ｌ１’（ポンプ光）が、時間軸上でパルスレーザ光Ｌ２’（ストークス光）の周波数帯域の周辺領域で一致することになる。ここで、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周辺領域は、その中心領域よりも強度が低い。そのため、この場合には、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の強度の高い領域をコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させるために用いることができず、パルスレーザ光のＬ１’，Ｌ２’のエネルギーを効率的にコヒーレントアンチストークスラマン散乱光の発生に利用することができず、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光の強度が低下してしまう。

これに対して、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１によれば、波長指示装置２１を作動させた場合には、図３（ｂ）に示すように、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数差Ω’を、Ω_３からΩ_２の範囲で調節することができる。また、波長指示装置２１を作動させない場合には、図５（ｂ）と同様に、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数差Ω’を、Ω_２からΩ_１の範囲で調節することができる。すなわち、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１によれば、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数差Ω’を、Ω_３からΩ_１の範囲で調節することができる。

さらには、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’のΔｔ遅延により、調整できるパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数差Ω’が限界付近に達する場合は、波長指示装置２１を作動させてパルスレーザ光Ｌ１’（ポンプ光）の波長を調整することで、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数差Ω’を所望の値に設定した際に、パルスレーザ光Ｌ１’、Ｌ２’の周波数帯域の中心領域が一致するように調整することが可能となる。こうすることで、パルスレーザ光のＬ１’，Ｌ２’のエネルギーを効率的にコヒーレントアンチストークスラマン散乱光の発生に利用することができる。

以上のように、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１によれば、フォトニッククリスタルファイバ１０により、２つの光路６，７を導光される各パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’に、標本Ａ中の分子の特定の振動周波数に略等しい周波数差を与えることで、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させることができる。

この場合において、波長指示装置２１により、第１の光路６を導光されるパルスレーザ光Ｌ１’の波長を調節することで、２つの光路６，７を導光される各パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数差Ω’を変化させることができる。これにより、標本Ａ中の分子の特定の振動周波数に応じて、各パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数差Ω’を調節して、この分子からコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させることができる。したがって、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させることができる分子、すなわち観察対象とする分子の範囲を広げることができ、標本Ａ中の様々な分子に対してコヒーレントアンチストークスラマン散乱光観察を行うことができる。

また、このように各パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数差Ω’を調節することで、２つの光路６，７を通るパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の強度のピークを時間的に合わせることができ、各パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の強度の高い領域を用いることができる。これにより、強度の高いコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を得ることができ、観察精度を向上することができる。

また、周波数分散調節装置９により、２つの光路６，７を導光される各パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’に等しい周波数分散量を与えることで、時間軸上の各時刻において、２つのパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数差Ω’を一定にすることができる。これにより、２つのパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’のエネルギーを効率的にコヒーレントアンチストークスラマン散乱光の発生に用いることができる。

また、第１の光路６に、標本Ａ面上におけるパルスレーザ光Ｌ１’の時間的タイミングを調節する光路調節装置１１を備えることで、標本Ａ面上において２つのパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’のタイミングを調整して、２つの光路６，７を導光される各パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数差Ωを微調整することができる。このように、波長指示装置２１と光路調節装置１１とを併用することで、標本Ａ中の分子の特定の振動周波数に一致させるように２つの光路６，７を導光される各パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数差Ω’を調節することができ、効率的にコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させることが可能となる。また、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させることができる分子の範囲を広げることができる。

また、周波数変換手段としてフォトニッククリスタルファイバを用いることにより、簡易かつ安価に、周波数分散が与えられた広い周波数スペクトル帯域を有するパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’を得ることが可能となる。また、用いるフォトニッククリスタルファイバの種類を選定することで、さまざまな周波数スペクトル成分および帯域を有するパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’を得ることができる。このため、標本Ａ中の分子のさまざまな振動周波数に一致させるように、２つのパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数差Ω’を調整することが可能となる。

なお、レーザコンバイナ８以降の光学系により、パルスレーザ光Ｌ１，Ｌ２’の周波数分散量が変化した場合や時間的なパルスタイミングが変化した場合は、標本Ａ面上において再度、パルスレーザ光Ｌ１，Ｌ２’の周波数差Ω’が標本Ａ中の分子の特定の振動周波数Ωに一致するように、パルスレーザ光Ｌ１’の周波数分散量、波長、時間的なパルスタイミングを調節してもよい。

また、標本Ａにおいて発生したコヒーレントアンチストークスラマン散乱光は、集光レンズ１３により集光され、ダイクロイックミラー１７によって分岐されて第１の光検出器１４により検出されてもよい。

次に、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１を使用して、多光子励起型の蛍光による標本Ａの観察を行う場合について以下に説明する。
この場合には、周波数分散調節装置９を作動させることにより、図６（ａ）の矢印Ｐ３に示すように、光路６を通過するパルスレーザ光Ｌ１’に与える周波数分散量を調節する。具体的には、図６（ｂ）に示すように、パルスレーザ光Ｌ１’が標本Ａ面において略フーリエ限界パルスに近づくようにパルスレーザ光Ｌ１’の周波数分散量を設定する。このように設定されたパルスレーザ光Ｌ１’を集光レンズ１３により標本Ａに集光することで、標本Ａにおける集光位置において多光子励起により蛍光を発生させることができる。

標本Ａにおいて発生した蛍光は、集光レンズ１３によって集光された後、ダイクロイックミラー１７によって分岐されて第１の光検出器１４により検出される。そして、パルスレーザ光Ｌ１の標本Ａ面上での集光位置の座標と、第１の光検出器１４により検出された蛍光強度とを対応づけて記憶することにより、２次元的な多光子蛍光画像を得ることができる。
なお、標本Ａにおいて発生した蛍光は、集光レンズ１５によって集光され、第２の光検出器１６により検出されてもよい。

上述のように、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１によれば、波長可変レーザ光源４を用いて多光子蛍光観察を行うことができる。この場合において、周波数分散調節装置９により、標本Ａ面上において略フーリエ限界パルスに近づくように周波数分散量を調節することで、多光子励起効果を効率的に発生させ、明るい画像を生成することが可能となる。

以上のように、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１によれば、フェムト秒レーザ光を出射する波長可変レーザ光源４を用いて、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光観察、多光子励起型の蛍光観察およびＳＨＧ光観察を切り替えて効率よく行うことができる。すなわち、１台のレーザ顕微鏡装置１により、３種類の観察を効率よく行うことができ、マルチモーダルな観察を達成することができる。

なお、図６（ａ）に示すようなパルスレーザ光Ｌ１’の周波数分散量を調整することなく蛍光による画像生成することができるため、多光子励起効果を多少悪化させても良い場合は、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光観察、多光子励起型の蛍光観察およびＳＨＧ光観察を同時に行うこともちろん可能である。

なお、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１の変形例として、図７に示すように、標本中の観察したい分子の振動周波数に応じて、光路調節装置１１の調節量を指示するパルスタイミング指示装置（パルスタイミング指示手段）２２を設けることとしてもよい。パルスタイミング指示装置２２は、例えばパソコン本体とモニタから構成されている。
このようにすることで本変形例に係るレーザ顕微鏡装置１’において、コヒーレントアンチストークス散乱光の画像の明るさが最大になるようになど、パルスタイミングの微調節を自動で行うことができる。

また、パルスタイミングを調節することは、図３（ｂ）に示す遅延量Δｔを調節することに相当する。すなわち、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数差Ω’を調節することに相当する。したがって、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数差Ω’が標本中の分子の特定の分子振動の周波数に含まれるようにパルスタイミングの調節範囲を設定し、その範囲内におい調節量を適宜変更しながら、アンチストークスラマン散乱光を検出することで、標本中の観察したい分子の特定の分子振動のスペクトルを得ることが可能となる。

なお、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１の変形例として、フォトニッククリスタルファイバ１０の異常分散帯域２６の少なくとも一部が９００ｎｍから１１００ｎｍの範囲に含まれているものを用いても良い。すなわち、フォトニッククリスタルファイバ１０の２次分散の波長特性が、図３（ａ）において、λzero_short＜１１００ｎｍ、且つ、λzero_long＞９００ｎｍとなっている。
こうすることで、上述してきたように、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させることができる分子振動の周波数範囲を広げる効果を損なわずに、後述する理由により多光子励起型の蛍光観察時においてｅＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ等の蛍光タンパクを効率よく励起して多光子蛍光観察ができ、且つ、効率良くＳＨＧ光観察を行うことができる。

近年、多光子励起型のレーザ顕微鏡において、標本Ａを標識するための蛍光物質としてｅＧＦＰ（enhanced Green Fluorescent Protein）、ＹＦＰ（Yellow Fluorescent Protein）、ＲＦＰ（Red Fluorescent Protein）といった蛍光タンパクが使用される。これらの蛍光タンパクを効率よく励起できる励起波長は９００ｎｍから１１００ｎｍの範囲である。また、９００ｎｍから１１００ｎｍの範囲の波長を有する観察光は、生体内での光散乱の影響も少ないため、特に生体の深部観察に適している。したがって、波長可変レーザ光源４により射出されるフェムト秒パルスレーザ光の波長を９００ｎｍから１１００ｎｍの範囲とすることで、ｅＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ等の蛍光タンパクを効率よく励起して多光子蛍光観察を行うことができる。

また、多光子励起型の蛍光観察と同様の条件で、ＳＨＧ光（第二次高調波光）観察も行うことができる。
ＳＨＧ（第二次高調波光）観察時においても、検出器の最適（高効率）観察波長帯域として４００ｎｍから６００ｎｍで設定されている場合が多い。したがって、波長可変レーザ光源４により射出されるフェムト秒パルスレーザ光の波長を９００ｎｍから１１００ｎｍの範囲とすることで、効率良くＳＨＧ観察を行うことができる。

また、波長可変レーザ光源４により射出されるフェムト秒パルスレーザ光の波長は、例えば９５０ｎｍに固定してもよい。

なお、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１の変形例として、周波数変換装置１０が、互いに異なる周波数差を与える複数のフォトニッククリスタルファイバ（周波数変換素子）と、複数のフォトニッククリスタルファイバを切り替える切り替え装置（切り替え手段）とを備えていてもよい（図示略）。

この場合、複数のフォトニッククリスタルファイバは、例えば以下の条件を満足するものを用意する。
（１）λzero_short:750nm ≦ λp:800nm ≦ λzero_long:850nm
（２）λzero_short:850nm ≦ λp:900nm ≦ λzero_long:950nm
（３）λzero_short:950nm ≦ λp:1000nm ≦ λzero_long:1050nm
切り替え装置は、観察対象に応じて第２の光路７上に配置されるフォトニッククリスタルファイバを、ターレットやスライダ等により切り替えるようになっている。

この場合において、切り替え装置により複数のフォトニッククリスタルファイバを切り替えることで、容易に２つの光路６，７を導光される各パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数差Ω’を変化させることができる。これにより、標本Ａ中の様々な分子に対してコヒーレントアンチストークスラマン散乱光観察を行うことができる。

以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。
例えば、波長可変レーザ光源４は、フェムト秒パルスレーザ光を出射することとして説明したが、これよりもパルス幅の短いアト秒パルスレーザ光等の極短パルスレーザ光や、これよりもパルス幅の長いピコ秒パルスレーザを出射することとしてもよい。

また、図１に示す例において、周波数分散調節装置９、光路調節装置１１を第１の光路６に配置することとして説明したが、これらの装置を第２の光路７に配置してもよく、第１の光路６と第２の光路７の両方に配置してもよい。なお、第２の光路７に光路調節装置１１を配置した場合には、パルスレーザ光Ｌ２’（ストークス光）の波長や時間的タイミングを調節することで、パルスレーザ光Ｌ１’Ｌ２’の周波数差Ω’を調節する。

また、周波数分散調節装置９として、周波数分散量が固定のものを複数用意し、段階的に切り替える方式や、挿脱可能方式により、フェムト秒パルスレーザ光に与える周波数分散量を切り替える構成を採用してもよい。
また、周波数分散調節装置９は、例えば、ガラス板のように所定の周波数分散特性を有する材質からなる部材（図示略）であってもよい。部材が本来持つ周波数分散特性により、部材を通過するフェムト秒パルスレーザ光に所定の周波数分散を与えることができる。 また、板厚の変化する楔状のガラス板のように、フェムト秒パルスレーザ光の通過する位置の部材の厚みを変化させることにより、与える周波数分散量が調整できる。
また、周波数分散調節装置９は、所望の周波数分散量を得るように調整された光ファイバであってもよい。

また、第１の光路６と第２の光路７の少なくとも一方に、例えば減光フィルタのような光量調節手段（図示略）を配置することにしてもよい。これにより、２つの光路６，７を通過してくるパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の光量調整ができ、最適な画像観察を行う事ができる。

また、多光子励起の蛍光観察の際には、第２の光路７をシャッタ等により制限することとしてもよい。多光子励起の蛍光観察時には第２の光路７への分岐は不要となるので、これを制限することによって、多光子蛍光画像に発生するノイズや標本Ａに与えるダメージを低減することができる。

Ａ 標本
Ｌ１，Ｌ２ フェムト秒パルスレーザ光
Ｌ１’，Ｌ２’ パルスレーザ光
Ω，Ω’ 周波数（差）
１，１’ レーザ顕微鏡装置
２ レーザ光源装置
３ 顕微鏡本体（照射・観察手段）
４ 波長可変レーザ光源（レーザ光源）
５ ビームスプリッタ（分岐手段）
６，７ 光路
８ レーザコンバイナ（合波手段）
９ 周波数分散調節装置（周波数分散調節手段）
１０ フォトニッククリスタルファイバ（周波数変換手段）
１１ 光路調節装置（パルスタイミング調節手段）
２１ 波長指示装置（波長指示手段）
２２ パルスタイミング指示装置（パルスタイミング指示手段）

Claims (9)

1. レーザ光源から発せられたパルスレーザ光を分岐手段によって２つの光路に分岐し、
   前記２つの光路の少なくとも一方に設けられた周波数変換手段によって、前記２つの光路を導光されるパルスレーザ光に前記標本中の分子の特定の振動周波数に略等しい周波数差を与え、
   前記２つの光路を導光されてきたパルスレーザ光を合波手段によって合波し、
   該合波手段により合波されたパルスレーザ光を照射手段によって標本に照射し、
   前記レーザ光源の波長が調整可能な波長指示手段によって、前記標本中の分子の特定の振動周波数に応じて前記レーザ光源の波長変更を指示するレーザ顕微鏡装置の作動方法。
2. 前記２つの光路の少なくとも一方に設けられた周波数分散調節手段によって、導光されるパルスレーザ光の周波数分散量を調節する請求項１に記載のレーザ顕微鏡装置の作動方法。
3. 前記２つの光路の少なくとも一方に設けられたパルスタイミング調節手段によって、前記標本面上におけるパルスレーザ光の時間的タイミングを調節する請求項１に記載のレーザ顕微鏡装置の作動方法。
4. パルスタイミング指示手段によって、前記標本中の観察したい分子の振動周波数に応じて前記パルスタイミング調節手段の調節量を指示する請求項３に記載のレーザ顕微鏡装置の作動方法。
5. 前記周波数変換手段が、フォトニッククリスタルファイバである請求項１に記載のレーザ顕微鏡装置の作動方法。
6. 前記フォトニッククリスタルファイバの異常分散波長帯域の少なくとも一部が、９００ｎｍから１１００ｎｍの範囲に含まれる請求項５に記載のレーザ顕微鏡装置の作動方法。
7. 前記周波数変換手段が、互いに異なる周波数を与える複数の周波数変換素子と、
   前記複数の周波数変換素子を切替える切り替え手段と、を備える請求項１に記載のレーザ顕微鏡装置の作動方法。
8. 前記複数の周波数変換手段が、複数のフォトニッククリスタルファイバで構成される請求項７に記載のレーザ顕微鏡装置の作動方法。
9. 前記複数のフォトニッククリスタルファイバの異常分散波長帯域の少なくとも一部が、９００ｎｍから１１００ｎｍの範囲に含まれる請求項８に記載のレーザ顕微鏡装置の作動方法。

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