JP6632531B2 - 照明光の焦点の形状を変える部材を有する顕微鏡 - Google Patents

Description

本発明は、対物レンズと光ファイバーとを備えた顕微鏡に関する。ここでこの対物レンズは照明光を照明光焦点にフォーカシングし、光ファイバーは照明光を搬送する。光ファイバーの終端部には、ファイバカプラが配置されている。ここでこのファイバカプラは、照明光を光ファイバーから取り出し、有利にはコリメートされた照明光束を生成する。

例えば、共焦点スキャン顕微鏡において、検査されるべき対象物は、少なくとも１つの照明光束の焦点によって、三次元にスキャンされる。ここでこの照明光束は、しばしば、光ファイバーによって、光源から、顕微鏡ビーム路内の入力箇所まで搬送される。共焦点スキャン顕微鏡は、一般的に、光源と、焦点合わせレンズと、ビームスプリッターと、ビーム制御のためのビーム偏向装置と、顕微鏡レンズと、検出アパーチャと、検出光若しくは蛍光を検出するための検出器とを有している。ここでこの焦点合わせレンズによって、光源の光が、ピンホールアパーチャ（いわゆる励起アパーチャ）にフォーカシングされる。照明光は、例えば、ビームスプリッターを介して入力される。

このような照明光束の焦点は、例えば、制御可能なビーム偏向装置によって、一般的に、２つのミラーを傾斜させることによって、対象物面において動かされる。ここでこれらの偏向軸は、多くの場合に、相互に垂直に延在している。従って、一方のミラーはｘ方向に偏向され、他方のミラーはｙ方向に偏向される。ミラーの傾斜は、例えば、ガルバノメーター調整素子によって実行される。対象物から到来した光のパワーは、スキャンビームの位置に依存して測定される。

対象物から到来した蛍光はビーム偏向装置を介してビームスプリッターに戻り、ビームスプリッターを通過する。これによって、次に、検出アパーチャにフォーカシングされる。この検出アパーチャの後ろに検出器が位置する。直接的に焦点領域から生じているのではない検出光は、別の光路を取り、検出アパーチャを通過しない。従って、ポイント情報が得られる。このポイント情報は、複数の面における対象物の連続したスキャンによって、三次元の画像に成る。

顕微鏡、特にスキャン顕微鏡または共焦点スキャン顕微鏡において、検体はしばしば、複数の照明光束を統合することによって作成された照明光束によって照明され、これによって、照明された検体から放射された反射光または蛍光を監視することができる。

異なる波長を有する複数の光束を統合するために、光学系内に通常、ダイクロックビームスプリッターが組み込まれる。ＤＥ１９６３３１８５Ａ１から、例えば、レーザースキャン顕微鏡用のスポット光源、および、異なる波長を有する少なくとも２つのレーザーの光をレーザースキャン顕微鏡に入力する方法が公知である。スポット光源は、モジュール形式で構成されており、ダイクロックビームコンバイナーを含んでいる。このビームコンバイナーは、少なくとも２つのレーザー光源の光を統合し、顕微鏡へと続く光ファイバーに入力する。

共焦点スキャン顕微鏡の解像度は特に、検体における、励起光束の焦点の強度分配および空間的な拡がりによって得られる。回折制限があるので、フォーカシングを強くすることによって、解像度を任意に上げることはできない。通常、レーザーから放射された照明光束の焦点は、光軸に関して回転対称であり、ガウスビームウェストを有している。ここで光のパワーは、光軸から外側へ向かって低減する。

ＷＯ９５/２１３９３Ａ１から、蛍光を用いる場合の解像度を上昇させる装置が公知である。この文献では、励起光束の上述したような焦点ボリュームの水平方向の縁部領域を、同様に、上述した形状を有している複数の脱励起光束の複数の焦点によって照明することが開示されている。これによって、その箇所で放出が誘起され、励起光束によって励起された検体領域が刺激されて、基底状態に戻される。この場合には、脱励起光束によって照明されていない領域からの、自然放出された光だけが検出され、これによって、全体的に解像度が上昇する。この方法に対しては、名称ＳＴＥＤ（誘導放出抑制 Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ Ｅｍｉｓｓｉｏｎ Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）が定着している。

ＳＴＥＤ技術は、近年、再び発展している。多くの場合には、（従来形成されていた）、複数の脱励起光束の複数の焦点による不均一な脱励起光照明の代わりに、脱励起光が、内部が中空の焦点に成形される。このために、脱励起光のビーム路内に、脱励起光束の照明光焦点の形状を変える部材が配置される。

例えば、この部材は、位相フィルターまたは推移位相フィルターまたは断片位相フィルターまたは切り替え可能な位相マトリクス、特にＬＣＤマトリクスを有し得る。特に、照明光焦点の形状を変える部材を用いることによって、リング状の焦点、いわゆるドーナツ型焦点を検体内に形成することができる。これは、励起光束の焦点とｘ−ｙ平面において、すなわち光軸に対して垂直な平面において重なる。これによって、ｘ−ｙ方向における解像度の上昇が実現される。リング状の焦点は、例えば、いわゆる渦状位相フィルターによって得られる。

例えば、Ｋｌａｒ等著「Ｂｒｅａｋｉｎｇ Ａｂｂｅ’ｓ ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔ ｉｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｗｉｔｈ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｂｅａｍｓ ｏｆ ｖａｒｉｏｕｓ ｓｈａｐｅｓ（Ｐｈｙｓｉｃａｌ ｒｅｖ．Ｅ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｐｈｙｓｉｃｓ，Ｐｌａｓｍａｓ，Ｆｌｕｉｄｓ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐｌｉｎａｒｙ ｔｏｐｉｃｓ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｏｆ Ｐｈｙｓｉｃｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｙ，Ｂｄ．６４，Ｎｒ．６，２６．１１．２００１，０６６６１３−１〜０６６６１３−９）」から、特別な位相フィルターを備えたＳＴＥＤ顕微鏡が公知である。

公知の顕微鏡は、位相フィルターに関して、極めて正確に、アライメントがされなければならない、という欠点を有している。このアライメントには、極めて多くの手間がかかる。さらに、このような顕微鏡は多くの場合に別個の保持部内に固定されている位相フィルターのアライメント不良によって大きく影響されてしまい、すぐさま、解像度の低減を生じさせる。

従って、本発明の課題は、このような欠点が回避されている顕微鏡を提供することである。

上述の課題は、ファイバカプラ内に、または、ファイバカプラに接して、照明光焦点の形状を変える部材が配置されていることを特徴とする顕微鏡によって解決される。この部材は、取り出されるべき照明光束に対して相対的にアライメントされている。

本発明は、顕微鏡使用開始時の、照明光焦点の形状を変える部材の手間のかかるアライメントが完全に回避されるという利点を有している。むしろ、事前アライメントに基づいて、ファイバカプラが自身の目標位置に位置付け、および、固定されるだけでよい。しかしファイバカプラのこのアライメントは、容易かつ迅速に実行される。なぜなら、取り出される照明光束のビーム経過は容易に追跡可能であり、ファイバカプラの目標経過と異なっている場合には、容易に再アライメントをすることが可能だからである。取り出されるべき照明光束に対して相対的に、照明光焦点の形状を変える部材をアライメントする形態は、格段に多くの手間を要するだろう。なぜなら、アライメント不良は、簡単な手段によって、特に、ビーム経過を単に追跡することによっては検出不可能であるからである。しかし有利には本発明では、取り出されるべき照明光束に対して相対的な、照明光焦点の形状を変える部材の手間がかかるアライメントが回避される。

特別な実施形態では、照明光焦点の形状を変える部材は、ファイバカプラのケーシングに、および／または、ファイバカプラのフロントレンズに配置および／または固定されている。択一的に、照明光焦点の形状を変える部材を、ファイバカプラ内に組み込む、および／または、ファイバカプラのケーシング内に配置することもできる。

特に有利な構成では、少なくとも１つの、更なる光ファイバーが設けられている。この、更なる光ファイバーは、対物レンズによって更なる照明光焦点にフォーカシングされる更なる照明光を搬送する。この、更なる光ファイバーの終端部には、更なるファイバカプラが配置されている。この更なるファイバカプラは、更なる照明光を更なる光ファイバーから取り出し、有利にはコリメートされた、更なる照明光束を形成する。特にここでは、この更なるファイバカプラ内にまたはこの更なるファイバカプラに接して、更なる照明光焦点の形状を変える、更なる部材が配置されている。

有利には、ファイバカプラは、バヨネット方式の差し込み接続によって光ファイバーと接続されている。更なるファイバカプラを、バヨネット方式の差し込み接続によって、更なる光ファイバーと接続することもできる。このような実施形態によって、例えば修理時の部品交換が容易になる。

例えば、照明光焦点の形状を変える部材は、位相フィルター、または、推移位相フィルターまたは断片位相フィルターまたは切り替え可能な位相マトリクス、特に、ＬＣＤマトリクスを有し得る。

照明光束または更なる光ファイバーによって搬送された少なくとも１つの更なる照明光束に対して付加的に、有利には、光ファイバーおよび／または照明光焦点の形状を変える部材を通過していない付加的な照明光束が、照明光ビーム路内に入力されてもよい。従って、対物レンズは、この付加的な照明光束もフォーカシングする。

例えば、解像度を上昇させるために、有利には、複数の照明光束のうちの少なくとも１つ（照明光束および／または更なる照明光束および／または付加的な照明光束）は、検体内に蛍光が励起されるように構成および設定されている。また、複数の照明光束のうちの少なくとも１つの別の照明光束は、検体内で誘導放出が生じるように構成および設定されている。

上述した照明光束のうちの少なくとも２つ、すなわち特に
ａ．照明光束と更なる照明光束、または、
ｂ．照明光束と付加的な照明光束、または、
ｃ．更なる照明光束と付加的な照明光束、または、
ｄ．照明光束と更なる照明光束と付加的な照明光束
が、ビームコンバイナー内に入力されている構成が極めて有利である。ここでこれらの入力された照明光束は共線状に統合されて、このビームコンバイナーを離れる。この場合には特に、複数の照明光束のうちの少なくとも第１の照明光束と第２の照明光束と（照明光束および／または更なる照明光束および／または付加的な照明光束）は、同じ照明光波長を有するが、異なる偏光、特に直線偏光を有することがある。

特に有利な構成では、ビームコンバイナーは、音響光学式ビームコンバイナーとして構成されており、次のように、構成され、動作される。すなわち、少なくとも１つの力学的な波との相互作用によって、第１の照明光束も、第２の照明光束も回折され、これによって、共通の光軸に偏向されるように、構成され、動作される。このような構成は、極めて特別な利点を有している。すなわち、使用時の要求に応じて、個々の照明光成分を所期のように遮断する、または、再び使用可能にする、または、照明光出力に関して個別にかつ別個に調整することができる、という特別な利点である。

このような構成は、音響光学式ビームコンバイナーが極めて迅速に、数マイクロ秒内で切り替え可能である、という極めて特別な利点を有している。このようにして、照明光束は例えば迅速に遮断されるまたは再び使用可能にされる。別の波長または別の波長組み合わせへの迅速な切り替えも可能である、ということは、この構成の特別な利点である。

このような、音響光学式ビームコンバイナーの作用は、実質的に、１つまたは複数の機械的波動と入力された照明光束との相互作用に基づいている。

音響光学素子は、通常、いわゆる音響光学結晶から成る。この音響光学結晶には、電気的な変換器が（文献ではしばしば、トランスデューサーと称される）が取り付けられている。通常、この変換器は、ピエゾ圧電材料と、ピエゾ圧電材料上に設けられた電極と、ピエゾ圧電材料下に設けられた電極とを含んでいる。典型的には３０ＭＨｚ〜８００ＭＨｚの範囲にある無線周波数による電極の電気的なスイッチングによって、このピエゾ圧電材料が振動される。従って、音響波、すなわち音波が生じる。この音波は、発生後に、結晶を通る。多くの場合に、音響波は、光学的な相互作用領域の通過後に、対向する結晶側面で吸収される、または、反射されて遠ざけられる。

音響光学結晶は、発生した音波が結晶の光学的な特性を変える、という特徴を有している。ここでは、この音によって、一種の光学格子または比較可能な光学的に能動的な構造、例えばホログラムが誘起される。結晶を通る光は、この光学格子で回折される。これに相当して、この光は、種々の回折次数において複数の回折方向に偏向される。入射する全ての光に、多かれ少なかれ、波長に依存せずに、影響を与える音響光学素子が存在する。これに関しては、単に、例えば、部材ＡＯＭ、ＡＯＤおよび周波数シフター等を参照されたい。さらに、既に、例えば入射した無線周波数に依存して、選択的に、個々の波長に作用する素子も存在する（ＡＯＴＦ）。しばしば、複屈折結晶、例えば二酸化テルルから成る音響光学素子が存在する。この場合には特に、光の入射方向に対して、および、その偏光に対して相対的な結晶軸の位置が各素子の音響的な作用を定める。

特に、音響光学式ビームコンバイナー内で、例えばＡＯＴＦが使用される場合には、力学的な波は、極めて特別な周波数を有していなければならない。これによってまさに、所望の照明光波長の光に対して、および、所望の偏光の光に対して、ブラグ条件が満たされる。ブラグ条件が満たされていない光は、この音響光学素子では、力学的な波によって偏向されない。

例えば市販のＡＯＴＦを含み得る、ビームコンバイナーを有する本発明の顕微鏡の特に簡素な構成では、音響光学式ビームコンバイナーは結晶を有しており、この結晶を通って、同時に、異なる音波周波数を有する第１の力学的な波と第２の力学的な波とが伝播する。ここでこの結晶と、力学的な波の伝播方向とは相互に相対的に、かつ、結晶内に入射する照明光束に対してそれぞれ相対的に、次のように配向されている。すなわち、第１の力学的な波で第１の照明光束が回折され、第２の力学的な波で第２の照明光束が回折され、これによって、共通の光軸に偏向されるように配向されている。

ここで、統合された照明光束が、照明光束の伝播方向に対して垂直に配向された出射面を通って結晶を離れるのは、特に有利である。波長が切り替えられる場合、または、照明光束が複数の波長を有している場合には、照明光束の方向の変更若しくは照明光束の空間的な分割は生じない。

しかし、この実施形態は次の欠点を有している。すなわち、同じ波長を有するが、異なる偏光を有する２つの照明光束を偏向するために、２つの異なる力学的な波が生成されなければならない、という欠点を有している。その点で、力学的な波のための生成器、例えば、結晶に配置されたピエゾ素子に、同時に、２つの異なる電磁ＨＦ波が印加されなければならない。これによって不所望には、二倍の量の熱出力が、１つ若しくは複数の結晶内に入力される。これは、最終的に、回折効率を低減させ、さらに、回避不可能な温度変動によって、検体および検出器に到来する光の偏向方向、ひいては、光出力も変動させてしまう。さらに、これらの力学的な波の周波数領域が重畳する場合には、うなりが発生してしまう。これは最終的に、検体および／または検出器に到来する光の光出力の周期的な変動を生じさせる。このような問題は特に、次のような事実に基づいている。すなわち、これらの力学的な波が自然に即して、限りなく幅が狭い、すなわち特異の音波周波数を有することがなく、むしろ常に、中心周波数を中心とした周波数領域が存在していなければならない、という事実に基づいている。

従って、特に有利な構成では、市販のＡＯＴＦは使用されない。むしろ、音響光学ビームコンバイナーは、それを通って、第１の照明光束および第２の照明光束の波長に割り当てられている音波周波数を有する力学的な波が伝播する結晶を有している。ここでこの結晶と力学的な波の伝播方向とは相互に相対的に、かつ、結晶に入射する照明光束に対してそれぞれ相対的に次のように配向されている。すなわち、力学的な波で、第１の照明光束も、第２の照明光束も回折され、これによって、共通の光軸に偏向されるように配向されている。

この場合には、特に、第１の照明光束は直線偏光されており、結晶の複屈折特性に関して常光の直線偏光方向である直線偏光方向を有する、および／または、第２の照明光束は直線偏光されており、結晶の複屈折特性に関して異常光の直線偏光方向である直線偏光方向を有する。特に、第１の照明光束の直線偏光方向または第２の照明光束の直線偏光方向が、力学的な波の伝播方向と検出光束の伝播方向とによって画定されている平面に配置されているようにすることもできる。

この種の音響光学式ビームコンバイナーの具体的な構成、特に、力学的な波（複数）の伝播方向および照明光束の伝播方向に対して相対的な結晶の配向、並びに、力学的な波および照明光束相互の配向、および、入射面および出射面相互の配向および結晶の光軸に対する配向も、例えば、以降で説明される反復法に従って展開可能である。ここでこの方法は、有利には、実際の素子に基づくのではなく（しかし、実際の素子に基づいてもよい）、コンピューターシミュレーションにおいて追跡される。これは、結晶形状、面および結晶格子の配向の個々のパラメータ、力学的な波（複数）の伝播方向の配向および照明光束の伝播方向が、所望の要求に相当するまで続けられる。このようにして、コンピューターシミュレーションによって全ての関連するパラメータが求められた場合、これに続いて結晶が、更なるステップにおいて製造される。

ここでは、例えば、まずは上述した構成から出発し、ここでは音響光学式ビームコンバイナーは市販の結晶を有している。第１の結晶光束と第２の結晶光束とを共通の光軸に偏向させるために、異なる音波周波数を有する第１の力学的な波と第２の力学的な波とが本来は同時にこの結晶を通って伝播しなければならない。

反復法に対しては逆の光路が考察され、この逆の光路で、第１の照明光束および第２の照明光束が、共線的に、有利には垂直に配向された出射面を通じて、結晶に入力される。しかし、第１の力学的な波だけが結晶内で生成される。この結果、第１の照明光束だけが力学的な波で回折され、他方では、同じ波長であるが、別の直線偏光方向を有している第２の光束は偏向されずにこの結晶を通過する。

次に、この結晶は有利には、入射する共線状の照明光束と、力学的な波の伝播方向によって画定された平面において、力学的な波によって２つの直線偏光成分の２つの照明光束が偏向されるまで回転され、これによって、力学的な波の伝播方向と結晶軸との間の角度も変えられる。

しかし、この回転は通常、出射面が、もはや、入射する共線状の照明光束に対して垂直ではなくなる、という結果をもたらす。このような理由から、ここで、次の反復ステップにおいて、結晶を回転させることなく、出射面が再び、入射する共線状の照明光束に対して垂直になるように、結晶の形状が変更される。

しかし、結晶形状の変更は通常、次の結果をもたらす。すなわち、力学的な波によって、もはや、照明光波長の２つの直線偏光成分それぞれが偏向されない、という結果である。このような理由から、結晶はここで再び、この条件が再び満たされるまで、回転される。その後、上述したような更なる反復ステップが繰り返される。

２つの直線偏光成分が同時に偏向されるという条件および光出射が共線状であるという条件が満たされるまで、反復サイクルが実行される。通常、この方法は極めて迅速に収束し、従って、僅かな反復サイクルの後、この目的が達成される。

特別な構成では、結晶の回転時に、それぞれ、逆に経過する照明光の直線偏光方向のうちの１つに関して、上記の照明光波長を有する全ての１次回折光が共線状に結晶から出射するよう、留意される。このような構成は、それぞれ唯一の力学的な波によってそれぞれ、異なる直線偏光を有する２つの成分が偏向する、という利点だけではなく、付加的に、上述した共線性が生じている１次の回折次数の光路を介して、多色の、共線状に入射する照明光が共線状に照明光ビーム路で回折されるという利点も有している。このような照明光に対して、有利には、空間的な分割を補償する必要は無い。なぜなら、空間的な分割は、このような照明光の場合には生じないからである。

このような構成では、例えば、結晶または第２の結晶は、複数の波長の一次光のための入射面と、共通の光軸に偏向された照明光束のための出射面とを有することができる。ここでこの入射面と出射面とは、次のように相互に配向されている。すなわち、一次光が、共線的な照明光束として、結晶内に入力可能であり、共通の光軸に偏向された照明光束が結晶を、共線の照明光束として離れるように相互に配向されている。

有利な構成では、この結晶を通って、第１の照明光束および第２の照明光束の波長を有しておらず、力学的な波で回折されない、少なくとも１つの更なる照明光束が延在し、第１の照明光束と第２の照明光束とともに、共通の光軸に達する。このような構成は、特に、複数の音響光学素子の連続接続を可能にする。これを以降で、詳細に説明する。

例えば、更なる照明光束は第２の結晶から生じる。この中を第２の力学的な波が伝播する。この第２の力学的な波は、更なる照明光束の波長に割り当てられた音波周波数を有している。ここでこの更なる照明光束は、更なる照明光波長の第３の照明光束を含んでいる。この第３の照明光束は、第２の力学的な波によって回折されている。または、この更なる照明光束は、更なる照明光波長の第３および第４の照明光束を含んでいる。しかし第３の照明光束と第４の照明光束は異なる偏光、特に直線偏光を有している。これらは、第２の力学的な波によって回折されている。最後に挙げた形態を実現するために、第２の結晶は有利には、次のように構成されるべきである。すなわち、上述したように、第２の結晶が、更なる波長の照明光を、その偏光と無関係に偏向するように構成されるべきである。

有利には、上述したように、上述した原理が同時に幾重にも使用される。これは、少なくとも１つの結晶において、異なる周波数の複数の力学的な波が、異なる波長の照明光に対して生成されることによって行われる。

例えば、結晶内にまたは第２の結晶内に、同時に、少なくとも１つの付加的な力学的な波が伝播可能である。この付加的な力学的な波は、付加的な波長に割り当てられている別の音波周波数を有している。ここで、付加的な力学的な波では、別の波長を有している少なくとも１つの付加的な照明光束が回折され、これによって共通の光軸に偏向される、および／または、付加的な力学的な波で、別の波長と、相互に異なる偏光、特に直線偏光とを有している２つの付加的な照明光束が回折され、これによって、共通の光軸に偏向される。

特別な構成では、音響光学式ビームコンバイナーは、少なくとも１つの、分散光学素子を有している。これは（少なくとも部分的に）結晶または第２の結晶によって引き起こされた、空間的なスペクトル分割を補償する。ここでこれは例えば、複数の波長の光を含んでいる照明光束の分割である。しかし、分散光学素子が、照明光の分割の補償に対して付加的に、検出光の空間的なスペクトル分割を補償してもよい。

この分散光学素子は、既に行われた、空間的なスペクトル分割が再び退行するように配置される。しかしこの補償が、結晶または第２の結晶によって退行される空間的なスペクトル分割を分散光学素子が生じさせる方法で行われてもよい。

音響光学式ビームコンバイナーは特に有利には、複数の一次光源の光を受光することができる。音響光学式ビームコンバイナーは、場合によって波長選択に従って、この一次光源の照明光束を統合する。

しかし、一次光源のうちの少なくとも１つが、偏光されていない一次光、特に白色光を生成することも可能である。このような光源は、例えば、偏光ビームスプリッターを有し得る。この偏光ビームスプリッターは、偏光されていない一次光を受光し、これを、空間的に、直線偏光方向に依存して分割する。従って、生じた照明光束は、１つまたは複数の結晶の種々の入力側を介して、１つ若しくは複数の力学的な波の作用に晒される。このようにして完全に所期のように、および、極めて柔軟に、切り替え可能な、１つまたは複数の波長の照明光が選択され、共線状に、検体の照明のために、照明ビーム路へ偏向される。この際に、偏光されていない一次光から、光学素子への入力および光学素子からの出力時の通常の損失を除いて、光強度がいくらかなくなってしまうことはない。特に、基本的には、直線偏光方向の光を完全に放棄する必要はない。

有利には、ビームコンバイナーはメインビームスプリッターとして機能し、これは、照明光を照明光ビーム路に、検体の照明のために偏向し、検体から出た検出光を、検出器を有する検出ビーム路に偏向する。

特別な構成では、検体から到来する検出光束から、結晶の力学的な波との相互作用によって、照明光波長および第１の直線偏光方向を有している検出光束成分も、照明光波長および第１の直線偏光方向に対して垂直な第２の直線偏光方向を有している検出光束成分も偏向され、これによって検出光束から除去される。択一的または付加的に、検体から到来する検出光束から、第２の結晶の力学的な波との相互作用によって、更なる照明光波長および第１の直線偏光方向を有している検出光束成分も、更なる照明光波長および第１の直線偏光方向に対して垂直な第２の直線偏光方向を有している検出光束成分も偏向され、これによって検出光束から除去されるようにしてもよい。

択一的または付加的に、結晶と力学的な波の伝播方向とを相互に相対的に、および、それぞれ結晶に入射する検出光束に対して相対的に、音響光学式ビームコンバイナーが、力学的な波によって、照明光波長と第１の直線偏光方向とを有する検出光束成分も、照明光波長と、第１の直線偏光方向に対して垂直な第２の直線偏光方向とを有する検出光束成分も偏向し、これによって検出光束から除去するように配向すること、および／または、第２の結晶と第２の力学的な波の伝播方向とを相互に相対的に、および、それぞれ第２の結晶に入射する検出光束に対して相対的に、音響光学式ビームコンバイナーが、第２の力学的な波によって、更なる照明光波長と第１の直線偏光方向とを有する検出光束成分も、更なる照明光波長と、第１の直線偏光方向に対して垂直な第２の直線偏光方向とを有する検出光束成分も偏向し、これによって検出光束から除去するように配向すること、も可能である。

既に、結晶の連続接続に関して記載したように、有利には、検出光束ははじめに結晶を通過し、次に第２の結晶を通過する。

音響光学式ビームコンバイナーの特別な構成に依存しないで、しかし、特に、力学的な波が照明光波長および２つの直線偏光方向の光成分に作用する音響光学式ビームコンバイナーの場合には、有利には、ビームコンバイナーのビーム案内部品が次のように配置および構成される。すなわち、検出光束の残りの部分が音響光学式ビームコンバイナーを共線状に離れることができるように、配置および構成される。このようにして、検出光束は容易に、検出器に、例えばマルチバンド検出器に導かれる。

本発明の顕微鏡は、有利には、スキャン顕微鏡または共焦点スキャン顕微鏡または高解像度スキャン顕微鏡またはＳＴＥＤ顕微鏡として構成可能である。

ＳＴＥＤ（誘導放出制御 Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ Ｅｍｉｓｓｉｏｎ Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）顕微鏡における、または、ＣＡＲＳ（コヒーレント反ストークスラマン散乱 Ｃｏｈｅｒｅｎｔ Ａｎｔｉ Ｓｔｏｋｅｓ Ｒａｍａｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）顕微鏡における、または、ＳＲＳ（誘導ラマン散乱 Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ Ｒａｍａｎ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）顕微鏡における、または、ＣＳＲＳ（コヒーレントストークスラマン散乱 Ｃｏｈｅｒｅｎｔ Ｓｔｏｋｅｓ Ｒａｍａｎ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）顕微鏡における、または、Ｒｉｋｅｓ（ラマン誘起カー効果散乱 Ｒａｍａｎ ｉｎｄｕｃｅｄ Ｋｅｒｒ−Ｅｆｆｅｃｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）顕微鏡における、検体の検査のための、本発明の顕微鏡の使用は特に有利である。

図面には、発明の構成要件が概略的に示されており、これを、図面に基づいて以降で説明する。ここでは、同じ作用を有する部材には、同じ参照番号が付与されている。

メインビームスプリッターとして機能する音響光学式ビームコンバイナーを有する、本発明の顕微鏡の実施例の概略図 本発明の顕微鏡内の音響光学式ビームコンバイナーの実施例

図１は、メインビームスプリッターとして機能する音響光学式ビームコンバイナー１を有する、本発明の顕微鏡の実施例の概略図である。顕微鏡は、対物レンズ２を有している。この対物レンズ２は、照明光を、検体４内の照明光焦点にフォーカシングする。顕微鏡はさらに、光ファイバー５を有している。この光ファイバー５は、図示されていない光源から到来する照明光を搬送し、この光ファイバー５の端部にはファイバカプラ６が配置されている。このファイバカプラ６は、光ファイバー５から照明光を取り出し、有利には、コリメートされた照明光束３を形成する。ファイバカプラ６には、照明光焦点の形状を変える部材７、例えば、位相推移フィルターが配置されている。この部材７は、取り出されるべき照明光束３に対して相対的に事前にアライメントされている。

更なる光ファイバー８が設けられている。この更なる光ファイバー８は、更なる照明光を搬送する。この更なる照明光は、対物レンズ２によって更なる照明光焦点にフォーカシングされる。この、更なる光ファイバー８の端部には、更なるファイバカプラ９が配置されている。この更なるファイバカプラ９は、更なる照明光を更なる光ファイバー８から取り出し、更なる照明光束１０を生成する。更なるファイバカプラ９には、更なる照明光焦点の形状を変える、更なる部材１１が配置されている。

さらに、第３の光ファイバー１２が設けられている。この第３の光ファイバー１２は、第３の照明光を搬送する。この第３の照明光は、対物レンズ２によって更なる照明光焦点にフォーカシングされる。この、第３の光ファイバー１２の端部には、更なるファイバカプラ１３が配置されている。この更なるファイバカプラ１３は、第３の照明光を第３の光ファイバー１２から取り出し、第３の照明光束１４を生成する。更なるファイバカプラ１３には、更なる照明光焦点の形状を変える、第３の部材１５が配置されている。

光ファイバー５から取り出された照明光束３と、更なる光ファイバー８から取り出された更なる照明光束１０と、第３の光ファイバー１２から取り出された第３の照明光束１４とは、音響光学式ビームコンバイナー１に入力され、入力された照明光束３、１０、１４はこの音響光学式ビームコンバイナー１を共線状に離れる。ここで特に、照明光束３、１０、１４のうちの少なくとも２つが同じ照明光波長を有し、しかし、異なる偏光、特に直線偏光を有するように、設定をすることができる。

音響光学式ビームコンバイナー１においては、力学的な波との相互作用によって、照明光束３、１０、１４が回折され、これによって共通の光軸に偏向される。このような構成は、次のような特別な利点を有する。すなわち、個々の照明光成分が所期のように、使用時の要求に応じて遮断される、または、再び使用可能にされる、または、照明光出力に関して個々におよび別個に調整可能である、という特別な利点を有する。別の波長への迅速な切り替えも可能である、または、別の波長組み合わせが可能である。

共線状に統合された照明光束３、１０、１４は、ビーム偏向装置１６および対物レンズ２を介して、照明されるべき検体４に達する。

検体４から出発した検出光１７は、逆の光路で、音響光学式ビームコンバイナー１に戻る。音響光学式ビームコンバイナー１は、メインビームスプリッターとして作用する。これは（上述したような）照明光を、検体４の照明のために、照明光ビーム路に偏向し、かつ、検体４から生じた検出光１７を、検出器１８を有する検出ビーム路へと通す。ここでこれは、力学的な波との相互作用によって、検出光１７から、照明光束３、１０、１４の照明光波長を有する成分を除去する。

図２は、ＳＴＥＤ顕微鏡での特別な使用例に関する、本発明の顕微鏡での音響光学式ビームコンバイナー１の実施例を示している。ここでは、検体４に加えられる照明光の経過のみが記入されており、分かりやすくするために、検出光の経過は記入されていない。

図２に示された実施例では、音響光学式ビームコンバイナー１は、照明光焦点の形状を変える部材をそれぞれ有している複数のファイバカプラを用いて、異なる（ここでは示されていない）光ファイバーから到来する２つの脱励起光束１９、２０と、励起光束２３とを、検体４を照明するための照明ビーム路に偏向するために使用されている。ここで脱励起光束１９、２０の波長はそれぞれλｄｅｐであり、かつ、異なる直線偏光を有しており、励起光束２３の波長はλｅｘｃである。

第１の結晶２２のピエゾ音波生成器２１には、周波数ｆ１の高周波と、周波数ｆ２の高周波とが加えられており、第１の結晶２２を通って伝播する（図示されていない）２つの力学的な波を生成する。これらはそれぞれ、周波数ｆ１およびｆ２に相応する音波周波数を有している。

波長λｅｘｃの励起光束２３は、第１の結晶２２を介して入力される。第１の結晶２２のピエゾ音波生成器２１に周波数ｆ２の高周波を印加することによって生成された力学的な波との相互作用によって、励起光束２３が回折され、検体４の照明のための照明ビーム路に偏向される。第１の結晶２２を介した入力は特に有利である。なぜなら、検体４で反射された励起光を、第１の結晶２２において、第１の結晶２２内を伝播する、周波数ｆ２を有する力学的な波によっても、第２の結晶２５内を伝播する力学的な波によっても、検出光からフィルタリングすることができるからである。

異常直線偏光方向を有する第１の脱励起光束１９は、同様に、第１の結晶２２を介して入力され、周波数ｆ１の高周波をピエゾ音波生成器２１に印加することによって生成された力学的な波との相互作用によって回折され、検体４を照明するための照明ビーム路に偏向される。第１の脱励起光束１９と励起光束２３とは、共線状に統合されて、結晶２２を離れる。

第２の結晶２５のピエゾ音波生成器２４に周波数ｆ１’の高周波が印加されており、周波数ｆ１’に相当する音波周波数を有する、第２の結晶２５を通って伝播する（図示されていない）力学的な波が生成される。この力学的な波との相互作用によって、第２の結晶２５の複屈折特性に関して、通常直線偏光方向を有する、波長λｄｅｐの第２の脱励起光束２０が回折され、次に、そこを通って伝播する、第１の結晶２２の力学的な波によって、第１の結晶２２によって照明ビーム路に偏向されることなく経過し、最終的に検体４に達する。第２の脱励起光束２０は、第１の結晶２２内を伝播する力学的な波によって偏向されることはない。なぜなら、この光に対するブラグ条件が満たされていないからである。第２の脱励起光束２０、第１の脱励起光束１９および励起光束２３は、結晶２２を、共線状に統合されて離れ、ビーム偏向装置１６（図２に示されていない）および対物レンズ２（図２に示されていない）を通過した後、照明されるべき検体４に入射する。

第１の脱励起光束１９のビーム路には、上述したように、脱励起光束１９の照明光焦点の形状を変える部材（図示されていない）が設けられている。例えば、この部材は、位相フィルターまたは推移位相フィルターまたは断片位相フィルターまたは切り替え可能な位相マトリクス、特にＬＣＤマトリクスを有し得る。特に、照明光焦点の形状を変えるこの部材を用いて、リング状の焦点、いわゆるドーナツ型焦点が検体４内に作成される。これは、ｘ−ｙ平面、すなわち光軸に対して垂直な平面内の励起光束２３の焦点と重なり、これによって、ｘ−ｙ方向における解像度が上昇する。リング状の焦点は、例えば、いわゆる渦状位相フィルターによって実現される。

第２の脱励起光束２０のビーム路に、同様に、脱励起光束２０の照明光焦点の形状を変える、更なる部材も配置されている（図示されていない）。特に、照明光焦点の形状を変える更なる部材によって、二重焦点が生じるようにすることができる。この二重焦点は、励起光束２３の焦点と、ｚ方向において、有利には、励起光束２３の焦点の中心の上方および下方で重なる。これによって、ｚ方向における解像度が上昇する。

本発明を、特別な実施形態に関連して説明した。ここで、同じまたは同じ作用を有する部材に対しては、多くの場合、同じ参照符号が用いられている。しかし当然ながら、後続する特許請求の範囲の権利範囲を逸脱しない限り、変更すること、および、別の形態にすることが可能である。

Claims (23)

1. 対物レンズと光ファイバーとを有する顕微鏡であって、
   前記対物レンズは、照明光を照明光焦点にフォーカシングし、
   前記光ファイバーは、前記照明光を搬送し、かつ、前記光ファイバーの終端部にはファイバカプラが配置されており、前記ファイバカプラは、前記照明光を前記光ファイバーから取り出し、コリメートされた照明光束を生成する顕微鏡において、
   前記ファイバカプラに接して、前記照明光焦点の形状を変える部材が配置されており、前記部材は、取り出されるべき前記照明光束に対して相対的にアライメントされている、
   ことを特徴とする顕微鏡。
2. 前記ファイバカプラは、フロントレンズを備えており、
   前記照明光焦点の形状を変える前記部材は、前記ファイバカプラのケーシングおよび前記フロントレンズの少なくとも一方に接して配置または固定されている、
   請求項１記載の顕微鏡。
3. 前記ファイバカプラは、前記光ファイバーとバヨネット方式の差し込み接続によって接続されている、
   請求項１または２記載の顕微鏡。
4. 前記照明光焦点の形状を変える前記部材は、位相フィルターまたは位相マトリクスまたはＬＣＤマトリクスを有している、
   請求項１から３までのいずれか１項記載の顕微鏡。
5. 前記顕微鏡は、複数の照明光束を搬送する複数の光ファイバーを有し、
   前記複数の照明光束のうちの少なくとも１つの照明光束は、検体内で蛍光励起が生じるように構成および設定されており、
   前記複数の照明光束のうちの少なくとも１つの別の照明光束は、検体内で誘導放出が生じるように構成および設定されている、
   請求項１から４までのいずれか１項記載の顕微鏡。
6. 前記複数の照明光束のうちの少なくとも２つがビームコンバイナー内に入力されており、入力された前記照明光束は共線状に統合されて、前記ビームコンバイナーを離れる、
   請求項５記載の顕微鏡。
7. 前記複数の照明光束のうちの少なくとも第１の照明光束（１９）と第２の照明光束（２０）とは、同じ照明光波長を有しているが、異なる偏光または異なる直線偏光を有している、
   請求項５または６記載の顕微鏡。
8. 前記顕微鏡は、ビームコンバイナーを有し、前記ビームコンバイナーは、音響光学式ビームコンバイナーとして構成されており、少なくとも１つの力学的な波との相互作用によって、前記第１の照明光束（１９）も前記第２の照明光束（２０）も回折され、これによって、共通の光軸に偏向されるように構成および動作されている、
   請求項７記載の顕微鏡。
9. 前記音響光学式ビームコンバイナーは、結晶を有しており、前記結晶を通って力学的な波が伝播し、前記力学的な波は、前記第１の照明光束（１９）と前記第２の照明光束（２０）との波長に割り当てられた音波周波数を有しており、
   前記力学的な波で前記第１の照明光束（１９）も前記第２の照明光束（２０）も回折され、これによって、共通の光軸に偏向されるように、前記結晶と前記力学的な波の伝播方向とは相互に相対的に、かつ、前記結晶に入射する前記照明光束に対してそれぞれ相対的に配向されている、
   請求項８記載の顕微鏡。
10. ａ．前記第１の照明光束（１９）は、直線偏光されており、前記結晶の複屈折特性に関して常光の直線偏光方向を有しており、または、
    ｂ．前記第２の照明光束（２０）は、直線偏光されており、前記結晶の複屈折特性に関して異常光の直線偏光方向を有しており、または、
    ｃ．前記第１の照明光束（１９）の前記直線偏光方向、または、前記第２の照明光束（２０）の前記直線偏光方向は、前記力学的な波の伝播方向と検出光束の伝播方向とによって画定されている平面に配置されている、
    請求項９記載の顕微鏡。
11. 前記音響光学式ビームコンバイナーは、結晶を有しており、異なる音波周波数を有する第１の力学的な波と第２の力学的な波とが同時に前記結晶を通って伝播し、
    前記第１の力学的な波で前記第１の照明光束（１９）が回折され、前記第２の力学的な波で前記第２の照明光束（２０）が回折され、これによって、共通の光軸に偏向されるように、前記結晶と前記力学的な波の伝播方向とは相互に相対的に、かつ、前記結晶に入射する前記照明光束に対してそれぞれ相対的に配向されている、
    請求項８から１０までのいずれか１項記載の顕微鏡。
12. 前記第１の照明光束（１９）の波長および前記第２の照明光束（２０）の波長を有しておらず、かつ、前記力学的な波で回折されない、少なくとも１つの更なる照明光束（２３）が前記結晶を通り、前記第１の照明光束（１９）と前記第２の照明光束（２０）とともに、前記共通の光軸に達する、
    請求項９から１１までのいずれか１項記載の顕微鏡。
13. 前記音響光学式ビームコンバイナーは、第２の結晶を有し、
    前記結晶内または前記第２の結晶内を、同時に、少なくとも１つの付加的な力学的な波が伝播し、前記付加的な力学的な波は、付加的な波長に割り当てられた別の音波周波数を有しており、
    ａ．前記付加的な力学的な波で、前記別の波長を有する少なくとも１つの付加的な照明光束が回折され、これによって、前記共通の光軸に偏向され、または、
    ｂ．前記付加的な力学的な波で、前記別の波長と、互いに異なる偏光と、を有している２つの付加的な照明光束が回折され、これによって、前記共通の光軸に偏向される、
    請求項９から１２までのいずれか１項記載の顕微鏡。
14. 前記ビームコンバイナーはメインビームスプリッターとして機能し、前記メインビームスプリッターは照明光を、検体を照明するための照明光ビーム路に偏向し、かつ、前記検体から出発する検出光を、検出器を有する検出ビーム路に偏向する、
    請求項６、８から１３までのいずれか１項記載の顕微鏡。
15. 前記ビームコンバイナーは、検体から出発する検出光を受光し、前記検出光から、前記照明光波長および前記更なる照明光波長および前記別の照明光波長の少なくとも１つを有する成分を除去する、
    請求項６、８から１４までのいずれか１項記載の顕微鏡。
16. ａ．検体から到来する検出光束から、前記結晶の力学的な波との相互作用によって、前記照明光波長と第１の直線偏光方向とを有する前記検出光束の成分も、前記照明光波長と、前記第１の直線偏光方向に対して垂直な第２の直線偏光方向と、を有する前記検出光束の成分も偏向され、これによって前記検出光束から除去され、または、
    ｂ．検体から到来する検出光束から、前記第２の結晶の力学的な波との相互作用によって、前記更なる照明光波長と第１の直線偏光方向とを有する前記検出光束の成分も、前記更なる照明光波長と、前記第１の直線偏光方向に対して垂直な第２の直線偏光方向と、を有する前記検出光束の成分も偏向され、これによって前記検出光束から除去される、
    請求項１３記載の顕微鏡。
17. 前記検出光束は、初めに前記結晶を通過し、次に前記第２の結晶を通過する、
    請求項１６記載の顕微鏡。
18. 前記ビームコンバイナーのビーム誘導部品は、前記検出光束の残りの部分が前記ビームコンバイナーを共線状に離れるように、配置および構成されている、
    請求項１６または１７記載の顕微鏡。
19. 前記顕微鏡は、スキャン顕微鏡として、または、共焦点スキャン顕微鏡として、または、高解像度スキャン顕微鏡として、または、ＳＴＥＤ顕微鏡として構成されている、
    請求項１から１８までのいずれか１項記載の顕微鏡。
20. ＳＴＥＤ（誘導放出制御 Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ Ｅｍｉｓｓｉｏｎ Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）顕微鏡における、または、ＣＡＲＳ（コヒーレント反ストークスラマン散乱 Ｃｏｈｅｒｅｎｔ Ａｎｔｉ Ｓｔｏｋｅｓ Ｒａｍａｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）顕微鏡における、または、ＳＲＳ（誘導ラマン散乱 Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ Ｒａｍａｎ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）顕微鏡における、または、ＣＳＲＳ（コヒーレントストークスラマン散乱 Ｃｏｈｅｒｅｎｔ Ｓｔｏｋｅｓ Ｒａｍａｎ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）顕微鏡における、または、Ｒｉｋｅｓ（ラマン誘起カー効果散乱 Ｒａｍａｎ ｉｎｄｕｃｅｄ Ｋｅｒｒ−Ｅｆｆｅｃｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）顕微鏡における、検体の検査のための、
    請求項１から１９までのいずれか１項記載の顕微鏡の使用。
21. 請求項１から１９までのいずれか１項記載の顕微鏡を製造するための、取り出されるべき照明光束に対して相対的に事前にアライメントされている、前記照明光焦点の形状を変える部材を有している、
    ことを特徴とするファイバカプラ。
22. 前記顕微鏡は、複数の照明光束を搬送する複数の光ファイバーを有し、
    異常直線偏光方向を有する、前記照明光束のうちの第１の脱励起光束（１９）は、第１の結晶（２２）を介して入力され、
    第２の結晶（２５）の複屈折特性に関して通常直線偏光方向を有する、前記照明光束のうちの第２の脱励起光束（２０）は、回折され、次に、そこを通って伝播する前記第１の結晶（２２）の力学的な波によって偏向されることなく、前記第１の結晶（２２）を通り照明ビーム路に進行し、
    前記第１の脱励起光束（１９）のビーム路には、前記第１の脱励起光束（１９）の照明光焦点の形状を変える前記部材が設けられており、
    前記第２の脱励起光束（２０）のビーム路には、前記第２の脱励起光束（２０）の照明光焦点の形状を変える更なる部材が設けられている、
    請求項１から１９までのいずれか１項記載の顕微鏡。
23. 前記更なる部材によって二重焦点が生成され、前記二重焦点は、前記第１の結晶（２２）を介して入力される励起光束（２３）の焦点とｚ方向において重なる、
    請求項２２記載の顕微鏡。

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