JP2018105999A - 超解像顕微鏡 - Google Patents

Abstract

【課題】小型に構成でき、光学調整も容易にできる超解像顕微鏡を提供する。
【解決手段】超解像顕微鏡は、照明光学系と検出光学系とを備える。照明光学系は、光源１０と、照明光分波部２０と、照明光遅延部３０と、照明光合波部４０と、を有する。光源１０は、有限の連続波長帯成分を含むパルス光を射出する。照明光分波部２０は、光源１０の射出光から第１の光と第２の光とを分波する。照明光遅延部３０は、第１の光に対して第２の光を遅延させる。照明光合波部４０は、照明光遅延部３０からの第１の光及び第２の光を合波する。検出光学系は、照明光合波部４０で合波された第１の光及び第２の光による試料Ｓからの応答光を検出する。
【選択図】図１

Description

本発明は、超解像顕微鏡に関するものである。

超解像顕微鏡として、例えば、少なくとも２以上の励起量子状態をもつ分子を含む試料を、２重共鳴吸収過程を用いて回折限界を超える高い空間分解能で観察可能な蛍光顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１、２参照）。

特許文献１、２に開示の蛍光顕微鏡は、試料中の分子を安定状態、例えば基底状態から第１量子状態に励起するためのポンプ光と分子を更に他の量子状態に遷移させるためのイレース光とを一組として、回折限界以下に収縮した蛍光スポットにより試料面を空間走査する。そして、各計測点の蛍光信号をコンピュータ上で２次元的に配列して画像処理することにより、回折限界の空間分解能を上回る解像度を有する蛍光画像を得ている。

その代表例として、蛍光色素分子を含む試料にポンプ光を照射して、蛍光色素分子を第１量子状態に励起する。さらに、試料にイレース光を照射して、蛍光色素分子を他の量子状態に強制遷移させることで第１量子状態の分子をクェンチする。その結果として、第１量子状態からの蛍光緩和を抑制する。この際、対物レンズによりポンプ光と中空状のイレース光とを試料に同時に照射すれば、蛍光色素で染色された試料面に形成される蛍光スポットは、中心部を残し回折限界以下に収縮される。

特開２００１−１００１０２号公報 特開２０１０−１５０２６号公報

超解像顕微鏡の原理自体は単純である。技術的には、いかにポンプ光と中空状のイレース光とを同軸で試料に集光させるかが重要である。すなわち、ポンプ光の光軸とイレース光の光軸とが多少でもずれると、蛍光スポットのピークが蛍光抑制されて、蛍光スポットの形状が乱れることになる。その結果、空間分解能が低下して、画質が劣化することになる。

ポンプ光とイレース光との光軸ずれの主な原因は、ポンプ光用のレーザ光源とイレース光用のレーザ光源との２台のレーザ光源を用い、これら２台のレーザ光源からの射出光の光軸を同軸に合わせる必要があるからである。

一方、近年では、ポンプ光及びイレース光を共通の１本のシングルモードファイバを経て２色性の位相板に入射させることで、ポンプ光及びイレース光を軸ずれすることなく試料に照射する方法もが考案されている（例えば、Optics Letters Vol. 40, Issue 6, pp. 1057-1060 (2015)）。

しかし、上記の場合であっても、ポンプ光用のレーザ光源とイレース光用のレーザ光源とを用いるため、これら複数台のレーザ光源からのポンプ光とイレース光とを合波させて共通のシングルモードファイバに入射させる光学システムが必要となる。また、色素の分光特性に応じてレーザ光源を入れ替えて、ポンプ光とイレース光とを導入する必要がある。そのため、顕微鏡システムの構成が大掛かりになるとともに、色素に応じた光学調整も面倒となり、改善が望まれている。

したがって、かかる観点に鑑みてなされた本発明の目的は、小型に構成でき、光学調整も容易にできる超解像顕微鏡を提供することにある。

上記目的を達成する本発明に係る超解像顕微鏡は、
試料中の分子を励起させる第１の光及び前記分子の励起を抑制する第２の光を、少なくとも一部を空間的に重ね合わせて前記試料に集光して照射する照明光学系と、
前記照明光の前記試料への照射による該試料からの応答光を検出する検出光学系と、を備え、
前記照明光学系は、光源と、照明光分波部と、照明光遅延部と、照明光合波部と、を有し、
前記光源は、有限の連続波長帯成分を含むパルス光を射出し、
前記照明光分波部は、前記光源の射出光から前記第１の光と前記第２の光とを分波し、
前記照明光遅延部は、前記第１の光に対して前記第２の光を遅延させ、
前記照明光合波部は、前記照明光遅延部からの前記第１の光及び前記第２の光を合波し、
前記検出光学系は、前記照明光合波部で合波された前記第１の光及び前記第２の光による前記試料からの前記応答光を検出する。

前記光源は、スーパーコンティニュアム光源とするとよい。

前記照明光分波部は、前記光源の射出光から前記第１の光又は前記第２の光を有限の波長帯域に制限して分光してもよい。

前記照明光分波部は第１のファイバカプラを有し、
前記第１のファイバカプラにより前記光源の射出光から前記第１の光及び前記第２の光を分波してもよい。

前記照明光分波部は、前記光源の射出光を２分岐する分岐ファイバと、該分岐ファイバの一方の分岐端に結合された第１のファイバグレーティング及び他方の分岐端に結合された第２のファイバグレーティングと、を有し、
前記第１のファイバグレーティングは前記第１の光を透過し、前記第２のファイバグレーティングは前記第２の光を透過してもよい。

前記照明光分波部は、前記第１のファイバカプラの入射端に結合された第３のファイバグレーティングを有し、
前記第３のファイバグレーティングは、前記第１の光及び前記第２の光を透過してもよい。

前記照明光遅延部は、前記第１の光を導波する第１のファイバと、前記第２の光を導波する第２のファイバと、を有し、
前記第２のファイバにおける前記第２の光の光路長は、前記第１のファイバにおける前記第１の光の光路長よりも長いとよい。

前記照明光遅延部は光サーキュレータを有し、
前記第２の光は前記光サーキュレータを経て前記第１の光の光路長よりも長い光路長を導波してもよい。

前記照明光分波部は、前記光源の射出光を２分岐する分岐ファイバと、該分岐ファイバの一方の分岐端に結合されて前記第１の光を透過する第１のファイバグレーティングと、前記分岐ファイバの他方の分岐端に結合されて前記第２の光を透過する第２のファイバグレーティングと、を有し、
前記照明光遅延部は、前記第１の光を導波する第１のファイバと、前記第２の光を導波する第２のファイバと、を有し、
前記第２のファイバにおける前記第２の光の光路長は、前記第１のファイバにおける前記第１の光の光路長よりも長く、
前記第１のファイバグレーティングは前記第１のファイバに形成され、前記第２のファイバグレーティングは前記第２のファイバに形成されてもよい。

前記照明光合波部は第２のファイバカプラを有し、
前記照明光遅延部からの前記第１の光及び前記第２の光を前記第２のファイバカプラにより合波してもよい。

少なくとも前記照明光分波部及び前記照明光遅延部は、前記照明光学系に対して着脱可能であるとよい。

本発明によれば、小型に構成でき、光学調整も容易にできる超解像顕微鏡を提供することが可能となる。

第１実施の形態に係る超解像顕微鏡の要部の概略構成を模式的に示す図である。 図１のスーパーコンティニュアム光源から射出される白色レーザ光の光スペクトルの一例を示す図である。 図１の空間変調素子の一例の概略構成を示す平面図である。 図３Ａの空間変調素子の光学特性を説明するための図である。 図１の空間変調素子の他の例の概略構成を示す平面図である。 図４Ａの空間変調素子の光学特性を説明するための図である。 第２実施の形態に係る超解像顕微鏡の要部の概略構成を模式的に示す図である。 ライン発振のレーザ光を用いた場合のイレース光の焦点面における集光パターンの強度分布を示す図である。 白色レーザ光を用いた場合のイレース光の焦点面における集光パターンの強度分布を示す図である。 第３実施の形態に係る超解像顕微鏡の要部の概略構成を模式的に示す図である。 照明光遅延部の変形例を説明するための図である。

以下、本発明の実施の形態について、図を参照して説明する。

（第１実施の形態）
図１は、第１実施の形態に係る超解像顕微鏡の概略構成を模式的に示す図である。本実施の形態に係る超解像顕微鏡は、少なくとも２以上の励起量子状態をもつ蛍光色素で染色された試料Ｓを観察するもので、蛍光色素を安定状態から第１量子状態に励起するための第１の光（ポンプ光）と蛍光色素を更に他の量子状態に遷移させて蛍光色素の励起を抑制するための第２の光（イレース光）とを照明光として用いる。

ポンプ光及びイレース光は、光源１０の射出光から生成される。光源１０は、有限の連続波長帯成分を含むパルス光を射出する。本実施の形態では、光源１０として、スーパーコンティニュアム光源が用いられる。スーパーコンティニュアム光源１０は、例えばマスターレーザ光源１１とシングルモードのフォトニック結晶ファイバ１２とを用いて構成される。マスターレーザ光源１１としては、例えばハイパワーの超短パルス光を射出するマイクロチップＮｄ：ＹＡＧレーザが用いられる。

マイクロチップＮｄ：ＹＡＧレーザの射出光をフォトニック結晶ファイバ１２に導入すると、非線形光学効果により図２に示すような光スペクトルを有する白色レーザ光が発生する。図２から明らかなように、この場合に発生する光スペクトルは、波長が５００ｎｍから２０００ｎｍまでと広帯域であり、特に波長１０６４ｎｍでは、強度の高いマイクロチップＮｄ：ＹＡＧレーザの発振光が重複している。

本実施の形態では、試料Ｓが超解像顕微鏡で実績のあるナイルレッド色素分子で染色されているものとする。この場合、照明光として、波長５００ｎｍの領域のポンプ光と波長６５０ｎｍの領域のイレース光とが用いられる。これらの光を含め、スーパーコンティニュアム光源１０からは、全波長領域の白色光が出力される。したがって、この白色光からポンプ光の波長帯域とイレース光の波長帯域とを分光して取り出すことができる。

しかし、一般にフォトニック結晶ファイバ１２を含め光学ファイバは、光学定数に関して正の分散特性を有している。そのため、導波する光学ファイバのコアの屈折率は、波長の短いポンプ光のほうが波長の長いイレース光よりも大きくなる。その結果、相対的にポンプ光の光路長が長くなり、ポンプ光及びイレース光のそれぞれの波長や光学ファイバの長さによっては、イレース光パルスがポンプ光パルスよりも先に試料Ｓに到達する場合がある。

このような照明条件下では、試料Ｓが第１電子状態に励起される前に、試料Ｓにイレース光が到達するために蛍光抑制効果を誘導できず、超解像顕微鏡観察ができなくなる。したがって、ポンプ光をイレース光に先行して、試料Ｓに到達させるための工夫が必要となる。

そこで、本実施の形態では、照明光学系に照明光分波部２０と照明光遅延部３０と照明光合波部４０とを設けて、スーパーコンティニュアム光源１０の射出光から、ポンプ光とイレース光とを、ポンプ光がイレース光よりも先行させて同軸で取り出す。

照明光分波部２０は、スーパーコンティニュアム光源１０の射出光からポンプ光とイレース光とを分光して分波する。照明光分波部２０は、例えばファイバカプラ（第１のファイバカプラ）２１を用いて構成される。ファイバカプラは、複数のシングルモードファイバのコアを平行に溶着させた構造を有する。異なる波長の光がそれぞれのファイバから入射すると染み出し効果により合波されて、何れかのファイバを共通に伝播する。溶着の長さと夫々の光の波長の定在波が立つ条件で結合比がきまる。ファイバカプラでの光の伝播は可逆的で、反対から多色の光を入射すると、夫々の波長に応じて異なるファイバから分波されて射出される。

本実施の形態では、ファイバカプラ２１として、１本の入射ファイバ２２と２本の射出ファイバとを有する１×２カプラを用いる。ファイバカプラ２１の入射ファイバ２２は、ＦＣコネクタ（Fiber Connector）２３を介してスーパーコンティニュアム光源１０のフォトニック結晶ファイバ１２の射出端に着脱自在に結合される。これにより、スーパーコンティニュアム光源１０の射出光から、ポンプ光とイレース光とを分光して、ファイバカプラ２１の２本の射出ファイバから分波して取り出す。ファイバカプラ２１で分波されたポンプ光及びイレース光は、照明光遅延部３０に入射される。

照明光遅延部３０は、照明光分波部２０で分波されたポンプ光及びイレース光を、ポンプ光に対してイレース光を遅延させて、ポンプ光をイレース光よりも先行させる。照明光遅延部３０は、例えば長さの異なる２本のシングルモードの第１のファイバ３１と第２のファイバ３２とを有して構成される。本実施の形態において、第１のファイバ３１は、第２のファイバ３２よりも長さが短い。第１のファイバ３１の入射端は、ファイバカプラ２１のポンプ光を射出する射出ファイバに結合される。第２のファイバ３２の入射端は、ファイバカプラ２１のイレース光を射出する射出ファイバに結合される。

第１のファイバ３１及び第２のファイバ３２は、それぞれの長さを調整して、第２のファイバ３２におけるイレース光の光路長を、第１のファイバ３１におけるポンプ光の光路長よりも長くする。これにより、ポンプ光及びイレース光に対して異なる所望の遅延を発生させて、ポンプ光に対してイレース光を遅延させる。第１のファイバ３１及び第２のファイバ３２からそれぞれの射出されるポンプ光及びイレース光は、照明光合波部４０に入射される。

照明光合波部４０は、照明光遅延部３０からのポンプ光及びイレース光を合波する。照明光合波部４０は、例えば２本の入射ファイバと１本の射出ファイバ４２とを有する２×１のファイバカプラ（第２のファイバカプラ）４１を用いて構成される。ファイバカプラ４１の一方の入射ファイバは、照明光遅延部３０の第１のファイバ３１の射出端に結合される。ファイバカプラ４１の他方の入射ファイバは、照明光遅延部３０の第２のファイバ３２の射出端に結合される。これにより、照明光遅延部３０で遅延量が調整されたポンプ光及びイレース光を同軸に合波して、射出端から射出させる。

ここで、照明光分波部２０を構成するファイバカプラ２１の２本の射出ファイバと、照明光遅延部３０を構成する第１のファイバ３１及び第２のファイバ３２とは、それぞれＦＣコネクタを介して着脱自在に結合することができる。他の例として、第１のファイバ３１及び第２のファイバ３２を含んでファイバカプラ２１を形成することにより、照明光分波部２０と照明光遅延部３０とを一体に構成することもできる。

また、照明光遅延部３０を構成する第１のファイバ３１及び第２のファイバ３２と、照明光合波部４０を構成するファイバカプラ４１の２本の入射ファイバとは、それぞれＦＣコネクタを介して着脱自在に結合することができる。他の例として、第１のファイバ３１及び第２のファイバ３２を含んでファイバカプラ４１を形成することにより、照明光遅延部３０と照明光合波部４０とを一体に構成することもできる。あるいは、第１のファイバ３１及び第２のファイバ３２を含んでファイバカプラ２１とファイバカプラ４１とを形成することにより、照明光分波部２０、照明光遅延部３０及び照明光合波部４０を一体に構成することもできる。

ファイバカプラ４１の射出ファイバ４２から導入されるポンプ光及びイレース光は、コリメータレンズ５１により共通にコリメートされた後、アイリス５２及びバンドパスフィルタ５３を透過してガルバノミラー光学系５４に導入される。バンドパスフィルタ５３は、ポンプ光及びイレース光を透過し、試料Ｓからの蛍光を反射するように構成される。

ガルバノミラー光学系５４に導入されたポンプ光及びイレース光は、ガルバノミラー光学系５４により二次元方向に偏向走査されて、瞳投影レンズ５５及び空間変調素子５６を経て顕微鏡対物レンズ５７により試料Ｓに集光される。空間変調素子５６は、顕微鏡対物レンズ５７により集光されるポンプ光及びイレース光に対し、ポンプ光が光強度の極大値を持ち、イレース光が光強度の極小値を持つように、ポンプ光及びイレース光のいずれか一方の少なくとも一部の偏光状態又は位相状態を変調するように構成される。

例えば、空間変調素子５６は、ポンプ光については顕微鏡対物レンズ５７により通常のガウスビームとしてビーム整形されることなく集光させる。また、イレース光については顕微鏡対物レンズ５７の焦点で強度が最小となる中空状にビーム整形されて集光されるように変調する。これにより、試料Ｓには、ポンプ光の照射領域の周囲の蛍光発光が抑制された回折限界を超える蛍光スポットが形成される。

空間変調素子５６は、例えば図３Ａ及び図３Ｂに示すように多層膜を用いて構成することができる。図３Ａ及び図３Ｂは、この場合の空間変調素子５６の概略構成を示す平面図及び空間変調素子５６の光学特性を説明するための図である。この空間変調素子５６は、ガラス基板５６ａ上の入射光束の全領域を変調領域とし、この変調領域に光軸の周りに分割された複数領域、ここでは８領域を有し、その８領域にイレース光の波長λｅに対して、λｅ／８ずつ位相が異なるように多層膜５６ｂが形成されている。

ここで、多層膜５６ｂは、図３Ｂにポンプ光及びイレース光の位相分布を模式的に示すように、イレース光に対してはラゲール・ガウシアンビームとなるように段階的に位相が増加し、全体で２π周回する様に設計される。一方、ポンプ光に対しては、多層膜５６ｂは、波長分散性により各領域でポンプ光の波長λｐに対して２πの整数倍の位相変化が発生するように設計される。

空間変調素子５６は、例えば図３Ａの多層膜５６ｂに代えて、各領域に独立に単層膜をコートして、ポンプ光とイレース光とに位相差（光路差）を与えるように構成することもできる。また、空間変調素子５６は、例えば図３Ａの多層膜５６ｂに代えて、ガラス基板５６ａを放射線状に分割し、各領域のエッチングの深さを調整して、ポンプ光とイレース光とに対して独立の位相差を与えるように構成することもできる。

空間変調素子５６は、例えば図４Ａ及び図４Ｂに示すように波長板を用いて構成することもできる。図４Ａ及び図４Ｂは、この場合の空間変調素子５６の概略構成を示す平面図及び光学特性を説明するための図である。この空間変調素子５６は、同心円状に接合された円柱基板５６ｃ及び輪帯基板５６ｄを有する。

円柱基板５６ｃ及び輪帯基板５６ｄは、それぞれ直交する進相軸（実線矢印で示す）及び遅相軸（破線矢印で示す）を有する例えば水晶基板からなり、円柱基板５６ｃの進相軸と輪帯基板５６ｄの進相軸とが直交するよう接合される。円柱基板５６ｃ及び輪帯基板５６ｄは、イレース光に対しては半波長板、ポンプ光に対しては１波長板となるように、それぞれの厚みが調整されて、ポンプ光及びイレース光の偏光状態を変調する。

図４Ａの空間変調素子５６は、図４Ｂに示すように、ポンプ光は同相で透過し、イレース光は位相が反転されて透過する。この空間変調素子５６を透過したポンプ光は、顕微鏡対物レンズ５７で集光されると、通常のガウスビームに近い形で集光される。これに対し、空間変調素子５６を透過したイレース光は、顕微鏡対物レンズ５７で集光されると、干渉により焦点のみで電場相殺されるので、３次元的な中空ビームとして集光される。したがって、この場合は、光軸方向にも蛍光スポットを収縮できるので、３次元的な超解像効果が得られる。

空間変調素子５６は、例えばフォトニック結晶材料からなる結晶基板に回折限界の微小なホール又はピットパターンを配列して構成することもできる。ホール又はピットパターンは、そのサイズ及び／又は間隔を調整することで、特定の波長に対する屈折率を調整することができる。

例えば、ホール又はピットパターンを、結晶基板の平面内で直交する方向に対して、異なるサイズ及び／又は間隔で配列すると、直交方向で異なる屈折率を与えることができる。この特性を利用することで、ポンプ光及びイレース光に対して独立に異なる屈折率を与えることができる。これにより、空間変調素子５６を透過したポンプ光及びイレース光を、顕微鏡対物レンズ５７により、同様に、ポンプ光は光強度の極大値を持ち、イレース光は光強度の極小値を持つように、試料Ｓに集光させることができる。

一方、ポンプ光の照射により試料Ｓから発生する蛍光は、ポンプ光及びイレース光の照明光の光路を逆に辿ってバンドパスフィルタ５３に入射され、該バンドパスフィルタ５３で反射されて照明光学系の光路から分離される。バンドパスフィルタ５３で反射された蛍光は、ブロックフィルタ５８で蛍光のみが取り出された後、集光レンズ５９に集光されて、ピンホール６０を経てフォトマルチプライヤ等の光検出器６１で受光される。

上記構成において、照明光学系は、スーパーコンティニュアム光源１０、照明光分波部２０、照明光遅延部３０、照明光合波部４０、コリメータレンズ５１、空間変調素子５６及び顕微鏡対物レンズ５７を含んで構成される。検出光学系は、バンドパスフィルタ５３、ブロックフィルタ５８、集光レンズ５９、ピンホール６０、光検出器６１を含んで構成される。

本実施の形態によると、ポンプ光及びイレース光を、スーパーコンティニュアム光源１０から射出される有限の連続波長帯成分を含むパルス光から取り出している。したがって、ポンプ光及びイレース光を別々の光源から得る場合と比較して、超解像顕微鏡全体を小型に構成できるとともに、光学調整も容易にできる。

また、少なくとも照明光分波部２０及び照明光遅延部３０は、照明光学系に対して着脱自在に構成することができる。したがって、種々の色素分子に対応する照明光分波部２０及び照明光遅延部３０を用意しておくことで、観察に用いる色素分子に応じた照明光分波部２０及び照明光遅延部３０を、ＦＣコネクタ等の脱着だけで簡単かつ迅速に交換して最適化することが可能となり、光軸調整の手間も不要となる。

例えば、キサンテン系の色素分子の場合は、ナイルレッド色素分子の場合と同様に、イレース光の波長はポンプ光の波長よりも長くなる。これに対し、フォトクロミック系の色素分子の場合は、イレース光の波長はポンプ光の波長よりも短くなる。このような場合でも、観察に用いる色素分子に応じて超解像顕微鏡を容易に最適化することが可能となる。

（第２実施の形態）
図５は、第２実施の形態に係る超解像顕微鏡の要部の概略構成を模式的に示す図である。本実施の形態に係る超解像顕微鏡は、図１において、照明光分波部２０の構成が異なるものである。以下、異なる点について説明する。

照明光分波部２０は、分岐ファイバ２５と、第１のファイバグレーティング２６と、第２のファイバグレーティング２７と、を有して構成される。分岐ファイバ２５は、２分岐ファイバで構成され、１つの入射端がＦＣコネクタ２３を介してスーパーコンティニュアム光源１０のフォトニック結晶ファイバ１２の射出端に着脱自在に結合される。

第１のファイバグレーティング２６は、入射端が分岐ファイバ２５の一方の分岐端に結合され、射出端が照明光遅延部３０の第１のファイバ３１の入射端に結合される。第２のファイバグレーティング２７は、入射端が分岐ファイバ２５の他方の分岐端に結合され、射出端が照明光遅延部３０の第２のファイバ３２の入射端に結合される。

第１のファイバグレーティング２６及び第２のファイバグレーティング２７は、光ファイバコア内の周期的な屈折率変調により波長選択的な反射フィルタとして機能する。本実施の形態では、第１のファイバグレーティング２６がポンプ光の波長帯域を選択的に透過して、その他の波長帯域を反射し、第２のファイバグレーティング２７がイレース光の波長帯域を選択的に透過して、その他の波長帯域を反射する。これにより、スーパーコンティニュアム光源１０の射出光から、ポンプ光とイレース光とが分光されて、照明光遅延部３０の第１のファイバ３１及び第２のファイバ３２にそれぞれ入射される。

なお、第１のファイバグレーティング２６及び第２のファイバグレーティング２７は、照明光遅延部３０を構成する第１のファイバ３１及び第２のファイバ３２にそれぞれ形成してもよい。他の例として、第１のファイバグレーティング２６及び第２のファイバグレーティング２７は、分岐ファイバ２５を構成する２本の射出ファイバにそれぞれ形成してもよい。

本実施の形態によれば、第１実施の形態と同様の効果が得られる。また、本実施の形態によると、ファイバグレーティングを用いて白色レーザ光からポンプ光及びイレース光をそれぞれ分光するので、ファイバグレーティングの溝、間隔等を調整することにより、ライン発振のレーザ光とは異なり、有限の帯域幅を持ったポンプ光及びイレース光を取り出すことができる。

図６Ａは、ライン発振のレーザ光を用いた場合のイレース光の焦点面における集光パターンの強度分布を示す図である。図６Ｂは、白色レーザ光を用いた場合のイレース光の焦点面における集光パターンの強度分布を示す図である。図６Ａは、イレース光の波長λｅが、６４６ｎｍ＜λｅ＜６４７ｎｍの場合である。図６Ｂは、波長λｅの中心波長が６４７ｎｍで、帯域幅が約３０ｎｍである６３４ｎｍ＜λｅ＜６６０ｎｍの場合である。なお、いずれの場合も、図１に示した空間変調素子５６は、図４Ａ及び図４Ｂに示した輪帯型波長板で変調した。

図６Ａ及び図６Ｂの比較から明らかなように、白色レーザ光から帯域幅を有するイレース光を分光する場合でも、焦点面に集光されるイレース光の中心部の強度はゼロとなる。したがって、超解像顕微鏡のイレース光として十分使用することができ、白色レーザ光の特徴を生かして、試料Ｓを効率的に照明することができる。

（第３実施の形態）
図７は、第３実施の形態に係る超解像顕微鏡の要部の概略構成を模式的に示す図である。本実施の形態に係る超解像顕微鏡は、図１において、照明光分波部２０の構成が異なるものである。以下、異なる点について説明する。

照明光分波部２０は、ファイバカプラ２１の入射ファイバ２２に結合された第３のファイバグレーティング２８を有する。第３のファイバグレーティング２８は、入射端がＦＣコネクタ２３を介してフォトニック結晶ファイバ１２の射出端に着脱自在に結合される。第３のファイバグレーティング２８は、スーパーコンティニュアム光源１０から射出される白色レーザ光から、ポンプ光及びイレース光の２つの有限波長帯域の透過率を高め、他の波長領域の光をカットするように、溝の間隔及び周期が最適化された２バンド透過フィルタとして機能する。

第３のファイバグレーティング２８を選択的に透過するポンプ光及びイレース光は、ファイバカプラ２１で分波されて、ポンプ光が第１のファイバ３１に入射され、イレース光が第２のファイバ３２に入射されて、ポンプ光に対してイレース光が遅延される。その他の構成は、第１実施の形態と同様である。

本実施の形態によれば、第２実施の形態と同様の効果が得られる。なお、第３のファイバグレーティング２８は、射出端がＦＣコネクタを介してファイバカプラ２１の入射ファイバ２２に結合されてもよい。他の例として、第３のファイバグレーティング２８は、ファイバカプラ２１の入射ファイバ２２に一体に形成されてもよい。

なお、本発明は上記実施の形態にのみ限定されるものではなく、幾多の変形又は変更が可能である。例えば、照明光遅延部３０は、図８に示すように光サーキュレータ３５を用いて構成することもできる。図８に示す光サーキュレータ３５は、第１ポート３６−１、第２ポート３６−２及び第３ポート３６−３を有する。

第１ポート３６−１は、ＦＣコネクタ等を介して照明光分波部２０の一方の射出端に結合される。第２ポート３６−２は、ＦＣコネクタ等を介してファイバ３７の一端に結合される。ファイバ３７の他端には、反射部材３８が配置される。第３のポート３６−３は、ＦＣコネクタ等を介して照明光合波部４０の一方の入射端に結合される。

これにより、照明光分波部２０で分波される例えばイレース光は、第１ポート３６−１に入射されて第２ポート３６−２からファイバ３７に導波される。ファイバ３７に導波されたイレース光は、反射部材３８で反射されてファイバ３７を逆方向に導波して、第３ポート３６−３を経て照明光合波部４０に入射される。

図８に示すような光サーキュレータ３５を用いれば、第２ポート３６−２に結合されるファイバ３７の長さを適宜変更することにより、ポンプ光に対するイレース光の遅延量を容易に最適化することができる。

また、上記実施の形態では、スーパーコンティニュアム光源１０を用いて白色レーザ光を得ている。この場合、白色レーザ光のスペクトルには、図２に示したようにショートパルスの尖頭値の高いマスターレーザ光源１１の発振光が重複している。このショートパルスの光は、多光子励起を誘導することができる。したがって、このショートパルスを利用することで、１台のスーパーコンティニュアム光源１０を用いて、光を分けることなく多光子励起を併用した超解像顕微鏡を実現することもできる。

１０ 光源（スーパーコンティニュアム光源）
１１ マスターレーザ光源
１２ フォトニック結晶ファイバ
２０ 照明光分波部
２１ ファイバカプラ（第１のファイバカプラ）
２３ ＦＣコネクタ
２５ 分岐ファイバ
２６ 第１のファイバグレーティング
２７ 第２のファイバグレーティング
２８ 第３のファイバグレーティング
３０ 照明光遅延部
３１ 第１のファイバ
３２ 第２のファイバ
３５ 光サーキュレータ
４０ 照明光合波部
４１ ファイバカプラ（第２のファイバカプラ）
５３ バンドパスフィルタ
５４ ガルバノミラー光学系
５６ 空間変調素子
５７ 顕微鏡対物レンズ
５８ ブロックフィルタ
５９ 集光レンズ
６０ ピンホール
６１ 光検出器
Ｓ 試料

Claims (11)

1. 試料中の分子を励起させる第１の光及び前記分子の励起を抑制する第２の光を、少なくとも一部を空間的に重ね合わせて前記試料に集光して照射する照明光学系と、
   前記照明光の前記試料への照射による該試料からの応答光を検出する検出光学系と、を備え、
   前記照明光学系は、光源と、照明光分波部と、照明光遅延部と、照明光合波部と、を有し、
   前記光源は、有限の連続波長帯成分を含むパルス光を射出し、
   前記照明光分波部は、前記光源の射出光から前記第１の光と前記第２の光とを分波し、
   前記照明光遅延部は、前記第１の光に対して前記第２の光を遅延させ、
   前記照明光合波部は、前記照明光遅延部からの前記第１の光及び前記第２の光を合波し、
   前記検出光学系は、前記照明光合波部で合波された前記第１の光及び前記第２の光による前記試料からの前記応答光を検出する、
   超解像顕微鏡。
2. 請求項１に記載の超解像顕微鏡において、
   前記光源は、スーパーコンティニュアム光源である、
   超解像顕微鏡。
3. 請求項１又は２に記載の超解像顕微鏡において、
   前記照明光分波部は、前記光源の射出光から前記第１の光又は前記第２の光を有限の波長帯域に制限して分光する、
   超解像顕微鏡。
4. 請求項１乃至３のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡において、
   前記照明光分波部は第１のファイバカプラを有し、
   前記第１のファイバカプラにより前記光源の射出光から前記第１の光及び前記第２の光を分波する、
   超解像顕微鏡。
5. 請求項１乃至３のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡において、
   前記照明光分波部は、前記光源の射出光を２分岐する分岐ファイバと、該分岐ファイバの一方の分岐端に結合された第１のファイバグレーティング及び他方の分岐端に結合された第２のファイバグレーティングと、を有し、
   前記第１のファイバグレーティングは前記第１の光を透過し、前記第２のファイバグレーティングは前記第２の光を透過する、
   超解像顕微鏡。
6. 請求項４に記載の超解像顕微鏡において、
   前記照明光分波部は、前記第１のファイバカプラの入射端に結合された第３のファイバグレーティングを有し、
   前記第３のファイバグレーティングは、前記第１の光及び前記第２の光を透過する、
   超解像顕微鏡。
7. 請求項１乃至６のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡において、
   前記照明光遅延部は、前記第１の光を導波する第１のファイバと、前記第２の光を導波する第２のファイバと、を有し、
   前記第２のファイバにおける前記第２の光の光路長は、前記第１のファイバにおける前記第１の光の光路長よりも長い、
   超解像顕微鏡。
8. 請求項１乃至６のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡において、
   前記照明光遅延部は光サーキュレータを有し、
   前記第２の光は前記光サーキュレータを経て前記第１の光の光路長よりも長い光路長を導波される、
   超解像顕微鏡。
9. 請求項１乃至３のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡において、
   前記照明光分波部は、前記光源の射出光を２分岐する分岐ファイバと、該分岐ファイバの一方の分岐端に結合されて前記第１の光を透過する第１のファイバグレーティングと、前記分岐ファイバの他方の分岐端に結合されて前記第２の光を透過する第２のファイバグレーティングと、を有し、
   前記照明光遅延部は、前記第１の光を導波する第１のファイバと、前記第２の光を導波する第２のファイバと、を有し、
   前記第２のファイバにおける前記第２の光の光路長は、前記第１のファイバにおける前記第１の光の光路長よりも長く、
   前記第１のファイバグレーティングは前記第１のファイバに形成され、前記第２のファイバグレーティングは前記第２のファイバに形成されている、
   超解像顕微鏡。
10. 請求項１乃至９のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡において、
    前記照明光合波部は第２のファイバカプラを有し、
    前記照明光遅延部からの前記第１の光及び前記第２の光を前記第２のファイバカプラにより合波する、
    超解像顕微鏡。
11. 請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡において、
    少なくとも前記照明光分波部及び前記照明光遅延部は、前記照明光学系に対して着脱可能である、
    超解像顕微鏡。
    

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