EP3042234A1 - Mikroskop mit einem element zum verändern der form des beleuchtungslichtfokus - Google Patents

Mikroskop mit einem element zum verändern der form des beleuchtungslichtfokus

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EP3042234A1
EP3042234A1 EP14771523.9A EP14771523A EP3042234A1 EP 3042234 A1 EP3042234 A1 EP 3042234A1 EP 14771523 A EP14771523 A EP 14771523A EP 3042234 A1 EP3042234 A1 EP 3042234A1
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EP
European Patent Office
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illumination light
light beam
crystal
wavelength
illumination
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP14771523.9A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Volker Seyfried
Vishnu Vardhan Krishnamachari
Arnold Giske
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Leica Microsystems CMS GmbH
Original Assignee
Leica Microsystems CMS GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Leica Microsystems CMS GmbH filed Critical Leica Microsystems CMS GmbH
Publication of EP3042234A1 publication Critical patent/EP3042234A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G02B6/32—Optical coupling means having lens focusing means positioned between opposed fibre ends

Definitions

  • the invention relates to a microscope with a lens that focuses illumination light to an illumination light focus, and with an optical fiber, which transports the illumination light and at the end of a fiber coupler is arranged, which decouples the illumination light from the optical fiber and generates a, preferably collimated, illumination light beam.
  • a confocal scanning microscope generally comprises a light source, a focusing optics, with which the light of the source is focused on a pinhole - the so-called excitation diaphragm, a beam splitter, a beam deflecting device for beam control, a microscope optics, a detection diaphragm and detectors for detecting the detection or fluorescent light.
  • the illumination light is coupled in via the beam splitter, for example.
  • the focus of such an illuminating light bundle can be moved in an object plane, for example, by means of a controllable beam deflecting device, generally by tilting two mirrors, wherein the deflecting axes are usually perpendicular to one another so that one mirror deflects in the x direction and the other in the y direction.
  • the tilting of the mirror is accomplished, for example, with the help of galvanometer actuators.
  • the power of the light coming from the object is measured as a function of the position of the scanning beam.
  • the fluorescent light coming from the object passes through the beam deflector back to the beam splitter, passes through this, to be subsequently focused on the detection aperture behind which the detectors are located.
  • Detection light that does not come directly from the focus region takes a different light path and does not pass through the detection aperture, so as to obtain point information that results in a three-dimensional image by sequentially scanning the object in multiple planes.
  • samples are often illuminated with an illumination light beam that has been produced by combining a plurality of illumination light beams to observe the reflected or fluorescent light emitted by the illuminated sample.
  • a point light source for a laser scanning microscope and a method for coupling the light of at least two lasers of different wavelengths in a laser scanning microscope is known.
  • the point light source has a modular design and includes a dichroic beam combiner, which combines the light from at least two laser light sources and couples them into an optical fiber leading to the microscope.
  • the resolving power of a confocal scanning microscope is, inter alia, given by the intensity distribution and the spatial extent of the focus of the excitation light beam in the sample. Because of the diffraction limit, the resolving power can not be arbitrarily increased by focusing more.
  • the focus of an illumination light beam emitted by a laser is rotationally symmetric with respect to the optical axis and has a Gaussian beam waist, the light power decreasing outwardly from the optical axis.
  • the STED technology has been developed in the meantime.
  • the depletion light is formed into an inwardly hollow focus.
  • an element for changing the shape of the illumination light focus of the Abregungslichtbündels is arranged in the beam path of the Abregungsander.
  • this element can have a phase filter or a gradient phase filter or a segment-phase filter or a switchable phase matrix, in particular an LCD matrix.
  • an annular focus in the sample a so-called Dougnut focus
  • An annular focus can For example, be achieved with a so-called. Vortex phase filter.
  • the object is achieved by a microscope which is characterized in that in or on the fiber coupler an element for changing the shape of the illuminating light focus is addressed, which is adjusted relative to the illuminating light bundle to be coupled out.
  • the invention has the advantage that a complex adjustment of the element for changing the shape of the illumination light focus during the startup of a microscope is completely avoided. Rather, due to the pre-adjustment, only the fiber coupler must be positioned and fixed in its desired position. However, the adjustment of the fiber coupler is easy and quick to accomplish, because the beam path of the coupled-out illumination light beam can easily be tracked and easily readjusted in the event of a deviation from a desired course of the fiber coupler. Much more complex would be the adjustment of the element for changing the shape of the illuminating light focus relative to the illuminating light beam to be coupled out, because a misalignment would not be detectable by simple means, in particular not by merely following the course of the beam.
  • this complex adjustment of the element for changing the shape of the illumination light focus relative to the illumination light beam to be coupled out is avoided.
  • the element for changing the shape of the illumination light focus is arranged and / or fixed on a housing of the fiber coupler and / or on a front lens of the fiber coupler.
  • the element for changing the shape of the illumination light focus in the fiber coupler is integrated and / or arranged in a housing of the fiber coupler.
  • At least one further optical fiber is present, which transports further illumination light, which is focused by the lens to a further illuminating light focus, and at the end of which a further fiber coupler is arranged, which decouples the further illumination light from the further optical fiber and another , preferably collimated, illuminating light beam generated.
  • a further element for changing the shape of the further illumination light focus is arranged in or on the further fiber coupler.
  • the fiber coupler is connected to the optical fiber through a bayonet-type connector. It can also be provided that the further fiber coupler is connected to the further optical fiber through a bayonet-type connector. Such an embodiment facilitates the replacement of components, for example in the event of repair.
  • the element for changing the shape of the illumination light focus may comprise a phase filter or a gradient phase filter or a segment-phase filter or a switchable phase matrix, in particular an LCD matrix.
  • an additional illumination light beam which does not pass through an optical fiber and / or element for changing the shape of the illumination light focus, into the illumination light beam path is coupled so that the lens also focuses the additional illumination light beam.
  • At least one of the illumination light bundles is designed and intended to cause a fluorescence excitation in a sample, while at least one other the illumination light beam is designed and intended to cause a polluted emission in a sample.
  • the illumination light beam and the further illumination light beam or b. the illumination light beam and the additional illumination light beam or
  • the coupled-in illumination light bundles leave collinear united.
  • provision can be made, in particular, for at least one first and one second of the illumination light bundles (illumination light bundle and / or further illumination light bundle and / or additional illumination light bundle) to have the same illumination light wavelength but a different polarization, in particular linear polarization.
  • the beam combiner is designed as an acousto-optic beam combiner and constructed and operated such that by Weichsel
  • the first illumination light beam, and the second illumination light beam diffracted and thereby directed to a common optical axis Such a design has the very special advantage that individual illumination light components can be selectively interrupted, depending on the application requirement, or released again or set individually and separately with regard to the illumination light output.
  • Such a design has the very special advantage that the acousto-optical beam combiner can be switched very quickly, within a few microseconds. In this way, an illumination light beam, for example, quickly interrupted or released. Also the possibility of fast switching to other wavelengths or other wavelength combinations is a particular advantage of such a design.
  • acousto-optic beam combiner is essentially based on the interaction of the coupled-in illumination light bundles with one or more mechanical waves.
  • Acousto-optic components generally consist of a so-called acousto-optic crystal to which an electrical transducer (often referred to in the literature as a transducer) is attached.
  • the transducer comprises a piezoelectric material and an overlying and an underlying electrode.
  • radio frequencies typically in the range between 30 MHz and 800 MHz
  • the piezoelectric material is caused to oscillate, so that an acoustic wave, ie a sound wave, can arise, which passes through the crystal after its formation.
  • the acoustic wave is absorbed or reflected off after passing through an optical interaction region on the opposite crystal side.
  • Acousto-optic crystals are distinguished by the fact that the resulting sound wave alters the optical properties of the crystal, with the sound inducing a type of optical grating or a comparable optically active structure, for example a hologram.
  • Light passing through the crystal undergoes diffraction at the optical grating. Accordingly, the light is directed in different diffraction orders in diffraction directions.
  • components such as AOM, AOD and frequency shifter.
  • the acoustooptic elements of birefringent crystals such as tellurium dioxide, in particular the position of the crystal axis relative to the direction of incidence of the light and its polarization determines the optical effect of each element.
  • the mechanical wave must have a specific frequency so that the Bragg condition is met precisely for the light of the desired illumination light wavelength and the desired polarization.
  • Light, for which the Bragg condition is not met, is not deflected in these acousto-optic components by the mechanical shaft.
  • the acousto-optical beam combiner has a crystal through which simultaneously propagate a first and a second mechansiche wave different sound frequency, wherein the crystal and the propagation direction the mechanical waves relative to each other and in each case relative to the illuminating light bundles incident in the crystal are aligned such that diffracted at the first mechanical shaft, the first illumination light beam and the second mechanical shaft, the second illumination light beam and thereby directed to a common optical axis.
  • the combined illuminating light beam leaves the crystal through an exit surface oriented perpendicular to the outward direction of the illumination light bundle.
  • this embodiment has the disadvantage that for deflecting two illumination light bundles, which have the same wavelength but different polarization, two different mechanical waves must be generated.
  • the generator for the mechanical waves for example, a angeortnette on the crystal piezoelectric element must be applied simultaneously with two different electromagnetic RF waves.
  • twice the amount of thermal power is introduced into the crystal or crystals, which ultimately reduces the diffraction efficiency and leads to the inevitable temperature fluctuations and the deflection directions and thus the light output of the arriving at the sample and the detector Light waver.
  • the frequency ranges of the mechanical waves overlap, beats may occur, ultimately leading to periodic variations in the light output of the light arriving at the sample and / or at the detector.
  • This problem is based in particular on the fact that the mechanical waves naturally can not have an infinitely narrow, that is to say singular, sound frequency, but rather that a frequency range around a center frequency always has to be present.
  • the acousto-optic beam combiner has a crystal through which a mechanical wave propagates a sound frequency associated with the wavelength of the first and second illumination light beams, the crystal and the propagation direction of the mechanical shaft being oriented relative to each other and respectively relative to the illuminating light bundles incident in the crystal are that on the mechansichen wave both the first illumination light beam, and the second illumination light beam diffracted and thereby directed to a common optical axis.
  • the first illumination light bundle may be linearly polarized and to have a linear polarization direction which is the linear polarization direction of the ordinary light based on a birefringence property of the crystal and / or the second Illumination light beam is linearly polarized and has a linear polarization direction, which is the linear polarization direction of the extraordinary light with respect to a birefringence property of the crystal.
  • the linear polarization direction of the first illumination light beam or the linear polarization direction of the second illumination light beam is arranged in the plane which is spanned by the propagation direction of the mechanical shaft and the propagation direction of the detection light beam.
  • Such an acousto-optical beam combiner in particular the orientation of the crystal relative to the direction of propagation of the mechanical shaft (s) and the propagation direction of the illumination light bundles, as well as the alignment of the mechanical shaft and the illumination light beam relative to each other, and also the orientation of the entry and exit surfaces to each other and to the optical axis of the crystal can be developed, for example, according to the iterative method described below, the method is preferably not on the basis of real components, which is also possible, but in a computer simulation is followed until the individual parameters of the crystal form, the Orientation of the surfaces and the crystal lattice, the orientation of the propagation direction of the mechanical wave (s) and the propagation directions of the illumination light bundles meet the desired requirements. If all the relevant parameters have been determined in this way in a computer simulation, the crystal can subsequently be produced in a further step.
  • the acousto-optical beam combiner has a commercially available crystal through which would actually propagate simultaneously a first and a second mechanical wave different sound frequency to both the first illumination light beam, as well to direct the second illumination light beam onto a common optical axis.
  • the inverted light path is considered, and in the reverse light path, the first and second illumination beams are collinearly coupled into the crystal through the exit surface, preferably perpendicularly aligned, but only the first of the mechanical waves is created in the crystal.
  • This has the consequence that only the first illumination light beam is diffracted at the mechanical shaft, while the second light beam, which has the same wavelength but the other linear polarization direction, passes through the crystal without being deflected.
  • the crystal is preferably rotated in the plane which is spanned by the incident collinear illumination beam and the propagation direction of the mechanical shaft, and thus also the angles between the propagation direction of the mechanical shaft and the crystal axes are changed, until with the mechanical shaft both illuminating light bundles be deflected both Linearpolarisationsanteile.
  • the changes to the crystal shape mean that the mechanical wave no longer deflects both linear polarization components of the illumination light wavelength. For this reason, the crystal is now rotated again until this condition is fulfilled again. Then the further iteration steps already described are repeated.
  • Such an embodiment not only has the advantage that in each case with a single mechanical wave both parts of different linear polarization deflects, but also that on the light path of the first diffraction order, in which the collinearity described above, multicolored, collinear incident illumination light collinear on an illumination light beam can be diffracted.
  • no compensation of spatial splits is required for this illuminating light because it does not exist for this illuminating light.
  • the crystal or the second crystal has an entrance surface for primary light of several wavelengths and a Having exit surface for the directed onto the common optical axis illumination light beam, wherein the entrance surface and the exit surface are aligned such that the primary light is coupled as a collinear illumination light beam in the crystal and directed onto the common optical axis illuminating light beam leaves the crystal as a collinear illumination light beam.
  • At least one further illuminating light bundle which does not have the wavelength of the first and second illuminating light bundles and which is not diffracted on the mechanical shaft, extends through the crystal and, together with the first and the second illuminating light bundles, runs onto the common optical light Axis passes.
  • the further illuminating light beam emanates from a second crystal in which propagates a second mechanical wave, which has a wavelength of the further illuminating light bundle associated sound frequency, the further illuminating light bundle includes a third illumination light beam of the further illumination light wavelength, that of the second was diffracted mechanical wave or that the further illumination light beam includes a third and a fourth illumination light beam of the further illumination light wavelength, but different polarization, in particular linear polarization, which were diffracted by the second mechanical shaft.
  • the second crystal should preferably be constructed in such a way that, as described in detail above, it deflects the illumination light of the further wavelength independently of its polarization.
  • the previously described principles are applied at the same time several times by generating in several at least one crystal a plurality of mechanical waves of different frequencies for illumination light of different wavelengths.
  • the acousto-optic beam combiner has at least one dispersive optical component which compensates for a spatial, spectral splitting (at least partially) caused by the crystal or the second crystal.
  • This may be, for example, a splitting of an illumination light bundle which contains light of several wavelengths.
  • the dispersive optical component - in addition to a compensation of a splitting of illumination light - compensates for a spatial spectral splitting of detection light.
  • the dispersive optical component can be arranged so that it reverses an already existing spatial spectral splitting. However, the compensation can also take place in such a way that the dispersive optical component causes a spatial spectral splitting, which is reversed by the crystal or the second crystal.
  • the acoustooptic beam combiner can receive the light of a plurality of primary light sources in a particularly advantageous manner, whose illumination light bulb, if necessary after a wavelength selection, unites the acoustooptic beam combiner.
  • At least one of the primary light sources may generate unpolarized primary light, in particular white light.
  • a light source may, for example, comprise a polarization beam splitter which receives the unpolarized primary light and spatially splits it in dependence on the linear polarization direction so that the resulting illumination light beams are exposed via different inputs of one or more crystals to the action of the mechanical wave or the action of the mechanical waves can be.
  • illumination light of one or more wavelengths can be selected in a very deliberate and extremely flexible manner and directed collinearly onto an illumination beam path for illuminating a sample; this without that of the unpolarized primary light - apart from the usual losses when coupling and uncoupling from optical components - something of the light intensity is lost.
  • the beam combiner functions as a main beam splitter, the illumination light onto an illumination light beam path for illumination directs a sample and directs the emanating from the sample detection light on a detection beam path with a detector.
  • the crystal and the propagation direction of the mechanical shaft can be oriented relative to one another and relative to the detection light bundle incident in the crystal in such a way that the acousto-optic beam combiner with the mechanical shaft has both the illumination light wavelength and a first linear polarization direction Proportion of the detection light beam, as well as the illumination light wavelength and a second, to the first linear polarization direction perpendicular linear polarization direction having portion of the detection light beam deflected and thereby removed from the detection light beam, and / or that the second crystal and the propagation direction of the second mechanical shaft relative to each other and each relative to the incident in the second crystal detection light beam are aligned such that the acousto-optic Strahlverillian with the second mechanical Wel le both the further illumination light wavelength and a first linear polarization direction having portion of the detection light beam, as well as the further illumination light wavelength and a second, to the first linear polarization direction perpendicular linear polarization direction having portion of the detection
  • the beam-guiding components of the beam combiner are arranged and configured in such a way that the remaining part of the detection light beam collinearly leaves the acoustooptic beam combiner.
  • the detection light beam can easily be fed to a detector, for example a multiband detector.
  • the microscope according to the invention can advantageously be designed as a scanning microscope or confocal scanning microscope or as a high-resolution scanning microscope or as a STED microscope.
  • the use of the microscope according to the invention for the examination of a sample in STED (Stimulated Emission Depletion) microscopy or in CARS microscopy (Coherent Anti Stokes Raman Spectroscopy) or in SRS microscopy (Stimulated Raman Scattering) or in the CSRS is particularly advantageous Microscopy (Coherent Stokes Raman Scattering) or in Rikes microscopy (Raman induced Kerr-effect scattering).
  • Fig. 1 shows schematically an embodiment of a microscope according to the invention with an acousto-optical Strahlkarger, which acts as a main beam splitter and
  • Fig. 2 shows an embodiment of an acousto-optical Strahlougers in a microscope according to the invention.
  • Fig. 1 shows schematically an embodiment of a microscope according to the invention with an acousto-optical beam combiner 1, which acts as a main beam splitter.
  • the microscope has an objective 2 which focuses illumination light into an illumination light focus in a sample 4, and with an optical fiber 5 which transports the illumination light coming from a light source, not shown, and at the end of which a fiber coupler 6 is arranged, which illuminates the illumination light Optical fiber decoupled and generates a, preferably collimated, illumination light beam 3.
  • a Element 7 for changing the shape of the illumination light focus, for example, a Phasenverlaufsfilter, gerodnet, which is pre-adjusted relative to the out-coupling the illumination light beam 3.
  • a further optical fiber 8 is present, which transports further illumination light, which is focused by the lens 2 to a further illuminating light focus, and at the end of another fiber coupler 9 is arranged, which decouples the further illumination light from the further optical fiber 8 and another illumination light beam 10 generated.
  • a further element 1 1 for changing the shape of the further illuminating light focus is gerodnet.
  • a third optical fiber 12 is provided, which transports third illumination light, which is focused by the lens 2 to a further illuminating light focus, and at the end of another fiber coupler 13 is arranged, which decouples the third illumination light from the further optical fiber 8 and a third illumination light beam 14 generated.
  • a third element 15 is arranged for changing the shape of the further illumination light focus.
  • the decoupled from the optical fiber 5 illumination light beam 3, the decoupled from the further optical fiber 8 further illumination light beam 10 and coupled out of the third optical fiber 12 third illumination light beam 14 are coupled into an acousto-optic Strahlverier 1, the coupled-in illumination light bundles 3, 10, 14 unite collinear leave ,
  • both the illuminating light bundles 3, 10, 14 are diffracted by Weichsel action with mechanical waves and thereby directed onto a common optical axis.
  • Such a design has the very special advantage that individual illumination light components can be selectively interrupted, depending on the application requirement, or released again or set individually and separately with regard to the illumination light output. Also the possibility of a fast switching to other wavelengths or other wavelength combinations is possible.
  • the collinearly combined illumination light bundles 3, 10, 14 pass through a beam deflection device 16 and the objective 2 to the sample 4 to be illuminated.
  • the detection light 17 emanating from the sample 4 reaches the inverted light path back to the acoustooptic beam combiner 1.
  • the acoustooptic beam combiner 1 functions as a main beam splitter which (as described above) directs illumination light onto an illumination light beam path for illumination of a sample 4 and allows the detection light 17 emanating from the sample 4 to pass to a detection beam path with a detector 18. In this case, it removes, by interaction with the mechanical waves from the detection light 17, the components which have the illumination light wavelengths of the illumination light bundles 3, 10, 14.
  • Fig. 2 shows an embodiment of an acousto-optical Strahlougers 1 in a microscope according to the invention with respect to a specific use in STED microscopy, with only the course of the illumination light, with which the sample 4 is applied, is located, but - for better clarity - not the course of the detection light.
  • the acousto-optic beam splitter 15 is used both two different (not shown here) optical fibers by means of fiber couplers, each having an element for changing the shape of the illuminating light focus, Abregungslichtbündel 19, 20 respectively the wavelength ⁇ and different linear polarization, as well as an excitation light beam 23 of wavelength ⁇ directed to an illumination beam path for illuminating a sample 4.
  • the piezo sound generator 21 of a first crystal 22 is acted upon by a high frequency wave of the frequency f1 and a high frequency wave of the frequency f2 and produces two mechanical waves (not shown) propagating through the first crystal 22 of one of the frequencies f1 and f2, respectively.
  • the excitation light beam 23 of wavelength ⁇ is coupled via the first crystal 22.
  • the excitation light beam 22 is diffracted and directed to a Beleuchtugsstrahlengang for illuminating a sample 4.
  • the coupling in via the first crystal 22 is of particular advantage because the excitation light reflected at the sample 4 diffuses out of the detection light both in the first crystal 22 with the mechanical wave propagating there frequency f2, and with a propagating in the second crystal 25 mechanical wave can be filtered out.
  • the first Abregungslichtbündel 19 with an out-of-phase linear polarization direction is also coupled via the first crystal 22 and by interaction with the mechanical wave, which is generated by the application of the piezoelectric sounder 21 with the high frequency wave of the frequency f1, diffracted and directed to the illumination beam path for illuminating the sample 4.
  • the first de-excitation light beam 19 and the excitation light beam 23 leave the crystal 22 collinearly united.
  • a piezo sound generator 24 of the second crystal 25 is acted on by a high frequency wave of the frequency f1 'and generates a mechanical wave (not shown) propagating through the second crystal 25 of a sound frequency corresponding to the frequency f1'.
  • the second excitation light beam 20 of the wavelength ⁇ which has a proper linear polarization direction with respect to the birefringence property of the second crystal 25, is diffracted and then propagates through the first crystal 22 undirected through the propagating mechanical waves of the first crystal 22 the second illumination light beam 20 experiences no obstruction by the mechanical waves propagating in the first crystal 22 because the Bragg condition for this light is not met.
  • the second Abregungsetterbündel 20, the first Abregungsetterbündel 19 and the excitation light beam 23 leave the crystal 22 collinear united and meet after passing through a beam deflector 16 (not shown in Figure 2) and the lens 2 (not shown in Figure 2) to the sample 4 to be illuminated ,
  • an element (not shown) for changing the shape of the illumination light focus of the de-excitation light beam 19 is provided in the beam path of the first deenergizing light bundle 19.
  • this element can have a phase filter or a gradient phase filter or a segment-phase filter or a switchable phase matrix, in particular an LCD matrix.
  • an annular focus in the sample 4 a so-called Dougnut focus, is generated, which coincides with the focus of the excitation light beam 19 in the xy plane, ie in a Plane perpendicular to the optical axis, overlaps to increase the resolution in the xy direction.
  • An annular focus can be achieved for example with a so-called. Vortex phase filter.
  • a further element (not shown) for changing the shape of the illumination light focus of the de-excitation light beam 20 is also arranged in the beam path of the second deenergizing light beam 20.
  • Double focus is generated, which overlaps with the focus of the excitation light beam 23 in the z-direction, preferably above and below the center of the focus of the excitation light beam 23, to cause an increase in resolution in the z-direction.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Mikroskop mit einem Objektiv, das Beleuchtungslicht zu einem Beleuchtungslichtfokus fokussiert, und mit einer Lichtleitfaser, die das Beleuchtungslicht transportiert und an deren Ende ein Faserkoppler angeordnet ist, der das Beleuchtungslicht aus der Lichtleitfaser auskoppelt und ein, vorzugsweise kollimiertes, Beleuchtungslichtbündel erzeugt. In oder an dem Faserkoppler ist ein Element zum Verändern der Form des Beleuchtungslichtfokus angeordnet, das relativ zu dem auszukoppelnden Beleuchtungslichtbündel vorjustiert ist.

Description

Mikroskop mit einem Element zum Verändern der Form des Beleuchtungslichtfokus
Die Erfindung betrifft ein Mikroskop mit einem Objektiv, das Beleuchtungslicht zu einem Beleuchtungslichtfokus fokussiert, und mit einer Lichtleitfaser, die das Beleuchtungslicht transportiert und an deren Ende ein Faserkoppler angeordnet ist, der das Beleuchtungslicht aus der Lichtleitfaser auskoppelt und ein, vorzugsweise kollimiertes, Beleuchtungslichtbündel erzeugt.
Beispielsweise in der konfokalen Scanmikroskopie wird ein zu untersuchendes Objekt mit dem Fokus wenigstens eines Beleuchtungslichtbündels, das häufig mit Hilfe einer Lichtleitfaser von einer Lichtquelle zum Ort der Einkopplung in den mikroskopischen Strahlengang transportiert wird, in drei Dimensionen abgetastet. Ein konfokales Scanmikroskop umfasst im Allgemeinen eine Lichtquelle, eine Fokussieroptik, mit der das Licht der Quelle auf eine Lochblende - die sog. Anregungsblende - fokussiert wird, einen Strahlteiler, eine Strahlablenkeinrichtung zur Strahlsteuerung, eine Mikroskopoptik, eine Detektionsblende und Detektoren zum Nachweis des Detektions- bzw. Fluoreszenzlichtes. Das Beleuchtungslicht wird beispielsweise über den Strahlteiler eingekoppelt.
Der Fokus eines solchen Beleuchtungslichtbündels kann beispielsweise mit Hilfe einer steuerbaren Strahlablenkeinrichtung, im Allgemeinen durch Verkippen zweier Spiegel, in einer Objektebene bewegt werden, wobei die Ablenkachsen meist senkrecht aufeinander stehen, so dass ein Spiegel in x-, der andere in y-Richtung ablenkt. Die Verkippung der Spiegel wird beispielsweise mit Hilfe von Galvanometer-Stellelementen bewerkstelligt. Die Leistung des vom Objekt kommenden Lichtes wird in Abhängigkeit von der Position des Abtaststrahles gemessen.
Das vom Objekt kommende Fluoreszenzlicht gelangt über die Strahlablenkeinrichtung zurück zum Strahlteiler, passiert diesen, um anschließend auf die Detektionsblende fokussiert zu werden, hinter der sich die Detektoren befinden. Detektionslicht, das nicht direkt aus der Fokusregion stammt, nimmt einen anderen Lichtweg und passiert die Detektionsblende nicht, so dass man eine Punktinformation erhält, die durch sequentielles Abtasten des Objekts in mehreren Ebenen zu einem dreidimensionalen Bild führt.
In einem Mikroskop, insbesondere in einem Scanmikroskop oder einen konfokalen Scanmikroskop, werden Proben häufig mit einem Beleuchtungslichtbündel beleuchtet, das durch Vereinigung mehrerer Beleuchtungslichtbündel erzeugt wurde, um das von der beleuchteten Probe emittierte Reflexions- oder Fluoreszenzlicht zu beobachten.
Zum Vereinigen von Lichtbündeln unterschiedlicher Wellenlänge werden in der Optik üblicherweise dichroitische Strahlteiler eingesetzt. Aus DE 196 33 185 A1 ist beispielsweise eine Punktlichtquelle für ein Laserscanmikroskop und ein Verfahren zum Einkoppeln des Lichtes von mindestens zwei Lasern unterschiedlicher Wellenlänge in ein Laserscanmikroskop bekannt. Die Punktlichtquelle ist modular ausgestaltet und beinhaltet einen dichroitischen Strahlvereiniger, der das Licht mindestens zweier Laserlichtquellen vereinigt und in eine zum Mikroskop führende Lichtleitfaser einkoppelt.
Das Auflösungsvermögen eines konfokalen Scanmikroskops ist unter anderem durch die Intensitätsverteilung und die räumliche Ausdehnung des Fokus des Anregungslichtbündels in der Probe gegeben. Wegen des Beugungslimits kann das Auflösungsvermögen durch stärkeres fokussieren nicht beliebig gesteigert werden. Üblicherweise ist der Fokus eines von einem Laser emittierte Beleuchtungslichtbündels rotationssymmetrisch in Bezug auf die optische Achse und hat eine gausssche Strahltaille, wobei die Lichtleistung ausgehend von der optische Achse nach außen hin abnimmt.
Eine Anordnung zur Steigerung des Auflösungsvermögens für Fluoreszenzanwendungen ist aus der WO 95/21393 A1 bekannt. In dieser Druckschrift ist offenbart, den lateralen Randbereich eines, wie oben beschriebenen, Fokusvolumens des Anregungslichtbündels mit den Foki mehrerer Abregungslichtbündel, die ebenfalls die oben beschriebene Form aufweisen, zu beleuchten, um dort eine induzierte Emission zu bewirken und dort die vom Anregungslichtbündel angeregten Probenbereiche stimuliert in den Grundzustand zurück zu bringen. Detektiert wird dann nur das spontan emittierte Licht aus den nicht von den Abregungslichtbündeln beleuchteten Bereichen, so daß insgesamt eine Auflösungsverbesserung erreicht wird. Für dieses Verfahren hat sich die Bezeichnung STED (Stimulated Emission Depletion) eingebürgert.
Die STED-Technologie wurde zwischenzeitlich weiterentwickelt. Zumeist wird anstelle der ungleichmäßigen Abregungslichtbeleuchtung mit den (herkömmlich geformeten) Foki mehrerer Abregungslichtbündel, das Abregungslicht zu einem innen hohlen Fokus geformt. Hierzu wird im Strahlengang des Abregungslichts ein Element zum Verändern der Form des Beleuchtungslichtfokus des Abregungslichtbündels angeordnet.
Beispielsweise kann dieses Element einen Phasenfilter oder einen Verlaufsphasenfilter oder einen Segmenphasentfilter oder eine schaltbare Phasenmatrix, insbesondere eine LCD- Matrix, aufweisen. Insbesondere kann vorgesehen sein, dass mit Hilfe des Elements zum Verändern der Form des Beleuchtungslichtfokus ein ringförmiger Fokus in der Probe, ein sog. Dougnut-Fokus, erzeugt wird, der mit dem Fokus des Anregungslichtbündels in der x-y- Ebene, also in einer Ebene senkrecht zur optischen Achse, überlappt, um eine Auflösungssteigerung in x-y-Richtung zu bewirken. Ein ringförmiger Fokus kann beispielsweise mit einem sog. Vortexphasenfilter erzielt werden.
Beispielsweise ist aus Klar et al. „Breaking Abbe 's diffraction resolution limit in fluorescence microscopy with stimulated emission depletion beams of various shapes", Physical rev. E Statistical Physics, Plasmas, Fluids and related interdisciplinary topics, American Institute Of Physics, New York, Ny, Bd. 64, Nr. 6, 26.1 1 .2001 , 066613-1 bis 066613-9, ein STED-Mikroskop mit speziellen Phasenfiltern bekannt.
Die bekannten Mikroskope weisen den Nachteil auf, dass sie hinsichtlich der Phasenfilter sehr genau justiert werden müssen, was sehr aufwendig ist. Darüber hinaus sind solche Mikroskope sehr anfällig gegen eine Dejustage der zumeist in separaten Haltern fixierten Phasenfilter, die sofort zu einem Verlust an Auflösungsvermögen führt.
Es ist daher die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Mikroskop anzugeben, bei dem diese Nachteile vermieden sind.
Die Aufgabe wird durch ein Mikroskop gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, dass in oder an dem Faserkoppler ein Element zum Verändern der Form des Beleuchtungslichtfokus angerodnet ist, das relativ zu dem auszukoppelnden Beleuchtungslichtbündel justiert ist.
Die Erfindung hat den Vorteil, dass ein aufwendiges Justieren des Elements zum Verändern der Form des Beleuchtungslichtfokus bei der Inbetriebnahme eines Mikroskops vollständig vermieden ist. Vielmehr muss auf Grund der Vorjustierung lediglich der Faserkoppler in seiner Sollposition positioniert und fixiert werden. Das Justieren des Faserkopplers ist jedoch einfach und schnell zu bewerkstelligen, weil der Strahlverlauf des ausgekoppelten Beleuchtungslichtbündels leicht nachverfolgt und im Fall einer Abweichung von einem Sollverlauf der Faserkoppler einfach nachjustiert werden kann. Wesentlich aufwendiger würde sich das Justieren des Elements zum Verändern der Form des Beleuchtungslichtfokus relativ zu dem auszukoppelnden Beleuchtungslichtbündel gestalten, weil eine Fehljustierung nicht mit einfachen Mitteln, insbesondere nicht durch bloßes Verfolgen des Strahlverlaufes, detektierbar wäre. In vorteilhafter Weise ist erfindungsgemäß jedoch dieses aufwendige Justieren des Elements zum Verändern der Form des Beleuchtungslichtfokus relativ zu dem auszukoppelnden Beleuchtungslichtbündel, vermieden.
Bei einer besonderen Ausführungsform ist das Element zum Verändern der Form des Beleuchtungslichtfokus an einem Gehäuse des Faserkopplers und/oder an einer Frontlinse des Faserkopplers angeordnet und/oder befestigt. Alternativ kann auch vorgesehen sein, dass das Element zum Verändern der Form des Beleuchtungslichtfokus in den Faserkoppler integriert ist und/oder in einem Gehäuse des Faserkopplers angeordnet ist.
Bei einer besonders vorteilhaften Ausführung ist wenigstens eine weitere Lichtleitfaser vorhanden, die weiteres Beleuchtungslicht transportiert, das von dem Objektiv zu einem weiteren Beleuchtungslichtfokus fokussiert wird, und an deren Ende ein weiterer Faserkoppler angeordnet ist, der das weitere Beleuchtungslicht aus der weiteren Lichtleitfaser auskoppelt und ein weiteres, vorzugsweise kollimiertes, Beleuchtungslichtbündel erzeugt. Insbesondere kann hierbei vorgesehen sein, dass in oder an dem weiteren Faserkoppler ein weiteres Element zum Verändern der Form des weiteren Beleuchtungslichtfokus angeordnet ist.
Vorzugsweise ist der Faserkoppler mit der Lichtleitfaser durch einen bajonettartige Steckverbindung verbunden. Es kann auch vorgesehen sein, dass der weitere Faserkoppler mit der weiteren Lichtleitfaser durch einen bajonettartige Steckverbindung verbunden ist. Eine solche Ausführung erleichtert das Austauschen von Komponenten beispielsweise im Reparaturfall.
Beispielsweise kann das Element zum Verändern der Form des Beleuchtungslichtfokus einen Phasenfilter oder einen Verlaufsphasenfilter oder einen Segmenphasentfilter oder eine schaltbare Phasenmatrix, insbesondere eine LCD-Matrix, aufweisen.
Zusätzlich zu dem Beleuchtungslichtbündel oder zu dem wenigstens einen weiteren Beleuchtungslichtbündel, das durch weitere Lichtleitfaser transportiert wurde, kann in vorteilhafter Weise vorgesehen sein, dass ein zusätzliches Beleuchtungslichtbündel, das keine Lichtleitfaser und/oder kein Element zum Verändern der Form des Beleuchtungslichtfokus durchläuft, in den Beleuchtungslichtstrahlengang eingekoppelt ist, so dass das Objektiv auch das zusätzliche Beleuchtungslichtbündel fokussiert.
Beispielsweise um eine Auflösungssteigerung zu erreichen, kann in vorteilhafter Weise vorgesehen sein, dass weingstens eines der Beleuchtungslichtbündel (Beleuchtungslichtbündel und/oder weiteres Beleuchtungslichtbündel und/oder zusätzliches Beleuchtungslichtbündel) dazu ausgebildet und bestimmt ist, in einer Probe eine Fluoreszenzanregung zu bewirken, während weingstens ein anderes der Beleuchtungslichtbündel dazu ausgebildet und bestimmt ist, in einer Probe eine stimmulierte Emission zu bewirken.
Ganz besonders vorteilhaft ist eine Ausführung, bei der wenigstens zwei der zuvor beschriebenen Beleuchtungslichtbündel, also insbesondere
a. das Beleuchtungslichtbündel und das weitere Beleuchtungslichtbündel oder b. das Beleuchtungslichtbündel und das zusätzliche Beleuchtungslichtbündel oder
c. das weitere Beleuchtungslichtbündel und das zusätzliche Beleuchtungslichtbündel oder
d. das Beleuchtungslichtbündel und das weitere Beleuchtungslichtbündel und das zusätzliche Beleuchtungslichtbündel,
in einen Strahlvereiniger eingekoppelt sind, den die eingekoppelten Beleuchtungslichtbündel kollinear vereinigt verlassen. Hierbei kann insbesondere vorgesehen sein, dass wenigstens ein erstes und ein zweites der Beleuchtungslichtbündel (Beleuchtungslichtbündel und/oder weiteres Beleuchtungslichtbündel und/oder zusätzliches Beleuchtungslichtbündel) dieselbe Beleuchtungslichtwellenlänge, jedoch eine unterschiedliche Polarisation, insbesondere Linearpolarisation, aufweisen.
Bei einer ganz besonders vorteilhaften Ausführung ist der Strahlvereiniger als akustooptischer Strahlvereiniger ausgebildet und derart aufgebaut und betrieben, dass durch Weichselwirkung mit wenigstens einer mechanischen Welle sowohl das erste Beleuchtungslichtbündel, als auch das zweite Beleuchtungslichtbündel gebeugt und dadurch auf eine gemeisame optische Achse gelenkt werden. Eine solche Ausführung hat den ganz besonderen Vorteil, dass einzelne Beleuchtungslichtkomponenten gezielt, je nach Anwendungsanforderung, unterbrochen oder wieder freigegeben oder hinsichtlich der Beleuchtungslichtleistung individuell und separat eingestellt werden können.
Eine solche Ausführung hat den ganz besonderen Vorteil, dass der akustooptische Strahlvereiniger sehr schnell, innerhalb von wenigen Mikrosekunden, geschaltet werden kann. Auf diese Weise kann ein Beleuchtungslichtbündel beispielsweise schnell unterbrochen oder wieder freigegeben werden. Auch die Möglichkeit eines schnellen Umschaltens zu anderen Wellenlängen ist oder anderen Wellenlängenkombinationen ist ein besonderer Vorteil einer solchen Ausführung.
Die Funktionsweise eines solchen akustooptischen Strahlvereinigers beruht im Wesentlichen auf der Wechselwirkung der eingekoppelten Beleuchtungslichtbündel mit einer mechanischen Welle oder mehreren mechanischen Wellen. Akustooptische Bauteile bestehen in der Regel aus einem sogenannten akustooptischen Kristall, an dem ein elektrischer Wandler (in der Literatur oft als Transducer bezeichnet) angebracht ist. Üblicherweise umfasst der Wandler ein piezoelektrisches Material sowie eine darüber liegende und eine darunter liegende Elektrode. Durch elektrisches Beschälten der Elektroden mit Radiofrequenzen, die typischer Weise im Bereich zwischen 30 MHz und 800 MHz liegen, wird das piezoelektrische Material zum Schwingen gebracht, so dass eine akustische Welle, d.h. eine Schallwelle, entstehen kann, die nach ihrer Entstehung den Kristall durchläuft. Meist wird die akustische Welle nach dem Durchlaufen eines optischen Wechselwirkungsgebiets an der gegenüberliegenden Kristallseite absorbiert oder wegreflektiert.
Akustooptische Kristalle zeichnen sich dadurch aus, dass die entstehende Schallwelle die optischen Eigenschaften des Kristalls verändert, wobei durch den Schall eine Art optisches Gitter oder eine vergleichbare optisch aktive Struktur, beispielsweise ein Hologramm, induziert wird. Durch den Kristall tretendes Licht erfährt an dem optischen Gitter eine Beugung. Entsprechend wird das Licht in verschiedenen Beugungsordnungen in Beugungsrichtungen gelenkt. Es gibt akustooptische Bauteile, die das gesamte einfallende Licht mehr oder weniger unabhängig von der Wellenlänge beeinflussen. Dazu sei lediglich beispielhaft auf Bauteile wie AOM, AOD und Frequenzschieber verwiesen. Außerdem gibt es auch bereits Bauteile, die beispielsweise abhängig von den eingestrahlten Radiofrequenzen selektiv auf einzelne Wellenlängen wirken (AOTFs). Häufig bestehen die akustooptischen Elemente aus doppelbrechenden Kristallen, wie beispielsweise Tellurdioxid, wobei insbesondere die Lage der Kristallachse relativ zur Einfallsrichtung des Lichts und seiner Polarisation die optische Wirkung des jeweiligen Elements bestimmt.
Insbesondere, wenn in dem akustooptischen Strahlvereiniger beispielsweise ein AOTF verwendet wird, muss die mechanische Welle eine ganz bestimmte Frequenz aufweisen, damit genau für das Licht der gewünschten Beleuchtungslichtwellenlänge und der gewünschten Polarisation die Bragg-Bedingung erfüllt ist. Licht, für das die Bragg-Bedingung nicht erfüllt ist, wird bei diesen akustooptischen Bauteilen durch die mechanische Welle nicht abgelenkt. Bei einer besonders einfachen Ausführung eines erfindungsgemäßen Mikroskops mit einem Strahlvereiniger, bei der dieser beispielsweise einen handelsüblichen AOTF beinhalten kann, weist der akustooptische Strahlvereiniger einen Kristall auf, durch den gleichzeitig eine erste und eine zweite mechansiche Welle unterschiedlicher Schallfrequenz propagieren, wobei der Kristall und die Ausbreitungsrichtung der mechanischen Wellen relativ zueinander und jeweils relativ zu den in den Kristall einfallenden Beleuchtungslichtbündeln derart ausgerichtet sind, dass an der ersten mechanischen Welle das erste Beleuchtungslichtbündel und an der zweiten mechanischen Welle das zweite Beleuchtungslichtbündel gebeugt und dadurch auf eine gemeinsame optische Achse gelenkt werden. Von besonderem Vorteil ist es hierbei, wenn das vereinigte Beleuchtungslichtbündel den Kristall durch eine senkrecht zur Ausbreitsungrichtung des Beleuchtungslichtbündels ausgerichtete Austrittsfläche verläßt. Bei einem Wechsel der Wellenlänge oder wenn das Beleuchtungslichtbündel mehrere Wellenlängen aufweist, kommt es nicht zu Richtungsänderungen bzw. zu einer räumlichen Aufspaltung des Beleuchtungslichtbündels.
Allerdings hat diese Ausführung den Nachteil, dass zum Ablenken von zwei Beleuchtungslichtbündeln, die zwar dieselbe Wellenlänge, jedoch unterschiedliche Polarisation aufweisen, zwei verschiedene mechanische Wellen erzeugt werden müssen. Insoweit muss der Erzeuger für die mechanischen Wellen, beispielweise ein an dem Kristall angeortnetes Piezo-Element, gleichzeitig mit zwei unterschiedlichen elektromagnetischen HF-Wellen beaufschlagt werden. Hierdurch wird, in nachteiliger weise, die doppelte Menge an Wärmeleistung in den Kristall bzw. die Kristalle eingetragen, was letztlich die Beugungseffizienz reduziert und dazu führt, dass durch die unvermeidbaren Temperaturschwankungen auch die Ablenkungsrichtungen und damit die Lichtleistungen des an der Probe und am Detektor ankommenden Lichtes schwanken. Außerdem kann es, wenn die Frequenzbereiche der mechansichen Wellen überlappen, zu Schwebungen kommen, was letztlich zu periodischen Schwankungen der Lichtleistung des an der Probe und/oder am Detektor ankommenden Lichtes führt. Dieses Problem basiert insbesondere auf der Tatsache, dass die mechanischen Wellen naturgemäß keine unendlich schmale, also singuläre, Schallfrequenz aufweisen können, sondern vielmehr immer ein Frequenzbereich um eine Mittenfrequenz vorhanden sein muss.
Bei einer ganz besonders vorteilhaften Ausführung wird daher kein handelsüblicher AOTF verwendet. Vielmehr weist der akustooptische Strahlvereiniger einen Kristall auf, durch den eine mechanische Welle einer der Wellenlänge des ersten und des zweiten Beleuchtungslichtbündels zugeordneten Schallfrequenz propagiert, wobei der Kristall und die Ausbreitungsrichtung der mechanischen Welle relativ zueinander und jeweils relativ zu den in den Kristall einfallenden Beleuchtungslichtbündeln derart ausgerichtet sind, dass an der mechansichen Welle sowohl das erste Beleuchtungslichtbündel, als auch das zweite Beleuchtungslichtbündel gebeugt und dadurch auf eine gemeisame optische Achse gelenkt werden.
Hierbei kann insbesondere vorgesehen sein, dass das erste Beleuchtungslichtbündel linear polarisiert ist und eine Linearpolarisationsrichtung aufweist, die die Linearpolarisationsrichtung des ordentlichen Lichtes bezogen auf eine Doppelbrechungseigenschaft des Kristalles ist und/oder dass das zweite Beleuchtungslichtbündel linear polarisiert ist und eine Linearpolarisationsrichtung aufweist, die die Linearpolarisationsrichtung des außerordentlichen Lichtes bezogen auf eine Doppelbrechungseigenschaft des Kristalles ist. Insbesondere kann auch vorgesehen sein, dass die Linearpolarisationsrichtung des ersten Beleuchtungslichtbündels oder die Linearpolarisationsrichtung des zweiten Beleuchtungslichtbündels in der Ebene angeordnet ist, die von der Ausbreitungsrichtung der mechanischen Welle und der Ausbreitungsrichtung des Detektionslichtbündels aufgespannt ist.
Die konkrete Ausgestaltung eines solchen akustooptischen Strahlvereinigers, insbesondere die Ausrichtung des Kristalls relativ zur Ausbreitungsrichtung der mechanischen Welle(n) und der Ausbreitungsrichtung der Beleuchtungslichtbündel, sowie die Ausrichtung der mechanischen Welle und der Beleuchtungsslichtbündel relativ zueinander, und auch die Ausrichtung der Ein- und Austrittsflächen zueinander und zur optischen Achse des Kristalls kann beispielsweise nach dem nachfolgend geschilderten, iterativen Verfahren entwickelt werden, wobei das Verfahren vorzugsweise nicht an Hand von realen Bauteilen, was allerdings auch möglich wäre, sondern in einer Computersimulation nachvollzogen wird, bis die einzelnen Parameter der Kristallform, der Ausrichtung der Flächen und des Kristallgitters, die Ausrichtung der Ausbreitungsrichtung der mechanischen Welle(n) und die Ausbreitungsrichtungen der Beleuchtungslichtbündel den gewünschten Anforderungen entsprechen. Wenn in einer Computersimulation sämtliche relevante Parameter auf diese Weise ermittelt wurden, kann der Kristall anschließend in einem weiteren Schritt hergestellt werden.
Hierbei kann beispielsweise zunächst von der Ausführung ausgegangen werden, die weiter oben beschrieben ist und bei der der akustooptische Strahlvereiniger einen handelsüblichen Kristall aufweist, durch den eigentlich gleichzeitig eine erste und eine zweite mechanische Welle unterschiedlicher Schallfrequenz propagieren müssten, um sowohl das erste Beleuchtungslichtbündel, als auch das zweite Beleuchtungslichtbündel auf eine gemeisame optische Achse zu lenken.
Für das Iterationsverfahren wird der umgekehrte Lichtweg betrachtet und auf dem umgekehrten Lichtweg das erste und das zweite Beleuchtungslichtbündel kollinear durch die - vorzugsweise senkrecht ausgerichtete - Austrittsfläche in den Kristall eingekoppelt, aber lediglich die erste der mechanischen Wellen in dem Kristall erzeugt. Dies hat zur Folge, dass lediglich das erste Beleuchtungslichtbündel an der mechanischen Welle gebeugt wird, während das zweite Lichtbündel, das zwar dieselbe Wellenlänge, jedoch die andere Linearpolarisationsrichtung aufweist, den Kristall unabgelenkt durchläuft. Anschließend wird der Kristall vorzugsweise in der Ebene, die durch das einfallende kollineare Beleuchtungslichtbündel und die Ausbreitungsrichtung der mechanischen Welle aufgespannt ist, so weit gedreht und damit auch die Winkel zwischen der Ausbreitungsrichtung der mechanischen Welle und den Kristallachsen verändert, bis mit der mechanischen Welle beide Beleuchtungslichtbündel beider Linearpolarisationsanteile abgelenkt werden.
Allerdings hat die Drehung in der Regel zur Folge, dass die Austrittsfläche nicht mehr senkrecht zum einfallenden kollinearen Beleuchtungslichtbündel steht. Aus diesem Grund wird nun in einem nächsten Iterationsschritt - ohne den Kristall zu drehen - die Form des Kristalls derart geändert, dass die Austrittsfläche wieder senkrecht zum einfallenden kollinearen Beleuchtungslichtbündel steht.
Allerdings haben die Änderungen an der Kristallform in der Regel zur Folge, dass mit der mechanischen Welle nicht mehr jeweils beide Linearpolarisationsanteile der Beleuchtungslichtwellenlänge abgelenkt werden. Aus diesem Grund wird der Kristall nun wieder gedreht, bis diese Bedingung wieder erfüllt ist. Dann werden die bereits beschriebenen, weiteren Iterationsschritte wiederholt.
Es werden so viele Iterationszyklen durchgeführt, bis die Bedingung einer gleichzeitigen Ablenkung beider Linearpolarisationsanteile und die Bedingung eines kollinearen Lichtaustritts erfüllt sind. In der Regel konvergiert das Verfahren sehr schnell, so dass nach wenigen Iterationszyklen das Ziel erreicht ist.
Bei einer besonderen Ausführung wird beim Drehen des Kristalls jeweils darauf geachtet, dass in Bezug auf eine der Linearpolarisationsrichtungen des umgekehrt verlaufenden Beleuchtungslichts das gesamte, in die erste Ordnung gebeugte Licht, das die Beleuchtungslichtwellenlängen aufweist, kollinear aus dem Kristall austritt. Eine solche Ausführung hat nicht nur den Vorteil, dass jeweils mit einer einzigen mechanischen Welle jeweils beide Anteile unterschiedlicher Linearpolarisation ablenkt, sondern auch, dass zusätzlich über den Lichtweg der ersten Beugungsordnung, bei der die oben beschriebene Kollinearität besteht, mehrfarbiges, kollinear einfallendes Beleuchtungslicht kollinear auf ein Beleuchtungslichtstrahlengang gebeugt werden kann. Für dieses Bleuchtungslicht bedarf es vorteilhafter Weise keiner Kompensation räumlicher Aufspaltungen, weil es diese für dieses Bleuchtungslicht nicht gibt.
Bei einer solchen Ausführung kann beispielsweise vorgesehen sein, dass der Kristall oder der zweite Kristall eine Eintrittsfläche für Primärlicht mehrerer Wellenlängen und eine Austrittsfläche für das auf die gemeinsame optische Achse gelenkte Beleuchtungslichtbündel aufweist, wobei die Eintrittsfläche und die Austrittsfläche derart zueinander ausgerichtet sind, dass das Primärlicht als kollineares Beleuchtungslichtbündel in den Kristall einkoppelbar ist und das auf die gemeinsame optische Achse gelenkte Beleuchtungslichtbündel den Kristall als kollineares Beleuchtungslichtbündel verlässt.
Bei einer vorteilhaften Ausführung ist vorgesehen, dass durch den Kristall weingstens ein weiteres Beleuchtungslichtbündel, das nicht die Wellenlänge des ersten und zweiten Beleuchtungslichtbündels aufweist und das nicht an der mechanischen Welle gebeugt wird, verläuft und gemeinsam mit dem ersten und dem zweiten Beleuchtungslichtbündel auf die gemeinsame optische Achse gelangt. Eine solche Ausführung erlaubt insbesondere das Hinteranderschalten meherer akustooptischer Bauteile, was nachfolgend im Detail beschrieben ist.
Beispielsweise kann vorgesehen sein, dass das weitere Beleuchtungslichtbündel von einem zweiten Kristall ausgeht, in dem eine zweite mechanische Welle propagiert, die eine der Wellenlänge des weitern Beleuchtungslichtbündels zugeordnete Schallfrequenz aufweist, wobei das weitere Beleuchtungslichtbündel ein drittes Beleuchtungslichtbündel der weiteren Beleuchtungslichtwellenlänge beinhaltet, das von der zweiten mechanischen Welle gebeugt wurde oder dass das weitere Beleuchtungslichtbündel ein drittes und ein viertes Beleuchtungslichtbündel der weiteren Beleuchtungslichtwellenlänge, jedoch unterschiedlicher Polarisation, insbesondere Linearpolarisation, beinhaltet, die von der zweiten mechanischen Welle gebeugt wurden. Zur Realisierung der letztgenannten Variante sollte der zweite Kristall vorzugsweise so aufgebaut sein, dass er, wie oben ausführlich geschildert, das Beleuchtungslicht der weiteren Wellenlänge unabhängig von dessen Polarisation ablenkt. Wie bereits angesprochen kann vorteilhaft vorgesehen sein, dass die zuvor geschilderten Prinzipien gleichzeitig mehrfach angewendet werden, indem in wenigstens einem Kristall mehrere mechanische Wellen unterschiedlicher Frequenzen für Beleuchtungslicht unterschiedlicher Wellenlängen erzeugt werden.
Beispielsweise kann vorgesehen sein, dass in dem Kristall oder in dem zweiten Kristall simultan wenigstens eine zusätzliche mechanische Welle propagiert, die eine, einer zusätzlichen Wellenlänge zugordnete andere Schallfrequenz aufweist, wobei an der zusätzlichen mechanischen Welle wenigstens ein zusätzliches Beleuchtungslichtbündel, das die andere Wellenlänge aufweist, gebeugt und dadurch auf die gemeisame optische Achse gelenkt wird, und/oder wobei an der zusätzlichen mechanischen Welle zwei zusätzliche Beleuchtungslichtbündel, die die andere Wellenlänge und eine voneinander verschiedene Polarisation, insbesondere Linearpolarisation, aufweisen, gebeugt und dadurch auf die gemeisame optische Achse gelenkt werden.
Bei einer besonderen Ausführung weist der akustooptische Strahlvereiniger wenigstens ein dispersives optisches Bauteil auf, das eine (wenigstens teilweise) von dem Kristall oder dem zweiten Kristall hervorgerufene räumliche, spektrale Aufspaltung kompensiert. Hierbei kann es sich beispielsweise um eine Aufspaltung eines Beleuchtungslichtbündels, das Licht mehrerer Wellenlängen beinhaltet, handeln. Es kann jedoch auch vorgesehen sein, dass das dispersive optische Bauteil - auch zusätzlich zu einer Kompensation einer Aufspaltung von Beleuchtunglicht - eine räumlich spektrale Aufspaltung von Detektionslicht kompensiert.
Das dispersive optisches Bauteil kann so angeordnet sein, dass es eine bereits erfolgte räumlich spektrale Aufspaltung wieder rückgängig macht. Die Kompensation kann aber auch in der Weise erfolgen, dass das dispersive optische Bauteil eine räumlich spektrale Aufspaltung verursacht, die von dem Kristall oder dem zweiten Kristall rückgängig gemacht wird.
Der akustooptische Strahlvereiniger kann in ganz besonders vorteilhafter Weise das Licht mehrerer Primärlichtquellen empfangen, deren Beleuchtungslichtbüdel, ggf. nach einer Wellenlängenselektion, der akustooptische Strahlvereiniger vereinigt.
Es ist auch möglich, dass wenigstens eine der Primärlichtquellen unpolarisiertes Primärlicht, insbesondere Weißlicht, erzeugt. Eine solche Lichtquelle kann beispielsweise einen Polarisationsstrahlteiler aufweisen, der das unpolarisierte Primärlicht empfängt und räumlich, in Abhängigkeit von der Linearpolarisationsrichtung aufspaltet, so dass die entstehenden Beleuchtungslichtstrahlenbündel über unterschiedliche Eingänge eines Kristalls oder mehrerer Kristalle der Wirkung der mechanischen Welle bzw. der Wirkung der mechanischen Wellen ausgesetzt werden können. Auf diese Weise kann ganz gezielt und äußerst flexibel umschaltbar Beleuchtungslicht einer oder mehrerer Wellenlängen ausgewählt und kollinear auf einen Beleuchtungsstrahlengang zur Beleuchtung einer Probe gelenkt werden; dies ohne, dass von dem unpolarisierten Primärlicht - abgesehen von den üblichen Verlusten bein Ein- und Auskoppeln aus optischen Bauteilen - etwas der Lichtintensität verloren geht. Insbesondere muss nicht grundsätzlich auf das Licht einer Linearpolarisationsrichtung gänzlich verzichtet werden.
In vorteilhafter Weise kann vorgesehen sein, dass der Strahlvereiniger als Hauptstrahlteiler fungiert, der Beleuchtungslicht auf einen Beleuchtungslichtstrahlengang zur Beleuchtung einer Probe lenkt und der von der Probe ausgehendes Detektionslicht auf einen Detektionsstrahlengang mit einem Detektor lenkt.
Bei einer besonderen Ausführung wird aus einem von einer Probe kommenden Detektionslichtbündel durch Wechselwirkung mit der mechanischen Welle des Kristalls sowohl ein die Beleuchtungslichtwellenlänge und eine erste Linearpolarisationsrichtung aufweisender Anteil des Detektionslichtbündes, als auch ein die Beleuchtungslichtwellenlänge und eine zweite, zur ersten Linearpolarisationsrichtung senkrechte Linearpolarisationsrichtung aufweisender Anteil des Detektionslichtes abgelenkt - und dadurch aus dem Detektionslichtbündel entfernt. Alternativ oder zusätzlich kann auch vorgesehen sein, dass aus einem von einer Probe kommenden Detektionslichtbündel durch Wechselwirkung mit der mechanischen Welle des zweiten Kristalls sowohl ein die weitere Beleuchtungslichtwellenlänge und eine erste Linearpolarisationsrichtung aufweisender Anteil des Detektionslichtbündes, als auch ein die weitere Beleuchtungslichtwellenlänge und eine zweite, zur ersten Linearpolarisationsrichtung senkrechte Linearpolarisationsrichtung aufweisender Anteil des Detektionslichtes abgelenkt - und dadurch aus dem Detektionslichtbündel entfernt werden.
Alternativ oder zusätzlich ist es auch möglich, dass der Kristall und die Ausbreitungsrichtung der mechanischen Welle relativ zueinander und jeweils relativ zu dem in den Kristall einfallenden Detektionslichtbündel derart ausgerichtet sind, dass der akustooptische Strahlvereiniger mit der mechanischen Welle sowohl den die Beleuchtungslichtwellenlänge und eine erste Linearpolarisationsrichtung aufweisenden Anteil des Detektionslichtbündels, als auch den die Beleuchtungslichtwellenlänge und eine zweite, zur ersten Linearpolarisationsrichtung senkrechten Linearpolarisationsrichtung aufweisenden Anteil des Detektionslichtbündels ablenkt und dadurch aus dem Detektionslichtbündel entfernt, und/oder dass der zweite Kristall und die Ausbreitungsrichtung der zweiten mechanischen Welle relativ zueinander und jeweils relativ zu dem in den zweiten Kristall einfallenden Detektionslichtbündel derart ausgerichtet sind, dass der akustooptische Strahlvereiniger mit der zweiten mechanischen Welle sowohl den die weitere Beleuchtungslichtwellenlänge und eine erste Linearpolarisationsrichtung aufweisenden Anteil des Detektionslichtbündels, als auch den die weitere Beleuchtungslichtwellenlänge und eine zweite, zur ersten Linearpolarisationsrichtung senkrechten Linearpolarisationsrichtung aufweisenden Anteil des Detektionslichtbündels ablenkt und dadurch aus dem Detektionslichtbündel entfernt.
Wie bereits analog in Bezug auf eine Hintereinanderschaltung der Kristalle angesprochen, kann in vorteilhafter Weise vorgesehen sein, dass das Detektionslichtbündel zuerst den Kristall und anschließend den zweiten Kristall durchläuft.
Unabhängig von der speziellen Ausführung des akustooptischen Strahlvereinigers, jedoch insbesondere bei einem akustooptischen Strahlvereiniger, bei dem eine mechanische Welle auf die Lichtanteile einer Beleuchtungslichtwellenlänge und beider Linearpolarisationsrichtungen wirkt, kann vorteilhaft vorgesehen sein, dass die strahlführenden Komponenten des Strahlvereinigers derart angeordnet und ausgebildet sind, dass der verbliebene Teil des Detektionslichtbündels den akustooptischen Strahlvereiniger kollinear verlässt. Auf diese Weise kann das Detektionslichtbündels einfach einem Detektor, beispielsweise einem Multibanddetektor, zugeleitet werden. Das erfindungsgemäße Mikroskop kann vorteilhaft als Scanmikroskop oder konfokales Scanmikroskop oder als höchstauflösendes Scanmikroskop oder als STED-Mikroskop ausgebildet sein.
Besonders vorteilhaft ist die Verwendung des erfindungsgemäßen Mikroskops zur Untersuchung einer Probe in der STED-Mikroskopie (Stimulated Emission Depletion) oder in der CARS-Mikroskopie (Coherent Anti Stokes Raman Spectroscopy) oder in der SRS- Mikroskopie (Stimulated Raman Scattering) oder in der CSRS-Mikroskopie (Coherent Stokes Raman Scattering) oder in der Rikes-Mikroskopie (Raman induced Kerr-Effect Scattering).
In der Zeichnung ist der Erfindungsgegenstand schematisch dargestellt und wird anhand der Figuren nachfolgend beschrieben, wobei gleich wirkende Elemente mit denselben Bezugszeichen versehen sind. Dabei zeigen:
Fig. 1 schematisch ein Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Mikroskops mit einem akustooptischen Strahlvereinger, der als Hauptstrahlteiler fungiert und
Fig. 2 ein Ausführungsbeispiel eines akustooptischen Strahlvereingers in einem erfindungsgemäßen Mikroskop.
Fig. 1 zeigt schematisch ein Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Mikroskops mit einem akustooptischen Strahlvereiniger 1 , der als Hauptstrahlteiler fungiert. Das Mikroskop weist ein Objektiv 2 auf, das Beleuchtungslicht zu einem Beleuchtungslichtfokus in einer Probe 4 fokussiert, und mit einer Lichtleitfaser 5, die das von einer nicht dargestellten Lichtquelle kommende Beleuchtungslicht transportiert und an deren Ende ein Faserkoppler 6 angeordnet ist, der das Beleuchtungslicht aus der Lichtleitfaser auskoppelt und ein, vorzugsweise kollimiertes, Beleuchtungslichtbündel 3 erzeugt. An dem Faserkoppler 6 ist ein Element 7 zum Verändern der Form des Beleuchtungslichtfokus, beispielsweise ein Phasenverlaufsfilter, angerodnet, das relativ zu dem auszukoppelnden Beleuchtungslichtbündel 3 vorjustiert ist.
Es ist eine weitere Lichtleitfaser 8 vorhanden, die weiteres Beleuchtungslicht transportiert, das von dem Objektiv 2 zu einem weiteren Beleuchtungslichtfokus fokussiert wird, und an deren Ende ein weiterer Faserkoppler 9 angeordnet ist, der das weitere Beleuchtungslicht aus der weiteren Lichtleitfaser 8 auskoppelt und ein weiteres Beleuchtungslichtbündel 10 erzeugt. An dem weiteren Faserkoppler 9 ist ein weiteres Element 1 1 zum Verändern der Form des weiteren Beleuchtungslichtfokus angerodnet.
Außerdem ist eine dritte Lichtleitfaser 12 vorhanden, die drittes Beleuchtungslicht transportiert, das von dem Objektiv 2 zu einem weiteren Beleuchtungslichtfokus fokussiert wird, und an deren Ende ein weiterer Faserkoppler 13 angeordnet ist, der das dritte Beleuchtungslicht aus der weiteren Lichtleitfaser 8 auskoppelt und ein drittes Beleuchtungslichtbündel 14 erzeugt. An dem weiteren Faserkoppler 9 ist ein drittes Element 15 zum Verändern der Form des weiteren Beleuchtungslichtfokus angeordnet.
Das aus der Lichtleitfaser 5 ausgekoppelte Beleuchtungslichtbündel 3, das aus der weiteren Lichtleitfaser 8 ausgekoppelte weitere Beleuchtungslichtbündel 10 und das aus der dritten Lichtleitfaser 12 ausgekoppelte dritte Beleuchtungslichtbündel 14 sind in einen akustooptischen Strahlvereiniger 1 eingekoppelt, den die eingekoppelten Beleuchtungslichtbündel 3, 10, 14 kollinear vereinigt verlassen. Hierbei kann insbesondere vorgesehen sein, dass wenigstens zwei der Beleuchtungslichtbündel 3, 10, 14 dieselbe Beleuchtungslichtwellenlänge, jedoch eine unterschiedliche Polarisation, insbesondere Linearpolarisation, aufweisen.
In dem akustooptischen Strahlvereiniger 1 werden durch Weichselwirkung mit mechanischen Wellen sowohl die Beleuchtungslichtbündel 3, 10, 14 gebeugt und dadurch auf eine gemeisame optische Achse gelenkt. Eine solche Ausführung hat den ganz besonderen Vorteil, dass einzelne Beleuchtungslichtkomponenten gezielt, je nach Anwendungsanforderung, unterbrochen oder wieder freigegeben oder hinsichtlich der Beleuchtungslichtleistung individuell und separat eingestellt werden können. Auch die Möglichkeit eines schnellen Umschaltens zu anderen Wellenlängen ist oder anderen Wellenlängenkombinationen ist möglich.
Die kollinear vereinigten Beleuchtungslichtbündel 3, 10, 14 gelangen über eine Strahlablenkeinrichtung 16 und das Objektiv 2 zu der zu beleuchtenden Probe 4.
Das von der Probe 4 ausgehende Detektionslicht 17 gelangt auf dem umgekehrten Lichtweg zurück zum akustooptischen Strahlvereiniger 1 . Der akustooptische Strahlvereiniger 1 fungiert als Hauptstrahlteiler, der (wie bereits beschrieben) Beleuchtungslicht auf einen Beleuchtungslichtstrahlengang zur Beleuchtung einer Probe 4 lenkt und der von der Probe 4 ausgehendes Detektionslicht 17 zu einen Detektionsstrahlengang mit einem Detektor 18 passieren lässt. Hierbei entfernt dieser durch Wechselwirkung mit den mechanischen Wellen aus dem Detektionslicht 17 die Anteile, die die Beleuchtungslichtwellenlängen der Beleuchtungslichtbündel 3, 10, 14 aufweisen.
Fig. 2 zeigt ein Ausführungsbeispiel eines akustooptischen Strahlvereingers 1 in einem erfindungsgemäßen Mikroskop in Bezug auf eine spezielle Verwendungsmöglichkeit in der STED-Mikroskopie, wobei lediglich der Verlauf des Beleuchtungslichtes, mit dem die Probe 4 beaufschlagt wird, eingezeichnet ist, jedoch - der besseren Übersichtlichkeit halber - nicht der Verlauf des Detektionslichtes.
Bei dem in Fig. 2 dargestellten Ausführungsbeispiel wird der akustooptische Strahlteiler 15 dazu genutzt, sowohl zwei, aus unterschiedlichen (hier nicht dargestellten) Lichtleitfasern mit Hilfe von Faserkopplern, die jeweils ein Element zum Verändern der Form des Beleuchtungslichtfokus aufweisen, kommenden Abregungslichtbündel 19, 20 jeweils der Wellenlänge λύβρ und unterschiedlicher Linearpolarisation, als auch ein Anregungslichtbündel 23 der Wellenlänge λβχο auf einen Beleuchtungsstrahlengang zur Beleuchtung einer Probe 4 zu lenken.
Der Piezo-Schallerzeuger 21 eines ersten Kristalls 22 ist mit einer Hochfrequenzwelle der Frequenz f1 und mit einer Hochfrequenzwelle der Frequenz f2 beaufschlagt und erzeugt zwei durch den ersten Kristall 22 propagierende (nicht dargestellte) mechanische Wellen jeweils einer der Frequenzen f1 und f2 entsprechenden Schallfrequenz.
Das Anregungslichtbündel 23 der Wellenlänge λβχο wird über den ersten Kristall 22 eingekoppelt. Durch Wechselwirkung mit der mechanischen Welle, die durch die Beaufschlagung des Piezo-Schallerzeugers 21 des ersten Kristalls 22 mit der Hochfrequenzwelle der Frequenz f2 erzeugt ist, wird das Anregungslichtbündel 22 gebeugt und auf einen Beleuchtugsstrahlengang zur Beleuchtung einer Probe 4 gelenkt. Die Einkopplung über den ersten Kristall 22 ist von besonderem Vorteil, weil das an der Probe 4 reflektierte Anregungslicht sowohl im ersten Kristall 22 mit der dort propagierenden mechansichen Welle der Frequenz f2, als auch mit einer in dem zweiten Kristall 25 propagierenden mechanischen Welle aus dem Detektionslicht herausgefiltert werden kann.
Das erste Abregungslichtbündel 19 mit außerordnetlicher Linearpolarisationsrichtung wird ebenfalls über den ersten Kristall 22 eingekoppelt und durch Wechselwirkung mit der mechanischen Welle, die durch die Beaufschlagung des Piezo-Schallerzeugers 21 mit der Hochfrequenzwelle der Frequenz f1 erzeugt ist, gebeugt und auf den Beleuchtungsstrahlengang zur Beleuchtung der Probe 4 gelenkt. Das erste Abregungslichtbündel 19 und das Anregungslichtbündel 23 verlassen den Kristall 22 kollinear vereinigt.
Ein Piezo-Schallerzeuger 24 des zweiten Kristalls 25 ist mit einer Hochfrequenzwelle der Frequenz f1 ' beaufschlagt und erzeugt eine durch den zweiten Kristall 25 propagierende (nicht dargestellte) mechanische Welle einer der Frequenz f1 ' entsprechenden Schallfrequenz. Durch Wechselwirkung mit dieser mechanischen Welle wird das zweite Abregungslichtbündel 20 der Wellenlänge λύβρ, das eine ordentliche Linearpolarisationsrichtung bezogen auf die Doppelbrechungseigenschaft des zweiten Kristalls 25 aufweist, gebeugt und verläuft anschließend durch die dort propagierenden mechanischen Wellen des ersten Kristalls 22 unabgelenkt durch den ersten Kristall 22 auf den Beleuchtungsstrahlengang und gelangt schließlich zur Probe 4. Das zweite Abregungslichtbündel 20 erfährt durch die in dem ersten Kristall 22 propagierenden mechanischen Wellen keine Abkenkung, weil die Bragg-Bedingung für dieses Licht nicht erfüllt ist. Das zweite Abregungslichtbündel 20, das erste Abregungslichtbündel 19 und das Anregungslichtbündel 23 verlassen den Kristall 22 kollinear vereinigt und treffen nach Durchlaufen einer Strahlablenkeinrichtung 16 (in Figur 2 nicht eingezeichnet) und des Objektivs 2 (in Figur 2 nicht eingezeichnet) zu der zu beleuchtenden Probe 4.
In dem Strahlengang des ersten Abregungslichtbündels 19 ist, wie bereits erwähnt, ein (nicht dargestelltes) Element zum Verändern der Form des Beleuchtungslichtfokus des Abregungslichtbündels 19 vorgesehen. Beispielsweise kann dieses Element einen Phasenfilter oder einen Verlaufsphasenfilter oder einen Segmenphasentfilter oder eine schaltbare Phasenmatrix, insbesondere eine LCD-Matrix, aufweisen. Insbesondere kann vorgesehen sein, dass mit Hilfe des Elements zum Verändern der Form des Beleuchtungslichtfokus ein ringförmiger Fokus in der Probe 4, ein sog. Dougnut-Fokus, erzeugt wird, der mit dem Fokus des Anregungslichtbündels 19 in der x-y-Ebene, also in einer Ebene senkrecht zur optischen Achse, überlappt, um eine Auflösungssteigerung in x- y-Richtung zu bewirken. Ein ringförmiger Fokus kann beispielsweise mit einem sog. Vortexphasenfilter erzielt werden.
In dem Strahlengang des zweiten Abregungslichtbündels 20 ist ebenfalls ein (nicht dargestelltes) weiteres Element zum Verändern der Form des Beleuchtungslichtfokus des Abregungslichtbündels 20 angeordnet. Insbesondere kann vorgesehen sein, dass mit Hilfe des weiteren Elements zum Verändern der Form des Beleuchtungslichtfokus ein Doppelfokus erzeugt wird, der mit dem Fokus des Anregungslichtbündels 23 in z-Richtung, vorzugsweise oberhalb und unterhalb der Mitte des Fokus des Anregungslichtbündels 23, überlappt, um eine Auflösungssteigerung in z-Richtung zu bewirken.
Die Erfindung wurde in Bezug auf eine besondere Ausführungsform beschrieben, wobei für gleiche oder gleichwirkende Bauteile zumeist dieselben Bezugszeichen verwendet sind. Es ist jedoch selbstverständlich, dass Änderungen und Abwandlungen durchgeführt werden können, ohne dabei den Schutzbereich der nachstehenden Ansprüche zu verlassen.

Claims

Patentansprüche
1 . Mikroskop mit einem Objektiv, das Beleuchtungslicht zu einem
Beleuchtungslichtfokus fokussiert, und mit einer Lichtleitfaser, die das Beleuchtungslicht transportiert und an deren Ende ein Faserkoppler angeordnet ist, der das Beleuchtungslicht aus der Lichtleitfaser auskoppelt und ein, vorzugsweise kollimiertes, Beleuchtungslichtbündel erzeugt, dadurch gekennzeichnet, daß in oder an dem Faserkoppler ein Element zum
Verändern der Form des Beleuchtungslichtfokus angerodnet ist, das relativ zu dem auszukoppelnden Beleuchtungslichtbündel justiert ist.
2. Mikroskop nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das Element zum Verändern der Form des Beleuchtungslichtfokus an einem Gehäuse des Faserkopplers und/oder an einer Frontlinse des Faserkopplers angeordnet und/oder befestigt ist.
3. Mikroskop nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das Element zum Verändern der Form des Beleuchtungslichtfokus in den Faserkoppler integriert ist und/oder in einem Gehäuse des Faserkopplers angeordnet ist.
4. Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens eine weitere Lichtleitfaser vorhanden ist, die weiteres Beleuchtungslicht transportiert, das von dem Objektiv zu einem weiteren Beleuchtungslichtfokus fokussiert wird, und an deren Ende ein weiterer Faserkoppler angeordnet ist, der das weitere
Beleuchtungslicht aus der weiteren Lichtleitfaser auskoppelt und ein weiteres, vorzugsweise kollimiertes, Beleuchtungslichtbündel erzeugt.
5. Mikroskop nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass in oder an dem weiteren Faserkoppler ein weiteres Element zum Verändern der Form des weiteren
Beleuchtungslichtfokus angeordnet ist.
6. Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Faserkoppler mit der Lichtleitfaser durch eine bajonettartige Steckverbindung verbunden ist und/oder dass der weitere Faserkoppler mit der weiteren Lichtleitfaser durch eine
bajonettartige Steckverbindung verbunden ist.
7. Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Element zum Verändern der Form des Beleuchtungslichtfokus einen Phasenfilter oder einen Verlaufsphasenfilter oder einen Segmenphasentfilter oder eine schaltbare Phasenmatrix, insbesondere eine LCD-Matrix, aufweist.
8. Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Objektiv ein zusätzliches Beleuchtungslichtbündel, das keine Lichtleitfaser und/oder kein Element zum Verändern der Form des Beleuchtungslichtfokus durchläuft, fokussiert.
9. Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass weingstens eines der Beleuchtungslichtbündel (Beleuchtungslichtbündel und/oder weiteres Beleuchtungslichtbündel und/oder zusätzliches Beleuchtungslichtbündel) dazu ausgebildet und bestimmt ist, in einer Probe eine Fluoreszenzanregung zu bewirken, während
wenigstens ein anderes der Beleuchtungslichtbündel dazu ausgebildet und bestimmt ist, in einer Probe eine stimmulierte Emission zu bewirken.
10. Mikroskop nach einem der Ansprüche 4 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass a. das Beleuchtungslichtbündel und das weitere Beleuchtungslichtbündel oder b. das Beleuchtungslichtbündel und das zusätzliche Beleuchtungslichtbündel oder c. das weitere Beleuchtungslichtbündel und das zusätzliche
Beleuchtungslichtbündel oder d. das Beleuchtungslichtbündel und das weitere Beleuchtungslichtbündel und das zusätzliche Beleuchtungslichtbündel in einen Strahlvereiniger eingekoppelt sind, den die eingekoppelten Beleuchtungslichtbündel kollinear vereinigt verlassen.
1 1 . Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens ein erstes und ein zweites der Beleuchtungslichtbündel (Beleuchtungslichtbündel und/oder weiteres Beleuchtungslichtbündel und/oder zusätzliches Beleuchtungslichtbündel) dieselbe Beleuchtungslichtwellenlänge, jedoch eine unterschiedliche Polarisation, insbesondere Linearpolarisation, aufweisen.
12. Mikroskop nach Anspruch 1 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der Strahlvereiniger als akustooptischer Strahlvereiniger ausgebildet und derart aufgebaut und betrieben ist, dass durch Weichselwirkung mit wenigstens einer mechanischen Welle sowohl das erste
Beleuchtungslichtbündel, als auch das zweite Beleuchtungslichtbündel gebeugt und dadurch auf eine gemeisame optische Achse gelenkt werden.
13. Mikroskop nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der akustooptische Strahlvereiniger einen Kristall aufweist, durch den eine mechanische Welle einer der Wellenlänge des ersten und des zweiten Beleuchtungslichtbündels zugeordneten
Schallfrequenz propagiert, wobei der Kristall und die Ausbreitungsrichtung der
mechanischen Welle relativ zueinander und jeweils relativ zu den in den Kristall einfallenden Beleuchtungslichtbündeln derart ausgerichtet sind, dass an der mechanischen Welle sowohl das erste Beleuchtungslichtbündel, als auch das zweite Beleuchtungslichtbündel gebeugt und dadurch auf eine gemeinsame optische Achse gelenkt werden.
14. Mikroskop nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass a. das erste Beleuchtungslichtbündel linear polarisiert ist und eine
Linearpolarisationsrichtung aufweist, die die Linearpolarisationsrichtung des ordentlichen Lichtes bezogen auf eine Doppelbrechungseigenschaft des Kristalles ist und/oder dass b. das zweite Beleuchtungslichtbündel linear polarisiert ist und eine
Linearpolarisationsrichtung aufweist, die die Linearpolarisationsrichtung des außerordentlichen Lichtes bezogen auf eine Doppelbrechungseigenschaft des Kristalles ist und/oder dass c. die Linearpolarisationsrichtung des ersten Beleuchtungslichtbündels oder die Linearpolarisationsrichtung des zweiten Beleuchtungslichtbündels in der Ebene angeordnet ist, die von der Ausbreitungsrichtung der mechanischen Welle und der Ausbreitungsrichtung des Detektionslichtbündels aufgespannt ist.
15. Mikroskop nach einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass der akustooptische Strahlvereiniger einen Kristall aufweist, durch den gleichzeitig eine erste und eine zweite mechanische Welle unterschiedlicher Schallfrequenz propagieren, wobei der Kristall und die Ausbreitungsrichtung der mechanischen Wellen relativ zueinander und jeweils relativ zu den in den Kristall einfallenden Beleuchtungslichtbündeln derart
ausgerichtet sind, dass an der ersten mechanischen Welle das erste
Beleuchtungslichtbündel und an der zweiten mechanischen Welle das zweite
Beleuchtungslichtbündel gebeugt und dadurch auf eine gemeisame optische Achse gelenkt werden.
16. Mikroskop nach einem der Ansprüche 12 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass durch den Kristall weingstens ein weiters Beleuchtungslichtbündel, das nicht die Wellenlänge des ersten und zweiten Beleuchtungslichtbündels aufweist und das nicht an der
mechanischen Welle gebeugt wird, verläuft und gemeinsam mit dem ersten und dem zweiten Beleuchtungslichtbündel auf die gemeinsame optische Achse gelangt.
17. Mikroskop nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass das weitere
Beleuchtungslichtbündel von einem zweiten Kristall ausgeht, in dem eine zweite
mechanische Welle propagiert, die eine der Wellenlänge des weiteren
Beleuchtungslichtbündels zugeordnete Schallfrequenz aufweist, wobei a. das weitere Beleuchtungslichtbündel ein drittes Beleuchtungslichtbündel der weiteren Beleuchtungslichtwellenlänge beinhaltet, das von der zweiten mechanischen Welle gebeugt wurde oder dass b. das weitere Beleuchtungslichtbündel ein drittes und ein viertes
Beleuchtungslichtbündel der weiteren Beleuchtungslichtwellenlänge, jedoch unterschiedlicher Polarisation, insbesondere Linearpolarisation, beinhaltet, die von der zweiten mechanischen Welle gebeugt wurden.
18. Mikroskop nach einem der Ansprüche 12 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass in dem Kristall oder in dem zweiten Kristall simultan wenigstens eine zusätzliche mechanische Welle propagiert, die eine, einer zusätzlichen Wellenlänge zugordnete andere
Schallfrequenz aufweist, wobei a. an der zusätzlichen mechanischen Welle wenigstens ein zusätzliches Beleuchtungslichtbündel, das die andere Wellenlänge aufweist gebeugt und dadurch auf die gemeisame optische Achse gelenkt wird, und/oder wobei b. an der zusätzlichen mechanischen Welle zwei zusätzliche
Beleuchtungslichtbündel, die die andere Wellenlänge und eine voneinander verschiedene Polarisation, insbesondere Linearpolarisation, aufweisen, gebeugt und dadurch auf die gemeisame optische Achse gelenkt werden.
19. Mikroskop nach einem der Ansprüche 10 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass der Strahlvereiniger als Hauptstrahlteiler fungiert, der Beleuchtungslicht auf einen
Beleuchtungslichtstrahlengang zur Beleuchtung einer Probe lenkt und der von der Probe ausgehendes Detektionslicht auf einen Detektionsstrahlengang mit einem Detektor lenkt.
20. Mikroskop nach einem der Ansprüche 10 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass der Strahlvereiniger von einer Probe ausgehendes Detektionslicht empfängt und aus diesem Detektionslicht die Anteile entfernt, die die Beleuchtungslichtwellenlänge und/oder die weitere Beleuchtungslichtwellenlänge und/oder die andere Beleuchtungslichtwellenlänge aufweisen.
21 . Mikroskop nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass a. aus einem von einer Probe kommenden Detektionslichtbündel durch Wechselwirkung mit der mechanischen Welle des Kristalls sowohl ein die Beleuchtungslichtwellenlänge und eine erste Linearpolarisationsrichtung aufweisender Anteil des Detektionslichtbündes, als auch ein die
Beleuchtungslichtwellenlänge und eine zweite, zur ersten
Linearpolarisationsrichtung senkrechte Linearpolarisationsrichtung aufweisender Anteil des Detektionslichtes abgelenkt - und dadurch aus dem Detektionslichtbündel entfernt werden, und/oder dass b. aus einem von einer Probe kommenden Detektionslichtbündel durch
Wechselwirkung mit der mechanischen Welle des zweiten Kristalls sowohl ein die weitere Beleuchtungslichtwellenlänge und eine erste
Linearpolarisationsrichtung aufweisender Anteil des Detektionslichtbündes, als auch ein die weitere Beleuchtungslichtwellenlänge und eine zweite, zur ersten Linearpolarisationsrichtung senkrechte Linearpolarisationsrichtung aufweisender Anteil des Detektionslichtes abgelenkt - und dadurch aus dem Detektionslichtbündel entfernt werden, und/oder dass c. der Kristall und die Ausbreitungsrichtung der mechanischen Welle relativ zueinander und jeweils relativ zu dem in den Kristall einfallenden Detektionslichtbündel derart ausgerichtet sind, dass der akustooptische
Strahlvereiniger mit der mechanischen Welle sowohl den die Beleuchtungslichtwellenlänge und eine erste Linearpolarisationsrichtung aufweisenden Anteil des Detektionslichtbündels, als auch den die Beleuchtungslichtwellenlänge und eine zweite, zur ersten
Linearpolarisationsrichtung senkrechten Linearpolarisationsrichtung aufweisenden Anteil des Detektionslichtbündels ablenkt und dadurch aus dem Detektionslichtbündel entfernt, und/oder dass d. der zweite Kristall und die Ausbreitungsrichtung der zweiten mechanischen Welle relativ zueinander und jeweils relativ zu dem in den zweiten Kristall einfallenden Detektionslichtbündel derart ausgerichtet sind, dass der akustooptische Strahlvereiniger mit der zweiten mechanischen Welle sowohl den die weitere Beleuchtungswellenlänge und eine erste
Linearpolarisationsrichtung aufweisenden Anteil des Detektionslichtbündels, als auch den die weitere Beleuchtungswellenlänge und eine zweite, zur ersten Linearpolarisationsrichtung senkrechten Linearpolarisationsrichtung aufweisenden Anteil des Detektionslichtbündels ablenkt und dadurch aus dem Detektionslichtbündel entfernt.
22. Mikroskop nach Anspruch 20 oder 21 , dadurch gekennzeichnet, dass das Detektionslichtbündel zuerst den Kristall und anschließend den zweiten Kristall durchläuft.
23. Mikroskop nach einem der Ansprüche 20 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass die strahlführenden Komponenten des Strahlvereinigers derart angeordnet und ausgebildet sind, dass der verbliebene Teil des Detektionslichtbündels den akustooptischen
Strahlvereiniger kollinear verlässt.
24. Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass Mikroskop als Scanmikroskop oder konfokales Scanmikroskop oder als höchstauflösendes Scanmikroskop oder als STED-Mikroskop ausgebildet ist.
25. Verwendung eines Mikroskops nach einem der Ansprüche 1 bis 24 zur
Untersuchung einer Probe in der STED-Mikroskopie (Stimulated Emission Depletion) oder in der CARS-Mikroskopie (Coherent Anti Stokes Raman Spectroscopy) oder in der SRS- Mikroskopie (Stimulated Raman Scattering) oder in der CSRS-Mikroskopie (Coherent Stokes Raman Scattering) oder in der Rikes-Mikroskopie (Raman induced Kerr-Effect Scattering).
26. Faserkoppler mit einem Element zum Verändern der Form des
Beleuchtungslichtfokus, das relativ zu einem auszukoppelnden Beleuchtungslichtbündel vorjustiert ist, zur Herstellung eines Mikroskops nach einem der Ansprüche 1 bis 24.
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