JP5489804B2

JP5489804B2 - Ｃａｒｓ光用ユニットおよび顕微鏡システム

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Publication number: JP5489804B2
Application number: JP2010067021A
Authority: JP
Inventors: 淳手塚; 昭典顕谷
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2010-03-23
Filing date: 2010-03-23
Publication date: 2014-05-14
Anticipated expiration: 2030-03-23
Also published as: JP2011197578A

Description

本発明はＣＡＲＳ光用ユニットおよび顕微鏡システムに関するものである。

従来、多光子蛍光観察とＣＡＲＳ光観察とを切り替えて行うことができるレーザ顕微鏡装置が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
このレーザ顕微鏡装置は、レーザ光源から発せられたパルスレーザ光を２つの光路に分岐して、一方の光路ではパルスレーザ光に付与する周波数分散量を調節することにより、標本上で略フーリエ限界パルスを達成可能な励起光またはポンプ光を切り替えて生成し、他方の光路では、フォトニッククリスタルファイバおよび光路長調節装置によってストークス光を生成することとしている。

そして、励起光の照射によって、標本の多光子蛍光観察が可能となり、ポンプ光とストークス光とを同時に照射することによって、標本のＣＡＲＳ光観察が可能となる。
一方、現行においては多光子蛍光観察およびＣＡＲＳ光観察を切り替えて行うことができるレーザ顕微鏡よりも、多光子蛍光観察専用のレーザ顕微鏡が多く使用されており、このようなレーザ顕微鏡にアドオンされてＣＡＲＳ光観察の機能を追加するＣＡＲＳ光用ユニットが望まれている。

特開２００９−２８１９２３号公報

しかしながら、特許文献１のレーザ顕微鏡装置は、フェムト秒パルスレーザ光に周波数分散を付与する周波数分散調節手段を、ポンプ光用の光路とストークス光用の光路とに分岐するためのビームスプリッタの後段に配置している。これは、多光子蛍光観察とＣＡＲＳ光観察とを両立可能な複合機能を有するレーザ顕微鏡装置のための専用の構造である。

一般的な多光子蛍光観察専用のレーザ顕微鏡では、レーザ波長の切り替えや、波長の変化、環境の変化等によるレーザ光源内のアライメント変化を調整する際の光軸の調整量を可能な限り低減するために、周波数分散調節手段をレーザ光源の極近くに配置あるいはレーザ光源と一体化している。このため、特許文献１のレーザ顕微鏡装置のストークス光用の光路をそのままユニット化しただけでは、多光子蛍光観察専用のレーザ顕微鏡にアドオンされてＣＡＲＳ光観察の機能を追加可能なＣＡＲＳ光用ユニットを構成することはできない。

本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、多光子蛍光観察専用のレーザ顕微鏡に当該レーザ顕微鏡の構成を変更することなくアドオンされてＣＡＲＳ光観察の機能を追加可能なＣＡＲＳ光用ユニットおよび顕微鏡システムを提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、レーザ光源から発せられたパルスレーザ光に周波数分散を付与する光源光周波数分散手段と、該光源光周波数分散手段から射出されたパルスレーザ光を標本に照射して観察する顕微鏡本体とを備える多光子蛍光顕微鏡の前記光源光周波数分散手段と前記顕微鏡本体との間の光路に挿入可能に構成され、前記光源光周波数分散手段から射出されてきたパルスレーザ光の一部を前記光路から分岐する光路分岐手段と、該光路分岐手段により分岐されたパルスレーザ光に周波数分散を付与する分岐光周波数分散手段と、該分岐光周波数分散手段により周波数分散を付与されたパルスレーザ光の周波数を変換する周波数変換手段と、前記光路に挿入可能に構成され、前記周波数変換手段によって周波数を変換されたパルスレーザ光を、前記光路を通過してきたパルスレーザ光に合波させる合波手段とを備えるＣＡＲＳ光用ユニットを提供する。

本発明によれば、多光子蛍光顕微鏡に備えられている光源光周波数分散手段と顕微鏡本体との間に光路に、光路分岐手段と合波手段とを挿入することで、レーザ光源から発せられ光源光周波数分散手段によって周波数分散が付与されたパルスレーザ光の一部が光路分岐手段によって分岐され、残りのパルスレーザ光が元の光路に通過させられ、両パルスレーザ光が合波手段によって合波されて顕微鏡本体に入射される。光路分岐手段により分岐されたパルスレーザ光は、分岐光周波数分散手段により周波数分散を付与された後、周波数変換手段によって周波数を変換された状態で合波手段によって合波される。光源光周波数分散手段による周波数分散は、光路分岐手段によって分岐された２つのパルスレーザ光のいずれにも付与されるが、分岐されたパルスレーザ光にはさらに分岐光周波数分散手段によって別個に周波数分散が付与されるので、２つのパルスレーザ光に付与する周波数分散を別個に調節することができる。

多光子蛍光観察を行う場合には、光源光周波数分散手段を調節することにより、標本面上において略フーリエ限界パルスが形成されるように周波数分散を付与することができ、多光子励起効果を効率よく発生させて明るく鮮明な多光子蛍光観察を行うことができる。

一方、ＣＡＲＳ光観察を行う場合には、分岐光周波数分散手段を調節することにより、周波数変換手段に入射されるパルスレーザ光が略フーリエ限界パルスとなるように周波数分散を付与し、光源光周波数分散手段を調節することによって、光路分岐手段によって分岐された２つのパルスレーザ光が標本面上において略同等の周波数分散量を有するようにすることができる。

光路分岐手段によって分岐されたパルスレーザ光は、合波手段によって合波される際には、時間軸上において周波数分布の傾きが一致した２つのパルスレーザ光となって合波される。これにより、標本において、一定の周波数差の２つのパルス光を入射させて、２つのパルスレーザ光のエネルギを効率よく利用してＣＡＲＳ光を発生させることができ、コントラストの高いＣＡＲＳ光観察を行うことができる。
すなわち、本発明によれば、多光子蛍光観察専用の多光子蛍光顕微鏡に、当該多光子蛍光顕微鏡の構成を変更することなくアドオンすることができ、これによって、明るく鮮明な多光子蛍光観察とコントラストの高いＣＡＲＳ光観察とを行うことができる。

上記発明においては、前記光路分岐手段により分岐されたパルスレーザ光に付与する時間遅延を調節する遅延時間調節手段を備えていてもよい。
このようにすることで、光路分岐手段によって分岐されたパルスレーザ光は、合波手段によって合波される際には、標本中における分子の特定の振動周波数に略等しい周波数差を時間軸方向の各時刻において有する２つのパルスレーザ光として合波される。これにより、標本において、比較的長時間にわたり、一定の周波数差の２つのパルス光を入射させて、２つのパルスレーザ光のエネルギを効率よく利用してＣＡＲＳ光を発生させることができ、コントラストの高いＣＡＲＳ光観察を行うことができる。

上記発明においては、前記光路に、該光路を通過するパルスレーザ光の光量を調節する光量調節手段を備え、前記光路分岐手段が、前記光源光周波数分散手段と前記光量調節手段との間に挿入可能に設けられていてもよい。
このようにすることで、光源光周波数分散手段と光量調節手段との距離を固定することができる。パルスレーザ光のビームにはダイバージェンスが存在する一方、光量調節手段は、パルスレーザ光を通過させる開口面積に制限のあるものが多く、けられが生じないように調節する必要があるが、光源光周波数分散手段と光量調節手段との距離を固定することで、観察方式を切り替えても、その都度のアライメント調整を不要とすることができる。
また、上記発明においては、前記光量調節手段が、音響光学素子であってもよい。このようにすることで、音響光学素子の有効入射開口に入射するパルスレーザ光を、都度の調節を行うことなく、いずれの観察方法においても一定とすることができる。

また、上記発明においては、前記光路分岐手段が、分岐比率を調節可能であってもよい。
このようにすることで、多光子蛍光観察時とＣＡＲＳ光観察時とで、分岐比率を調節して、いずれの観察方法においても良好な観察を行うことが可能となる。

また、上記発明においては、前記光路分岐手段が、偏光ビームスプリッタと、該偏光ビームスプリッタに入射するパルスレーザ光の偏光面を調節する波長板とを備えていてもよい。
このようにすることで、波長板を操作して偏光面を調節して、偏光ビームスプリッタによるパルスレーザ光の分岐比率を簡易かつ任意に調節することができる。

また、上記発明においては、前記多光子蛍光顕微鏡が、前記光路に、前記顕微鏡本体に入射させるパルスレーザ光のアライメントを調整する本体側アライメント調整手段を備え、前記周波数変換手段と前記合波手段との間に配置された分岐光アライメント調整手段を備え、前記合波手段が、前記本体側アライメント調整手段と前記顕微鏡本体との間に挿入可能に設けられていてもよい。

このようにすることで、多光子蛍光観察時には本体側アライメント調整手段によって、顕微鏡本体へのパルスレーザ光のアライメント調整を行い、ＣＡＲＳ光観察時には、本体側アライメント調整手段および分岐光アライメント調整手段によって２つのパルスレーザ光のアライメント調整を行うことができる。

また、上記発明においては、前記光路に挿入可能に設けられ、パルスレーザ光を波長毎に分岐して迂回光路を形成する一対のダイクロイックミラーと、該ダイクロイックミラー間の迂回光路に配置された迂回光アライメント調整手段とを備えていてもよい。
このようにすることで、一対のダイクロイックミラーを光源光周波数分散手段と顕微鏡本体との間の光路に挿入して迂回光路を形成し、迂回光アライメント調整手段を調節しておくことにより、レーザ光源の波長切替時にその都度アライメント調整を行わなくても、アライメントの調整されたパルスレーザ光を顕微鏡本体に入射させることができる。

また、上記発明においては、前記周波数変換手段が、フォトニッククリスタルファイバであってもよい。
このようにすることで、簡易かつ安価にパルスレーザ光の周波数帯域を変更あるいは拡大することができる。また、用いるフォトニッククリスタルファイバの種類を選定することにより、種々の周波数スペクトル成分および帯域を有するパルスレーザ光を得ることができる。

また、本発明は、レーザ光源から発せられたパルスレーザ光に周波数分散を付与する光源光周波数分散手段と、該光源光周波数分散手段から射出されたパルスレーザ光を標本に照射して観察する顕微鏡本体とを備える多光子蛍光顕微鏡と、該多光子蛍光顕微鏡に対して着脱される上記いずれかのＣＡＲＳ光用ユニットとを備える顕微鏡システムを提供する。

上記発明においては、前記多光子蛍光顕微鏡が、前記光路に、前記顕微鏡本体に入射させるパルスレーザ光のアライメントを電動で調整する電動アライメント調整手段を備え、該電動アライメント調整手段が、ＣＡＲＳ光観察時および多光子蛍光観察時の２種類のアライメント調整値を記憶し、必要に応じてＣＡＲＳ光観察時に対応するアライメント調整値または多光子蛍光観察時に対応する対応するアライメント調整値を読み出してアライメントを調整してもよい。

また、上記発明においては、前記多光子蛍光顕微鏡が、前記光路に、前記顕微鏡本体に入射させるパルスレーザ光のアライメントを電動で調整する電動アライメント調整手段を備え、ＣＡＲＳ光観察時のパルスレーザ光の波長および多光子蛍光観察時のパルスレーザ光の波長に対する２種類のアライメント調整値を記憶し、パルスレーザ光の波長の切り替えに応じて各波長に対応するアライメント調整値を読み出してアライメントを調整してもよい。

多光子蛍光観察専用のレーザ顕微鏡に当該レーザ顕微鏡の構成を変更することなくアドオンされてＣＡＲＳ光観察の機能を追加することができるという効果を奏する。

本発明の第１の実施形態に係るＣＡＲＳ光用ユニットと、これを装着する多光子蛍光観察用のレーザ顕微鏡とを示す模式図である。図１のＣＡＲＳ光用ユニットを多光子蛍光観察用のレーザ顕微鏡に装着した状態を示す模式図である。図１のＣＡＲＳ光用ユニットの変形例を示す模式図である。本発明の第２の実施形態に係るＣＡＲＳ光用ユニットと、これを装着する多光子蛍光観察用のレーザ顕微鏡とを示す模式図である。図４のＣＡＲＳ光用ユニットを装着したレーザ顕微鏡を多光子蛍光観察に使用する場合を説明する模式図である。図４のＣＡＲＳ光用ユニットを装着したレーザ顕微鏡をＣＡＲＳ光観察に使用する場合を説明する模式図である。本発明の第３の実施形態に係るＣＡＲＳ光用ユニットと、これを装着する多光子蛍光観察用のレーザ顕微鏡とを示す模式図である。図７のＣＡＲＳ光用ユニットを装着したレーザ顕微鏡をＣＡＲＳ光観察に使用する場合を説明する模式図である。

本発明の第１の実施形態に係るＣＡＲＳ光用ユニット１および顕微鏡システムについて、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡システムは、多光子蛍光観察専用のレーザ顕微鏡２と、該レーザ顕微鏡に装着されるＣＡＲＳ光用ユニット１とを備えている。
本実施形態に係るＣＡＲＳ光用ユニット１は、多光子蛍光観察専用のレーザ顕微鏡２に装着されることにより、多光子蛍光観察の機能を損なうことなくＣＡＲＳ光観察の機能を追加するものである。

すなわち、本実施形態に係るＣＡＲＳ光用ユニット１が取り付けられるレーザ顕微鏡２は、図１に示されるように、フェムト秒パルスレーザ光を発するレーザ光源３と、該レーザ光源３から発せられたフェムト秒パルスレーザ光に付与する周波数分散量を調節する第１の周波数分散装置（光源光周波数分散手段）４と、周波数分散量を調節されたパルスレーザ光の光量調節を行う音響光学素子（光量調節手段）５と、音響光学素子５から射出されたパルスレーザ光を標本Ａに照射して標本Ａの観察を行う顕微鏡本体６とを備えている。

第１の周波数分散装置４は、例えば、相互の間隔を調節可能な一対のプリズム（図示略）と、ミラー（図示略）とを備えている。一対のプリズムを通過したフェムト秒パルスレーザ光は、ミラーによって折り返された後に再度プリズム対を通過し同一の光路上に戻されるようになっている。この場合に、プリズムの間隔を調節することにより、第１の周波数分散装置４を通過するパルスレーザ光に与える周波数分散量を調節することができるようになっている。また、上記プリズム対の代わりに回折格子対（図示略）を用いてもよい。

また、第１の周波数分散装置４は、パルスレーザ光が、標本Ａ面上において略フーリエ限界パルスに近づくように、付与する周波数分散量を調節できるようになっている。具体的には、第１の周波数分散装置４は、パルスレーザ光が第１の周波数分散装置４から標本Ａまでに経験する周波数分散量を減じるようになっている。これにより、レーザ光源３から標本Ａまでの全光路において生じる周波数分散によるパルスレーザ光のパルス幅の広がりを補償することができ、標本Ａ上に集光される時点でのパルスレーザ光が、略フーリエ限界に近いパルス幅を達成することができるようになっている。

音響光学素子５は、第１の周波数分散装置４に対して間隔を空けて固定され、第１の周波数分散装置４から射出されてくるパルスレーザ光を、けられを生じさせることなく、その有効入射開口内に入射させるようになっている。そして、音響光学結晶に入射させる音響波の振幅を調節することにより、音響光学素子５から射出されるパルスレーザ光の光量を調節するようになっている。

顕微鏡本体６は、例えば、レーザ走査型顕微鏡であって、レーザ光源３から射出されたパルスレーザ光を２次元的に走査するスキャナ７およびレンズ群８と、スキャナ７により走査されたパルスレーザ光を標本Ａ面に集光する集光レンズ９と、標本Ａにおいて発生し、集光レンズ９によって集光された光を検出する第１の光検出器１０と、標本Ａを透過する方向に発生する光を集光する集光レンズ１１と、集光レンズ１１により集光された光を検出する第２の光検出器１２とを備えている。
図中、符号１３はダイクロイックミラー、符号１４はステージである。

本実施形態に係るＣＡＲＳ光用ユニット１は、図１に示されるように、ビームスプリッタ１５と、レーザコンバイナ１６と、これらビームスプリッタ１５およびレーザコンバイナ１６間に形成される光路（以下、分岐経路Ｃ２という。）に配置された第２の周波数分散装置（分岐光周波数分散手段）１７と、フォトニッククリスタルファイバ（周波数変換手段）１８と、光路調節装置（遅延時間調節手段）１９とを備えている。符号２０は、分岐光路を形成するためのミラーである。

ビームスプリッタ１５は、第１の周波数分散装置４と音響光学素子５との間の主光路（光路Ｃ１）に挿入可能に設けられている。主光路Ｃ１に挿入されることで、第１の周波数分散装置４から射出されたパルスレーザ光を所定の分岐比率で主光路Ｃ１から分岐し、一方を音響光学素子５へ透過させ、他方を分岐光路Ｃ２へ偏向させるようになっている。

レーザコンバイナ１６は、音響光学素子５と顕微鏡本体６との間の主光路Ｃ１に挿入可能に設けられている。主光路Ｃ１に挿入されることで、音響光学素子５から射出されたパルスレーザ光を透過させ、分岐光路Ｃ２を伝播してきたパルスレーザ光を偏向して、２つのパルスレーザ光を再度主光路Ｃ１上に合波して戻すことができるようになっている。

第２の周波数分散装置１７は、通過するパルスレーザ光に周波数分散を付与して、その後段に配置されているフォトニッククリスタルファイバ１８に導入される直前において略フーリエ限界パルスに近づけるようになっている。

フォトニッククリスタルファイバ１８は、導光されるパルスレーザ光の周波数帯域を変更および／または拡大したパルスレーザ光を生成し、主光路Ｃ１および分岐光路Ｃ２を導光されるパルスレーザ光に標本Ａ中の分子の特定の振動周波数に略等しい周波数差を与えるようになっている。

光路調節装置１９は、例えば、少なくとも２組以上のミラー（リフレクタ）により構成される（図示略）。これらリフレクタを用いてパルスレーザ光の光路を折り返し、これらリフレクタの間隔を調節することで、パルスレーザ光の光路長を変化させるようになっている。これによって、パルスレーザ光のパルスの時間的タイミングを調整することができる。

このように構成された本実施形態に係るＣＡＲＳ光用ユニット１の作用について以下に説明する。
本実施形態に係るＣＡＲＳ光用ユニット１を多光子蛍光観察専用のレーザ顕微鏡２にアドオンするには、図２に示されるように、第１の周波数分散装置４と音響光学素子５との間に配置される主光路Ｃ１にビームスプリッタ１５を挿入し、音響光学素子５と顕微鏡本体６との間に配置される主光路Ｃ１にレーザコンバイナ１６を挿入する。

そして、多光子蛍光観察を行う場合には、第１の周波数分散装置４により、主光路Ｃ１を通過するパルスレーザ光に、標本Ａ面上において略フーリエ限界パルスとなるような周波数分散を付与し、音響光学素子５により光量を調節した状態で、顕微鏡本体６に入射させる。

顕微鏡本体６においては、スキャナ７によって２次元的にパルスレーザ光を走査し、レンズ群８によってリレーしたパルスレーザ光を集光レンズ９によって標本Ａ上に集光する。これにより、標本Ａにおけるパルスレーザ光の集光位置においては、パルスレーザ光の光子密度が十分に高められて多光子励起効果を効率よく発生させることができる。そして、発生した明るい多光子蛍光は、集光レンズ９によって集光され、ダイクロイックミラー１３によって分岐されて光検出器１０により検出される。これにより、標本Ａの明るくかつ鮮明な多光子蛍光画像を取得することができる。

次に、ＣＡＲＳ光観察を行う場合には、第１の周波数分散装置４により、レーザ光源３から射出されたフェムト秒パルスレーザ光に初期の周波数分散を付与する。初期の周波数分散を付与されたパルスレーザ光は、ビームスプリッタ１５によって主光路Ｃ１と分岐光路Ｃ２とに所定の分岐比率で分岐される。ビームスプリッタ１５を透過して主光路Ｃ１を導光されるパルスレーザ光は、音響光学素子５によって光量を調整された後にレーザコンバイナ１６を透過して顕微鏡本体６に入射される。

一方、ビームスプリッタ１５により偏向されて分岐光路Ｃ２を導光させられるパルスレーザ光は、ミラー２０によって偏向され、第２の周波数分散装置１７により周波数分散を付与されて、後段のフォトニッククリスタルファイバ１８の直前において略フーリエ限界パルスとなる。そして、フォトニッククリスタルファイバ１８を通過させられる間に、主光路Ｃ１のパルスレーザ光に対して周波数スペクトルを変更および／または拡大された広帯域のパルスレーザ光となって光路調節装置１９に入射される。

フォトニッククリスタルファイバ１８を通過させられる間に、パルスレーザ光には所定の周波数分散が与えられる。
また、パルスレーザ光は、光路調節装置１９において時間遅延を付与された後にレーザコンバイナ１６において偏向されて、主光路Ｃ１を通過してきたパルスレーザ光と合波される。

主光路Ｃ１を通過してレーザコンバイナ１６に入射されたパルスレーザ光と、分岐光路Ｃ２を通過してレーザコンバイナ１６に入射されたパルスレーザ光とは、第１の周波数分散装置４によって、時間軸上における周波数分布の傾きが一致するように周波数分散量が調節されている。したがって、合波された２つのパルスレーザ光は、比較的長い時間にわたって、その周波数差が一定に維持される。

このように合波された２つのパルスレーザ光をスキャナ７によって２次元的に走査して、レンズ群８によってリレーし、集光レンズ９によって標本Ａ上に集光することにより、標本Ａにおけるパルスレーザ光の集光位置においては、標本Ａ内の分子を振動させてＣＡＲＳ光を発生させることができる。発生したＣＡＲＳ光は、例えば、標本Ａを透過して集光レンズ１１により集光され、第２の光検出器１２によって検出される。これにより、コントラストの高いＣＡＲＳ光画像を取得することができる。

このように、本実施形態に係るＣＡＲＳ光用ユニット１によれば、多光子蛍光観察専用のレーザ顕微鏡２の主光路Ｃ１の第１の周波数分散装置４と顕微鏡本体６との間に挿入するだけで、レーザ顕微鏡２の構成を変更等することなく、ＣＡＲＳ光観察機能をアドオンすることができる。この場合に、レーザ光源３に近接してあるいは一体的に設けられる第１の周波数分散装置４を備える通常のレーザ顕微鏡２にも簡単にＣＡＲＳ光観察機能をアドオンすることができるという利点がある。そして、レーザ顕微鏡２にＣＡＲＳ光用ユニット１を装着した後には、レーザ顕微鏡２側に設けられた第１の周波数分散装置４と、分岐光路Ｃ２に設けられた第２の周波数分散装置１７とを調節して、明るくかつ鮮明な多光子蛍光観察と、高いコントラストのＣＡＲＳ光観察とを行うことができ、標本Ａのマルチモーダルな観察が可能となる。

なお、本実施形態においては、光路分岐手段として、一定の分岐比率でパルスレーザ光を分岐するビームスプリッタ１５を採用したが、これに代えて、図３に示されるように、偏光ビームスプリッタ２１とλ／２板（波長板）２２との組み合わせを採用してもよい。すなわち、偏光ビームスプリッタ２１により、入射されるパルスレーザ光の偏光によって分岐比率を異ならせることができ、λ／２板２２によって入射されるパルスレーザ光の偏光を変化させることができる。その結果、λ／２板２２を操作することにより、主光路Ｃ１と分岐光路Ｃ２に任意の分岐比率でパルスレーザ光を入射させることができる。

すなわち、多光子蛍光観察の際には、主光路Ｃ１へのパルスレーザ光の入射を増大させて、分岐光路Ｃ２へのパルスレーザ光の入射を低減する。一方、ＣＡＲＳ光観察の際には、最も良好にＣＡＲＳ光を発生させ得る光量バランスとなるように、分岐比率を設定することができる。

次に、本発明の第２の実施形態に係るＣＡＲＳ光用ユニット３０について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態の説明において、上述した第１の実施形態に係るＣＡＲＳ光用ユニット１と構成を共通とする箇所には同一符号を付して説明を省略する。

本実施形態に係るＣＡＲＳ光用ユニット３０は、該ＣＡＲＳ光用ユニット３０を取り付ける多光子蛍光観察専用のレーザ顕微鏡３１として、図４に示されるように顕微鏡本体６へのパルスレーザ光のアライメントを調節するアライメントユニット３２を備えたものを想定している。
このＣＡＲＳ光用ユニット３０には、レーザコンバイナ１６に合波される際に分岐光路Ｃ２を通過してきたパルスレーザ光のアライメントを調節するアライメントユニット３３が備えられている。

また、図４に示す例では、ＣＡＲＳ光用ユニット３０には、該ＣＡＲＳ光用ユニット３０がレーザ顕微鏡３１に装着されることによりアライメントユニット３２を迂回させる迂回光路Ｃ３を形成するための一対のダイクロイックミラー３４、一対のミラー３５および他のアライメントユニット３６が備えられている。さらに、図４に示す例では、ＣＡＲＳ光用ユニット３０には、主光路Ｃ１に挿脱可能に設けられる第３の周波数分散装置３７が備えられている。

迂回光路Ｃ３を形成するためのダイクロイックミラー３４は、使用するパルスレーザ光の波長が切り替えられた場合に、パルスレーザ光の光路を主光路Ｃ１と迂回光路Ｃ３とで切り替えるような波長特性を有している。波長が変化するとパルスレーザ光のアライメントが変化するため、主光路Ｃ１に設けられたアライメントユニット３２は、一の波長のパルスレーザ光に対するアライメントを調節し、迂回光路Ｃ３に設けられたアライメントユニット３３は、他の波長のパルスレーザ光に対するアライメントを調節するように設定されている。

また、第３の周波数分散装置３７は正分散の平行平板ガラスであり、多光子蛍光観察時には主光路Ｃ１から抜き出され、ＣＡＲＳ光観察時には主光路Ｃ１内に挿入されるようになっている。第３の周波数分散装置３７が主光路Ｃ１から抜き出された状態では、パルスレーザ光が標本Ａ面上で略フーリエ限界パルスとなるように第１の周波数分散装置４により付与する周波数分散量が設定されている。一方、第３の周波数分散装置３７が主光路Ｃ１に挿入されることにより、第１の周波数分散装置４により付与する周波数分散量を調節しなくても、主光路Ｃ１および分岐光路Ｃ２を通過する２つのパルスレーザ光の周波数分散量がレーザコンバイナ１６の位置において略同等となるような周波数分散が、主光路Ｃ１を通過するパルスレーザ光に付与されるようになっている。

また、正分散の平行平板ガラスの代わりに、レーザ光の波長幅を狭帯域化するフィルタを用いてもよい。レーザ光の波長幅を狭帯域化することで、ポンプ光とストークス光の波長差を分子の振動数に合わせることができる。多光子励起による観察の場合には、このフィルタを主光路Ｃ１から抜き出すことで、多光子励起の効率を高めることができる。反射光防止などのために、このフィルタを光路に対して傾けて配置している場合は、主光路Ｃ１から抜き出したときの光路のシフト量を補正する補正ガラスを光路中に挿入すればよい。

このように構成された本実施形態に係るＣＡＲＳ光用ユニット３０によれば、レーザ顕微鏡３１の主光路Ｃ１における第１の周波数分散装置４と音響光学素子５との間に、ビームスプリッタ１５を挿入し、音響光学素子５とアライメントユニット３２との間に第３の周波数分散装置３７および一方のダイクロイックミラー３４を挿入し、アライメントユニット３２と顕微鏡本体６との間に、他方のダイクロイックミラー３４およびレーザコンバイナ１６を挿入することによりレーザ顕微鏡３１に装着される。

この状態で、多光子蛍光観察を行うには、図５に示されるように、第３の周波数分散装置３７を主光路Ｃ１から抜き出しておき、多光子蛍光観察用の波長（例えば、９５０ｎｍ）のパルスレーザ光をレーザ光源３から発生させる。パルスレーザ光は、第１の周波数分散装置４によって周波数分散が付与された後、ビームスプリッタ１５を透過して主光路Ｃ１に入射したものが音響光学素子５によって光量を調節され、ダイクロイックミラー３４を透過して、アライメントユニット３２によってアライメントが調整されて顕微鏡本体６に入射される。これにより、標本Ａの集光点においてはパルスレーザ光が略フーリエ限界パルスとなるので、効率的に多光子励起効果が発生し、明るい多光子蛍光観察を行うことができる。

ＣＡＲＳ光観察を行うには、図６に示されるように、第３の周波数分散装置３７を主光路Ｃ１に挿入しておき、ＣＡＲＳ光観察用の波長（例えば、８００ｎｍ）のパルスレーザ光をレーザ光源３から発生させる。パルスレーザ光は、第１の周波数分散装置４によって周波数分散が付与された後、ビームスプリッタ１５を透過して主光路Ｃ１に入射したものが音響光学素子５によって光量を調節され、ダイクロイックミラー３４により偏向されて迂回光路Ｃ３に入り、アライメントユニット３６によってアライメントが調整された後にダイクロイックミラー３４によって主光路Ｃ１に導入され、顕微鏡本体６に入射される。

一方、ビームスプリッタ１５により偏向されて分岐光路Ｃ２に入射したパルスレーザ光は、第２の周波数分散装置１７によって周波数分散を付与されて、略フーリエ限界パルスとなってフォトニッククリスタルファイバ１８に入射し、そこで周波数変換された後に光路調節装置１９によって時間遅延を付与される。そして、アライメントユニット３３によってアライメントを調整された状態で、レーザコンバイナ１６によって主光路Ｃ１を通過してきたパルスレーザ光と合波される。

このように本実施形態に係るＣＡＲＳ光用ユニット３０によれば、多光子蛍光観察とＣＡＲＳ光観察の切替に対応して、平行平板ガラスからなる第３の周波数分散装置３７を挿脱するだけで、観察方法の変更毎に第１の周波数分散装置４を調節せずに済むという利点がある。また、ダイクロイックミラー３４によって、アライメントユニット３２，３６を切り替える迂回光路Ｃ３を形成しているので、観察方法の切替に対応してレーザ光源３から発する波長を切り替えた際のアライメント調整も不要となるという利点がある。

なお、本実施形態においては、主光路Ｃ１のアライメントユニット３２の前後段にダイクロイックミラー３４を挿入して、アライメントユニット３２を迂回させる迂回光路Ｃ３を設けることとしたが、これに代えて、アライメントユニット３２の前段または後段のいずれかに両方のダイクロイックミラー３４を挿入して迂回光路Ｃ３を形成することにしてもよい。この場合、迂回光路Ｃ３を通過するパルスレーザ光のアライメントは、アライメントユニット３２，３６の両方によって行われることになる。

次に、本発明の第３の実施形態に係るＣＡＲＳ光用ユニット４０について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態の説明において、上述した第２の実施形態に係るＣＡＲＳ光用ユニット３０と構成を共通とする箇所には同一符号を付して説明を省略する。

本実施形態に係るＣＡＲＳ光用ユニット４０は、該ＣＡＲＳ光用ユニット４０を取り付ける多光子蛍光観察専用のレーザ顕微鏡４１として、図７に示されるように、アライメントユニット４２の前段に、λ／４板４３，４４によって前後に挟まれたビーム径・波面調整光学系４５を備えたものを備える顕微鏡システムに適用されることを想定している。また、ＣＡＲＳ光観察用の波長と多光子蛍光観察用の波長とは異なることから、これら２種類のアライメント調整値を記憶し、波長の切替毎に、電動で調整値を切り替えるアライメントユニット４２によって、測定のたびにアライメント調整を行わなくて済むようにできる。また、アライメント調整値はＣＡＲＳ光用ユニット４０を取り付けたときに追加するようにしてもよい。

このようなレーザ顕微鏡４１によれば、主光路Ｃ１に設けられたビーム径・波面調整光学系４５によって、顕微鏡本体６の瞳投影面において最適なビーム径と波面とを実現することができる。
ここで、レーザ光源３から発せられたパルスレーザ光は、直線偏光であり、入射させるパルスレーザ光が直線偏光であることを必要とする音響光学素子５への戻り光をビーム径・波面調整光学系４５の前段のλ／４板４３によって円偏光に変化させて防ぐようになっている。また、ＣＡＲＳ光観察においては、直線偏光であることが要求されるため、ビーム径・波面調整光学系４５の後段のλ／４板４４により、円偏光に変化したパルスレーザ光を直線偏光に戻して顕微鏡本体６に向かわせるようになっている。

また、このＣＡＲＳ光用ユニット４０には、ミラー２０と第２の周波数分散装置１７との間にファイバ調節機構４６、フォトニッククリスタルファイバ１８と光路調節機構１９との間に、ビーム径・波面調整光学系４７およびその前段に配される短波長カットフィルタ４８が備えられている。また、第２の周波数分散装置１７とフォトニッククリスタルファイバ１８との間および光路調節機構１９とミラー２０との間にはそれぞれビームスプリッタ４９と検出器５０とからなるビームサンプラが設けられている。
ＣＡＲＳ光用ユニット４０に設けられた第３の周波数分散装置３７は、図８に示されるように、レーザ顕微鏡４１の主光路Ｃ１のλ／４板４３とビーム径・波面調整光学系４５との間に挿入されるようになっている。

短波長カットフィルタ４８はフォトニッククリスタルファイバ１８によって波長変換されたパルスレーザ光の波長中で、ＣＡＲＳ光観察に寄与しない波長帯域を遮断するようになっている。
また、ビームサンプラはフォトニッククリスタルファイバ１８の前後段に配置され、各位置におけるパルスレーザ光の光量を測定することで、パルスレーザ光のフォトニッククリスタルファイバ１８への入射効率を測定することができるようになっている。そして、測定の結果、入射効率が低い場合には、ファイバ調節機構４６によって、フォトニッククリスタルファイバ１８に入射するパルスレーザ光の光軸を調節することができるようになっている。

本実施形態に係るＣＡＲＳ光用ユニットによっても、観察方法の切替によってパルスレーザ光の波長を切り替えてもアライメント調整を手動で行う必要が無く、ビーム径・波面調整光学系４５，４７によって、より高精度の多光子蛍光観察およびＣＡＲＳ光観察を行うことができるという利点がある。

なお、本実施形態においては、ＣＡＲＳ光用ユニット４０に設けたレーザコンバイナ１６として、ＣＡＲＳ光観察にはダイクロイックミラーを使用し、多光子蛍光観察時には素ガラスを使用するように、切替可能に構成してもよい。このようにすることで、多光子蛍光観察においてはパルスレーザ光の損失を低減し、多光子励起効果を効率的に発生させることができるという利点がある。

Ａ標本
Ｃ１主光路（光路）
Ｃ３迂回光路
１，３０，４０ＣＡＲＳ光用ユニット
２レーザ顕微鏡（多光子蛍光顕微鏡）
３レーザ光源
４第１の周波数分散装置（光源光周波数分散手段）
５音響光学素子（光量調節手段）
６顕微鏡本体
１５ビームスプリッタ（光路分岐手段）
１６レーザコンバイナ（合波手段）
１７第２の周波数分散装置（分岐光周波数分散手段）
１８フォトニッククリスタルファイバ（周波数変換手段）
１９光路調節装置（遅延時間調節手段）
２１偏光ビームスプリッタ（光路分岐手段）
２２ λ／２板（波長板）
３２，４２アライメントユニット（本体側アライメント調整手段）
３３アライメントユニット（分岐光アライメント調整手段）
３４ダイクロイックミラー
３６アライメントユニット（迂回光アライメント調整手段）

Claims

レーザ光源から発せられたパルスレーザ光に周波数分散を付与する光源光周波数分散手段と、該光源光周波数分散手段から射出されたパルスレーザ光を標本に照射して観察する顕微鏡本体とを備える多光子蛍光顕微鏡の前記光源光周波数分散手段と前記顕微鏡本体との間の光路に挿入可能に構成され、前記光源光周波数分散手段から射出されてきたパルスレーザ光の一部を前記光路から分岐する光路分岐手段と、
該光路分岐手段により分岐されたパルスレーザ光に周波数分散を付与する分岐光周波数分散手段と、
該分岐光周波数分散手段により周波数分散を付与されたパルスレーザ光の周波数を変換する周波数変換手段と、
前記光路に挿入可能に構成され、前記周波数変換手段によって周波数を変換されたパルスレーザ光を、前記光路を通過してきたパルスレーザ光に合波させる合波手段とを備え、
前記分岐光周波数分散手段は、前記分岐されたパルスレーザ光に周波数分散を付与して前記周波数変換手段に導入される直前において略フーリエ限界パルスに近づけるＣＡＲＳ光用ユニット。
前記光路分岐手段により分岐されたパルスレーザ光に付与する時間遅延を調節する遅延時間調節手段を備える請求項１に記載のＣＡＲＳ光用ユニット。
前記光路に、該光路を通過するパルスレーザ光の光量を調節する光量調節手段を備え、
前記光路分岐手段が、前記光源光周波数分散手段と前記光量調節手段との間に挿入可能に設けられている請求項１または請求項２に記載のＣＡＲＳ光用ユニット。
前記光量調節手段が、音響光学素子である請求項３に記載のＣＡＲＳ光用ユニット。
前記光路分岐手段が、分岐比率を調節可能である請求項１から請求項４のいずれかに記載のＣＡＲＳ光用ユニット。
前記光路分岐手段が、偏光ビームスプリッタと、該偏光ビームスプリッタに入射するパルスレーザ光の偏光面を調節する波長板とを備える請求項５に記載のＣＡＲＳ光用ユニット。
前記多光子蛍光顕微鏡が、前記光路に、前記顕微鏡本体に入射させるパルスレーザ光のアライメントを調整する本体側アライメント調整手段を備え、
前記周波数変換手段と前記合波手段との間に配置された分岐光アライメント調整手段を備え、
前記合波手段が、前記本体側アライメント調整手段と前記顕微鏡本体との間に挿入可能に設けられている請求項１または請求項２に記載のＣＡＲＳ光用ユニット。
前記光路に挿入可能に設けられ、パルスレーザ光を波長毎に分岐して迂回光路を形成する一対のダイクロイックミラーと、該ダイクロイックミラー間の迂回光路に配置された迂回光アライメント調整手段とを備える請求項１または請求項２に記載のＣＡＲＳ光用ユニット。
前記周波数変換手段が、フォトニッククリスタルファイバである請求項１または請求項２に記載のＣＡＲＳ光用ユニット。
レーザ光源から発せられたパルスレーザ光に周波数分散を付与する光源光周波数分散手段と、該光源光周波数分散手段から射出されたパルスレーザ光を標本に照射して観察する顕微鏡本体とを備える多光子蛍光顕微鏡と、
該多光子蛍光顕微鏡に対して着脱される請求項１から請求項９のいずれかに記載のＣＡＲＳ光用ユニットとを備える顕微鏡システム。
前記多光子蛍光顕微鏡が、前記光路に、前記顕微鏡本体に入射させるパルスレーザ光のアライメントを電動で調整する電動アライメント調整手段を備え、
該電動アライメント調整手段が、ＣＡＲＳ光観察時および多光子蛍光観察時の２種類のアライメント調整値を記憶し、必要に応じてＣＡＲＳ光観察時に対応するアライメント調整値または多光子蛍光観察時に対応する対応するアライメント調整値を読み出してアライメントを調整する請求項１０に記載の顕微鏡システム。
前記多光子蛍光顕微鏡が、前記光路に、前記顕微鏡本体に入射させるパルスレーザ光のアライメントを電動で調整する電動アライメント調整手段を備え、
ＣＡＲＳ光観察時のパルスレーザ光の波長および多光子蛍光観察時のパルスレーザ光の波長に対する２種類のアライメント調整値を記憶し、パルスレーザ光の波長の切り替えに応じて各波長に対応するアライメント調整値を読み出してアライメントを調整する請求項１０に記載の顕微鏡システム。