JP6255389B2 - 試料中の関心組織を高空間分解能で画像化するための顕微鏡 - Google Patents

Description

発明の詳細な説明

本発明は、試料中の関心組織を高空間分解能で画像化するための顕微鏡に関する。

本発明は、高空間分解及び高時間分解での画像化に理想的な方法である、誘導放出抑制（ＳＴＥＤ）顕微鏡に特に適用できるが、これに限定されない（Ｓ． Ｗ． Ｈｅｌｌ ａｎｄ Ｊ． Ｗｉｃｈｍａｎｎ， Ｏｐｔｉｃｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ １９， ７８０ （１９９４）； Ｔ． Ａ． Ｋｌａｒ ａｎｄ Ｓ．Ｗ． Ｈｅｌｌ， Ｏｐｔｉｃｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２４， ９５４ （１９９９））。６ｎｍの分解能（Ｅ． Ｒｉｔｔｗｅｇｅｒ， Ｋ． Ｙ． Ｈａｎ， Ｓ． Ｅ． Ｉｒｖｉｎｅ， Ｃ． Ｅｇｇｅｌｉｎｇ， ａｎｄ Ｓ． Ｗ． Ｈｅｌｌ， Ｎａｔｕｒｅ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ ３， １４４ （２００９））よりも高性能の解像度に到達し得る。ＳＴＥＤ顕微鏡は、２００フレーム／秒（Ｍ． Ａ． Ｌａｕｔｅｒｂａｃｈ， Ｃ． Ｕｌｌａｌ， Ｖ．Ｗｅｓｔｐｈａｌ， ａｎｄ Ｓ． Ｗ． Ｈｅｌｌ， Ｌａｎｇｍｕｉｒ ２６， １４４００ （２０１０））の動態イメージ（Ｖ． Ｗｅｓｔｐｈａｌ， Ｍ． Ａ． Ｌａｕｔｅｒｂａｃｈ， Ａ． Ｄｉ Ｎｉｃｏｌａ， ａｎｄ Ｓ． Ｗ． Ｈｅｌｌ， Ｎｅｗ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｃｓ ９， ４３５ （２００７））を可能にし、生きた細胞の動態イメージ（Ｖ．Ｗｅｓｔｐｈａｌ， Ｓ． Ｏ． Ｒｉｚｚｏｌｉ， Ｍ． Ａ． Ｌａｕｔｅｒｂａｃｈ， Ｄ． Ｋａｍｉｎ， Ｒ． Ｊａｈｎ， ａｎｄ Ｓ． Ｗ． Ｈｅｌｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２０， ２４６ （２００８）； Ｂ． Ｈｅｉｎ， Ｋ． Ｉ． Ｗｉｌｌｉｇ， ａｎｄ Ｓ． Ｗ． Ｈｅｌｌ， Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １０５， １４２７１ （２００８））のみならず、組織の動態イメージ（Ｕ． Ｖ． Ｎａｇｅｒｌ， Ｋ． Ｉ． Ｗｉｌｌｉｇ， Ｂ． Ｈｅｉｎ， Ｓ． Ｗ． Ｈｅｌｌ， ａｎｄ Ｔ． Ｂｏｎｈｏｅｆｆｅｒ， Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １０５， １８９８２ （２００８）； Ｎ． Ｔ． Ｕｒｂａｎ， Ｋ． Ｉ． Ｗｉｌｌｉｇ， Ｓ． Ｗ． Ｈｅｌｌ， ａｎｄ Ｕ． Ｖ． Ｎａｇｅｒｌ， Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ １０１， １２７７ （２０１１））にも対応可能である。

ＳＴＥＤ顕微鏡は、通常、レーザー主走査系顕微鏡のような実装である。蛍光マーカー又は蛍光物質の様な、第一分光特性を有する第一の状態と、第二分光特性を有する第二の状態とを有する物質が画像化のための試料として用いられる。特に、蛍光物質は、第一の状態から第二の状態へ弛緩するときに、蛍光発光する。ＳＴＥＤ顕微鏡では、対物レンズ組み立て体（アセンブリ）を介して試料に照射される、フォーカスされたレーザープローブ光線によって、励起状態の焦点が得られる。励起状態の焦点外においては、蛍光物質の蛍光能は、一時的に消える。非蛍光状態への分子の切り替えは、レーザー転移光線（「ＳＴＥＤビーム」）による誘導放出を経て成される。ＳＴＥＤビームは、通常、チャージされた螺旋状態の位相マスクを通過し、あるときは対物レンズ組み立て品の後焦点面上に４ｆ配置（４ｆ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）で投影され、結果的に、第二の状態の蛍光プローブを第一の状態に抑制させるように適応されている第一の強度を有する第一の強度の領域、及び、第一の状態と第二の状態との間に蛍光プローブを移さないように適応されている第二の領域を有するトロイダルフォーカス（ｔｏｒｏｉｄａｌ ｆｏｃｕｓ）となる（Ｖ． Ｗｅｓｔｐｈａｌ， Ｍ． Ａ． Ｌａｕｔｅｒｂａｃｈ， Ａ． Ｄｉ Ｎｉｃｏｌａ， ａｎｄ Ｓ． Ｗ． Ｈｅｌｌ， Ｎｅｗ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｃｓ ９， ４３５ （２００７））。さらに、ＳＴＥＤ顕微鏡では、少なくとも一部は第二の強度の領域上にある、トロイダル（ドーナツ）形状のＳＴＥＤフォーカスと重ねられたプローブ光線によって、着色された試料に蛍光を誘導し得る。このように、励起フォーカスの周囲に相当する第一の強度領域の誘導放出によって、蛍光プローブの光を放射する能力が消される。ＳＴＥＤフォーカスがゼロに近い強度を有する極めて中心に近い位置である第二の領域でのみ、かなりの時間、蛍光プローブは蛍光状態であることができる。蛍光発生素がスイッチオフされておらず、従って分解可能な距離が最小となる第二の強度領域は、ＳＴＥＤビームの強度を増やしながら、ゼロに縮んでいく（Ｓ． Ｗ． Ｈｅｌｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１６， １１５３ （２００７））。転移光線の第二の領域にある蛍光発生素の蛍光が、プローブ検出器によって逐一検出される光学測定信号を形成する。

しかしながら、あまり光を吸収せず、蛍光を発しない細胞等の生態学的試料を試料として、関心組織を設置し画像化することを求めることがしばしばある。そのような関心組織を設置して画像化することは、ＳＴＥＤ顕微鏡を用いて、第二高分解カラーチャネルを実行しても難しい。

本発明は、上述した課題を解決することを目的とする。

そのためには、本発明は、物質を含んでいる試料中の関心組織を高空間分解能で画像化するための顕微鏡であって、上記物質は第一分光特性を有している第一の状態及び第二分光特性を有している第二の状態を有しており、顕微鏡が、
−互いに反対を向いている第一及び第二の面を有しており、且つ上記第一及び第二の面の側に第一及び第二の焦点面がそれぞれ存在しており、上記試料は第一の面の側に置かれるためのものである、対物レンズ組み立て体、
−上記対物レンズ組み立て体を通って上記試料に向けて転移光線を放つために、上記対物レンズ組み立て体の第二の面の側に配置され、上記転移光線は強度及び位相の特性を有している、転移光源、
−上記転移光源及び上記対物レンズ組み立て体の間に設置されている光線調節装置であって、上記光線調節装置と上記対物レンズ組み立て体とを通過した上記転移光線が、上記第二の状態にある物質を、上記第一の状態に移すように適応されている第一の強度を有している、第一の強度の領域、及び、上記第一と第二の状態との間に上記物質を移さないように適応されている第二の領域を有している、第二の強度の領域を少なくとも呈するように、空間的に上記転移光線を変化させるために構成されている上記光線調節装置、
−上記第二の状態にある物質の一部から、光学測定信号を検出するように構成されているプローブ形検出器、
を含んでおり、
−位相差を発生させるように、さらに構成されている上記光線調節装置、
−上記試料に向けて照射光線を放つために配置されており、上記照射光線は強度及び位相の特性を有している、照射光源、並びに、
−上記照射光線が、上記試料、上記対物レンズ組み立て体及び上記光線調節装置を少なくとも１回通過した後に、上記照射光線の強度を検出するために配置されている強度検出器
を含む位相差顕微鏡検査システムを含む顕微鏡を提案する。

従って、本発明は、第二のコントラストチャンネルを通して、あまり光を吸収せず、且つ蛍光を発しない関心組織、及び特に生物学的な関心組織を配置して、画像化することを可能にする改良された観察能力を有している高分解顕微鏡を提供する。

また、本発明によれば、位相差顕微鏡検査システムは、高空間分解能の顕微鏡検査システムのために使用されているものと同一の光線調節装置を使用し、故に、追加の光学部品はほとんど無く、転移光線経路には追加の部品は無い。

さらに、第二のコントラストチャンネルのために位相差を使用することは、第二のマーカーによって試料を着色することを不要とする。

上記光線調節装置は、上記第一の強度の領域が上記第二の強度の領域を囲むように、上記転移光線を変化させるために構成され得る。

上記光線調節装置は、上記転移光線及び上記照射光線の位相の特性を調節するために構成されている位相マスクであり得る。

特に、上記光線調節装置は、角度依存の位相シフトを、上記転移光線及び上記照射光線の位相の特性に適用するために構成されている位相マスクであり得る。これらの設備と共に、ＳＴＥＤビームを形成するために通常使用されているものと同じタイプの位相マスクを用いる螺旋位相コントラスト法（ＳＰＣ）(Ｊ． Ｄａｖｉｓ、Ｄ． ＭｃＮａｍａｒａ、Ｄ． Ｃｏｔｔｒｅｌｌ、及びＪ． Ｃａｍｐｏｓ、Ｏｐｔｉｃｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２５、９９ （２０００）：Ｓ． Ｆｕｒｈａｐｔｅｒ、Ａ． Ｊｅｓａｃｈｅｒ、Ｓ． Ｂｅｒｎｅｔ、及びＭ． Ｒｉｔｓｃｈ−Ｍａｒｔｅ、Ｏｐｔｉｃｓ Ｅｘｐｒｅｓｓ １３、６８９ （２００５））を実装し得る。トロイダル（ドーナツ）形状は、高空間分解能での画像化に用いられるとき、上記位相マスクを通過した上記転移光線に与えられ得る。結果として、第二の強度の領域を囲む管状の第一の強度の領域となる。上記螺旋状の位相マスクは、位相差顕微鏡に使用されるとき、信号対雑音比の増強を可能とする相殺的干渉の配置にできる。

特定の実施形態では、上記顕微鏡は、誘導放出抑制（ＳＴＥＤ）顕微鏡として構成されてもよい。そのような実施形態では、上記物質は、上記第二の状態から上記第一の状態に弛緩するときに蛍光を発する蛍光マーカーを含み、上記顕微鏡は、上記転移光線と重ねられるプローブ光線を放つように構成されているプローブ光源をさらに含んでおり、上記プローブ光線が、上記第一の状態にあるマーカーを上記第二の状態に移すように構成されている強度を有しており、上記第一の強度の領域における上記転移光線が上記マーカーの第二の状態を抑制させるように構成されている、蛍光を発する蛍光マーカーを含む。

上記転移光線及び上記プローブ光線は、同一の単一の光源によって放たれ得る。上記転移光源及び上記プローブ光源は、転移及びプローブ光線の両方を生じさせる単一の光源を形成し得る。

別の形態として、上記転移光源及び上記プローブ光源は別個であり得る。

また、上記転移光線及び上記プローブ光線は共に、上記光線調節装置を通過し得る。

上記顕微鏡は、上記転移光線によって上記試料が走査され得るように、上記転移光線及び上記試料を、互いに相対的に移動させるように構成されている転移光走査配置をさらに有し得る。

上記顕微鏡は、上記照射光線によって上記試料が走査され得るように、上記照射光線及び上記試料を、互いに相対的に移動させるように構成されている照射光走査配置をさらに有し得る。

一実施形態では、上記転移光走査配置は、上記照射光走査配置としても使用され得る。

上記強度検出器は、ＣＣＤ又はＣＭＯＳカメラ等の画素化検出器であり得る。

別の形態では、上記強度検出器は、アバランシェフォトダイオード又は光電倍増管等の単一の画素検出器であり得る。この設備を、照射光走査配置の使用と組み合わせることによって、走査モードでの位相差顕微鏡法を実施できる。そのような走査モードでは、画像の位置合わせ精度が点源及び検出器のみに依存し、画像の歪みが起こり得ず、それ故、うまく画像が位置合わせされることが期待できるように、位相差の画像化及び高分解能での画像化は、上記同一の走査配置を使用してもよい。

上記照射光源は、レーザー装置等のコヒーレント光源を含み得る。この設備を、強度検出器としての点検出器の使用と組み合わせることによって、焦点が外れた面からの信号除去である光学切片が得られる。

また、照射光源は、発光ダイオード、水銀灯、又はハロゲンランプ等のインコヒーレント光源を含み得る。

上記照射光源は、上記対物レンズ組み立て体の第一の面の側に、上記試料を設置するために規定されている場所から隔てて配置され得る。

上記強度検出器は、上記対物レンズ組み立て体の第二の面の側に配置され得る。

また、上記照射光源は、上記対物レンズ組み立て体の第二の面の側に配置され得る。

反射素子は、上記対物レンズ組み立て体の第一の面の側に、上記試料を設置するために規定されている場所から隔てて配置され得る。

別の形態では、上記強度検出器は、上記対物レンズ組み立て体の第一の面の側に配置され得る。

特に、上記転移光線は上記照射光線であり得る。

本発明の他の目的及び優位性は、後述する特定の形態の開示によって表される。本形態は、限定されるものでは無い発明の形態であり、上記開示は添付する図面を参考になされる。

−図１は、本発明の第一の実施形態に係る、高空間分解能で画像化するための顕微鏡の主な要素の略図であり、対物レンズ組み立て体を実装している顕微鏡、転移光線及び照射光線を放つ光源、高空間分解能の画像化のための位相マスク及びプローブ形検出器、並びに、位相差の画像化のための照射光源及び強度検出器の略図である。

−図２は、カバースリップ上の小さな液浸油滴から成る試料の、図１の顕微鏡によって得られた位相差画像である。上記試料は、照射光源から放たれ、試料（Ａ、Ｂ、Ｃ）、及び、４つの照射／走査の組み合わせの候補：インコヒーレント照射光線／広範囲検出（Ｄ）、インコヒーレント照射光線／走査検出（Ｅ）、コヒーレント照射光線／広範囲検出（Ｆ）、コヒーレント照射光線／走査検出（Ｇ）、を通過した照射光線毎に、位相マスクの位置が異なる。

−図３は、（ａ）インコヒーレント照射及び広範囲検出を用いた図１の顕微鏡によって得られた神経細胞の位相差画像、（ｂ）インコヒーレント照射及び走査検出を用いた図１の顕微鏡によって得られた神経細胞の位相差画像、（ｃ）従来の共焦点蛍光顕微鏡検査法によって得られた位相差画像から選ばれた関心領域の画像、並びに、（ｄ、ｅ）図１の顕微鏡によって得られた関心領域のＳＴＥＤの画像を示している。

−図４は、（ａ、ｂ）図１の顕微鏡によって得られた星状細胞の走査ＳＰＣの画像、（ｃ）図１の顕微鏡によって得られた、包理された星状細胞中の細胞小器官のＳＰＣ画像、（ｄ）図１の顕微鏡によって得られた、包理された星状細胞中の細胞小器官のＳＴＥＤ画像、（ｃ）図１の顕微鏡によって得られた、包理された星状細胞中の細胞小器官のＳＰＣ及びＳＴＥＤ画像の重ね合わせ、（ｆ）免疫染色されているアクチンフィラメントの共焦点蛍光画像、（ｇ）図１の顕微鏡によって得られた、免疫染色されているアクチンフィラメントのＳＴＥＤ画像（ｈ）図１の顕微鏡によって得られた、免疫染色されているアクチンフィラメントの共焦点ＳＰＣ画像を示している。

−図５は、転移光線及びプローブ光線が、二つの異なる光源によって放たれる、図１の実施形態の別の形態に係る、高空間分解能で画像化するための顕微鏡の主な要素の略図である。

−図６は、転移光源が、転送方式の位相差顕微鏡のための照射光源としてもまた使用される、本発明の第二の実施形態に係る、高空間分解能で画像化するための顕微鏡の主な要素の略図である。

−図７は、転移光源が、逆反射体と共に位相差顕微鏡のための照射光源としてもまた使用される、本発明の第三の実施形態に係る、高空間分解能で画像化するための顕微鏡の主な要素の略図である。

−図８は、スイッチ光源が、逆反射体及びビーム走査と共に位相差顕微鏡のための照射光源としてもまた使用される、本発明の第四の実施形態に係る、高空間分解能で画像化するための顕微鏡の主な要素の略図である。

図では、同一の参照番号は同一又は同様の要素を指す。

図１は、試料２（ＳＭＰ）中の、特に生体細胞等の生物学的な関心組織を設置及び画像化するように構成されている高空間分解能で画像化するための顕微鏡１を示す。

図１において、誘導放出抑制（ＳＴＥＤ）顕微鏡１は、第一分光特性を有している第一の状態及び第二分光特性を有している第二の状態を有している物質のような、蛍光マーカーで標識されている関心組織を画像化するためのものとして示されている。実際、蛍光マーカーは、繰り返し、第一の状態としての基底状態から第二の状態としての励起状態に移ることができ、励起状態から基底状態に弛緩するとき蛍光を発する。

顕微鏡１は、第一又は前面及び第二又は裏面を有している対物レンズ組み立て体３（ＯＢＪ）を含んでおり、前面及び裏面は、互いに反対を向いている。対物レンズ組み立て体３は、前面上に、画像化される試料２が設置される第一焦点面又は前焦点面を形成する。第二焦点面又は裏焦点面は対物レンズ組み立て体３の裏面の側に配置されている。

光源４は、対物レンズ組み立て体３を通って試料２に向けて光線６を放つように、対物レンズ組み立て体３の第二の面の側に配置されている。

図に示された実施形態において、光源４は、Ｔｉ：サファイアレーザー Ｔｉ：Ｓａ等のレーザー光線６を放つように構成されている単一のレーザー装置、及び、レーザー光線６をプローブ光線５ａと転移光線５ｂとに分離するためのセパレータ７を含む。プローブ光線５ａは、特に、蛍光マーカーの励起を生じさせ、蛍光マーカーを基底状態から励起状態に移すための、強度及び波長となるように構成されている。逆に、転移光線５ｂは、特に強度及び波長に関して、蛍光マーカーの脱励起を生じさせ、基底状態へ蛍光マーカーの励起状態の抑制させるように調整されている。

図５に示されている別の形態において、プローブ光線５ａ及び転移光線５ｂは、二つの異なる転移光源（４ｂ）及びプローブ光源（４ａ）によって別々に、各々放たれ得る。

特に、レーザー装置は、本実施形態では、転移光線５ｂ又はＳＴＥＤビームを発生させるように周波数２倍化ＯＰＯ８を前後運動させ、且つ、本実施形態では、励起のためのプローブ光線５ａ又は超連続体を発生させるように光結晶ファイバー９（ＰＣＦ）を前後運動させる。誘電性フィルターは励起波長を選択するために使用され得る。同一の光源からのＳＴＥＤビーム５ｂ及び励起ビーム５ａを発生させることで、潜在的な時間変動を排除する（Ｅ． Ａｕｋｓｏｒｉｕｓ， Ｂ． Ｒ． Ｂｏｒｕａｈ， Ｃ． Ｄｕｎｓｂｙ， Ｐ． Ｍ． Ｐ． Ｌａｎｉｇａｎ， Ｇ． Ｋｅｎｎｅｄｙ， Ｍ． Ａ． Ａ． Ｎｅｉｌ， ａｎｄ Ｐ． Ｍ． Ｗ． Ｆｒｅｎｃｈ， Ｏｐｔｉｃｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３３， １１３ （２００８））。パルス状の一時的なオーバーレイは光学的遅延線（図示せず）によって調節される。

ＳＴＥＤビーム５ｂは、光源４及び対物レンズ組み立て体３の間にある、対物レンズ組み立て体３の第二の面の側に設置されている光線調節装置１０を通って、対物レンズ組み立て体３の方へ向けられている。

一旦、ＳＴＥＤビーム５ｂが光線調節装置１０及び対物レンズ組み立て体３を通過すると、励起状態の蛍光マーカーを基底状態に移すように構成されている公称強度を有する、第一の強度の領域、及び、第一及び第二の状態の間に蛍光マーカーを移さないように構成されている第二の強度を有する、第二の強度の領域を少なくとも呈するように、ＳＴＥＤビーム５ｂの特に強度及び／又は位相を空間的に変化させるように、光線調節装置１０は構成されている。特に、第二の強度の領域は、ゼロ又はゼロに近い強度を有し得る。

より好ましい実施形態では、これに限定されるものではないが、光線調整装置１０は、角度依存の位相シフトをＳＴＥＤビーム５ｂの位相の特性に適用するように構成されている螺旋状の位相マスク（ＰＭ）である。例えば、そのような螺旋状の位相マスク１０は、反射板又は透過板から成ってもよい。反射板又は透過板は、一般に光軸に垂直に延伸しており、また、反射板又は透過板は、光軸の周囲で螺旋になっているもののうちの少なくとも一つの、向かい合って横の面に存在している。そのような螺旋状の位相マスク１０は、蛍光マーカーの励起状態の抑制に適した強度の第一の強度の領域が、ゼロ又はゼロに近い強度の第二の強度の領域を連続的に囲むように、ＳＴＥＤビーム５ｂのトロイダル焦点を発生させることができる。

他の実施形態では、光線調整装置１０は、好ましくは、第一の強度の領域が、少なくとも部分的に第二の強度の領域を囲むように、転移光線の位相の特性を調節し、又は、変化させるように構成されている、任意の他の種類の位相マスクであり得る。光線調節装置１０は、任意の他の螺旋状の光変調装置でもあり得る。

４ｆ配置の第一のレンズ１１ａ及び第二のレンズ１１ｂ（Ｌ１及びＬ２）を備えるテレスコープ１１は、対物レンズ組み立て体３のフーリエ面に位相マスク１０を存在させるために、位相マスク１０上に対物レンズ組み立て体３の後焦点面を撮像する。

ＳＴＥＤビーム５ｂは、試料２にトロイダル焦点を発生させるために螺旋状の位相マスク１０を通過する。励起ビーム５ａはＳＴＥＤビーム５ｂと組み合わされることによって、第一のダイクロイックミラー１２（ＤＭ１）を通るＳＴＥＤビーム５ｂの第二の領域の少なくとも一部と重ねられる。その結果、励起ビーム５ａ及びＳＴＥＤビーム５ｂは、試料２を照射するスイッチ光線５を形成する。

顕微鏡１は、試料２がスイッチ光線５によって走査され得るように、少なくとも転移光線５ｂ及び試料２を互いに相対的に移動させるように構成されている、転移光走査配置をさらに有する。別の形態では、転移光走査配置は、スイッチ光線５を形成する転移光線５ｂ及びプローブ光線５ａ並びに試料２の両方を、互いに相対的に移動させ得る。転移光走査配置は、（スイッチ光線５の）転移光線５ｂ、及び／又は、試料２が搭載された移動支持体の位置を変えるように構成されている走査器を含み得る。図示された実施形態では、試料はピエゾステージを用いて走査される。

そうすることで、スイッチ光線５の中心では、ＳＴＥＤビーム５ｂのゼロ又はゼロに近い強度の領域上に重ねられた励起ビーム５ａによって、蛍光マーカーの蛍光が誘発され得る。これに対して、スイッチ光線５の周囲では、ＳＴＥＤ光線５ｂの管状の第一の強度の領域による誘導放出によって、蛍光マーカーの蛍光を放つ能力が失われる。

スイッチ光線５は、第二のダイクロイックミラー１３（ＤＭ２）によって、蛍光から分離される。アバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）等のプローブ検出器１５は、光学測定信号として蛍光マーカーの蛍光を検出するために、対物レンズ組み立て体３の第二の面の側に配置されている。

本発明によれば、上述の開示されたＳＴＥＤ顕微鏡１は螺旋位相コントラスト法（ＳＰＣ）を実行する。

そのために、顕微鏡１は、対物レンズ組み立て体３の第一の面から試料２に向けて照射光線１７を放つように配置されている照射光源１６をさらに含む。

図１において、照射光源１６は、対物レンズ組み立て体３の第一の面の側に、試料２を設置するために規定されている場所から隔てて配置されている。照射光源１６は、Kohler照射のための絞り（ピンホール ＰＨ）が設けられた板２０の後ろに配置されている発光ダイオード（ＬＥＤ）（波長６３０ｎｍ）等のインコヒーレント光源１８を備える。別の形態では、インコヒーレント光源１８は水銀灯、ハロゲンランプ、又は、その他のものであり得る。レンズ２１（Ｌ５）は、光捕集器として機能し、且つ、レンズ２２（Ｌ４）は、照射光線１７の焦点を試料２上に合わせる。図示された実施形態において、照射光源１６は、レーザー装置等のコヒーレント光源２３も備える。インコヒーレント光源１８及びコヒーレント光源２３のどちらか一方を用いて、試料２に光が照射され得る。また、照射光源１６は、インコヒーレント光源１８及びコヒーレント光源２３のうち一つのみを備え得る。

位相マスク１０は、振幅及び位相物体に対して、等方的にコントラストを増強するために、対物レンズ組み立て体３のフーリエ面に配置されている。コヒーレントレーザー照射を用いるＳＰＣは、細胞等の弱い位相物体を視覚化することを可能にするということが立証された（Ａ. Ｊｅｓａｃｈｅｒ、Ｓ． Ｆｕｒｈａｐｔｅｒ、Ｓ． Ｂｅｒｎｅｔ， 及び Ｍ． Ｒｉｔｓｃｈ‐Ｍａｒｔｅ， Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｌｅｔｔｅｒｓ ９４ （２００５））。近年、１ｎｍにフィルタ処理されたスペクトラムを有するＬＥＤが、生物学的試料の画像化のために使用され（Ｇ． Ｓｉｔｕ、Ｍ． Ｗａｒｂｅｒ、Ｇ． Ｐｅｄｒｉｎｉ、及びＷ． Ｏｓｔｅｎ、Ｏｐｔｉｃｓ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ２８３、１２７３ （２０１０）)、超発光ダイオードを用いるＳＯＣが発表された（Ｓ． Ｓｃｈａｕｓｂｅｒｇｅｒ、Ｂ． Ｈｅｉｓｅ、Ｃ． Ｍａｕｒｅｒ、Ｓ． Ｂｅｒｎｅｔ、Ｍ． Ｒｉｔｓｃｈ−Ｍａｒｔｅ、及びＤ． Ｓｔｉｆｔｅｒ、 Ｏｐｔｉｃｓ ｌｅｔｔｅｒｓ ３５、４１５４ （２０１０））。

対物レンズ組み立て体３の第二の面の側に配置された偏光ビームスプリッタ２４（ＰＢＳ）は、試料２、対物レンズ組み立て体３及び位相マスク１０を通過した照射光線１７から成る位相差ビーム１７ａ及びＳＴＥＤビーム５ｂを分離する。

レンズ２５（Ｌ３）は、位相差ビーム１７ａの強度を検出するために対物レンズ組み立て体３の第二の面の側に設置された、強度検出器２６（Ｄｅｔ）上に、位相差画像を形成する。

強度検出器２６は、広視野の検出を可能にするために、ＣＣＤ又はＣＭＯＳカメラ等の画素化検出器であり得る。

好ましい別の形態では、強度検出器２６は、アバランシェフォトダイオード又は光電増倍管等の単一の画素検出器であり得る。さらに有利な形態として、顕微鏡１は、試料２が照射光線１７によって走査され得るように照射光線１７及び試料２を互いに相対的に移動させるように構成されている照射光走査配置をさらに取り得る。スイッチ光走査配置に関しては、照射光走査配置は、照射光線１７の方向を変更できるように構成されている走査器、及び／又は、試料２が載せられる移動可能な支持台を備え得る。そのような設備は、走査モードにおけるＳＰＣの実施を可能にする。照射光走査配置は転移光走査配置によって形成され得ることは、以下の説明から明白になるであろう。

開示される実施形態において、ＳＴＥＤ顕微鏡にて螺旋状の位相マスク１０を使用するため、実装される位相差様式は、螺旋型の様式である。しかしながら、任意のタイプの位相差様式も、位相マスク１０、及び、より一般的には高分解能の顕微鏡の光線調節装置によって実装され得る。

ＳＰＣそのものの特徴は図２に示されている。図２では、強い位相差を与えるカバースリップの上の小粒の液浸油の滴が試験試料として使用されている。同一の関心領域について、４つの照射／走査の組み合わせの候補：インコヒーレントＬＥＤ照射、広視野検出（図２Ｄ）；インコヒーレントＬＥＤ照射、走査検出（図２Ｅ）；コヒーレント光線照射、広視野検出（図２Ｆ）；コヒーレント光線照射、走査の検出（図２Ｇ）を用いて記録された。同様に、コヒーレント照射の照射ビームに対する位相マスクの位置を観察した（図２Ａ、２Ｂ及び２Ｃ）。

図２Ａ、２Ｂ及び２Ｃにおいて、コヒーレント照射（レーザー）は螺旋を誘導し、それら螺旋の開始点は、位相マスクがわずかに中心からずれることによって生じることが示されている。コヒーレント照射による螺旋の開始点はこの位置に依存する。位相マスクの特異点、及び、この場合では位相マスクの面の螺旋形状が、照射ビームの中心になる場合、螺旋状の位相差は螺旋を誘導せず、変質を誘導し同心円となる（図２Ａ）。位相マスクをわずかにオフセットすることは螺旋状を誘導し、その螺旋の開始点は位相マスクの位置に依存する（図２Ｂ及び２Ｃ）。

広視野モード及び走査モードを比較している図２Ｄ、２Ｅ、２Ｆ及び２Ｇにおいて、インコヒーレントの照射（ＬＥＤ）については、本質的な違いは見られない（図２Ｄ及び２Ｅ）。一方、広視野配置のコヒーレント照射（レーザー）は、光路（図２Ｆ）中の、様々な面上の反射から発生する、干渉縞の強バックグラウンドをもたらす。走査を行なう構成では、このバックグラウンドは、試料の位置に関係なくより均一且つ一定である。なぜなら、走査を行なう構成では、画像の質が向上されるように、試料由来ではない影が、画像全体にわたって一定であるからである（図２Ｇ）。画像中の一定のオフセットは、表示のために取り除かれるが（コントラストの引き伸ばし）、画像は飽和しない。走査された画像は５０ｎｍの画素で記録された。

図３ａ及び３ｂにおいて、上述の開示された顕微鏡によって得られた神経細胞の位相差画像が示されている。図３ａには、インコヒーレント照射及び広視野検出を用いて画像が得られているのに対し、図３ｂには、インコヒーレント照射及び走査検出を用いて画像が得られている。図３ｃには、図３ａ及び３ｂに示される位相差画像から選ばれた関心領域の、従来の共焦点蛍光顕微鏡検査法によって得られた画像が示されている。図３ｄ及び３ｅには、上述の通り説明した顕微鏡を用いる高分解能のＳＴＥＤ法によって得られた、同じ関心領域の画像が示されており、図３ｅでは、Wienerフィルタリングによってノイズが抑えられている（図３ｄの挿入画は白棒に応じた強度特性を示している。）。

図３から分かるように、広視野及び走査ＳＰＣは、神経炎等の平らな細部を含む神経細胞をはっきりと見えるようにできる可能性があり、且つ、従来の共焦点蛍光顕微鏡検査法又は高分解能のＳＴＥＤ顕微鏡法によって画像化する関心領域を選択できるようにする可能性がある。

図４ａ及び４ｂには、図１の顕微鏡によって得られた星状細胞の走査ＳＰＣ画像が示されている。図４ｃ及び４ｄには、それぞれＳＰＣ顕微鏡法及び共焦点蛍光顕微鏡検査法による図１の顕微鏡によって得られた、包理された星状細胞中の細胞小器官の画像が示されており、図４ｅは、これらの２つの画像が重ねられたものである。図４ｆ、４ｇ及び４ｈには、それぞれ、共焦点蛍光顕微鏡検査法、既に開示された顕微鏡によって実行されたＳＴＥＤ顕微鏡法、及び、既に開示された顕微鏡によって実行された共焦点ＳＰＣによって、免疫染色されているアクチンフィラメントの画像得られている。

図４に見られるように、共焦点のＳＰＣの画像化は弱い位相物体を可視化する。（ａ）走査ＳＰＣを左右対称に配置することは、暗いバックグラウンド上の、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ中の星状細胞の輪郭を強調する。（ｂ）非対称配置は、ＤＩＣ（微分干渉コントラスト）における高バックグラウンド上での影効果による星状細胞を示す。（ｃ）輪郭検出は、包理された星状細胞中の細胞小器官の画像化を可能にする。（ｄ）免疫染色されているＶＡＭＰＳ３の共焦点の蛍光の画像化は、細胞小器官の外側の小胞を可視化する。（ｅ）ＳＰＣ及び蛍光画像は完全に重ね合され得る。（ｆ）神経細胞の神経細胞成長円錐の鋭い突起中の、免疫染色されているアクチンフィラメント（共焦点の蛍光の画像）。（ｇ）ＳＴＥＤ画像化は、放射状の組織の細部を分析することを可能にする。（ｇ）共焦点ＳＰＣ（緑）は、位相差法で、鋭い突起の視覚化を可能にする。対称輪郭検出は、ＳＴＥＤの画像（赤）によるオーバーレイに適している。スケールバー：（ｂ）５μｍ；（ｅ）１０μｍ；（ｈ）０．５μｍ。

本発明の顕微鏡を用いて、複数のＳＴＥＤ（又は共焦点蛍光）画像を同時に記録することができ、位相差画像法を行なう間は、スイッチ光線から容易に光学的に分離され得る照射が用いられる。この場合、位相マスクの波長が合っていなくても、ＳＰＣが維持される（Ｇ． Ｓｉｔｕ、Ｇ． Ｐｅｄｒｉｎｉ， 及びＷ． Ｏｓｔｅｎ、Ｊ． Ｏｐｔ． Ｓｏｃ． Ａｍ． Ａ ２６、１７８８ （２００９））。真の同時画像化は、ドリフトのために起こり得る位置合わせの不一致をなくす。螺旋状の位相差は、ＳＴＥＤの画像化の能力を欠損させることなく、ＳＴＥＤ顕微鏡に実装される。特に生物学的試料のために、第二のコントラストチャンネルとして機能する。

螺旋状の位相差（ＳＰＣ）を、ＳＴＥＤ顕微鏡１に取り込む際の付加的な光学部品は少しだけである。特に、同一の位相マスク１０はＳＴＥＤビーム５ｂを形成し、且つ、位相差を発生させる。２つのコントラストチャンネルによる細胞の画像化に際しては、ラベルフリーの位相差及び高分解能のＳＴＥＤ顕微鏡法が、実行され得る。

図６、７及び８に示されている他の実施形態において、位相差の画像化のために使用されている照射光源は、対物レンズ組み立て体３の第二の面の側に配置されている。特に、転移光源５ｂは、位相差照射のための照射光源として使用されている。図６、７及び８では、励起ビーム５ａを放つためのプローブ光源４ａ（Ｅｘｃレーザー）及びレーザービーム５ｂを放つための転移光源４ｂ（ＳＴＥＤ光線）を備えていることが示されているが、一つのレーザー装置のみを使用することもできる。

特に、図６は、転送方式における位相差照射のための照射光線として、ＳＴＥＤビーム５ｂを使用することを示している。図６に示されている第二の実施形態に係る顕微鏡１’は、位相マスク１０、対物レンズ組み立て体３、及び、試料２を連続して通過したＳＴＥＤビーム５ｂを受けるための強度検出器２６（位相 ｃｏｎｔ． Ｄｅｔ）が対物レンズ組み立て体３の第一の面の側に配置されているという点で、図１の形態と主に異なる。第二の実施形態に係る顕微鏡１’の他の一部は、第一の実施形態に既に開示されてものと類似している。類似したものに関する記載は繰り返さず、参照番号はこれまでの説明をさらに詳細にするために付される。

この実施形態では、ＳＴＥＤビーム５ｂはレンズ３０（Ｌ５）によって偏向維持ファイバー３２の中につながっている。この配置はＳＴＥＤビーム５ｂのビームの特性から不要なものを取り除き、且つ、振動を時間的に引き伸ばすために使用される。レンズ３１（Ｌ７）は出力結合器として機能する。しかしながら、不要なものを取り除き、且つ、振動を時間的に引き伸ばすためにファイバーを使用することは必須ではない。例えば、空間から不要なものを取り除くためのファイバーは、ピンホールに置換され得る。ＳＴＥＤビーム５ｂは、位相マスク１０を通過し、第一のレンズ及び第二のレンズ１１ｂ（Ｌ１及びＬ２）によって、対物レンズ組み立て体３の後焦点面上に投影される。

高分解蛍光画像化のために、蛍光マーカーは励起ビーム５ａによって試料２中で励起され、蛍光はプローブ検出器１５（ＦＬ Ｄｅｔ）によって検出される。上で説明されているように、同じ領域中の蛍光マーカーを、ＳＴＥＤビーム５ｂによって暗くし続けることができる。

位相差の画像化のために、ＳＴＥＤビーム５ｂを放つ光源４ｂは、位相差法のための照射ビームのためにも使用され得る：試料２を通過したＳＴＥＤ光源４ｂの光は、強度検出器２６上に投影される。図１に示される設備とは対照的に、位相差のための照射光は第一の位相差マスク１０、次いで試料２を通過する。

図７は、位相差照射のためのＳＴＥＤビーム５ｂを、逆反射体と共に使用することを示している。図７に示されている第三の実施形態に係る顕微鏡１’’は、反射素子（３５）が、対物レンズ組み立て体３を通過したＳＴＥＤ光線５ｂを反射するために、対物レンズ組み立て体３の第一の面の側に、試料２を設置するために規定されている場所から隔てて配置されているという点で図１の形態と主に異なる。この場合も先と同様に、第二の実施形態に係る顕微鏡１’の他の一部は、第一の実施形態に既に開示されてものと類似している。類似したものに関する記載は繰り返さず、参照番号はこれまでの説明をさらに詳細にするために付される。

ＳＴＥＤビーム５ｂは偏光ビームスプリッタ２４（ＢＳ）を通過する。次に、図３の第二の実施形態のように、ＳＴＥＤビーム５ｂはレンズ３０（Ｌ６）によって偏向維持ファイバー３２の中につながっている。レンズ３１（Ｌ７）は出力結合器として機能する。ＳＴＥＤビーム５ｂは、位相マスク１０を通過し、第一のレンズ１１ａ及び第二のレンズ１１ｂ（Ｌ１及びＬ２）によって対物レンズ組み立て体３の後焦点面上に投影される。４分の１波長板３７（ＱＷＰ）は、試料２中に回転偏光を生成するように機能する。

図６の第二の実施形態に関しては、高分解蛍光画像化のために、蛍光マーカーは、励起ビーム５ａによって試料２中で励起されており、且つ、蛍光はプローブ検出器１５によって検出されている。上で説明されているように、同じ領域中の蛍光マーカーを、ＳＴＥＤビーム５ｂによって暗くし続けることができる。

位相差画像法を行なうとき、ＳＴＥＤビーム５ｂは、試料２を通過した後に、レンズ２（Ｌ４）及び鏡３８（Ｍ）から成る逆反射体によって、反射され逆戻りする。球面鏡の使用は有利ではあるが必須ではない。逆進するビームは、２回通過した試料２を形成する位相の情報を伝える。位相マスク１０を二度目に通過した後、レンズ３１（Ｌ７）によって、共焦点検出ピンホールとして機能するファイバーの差し込み口上にフォーカスされる。ビームがファイバー３２に到達するとき、その偏光は、４分の１反射板３７を二重に通過するため、９０℃曲げられる。光は、偏光維持ファイバーから抜け出し、それ故、曲げられた偏光を有しており、偏光ビームスプリッタ２４によって強度検出器２６に向けて反射される。別の形態では、他の種類の逆反射体も使用され得る。

この配置は、同一のファイバー（又はピンホール）が、ＳＴＥＤビームを放ち、且つ、共焦点ピンホールとして機能するので、ＳＴＥＤビーム及び共焦点位相差検出が完全に一列に並んでいるという利点を有している。

図８は、逆反射体３５及びビーム走査と共に、位相差の照射のためのＳＴＥＤビーム５ｂを使用することを示している。図８に示されている第四の実施形態に係る顕微鏡１’’’は、走査鏡４０（ＳＭ）が試料２の全体を照射ビームで走査することを可能にするという点で図７の第三の実施形態と主に異なる。２つのレンズ（Ｌ９及びＬ１０）から成る第二のテレスコープ４１は、対物レンズ組み立て体３の口径上に、走査ミラーを撮像する。この場合も先と同様に、第四の実施形態に基づく顕微鏡１’’’の他の一部は、第一の実施形態について既に開示されているものに類似している。第四の実施形態に係る顕微鏡１’の他の一部は、第一の実施形態に既に開示されてものと類似している。類似したものに関する記載は繰り返さず、参照番号はこれまでの説明をさらに詳細にするために付される。

上述の本発明に関する記載は、蛍光マーカーを含んでいる物質を用いる誘導放出抑制（ＳＴＥＤ）タイプの顕微鏡について作成されている。本発明は、しかしながら、ＳＴＥＤ顕微鏡法に限られず、且つ、より一般的に、あらゆる種類の顕微鏡において実現され得る。例えば、一旦、波面調節光学装置を通過すると、第二分光特性を有する第二の状態にある物質を、第一分光特性を有する第一の状態に移すように構成されている第一の強度を有している第一の領域、並びに、少なくとも、第一及び第二の状態の間に物質を移さないように構成されている第二の強度を有している第二の領域を呈する転移光線を、スイッチ光線が含む可逆飽和性光学蛍光転移（ＲＥＳＯＬＦＴ）顕微鏡等である。物質は、第一の状態及び第二の状態を有し、下記の特徴的な特性を含む物質から選ばれる。

−第一の状態と第二の状態とで、プローブビームの光吸収が変化するもの、
−第一の状態と第二の状態とで、プローブビームのための偏光特性が変化するもの、
−第一の状態と第二の状態とで、蛍光、燐光、電界発光及び化学発光から選ばれる発光が変化するもの。

図１は、本発明の第一の実施形態に係る、高空間分解能で画像化するための顕微鏡の主な要素の略図であり、対物レンズ組み立て体を実装している顕微鏡、転移光線及び照射光線を放つ光源、高空間分解能の画像化のための位相マスク及びプローブ形検出器、並びに、位相差の画像化のための照射光源及び強度検出器の略図である。 図２は、カバースリップ上の小さな液浸油滴から成る試料の、図１の顕微鏡によって得られた位相差画像である。上記試料は、照射光源から放たれ、試料（Ａ、Ｂ、Ｃ）、及び、４つの照射／走査の組み合わせの候補：インコヒーレント照射光線／広範囲検出（Ｄ）、インコヒーレント照射光線／走査検出（Ｅ）、コヒーレント照射光線／広範囲検出（Ｆ）、コヒーレント照射光線／走査検出（Ｇ）、を通過した照射光線毎に、位相マスクの位置が異なる。 図３は、（ａ）インコヒーレント照射及び広範囲検出を用いた図１の顕微鏡によって得られた神経細胞の位相差画像、（ｂ）インコヒーレント照射及び走査検出を用いた図１の顕微鏡によって得られた神経細胞の位相差画像、（ｃ）従来の共焦点蛍光顕微鏡検査法によって得られた位相差画像から選ばれた関心領域の画像、並びに、（ｄ、ｅ）図１の顕微鏡によって得られた関心領域のＳＴＥＤの画像を示している。 図４は、（ａ、ｂ）図１の顕微鏡によって得られた星状細胞の走査ＳＰＣの画像、（ｃ）図１の顕微鏡によって得られた、包理された星状細胞中の細胞小器官のＳＰＣ画像、（ｄ）図１の顕微鏡によって得られた、包理された星状細胞中の細胞小器官のＳＴＥＤ画像、（ｃ）図１の顕微鏡によって得られた、包理された星状細胞中の細胞小器官のＳＰＣ及びＳＴＥＤ画像の重ね合わせ、（ｆ）免疫染色されているアクチンフィラメントの共焦点蛍光画像、（ｇ）図１の顕微鏡によって得られた、免疫染色されているアクチンフィラメントのＳＴＥＤ画像（ｈ）図１の顕微鏡によって得られた、免疫染色されているアクチンフィラメントの共焦点ＳＰＣ画像を示している。 図５は、転移光線及びプローブ光線が、二つの異なる光源によって放たれる、図１の実施形態の別の形態に係る、高空間分解能で画像化するための顕微鏡の主な要素の略図である。 図６は、転移光源が、転送方式の位相差顕微鏡のための照射光源としてもまた使用される、本発明の第二の実施形態に係る、高空間分解能で画像化するための顕微鏡の主な要素の略図である。 図７は、転移光源が、逆反射体と共に位相差顕微鏡のための照射光源としてもまた使用される、本発明の第三の実施形態に係る、高空間分解能で画像化するための顕微鏡の主な要素の略図である。 図８は、スイッチ光源が、逆反射体及びビーム走査と共に位相差顕微鏡のための照射光源としてもまた使用される、本発明の第四の実施形態に係る、高空間分解能で画像化するための顕微鏡の主な要素の略図である。

Claims (26)

1. 物質を含んでいる試料（２）中の関心組織を高空間分解能で画像化するための顕微鏡（１；１’；１’’；１’’’）であって、上記物質は第一分光特性を有している第一の状態及び第二分光特性を有している第二の状態を有しており、上記顕微鏡（１；１’；１’’；１’’’）は、
   −互いに反対を向いている第一及び第二の面を有しており、且つ上記第一及び第二の面の側に第一及び第二の焦点面がそれぞれ存在しており、上記試料（２）は上記第一の面の側に置かれるためのものである、対物レンズ組み立て体（３）、
   −上記対物レンズ組み立て体（３）を通って上記試料（２）に向けて転移光線（５ｂ）を放つために、上記対物レンズ組み立て体（３）の上記第二の面の側に配置され、上記転移光線（５ｂ）は強度及び位相の特性を有している、転移光源（４ｂ）、
   −上記転移光源（４ｂ）及び上記対物レンズ組み立て体（３）の間に設置されている光線調節装置（１０）であって、上記転移光線（５ｂ）が、上記光線調節装置（１０）と上記対物レンズ組み立て体（３）とを通過した後に、上記第二の状態にある上記物質を、上記第一の状態に移すように適応されている第一の強度を有している第一の強度の領域、及び、上記第一と第二の状態との間に上記物質を移さないように適応されている第二の領域を有している第二の強度の領域を少なくとも呈するように、空間的に上記転移光線（５ｂ）を変化させるように構成されている上記光線調節装置（１０）、
   −上記第二の状態にある物質の一部から、光学測定信号を検出するように構成されているプローブ検出器（１５）、
   を含んでおり、
   −さらに、位相差を発生させるように構成されている上記光線調節装置（１０）、
   −上記試料（２）に向けて照射光線（１７；５ｂ）を放つように配置されており、上記照射光線（１７；５ｂ）は強度及び位相の特性を有している、照射光源（１６；４ｂ）、並びに、
   −上記照射光線（１７；５ｂ）が、上記試料（２）、上記対物レンズ組み立て体（３）及び上記光線調節装置（１０）を少なくとも１回通過した後に、上記照射光線（１７；５ｂ）の強度を検出するように配置されている強度検出器（２６）
   を含む位相差顕微鏡検査システムを含むことを特徴とする顕微鏡（１；１’；１’’；１’’’）。
2. 上記光線調節装置（１０）は、上記第一の強度の領域が上記第二の強度の領域を囲むように上記転移光線（５ｂ）を変化させるように構成されている、請求項１に記載の顕微鏡（１；１’；１’’；１’’’）。
3. 上記光線調節装置（１０）は、上記転移光線（５ｂ）及び上記照射光線（１７；５ｂ）の位相の特性を調節するように構成されている位相マスクである、請求項１又は２に記載の顕微鏡（１；１’；１’’；１’’’）。
4. 上記光線調節装置（１０）は、角度依存の位相シフトを、上記転移光線（５ｂ）の位相の特性及び上記照射光線（１７；５ｂ）の位相の特性に適用するように構成されている螺旋状の位相マスクである、請求項３に記載の顕微鏡（１；１’；１’’；１’’’）。
5. 上記物質は、上記第二の状態から上記第一の状態へ弛緩するとき蛍光を発する蛍光マーカーを含み、上記顕微鏡は上記転移光線（５ｂ）と重ねられるプローブ光線（５ａ）を放つように構成されているプローブ光源（４ａ）をさらに含み、上記プローブ光線（５ａ）は、上記第一の状態にある上記マーカーを上記第二の状態に移すように構成されている強度を有しており、上記第一の強度の領域における上記転移光線（５ｂ）は、上記マーカーの第二の状態を抑制させるように構成されている、請求項１〜４のいずれかに記載の顕微鏡（１；１’；１’’；１’’’）。
6. 上記転移光源（４ｂ）及び上記プローブ光源（４ａ）は、上記転移光線（５ｂ）及び上記プローブ光線（５ａ）の両方を生じさせる単一の光源（４）を形成する、請求項５に記載の顕微鏡（１）。
7. 上記試料（２）が上記転移光線（５ｂ）によって走査され得るように、上記転移光線（５ｂ）及び上記試料（２）を互いに相対的に移動させるように構成されている、転移光走査配置をさらに有する、請求項１〜６のいずれかに記載の顕微鏡（１；１’；１’’；１’’’）。
8. 上記試料（２）が上記照射光線（１７；５ｂ）によって走査され得るように、上記照射光線（１７；５ｂ）及び上記試料（２）を、互いに相対的に移動させるように構成されている、照射光走査配置をさらに有する、請求項１〜７のいずれかに記載の顕微鏡（１；１’；１’’；１’’’）。
9. 上記強度検出器（２６）は、画素化検出器である、請求項１〜８のいずれかに記載の顕微鏡（１；１’；１’’；１’’’）。
10. 上記画素化検出器は、ＣＣＤカメラである、請求項９に記載の顕微鏡（１；１’；１’’；１’’’）。
11. 上記画素化検出器は、ＣＭＯＳカメラである、請求項９に記載の顕微鏡（１；１’；１’’；１’’’）。
12. 上記強度検出器（２６）は、単一の画素検出器である、請求項１〜８のいずれかに記載の顕微鏡（１；１’；１’’；１’’’）。
13. 上記単一の画素検出器は、アバランシェフォトダイオードである、請求項１２に記載の顕微鏡（１；１’；１’’；１’’’）。
14. 上記単一の画素検出器は、光電増倍管である、請求項１２に記載の顕微鏡（１；１’；１’’；１’’’）。
15. 上記照射光源（１６；４ｂ）は、コヒーレント光源を含む、請求項１〜１４のいずれかに記載の顕微鏡（１；１’；１’’；１’’’）。
16. 上記コヒーレント光源は、レーザー装置である、請求項１５に記載の顕微鏡（１；１’；１’’；１’’’）。
17. 上記照射光源（１６）は、インコヒーレント光源を含む、請求項１〜１４のいずれかに記載の顕微鏡（１）。
18. 上記インコヒーレント光源は、発光ダイオードである、請求項１７に記載の顕微鏡（１）。
19. 上記インコヒーレント光源は、水銀灯である、請求項１７に記載の顕微鏡（１）。
20. 上記インコヒーレント光源は、ハロゲンランプである、請求項１７に記載の顕微鏡（１）。
21. 上記照射光源（１６）は、上記対物レンズ組み立て体（３）の上記第一の面の側に、上記試料（２）を設置するために規定されている場所から隔てて配置されている、請求項１〜２０のいずれかに記載の顕微鏡（１）。
22. 上記強度検出器（２６）は、上記対物レンズ組み立て体（３）の第二の面の側に配置されている、請求項２１に記載の顕微鏡（１）。
23. 上記照射光源（５ｂ）は、上記対物レンズ組み立て体（３）の第二の面の側に配置されている、請求項１〜２０のいずれかに記載の顕微鏡（１’；１’’；１’’’）。
24. 反射素子（３５）は、上記対物レンズ組み立て体（３）の第一の面の側に、上記試料（２）を設置するために規定されている場所から隔てて、配置されている、請求項２３に記載の顕微鏡（１’；１’’；１’’’）。
25. 上記強度検出器（２６）は、上記対物レンズ組み立て体（３）の第一の面の側に配置されている、請求項２３に記載の顕微鏡（１’）。
26. 上記転移光線（５ｂ）は、上記照射光線（１７；５ｂ）である、請求項２３〜２５のいずれかに記載の顕微鏡（１’；１’’；１’’’）。
    

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