PT110747B

PT110747B - Dispositivo para melhorar o desempenho em microscopia por depleção da emissão estimulada (sted) usando uma única máscara de fase

Info

Publication number: PT110747B
Application number: PT110747A
Authority: PT
Inventors: José Abrantes Guedes Da Fonseca Pereira António
Original assignee: Inst De Biologia Molecular E Celular Ibmc
Priority date: 2018-05-18
Filing date: 2018-05-18
Publication date: 2023-02-10
Also published as: WO2019221622A1; PT110747A; US20210208379A1; US11487098B2; EP3853650A1

Abstract

A PRESENTE INVENÇÃO REFERE-SE A UM MÉTODO PARA MICROSCOPIA DE ALTA RESOLUÇÃO ESPACIAL COMPREENDENDO UMA PLACA DE FASE OU UM MODULADOR ESPACIAL DE LUZ PARA MICROSCOPIA DE DEPLEÇÃO DA EMISSÃO ESTIMULADA (''STIMULATED EMISSION DEPLETION'' - STED) E MICROSCOPIA DE TRANSIÇÕES ÓPTICAS FLUORESCENTES REVERSÍVEIS SATURÁVEIS (''REVERSIBLE SATURABLE OPTICAL FLUORESCENCE TRANSITION'' - RESOLFT) NO GERAL, EM QUE UM PADRÃO BIVÓRTICE É IMPRESSO NA DITA PLACA DE FASE OU MODULADOR ESPACIAL DE LUZ PARA GERAR UM FEIXE. O PADRÃO BIVÓRTICE PERMITE ALGUMA LIBERDADE NA CONFORMAÇÃO DO FEIXE STED DE FORMA A MELHORAR O DESEMPENHO AXIAL E A CAPACIDADE DE SECCIONAMENTO ÓPTICO DESTA MICROSCOPIA. A PRESENTE INVENÇÃO REFERE-SE AINDA A UM MÉTODO PARA MICROSCOPIA STED E RESOLFT COMPREENDENDO O PASSO DE MODULAÇÃO DA FASE ÓPTICA DA LUZ NUMA PLACA DE FASE OU NUM MODULADOR ESPACIAL DE LUZ COM UMA MÁSCARA DE FASE COMPREENDENDO UM PADRÃO EM BIVÓRTICE COM UM RAIO AJUSTÁVEL. AS MÁSCARAS DE FASE E OS MÉTODOS DE MICROSCOPIA DE STED E RESOLFT AQUI DIVULGADOS PODEM SER VANTAJOSAMENTE APLICADOS PARA FORNECER UM REGIME HÍBRIDO 2D/3D, MAS COM UMA REDUÇÃO SIGNIFICATIVA NOS GRAUS DE LIBERDADE PARA ALINHAMENTO EM RELAÇÃO AO QUE É ENCONTRADO EM SUPERPOSIÇÕES INCOERENTES DE FEIXE, PROPORCIONANDO ASSIM UMA MELHORIA NA QUALIDADE DO FEIXE, OU SEJA, UMA INTENSIDADE CENTRAL MINIMIZADA E MENOR SENSIBILIDADE A ABERRAÇÕES, RESULTANDO NUM NÍVEL DE SINAL E NUM DESEMPENHO AXIAL AUMENTADOS.

Description

DESCRIÇÃO

DISPOSITIVO PARA MELHORAR O DESEMPENHO EM MICROSCOPIA POR DEPLEÇÃO DA EMISSÃO ESTIMULADA (STED) USANDO UMA ÚNICA MÁSCARA DE FASE

Campo técnico da invenção

A presente invenção refere-se a placa de fase ou um dispositivo modulador espacial de luz para microscopia de depleção da emissão estimulada (STimulated Emission Depletion - STED) e microscopia de transições ópticas fluorescentes reversíveis saturáveis (Reversible Saturable OpticaL Fluorescence Transitions - RESOLFT) no geral, que resulta da impressão de uma função matemática bivórtice numa máscara monofásica e que permite moldar o feixe STED para proporcionar um melhor desempenho axial, maior resolução e maior nível de sinal.

Assim, a presente invenção enquadra-se no campo técnico da

Física, Instrumentos, Óptica e Dispositivos ou arranjos para o controlo da fase da luz.

Estado da arte

A microscopia de fluorescência é convencionalmente limitada a uma resolução de aproximadamente metade do comprimento de onda da radiação usada para excitar a amostra fluorescente. Isto é conhecido como o 'limite de difração'. Têm sido desenvolvidas técnicas que contornar este limite, aproveitando a resposta nãolinear dos fluoróforos à luz, tal como na família de técnicas de microscopia de transições ópticas fluorescentes reversíveis saturáveis (Reversible Saturable OpticaL Fluorescence Transitions - RESOLFT. Nesta família, o caso particular da microscopia de depleção de emissão estimulada (STimulated Emission Depletion - STED) (Hell and Wichmann, 1994, Klar et al., 2000) supera o limite de difração depletando as áreas periféricas do ponto excitado antes que elas possam emitir luz fluorescente espontaneamente. Essa depleção é alcançada pelo processo de emissão estimulada e geralmente é implementada ao atingir a amostra com o chamado feixe de STED, que apresenta um ponto escuro central cercado por regiões de alta intensidade (Keller et al., 2007). Como resultado, apenas a parte central do ponto excitado irá sobreviver à ação do feixe de depleção STED e, assim, eventualmente, emitir fluorescência. De maneira análoga, a família de métodos RESOLFT (da qual o STED é um caso particular) exige igualmente o uso de um feixe com uma mancha escura central e com um padrão de intensidade similar. O método STED é usado aqui como exemplo paradigmático na discussão da geração de feixes RESOLFT.

As implementações típicas da microscopia STED usam uma ou mais máscaras de fase que são colocadas aproximadamente em (ou aproximadamente em um plano conjugado com) o plano focal posterior da objetiva do microscópio. O dispositivo que define a máscara de fase pode ser uma placa de fase estruturada (polímero ou vidro, por exemplo) ou um dispositivo dinamicamente controlável (modulador espacial de luz). Os feixes STED particulares fornecidos pela ação dessas máscaras de fase definem dois modos STED padrão: 2D STED e 3D STED. Este último é às vezes chamado alternativamente de z-STED. Conforme descrito em mais detalhes abaixo, os 2D STED e 3D STED são modos discretos com méritos de desempenho complementares

Uma depleção mais isotrópica pode ser conseguida pela combinação dos modos de 2D e 3D, que requerem o uso de duas máscaras de fase (Harke et al., 2008). Este modo híbrido funciona através da realização de uma sobreposição incoerente de componentes de dois feixes e é implementado em vários sistemas STED comerciais, e têm sido usadas diferentes estratégias para evitar os problemas inerentes de alinhamento incorreto que surgem do fato de que dois componentes de feixe independentes têm de coalescer precisamente na amostra.

STED 2D convencional usa uma máscara de fase de rampa helicoidal para criar um feixe em formato de donut com uma intensidade nula ao longo do eixo óptico e um anel de maior intensidade em torno do deste eixo, exibindo um perfil de intensidade íngreme e profundo (Keller et al., 2007, Torok e Munro, 2004).

Sujeita a este perfil de depleção, a fonte de fluorescência torna-se mais fina no plano XY, atingindo rotineiramente uma dimensão lateral bem abaixo de um décimo do comprimento de onda do feixe de depleção (Westphal e Hell, 2005). No entanto, este método STED 2D não melhora a resolução axial (> 500nm) ou o seccionamento óptico , com estes aspectos permanecendo iguais aos níveis ligados à microscopia confocal convencional.

Estes aspectos (resolução axial, seccionamento óptico) podem ser melhorados usando um feixe de STED 3D (LAR K et al., 200 0) que depleta o ponto de excitação preferencialmente acima e abaixo do plano focal, ao longo do eixo óptico. Este modo de operação é muito eficaz na melhoria da resolução axial. No entanto, ele fálo à custa de uma melhoria significativamente mais fraca na resolução lateral e de uma depleção mais ineficiente de áreas de excitação secundárias, em comparação com o modo STED 2D, fazendo com que o STED 3D tenha inerentemente mais nível de ruído do que o STED 2D. Além disso, a dimensão da máscara de fase no STED 3D deve ser precisamente sintonizada e as aberrações devem ser bem controladas de modo que uma intensidade de zero central seja formada de facto.

STED 2D e 3D são, portanto, modos discretos de operação com atributos complementares em relação à redução da fonte fluorescente efectiva e nenhum se destaca por diminuir a fonte de fluorescência isotropicamente. No entanto, como os feixes STED 2D e 3D se tornam significativamente incoerentes, os seus perfis de intensidade podem ser adicionados para obter um modo híbrido que permite uma redução mais isotrópica da fonte fluorescente. Assim, este modo STED híbrido incoerente (incoherent hybdid - IH) requer o uso de mais do que uma máscara de fase. Os modos STED 2D, 3D e IH são implementados em muitos sistemas STED, incluindo os comercialmente disponíveis. 0 facto de o STED IH exigir o uso de duas máscaras de fase, significa que é crítico que os zeros centrais dos feixes transformados devem ser alinhados precisamente. Desalinhamentos relativos e imperfeições do feixe no STED IH podem gerar efeitos de aberração composta complexos, bem como um preenchimento indesejado do central (Antonello et al., 2016, Booth et al., 2015), que comprometem a melhoria da resolução, diminui o sinal detectável e pode comprometer a simetria da depleção.

Um modo híbrido sintonizável que seja capaz de proporcionar resolução lateral de nível 2D com melhor isotropia, enquanto evita o uso de múltiplas máscaras de fase, está ausente no estado da técnica anterior e no conjunto de ferramentas para microscopia STED.

Estes fatos são divulgados para ilustrar o problema técnico abordado pela presente divulgação.

Sumário da invenção

A presente invenção refere-se a uma placa de fase ou modulador de espacial de luz para microscopia de depleção da emissão estimulada (STimulated Emission Depletion - STED) e microscopia de transições ópticas fluorescentes reversíveis saturáveis (Reversible Saturable OpticaL Fluorescence Transitions - RESOLFT) no geral caracterizado por, compreender um padrão bivórtice com duas seções de vórtice, um vórtice interno em forma de disco e um vórtice externo em forma de anel, com um raio ajustável, numa única máscara de fase.

Noutra forma de realização da presente invenção, a placa de fase ou dispositivo modulador espacial de luz é caracterizada por, compreender uma fase entre o vórtice interno e o vórtice externo, de acordo com o raio de cada vórtice, sendo o raio do vórtice interno mais preferencialmente menor que o raio do vórtice externo.

Noutra forma de realização da presente invenção, a placa de fase ou dispositivo modulador espacial de luz é caracterizado por, compreender um padrão bivórtice onde o passo de fase na transição entre os dois vórtices tem uma magnitude entre 0 e 2ηπ radianos, mais preferencialmente (2η+1)π radianos, onde n é qualquer número natural.

Noutra forma de realização da presente invenção, a placa de fase ou modulador espacial de luz é caracterizado por, compreender uma transição suavizada entre vórtices.

Noutra forma de realização da presente invenção, a placa de fase ou modulador espacial de luz é caracterizado por compreender mais do que duas estruturas em vórtice.

Noutra forma de realização da presente invenção, a placa de fase ou modulador espacial de luz é caracterizado por compreender uma máscara de fase arbitrária, dentro ou fora das regiões com padrão bivórtice.

A presente invenção também se refere a um método para a microscopia STED e RESOLFT no geral caracterizado por, compreender o passo de: modular a fase da radiação numa placa de fase ou num modulador espacial de luz gerando uma máscara de fase com um padrão bivórtice com duas seções de vórtice, um vórtice interno em forma de disco e um vórtice externo em forma de anel, com um raio ajustável, numa única máscara de fase, como descrito acima.

A presente invenção também se refere a um método para a microscopia

STED e RESOLFT no geral caracterizado por, compreender o passo de: modular a fase da radiação numa placa de fase ou num modulador espacial de luz gerando, através de compensação ou do uso de funções de correcção de fase, uma máscara de fase com um padrão bivórtice com duas seções de vórtice, um vórtice interno em forma de disco e um vórtice externo em forma de anel, com um raio ajustável, numa única máscara de fase, como descrito acima.

As máscaras de fase e os métodos de microscopia de STED e RESOLFT aqui divulgados podem ser vantajosamente aplicados para proporcionar um regime híbrido 2D/3D, mas com uma redução significativa nos graus de liberdade para alinhamento em relação ao que é encontrado em superposições incoerentes de feixe, proporcionando assim uma melhoria na qualidade do feixe, ou seja, uma intensidade central minimizada e menor sensibilidade a aberrações, resultando num nível de sinal e num desempenho axial aumentados.

Descrição da Invenção

A presente invenção divulga uma placa de fase para microscopia STED e RESOLFT que resulta da impressão de uma nova função matemática bivórtice numa única máscara de fase ou numa placa de fase que permite algum grau de liberdade na modelagem do feixe para um regime híbrido 2D/3D e resulta num desempenho axial significativamente melhorado. 0 modo de operação STED proporcionado pela acção da máscara de fase ou placa de fase em bivórtice é aqui designado por STED coerente-híbrido (CH-STED).

Uma vantagem clara da máscara de fase de CH-STED é uma redução significativa nos graus de liberdade para o alinhamento e a consequente melhoria na qualidade do feixe, nomeadamente, um centro de intensidade minimizada, com um nível de sinal aumentado.

Numa forma de realização da presente invenção, o feixe de laser ST ED 2D é transformado pela placa de fase para obter super6 resolução axial e seccionamento óptico melhor do que o confocal, com apenas uma máscara de fase. Na forma de realização preferida, o CH-STED é caracterizado por uma máscara de fase ou placa de fase com padrão bivórtice compreendendo duas seções de vórtice (também conhecidas como rampas de fase helicoidal): um vórtice interno em forma de disco e um externo e forma de anel. A função matemática que representa o atraso de fase ( φ) da máscara de fase do bi-vórtice é:

Φ(τ,θ) ηθ ηθ + απ if r< η if r₂ > r> η (Eq.l) onde r é a distância perpendicular ao eixo óptico, Θ é o ângulo azimutal e η e r₂ definem o raio do vórtice interno e externo, respectivamente (Fig.la), n é um integrador que é igual a 1 para melhor resolução e a , cujo padrão é 1, é um parâmetro livre que pode ser usado para refinar a distribuição axial do feixe. Na prática, r₂ é definido pela dimensão transversal do sistema óptico (Fig.lb), que limita o raio efetivo do elemento de fase impresso.

Numa outra forma de realização da presente invenção, a transformação do feixe STED na máscara de fase ou na placa de fase para CH-STED, é caracterizado por compreender um parâmetro definido por:

c = rjr₂ que varia numa gama entre 0 e 1.

CH-STED tende ao regime STED 2D quando c se aproxima de 1. Este modo limite é entendido notando que neste caso o tamanho finito da lente do microscópio não permite que a informação derivada da seção de vórtice externa seja transmitida ao plano da amostra, deixando o vórtice interno como o único vórtice operando no feixe efetivo, como no STED 2D. Da mesma forma, pode-se notar que a família de funções bivórtice definidas pela Eq.l torna-se um modo STED 2D padrão quando a tende a um múltiplo de 2 (incluindo 0), caso em que a máscara degenera para um único vórtice porque o passo de fase entre os vórtices desaparece.

Ao sair do regime 2D puro, que ocorre, por exemplo, diminuindo o parâmetro c abaixo de 1, a resolução lateral cai gradualmente abaixo da linha de base do STED 2D, a menos que a potência do feixe STED seja aumentada. Isto é acompanhado por um aumento no seccionamento óptico, bem como na resolução axial. Isso pode ser visto pelo facto de o feixe CH-STED não só atenuar passivamente o sinal acima e abaixo do plano focal (como acontece num microscópio confocal), mas também o depleta ativamente, agindo como um elemento de super-resolução.

A alteração qualitativa observada no CH-STED é, por conseguinte, uma transição das linhas de contorno de intensidade de convexas para côncavas, observadas a partir do ponto nodal (Fig.2), gerando assim um grau de confinamento axial que está ausente no modo 2D. Esta transformação pode ser visualizada como uma deleção dos bordos do feixe de depleção 2D em torno ou perto do ponto focal (Fig.2).

A máscara de fase bivórtice gerada (Eq.l e Fig.l) fornece a estrutura de base que proporciona uma melhoria qualitativa no desempenho axial (seccionamento óptico, e resolução axial) relativamente ao modo STED 2D puro (Fig.3).

É importante ressaltar que o desempenho não é comprometido pela aplicação de algumas transformações à sua estrutura (Fig.4), nomeadamente:

- suavização da transição entre vórtice;

- adição de outras funções de vórtice;

- inclusão de uma função de fase arbitrária dentro do bivórtice;

- adição de uma função arbitrária fora da região bivórtice;

Em geral, a melhoria descrita nesta invenção ocorre sempre que uma secção de vórtice dentro de uma de máscara de fase arbitrária é substituída por um bivórtice, independentemente da estrutura remanescente da máscara de fase.

Além disso, noutra forma de realização da presente invenção, o bivórtice pode ser definido por uma transição inter-vórtice completa deDK radianos (a = 1, como nas Figs.4 a e b) ou por uma transição inter-vórtice incompleta {a / 1, Fig.4 c) , pois não compromete a geração da mancha escura requerida no centro.

Uma máscara de fase CH-STED é capaz de, sem exigir uma pluralidade de máscaras, fornecer uma contração mais isotrópica da fonte fluorescente efetiva do que as máscaras 2D ou 3D sozinhas. No entanto, esta invenção não impede ou limita o uso de máscaras adicionais para gerar feixes com características específicas através de combinações dos mesmos. Como exemplo, o STED-IH, que normalmente usa uma placa de fase com uma máscara de fase 2D e outra 3D, pode ser usado para combinar a máscara CH-STED com a máscara STED 2D. Qualquer outra combinação é permitida, desde que a principal característica seja que pelo menos uma das máscaras de fase ou placa de fase utilize uma função de fase que compreende um bivórtice.

A ação do bivórtice na máscara de fase CH-STED descrita acima é incorporada num dispositivo de modulação da fase física da luz que é colocado ao longo do trajecto do feixe do laser STED. 0 dispositivo que define a máscara de fase pode ser uma placa estruturada, conhecida por placa de fase (compreendendo polímero ou vidro estruturado, por exemplo) ou um dispositivo endereçável dinamicamente (tal como modulador de espacial luz). As diferentes seções do feixe óptico que passa pelo dispositivo sofrerão mudanças de fase de acordo com a máscara de fase CHSTED impressa, transformando o feixe.

padrão de feixe transformado exibe as caracteristicas desejadas quando a máscara de fase é colocada num plano conjugado com a abertura posterior da objetiva do microscópio, embora mudanças desse regime não façam fundamentalmente comprometer o desempenho do método.

Numa outra forma de realização da presente invenção, um método para a microscopia STED e RESOLFT no geral pode ser desenvolvido compreendendo o passo de: modulação da fase da radiação numa placa de fase ou num modulador espacial de luz gerando uma máscara de fase com um padrão bivórtice com duas seções de vórtice, um vórtice interno em forma de disco e um vórtice externo em forma de anel, com um raio ajustável, numa única máscara de fase, como descrito acima.

Numa outra forma de realização da presente invenção, as máscaras de fase para CH-STED utilizadas na presente invenção compreendem uma modulação da placa de fase ou do um modulador espacial de luz existentes de acordo com as caracteristicas instrumentais da configuração óptica. Por exemplo, um componente de fase de onda senoidal pode ser incluído na função de máscara de fase impressa para permitir o ajuste da direção do feixe depois de passar pelo dispositivo de modulação de fase. Além disso, uma função instrumental conhecida como correcção de campo plana pode ser incluída para compensar a forma particular do feixe original (não transformado) ou, mais geralmente, uma função de compensação de aberração pode ser utilizada. A caracteristica essencial que caracteriza a presente invenção é que a função de fase compreende uma máscara de fase com padrão bivórtice (Fig. 4) . No jargão óptico, dir-se-ia que a função de fase bivórtice é considerada a máscara de fase eficaz ou é um componente desta. Assim, outra forma de realização da presente invenção, um método para microscopia STED e RESOLFT pode ser desenvolvido por compreender um passo de: a modulação da fase física de um feixe de laser utilizando compensação ou funções de correcção de fase na placa de fase ou um dispositivo de luz modulador espacial para gerar uma máscara de fase eficaz como descrito acima.

Breve Descrição das Figuras

Figura 1: Desenhos do padrão bivortex da máscara de fase, a) A placa de fase eficaz da função de máscara é definida como um vórtice em forma de disco rodeado por um vórtice em forma de anel. A linha que separa as duas seções (com um raio rl) define um deslocamento de fase de π . b) Na prática, o vórtice (externo) do anel pode ter um raio arbitrário maior que r2, com a geometria da lente do microscópio limitando tipicamente o raio efetivo da função de fase para r2.

Figura 2: Feixe depleção CH-STED gerado por uma placa de fase compreendendo uma máscara de fase em bivórtice. As imagens mostram sinais espalhados por nanoesferas de ouro quando sijeitas a varrimento pelo laser de depleção STED. Estas imagens são, portanto, representações da seção transversal da geometria do feixe STED. A transformação do feixe de depleção CH-STED é observada diminuindo o parâmetro c abaixo de 1. As alterações morfológicas são caracterizadas principalmente por um alargamento da mancha central escura, que ocorre seletivamente no plano focal, juntamente com um alongamento global da estrutura focal do feixe.

Figura 3: CH- STED empregando a máscara de fase com padrão bivórtice para obtenção de imagens de um fuso mitótico. A metade superior do fuso mitótico é visualizada com 2D STED (que corresponde a CH-STED com c=l) , que é alternado para CH-STED na metade inferior (c<l). Todos os outros parâmetros de aquisição permanecem inalterados. Pode ser visto que, embora seja esperada alguma perda de resolução xy ao diminuir c abaixo de 1, a redistribuição do feixe de depleção torna-se mais efetiva em expor os filamentos que compõem o objecto, devido a um melhor desempenho axial , com um volume de depleção alongado . Quando necessário, a perda na resolução xy é compensada por um aumento da intensidade do laser de depleção.

Figura 4: Concretizações ilustrativas compreendendo a função de fase bivórtice impressa na placa de fase, a) Exemplo de uma máscara de fase CH -STED onde funções arbitrárias (representados por um pontuado negro) são adicionadas dentro e/ou fora da função de fase bivórtice . b) Exemplo de uma função de máscara onde a transição de fase entre duas seções do bivórtice é suavizada por convolução. c) Exemplo da máscara de fase bivórtice da placa de fase quando os dois vórtices são deslocados por um valor απ , com a diferente de 1.

Exemplos

Exemplo 1: Produção de uma placa de fase gerando máscara de fase bivórtice

Num exemplo, a máscara de fase bivórtice da presente invenção é gerada por um dispositivo de placa de fase. Tal dispositivo pode ser produzido pela elaboração do negativo do bivórtice da máscara de fase da presente de invenção sobre um molde e pela revelação do molde para se obter uma placa de fase com padrão bivórtice. 0 fabrico do molde pode ser conseguido por métodos conhecidos na técnica, por exemplo, os descritos por Oemrawsingh et al, 2004, com o passo adicional de compreender um passo de: conceber o molde como um negativo da fase de mascara da presente invenção. Pela libertação do molde, uma placa de fase sólida com uma configuração bivórtice é obtida.

Exemplo 2: Produção da máscara de fase bivórtice por um modulador espacial de luz

Noutro exemplo, a máscara de fase bivórtice da presente invenção pode ser gerada por um modulador espacial de luz. Este pode ser produzido através da integração um semicondutor de metal-óxido complementar (complementary metal-oxide-semiconductor - CMOS) no modulador espacial de luz, por métodos tais como os descritos na técnica (ZHU, et al 2004.), com a adição de um passo compreendendo: controlar o modulador espacial de luz de forma a imprimir o bivórtice da máscara de fase da presente invenção, através do controlo electrónico de suas subunidades.

Exemplo 3: Método de microscopia STED empregando uma máscara de fase bivórtice através de funções de compensação ou correcção.

Um outro exemplo de um a forma de realização da presente invenção refere-se a um método para a microscopia STED que pode ser desenvolvido através de um passo que compreende: a modulação da fase física de um feixe de radiação pela placa de fase existente ou por um um modulador espacial de luz utilizando funções de compensação ou de correcção de fase para, em última análise, gerar fase a máscara bivórtice da presente invenção como a máscara de fase efectiva, ou como um componente da máscara de fase efetiva.

Referências

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Placa de fase ou dispositivo modulador espacial de luz para microscopia de depleção da emissão estimulada (STED)e microscopia de transições óticas fluorescentes reversíveis saturáveis (RESOLFT), compreendendo uma máscara de fase única composta por um perfil bi-vortex com duas secções de vórtice, um vórtice em forma de disco interno e um vórtice em forma de anel exterior, e uma transição inter-vórtice suavizada de π radianos completos.
2. PIaca de fase ou o dispositivo modulador espacial de luz de acordo com a reivindicação 1, compreendendo ainda uma mudança de fase entre o vórtice interno e o vórtice externo.
3. PIaca de fase ou o dispositivo modulador espacial de luz de acordo com a reivindicação 2, em que a mudança de fase tem uma magnitude entre 0 e 2 π radianos, mais preferencialmente de 1 π radiano.
4. Placa de fase ou o dispositivo modulador espacial de luz de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que um atraso de fase (ç)da máscara de fase de perfil bivortex é representado pela seguinte função matemática:

Φ^,θ) ηθ ηθ + απ if r<r, if r₂ >r>r.

Onde r é a distância perpendicular ao eixo ótico, é o ângulo azimutal#, e define η r₂ um raio do vórtice interno e externo, respectivamente, é um número inteiro que equivale a 1 para melhor resolução e , que por defeito consiste de 1, é um parâmetro entre 0 e 2na, que pode ser usado para refinar a distribuição da energia do feixe ao longo do eixo ótico.
5. Um método para a microscopia STED e RESOLFT, que inclui a produção de uma única máscara de fase composta por um perfil de bivortex com duas secções de vórtice, um vórtice em forma de disco interno e um vórtice em forma de anel exterior, e uma transição inter-vórtice suavizada de π radianos completos, através da modulação da fase física de um feixe ótico utilizando uma placa de fase ou um dispositivo modulador espacial de luz.
6. Método para a microscopia STED e RESOLFT de acordo com a reivindicação 5, em que o passo de modulação compreende a realização de uma mudança de fase entre o vórtice interno e o vórtice externo, de acordo com um raio de cada vórtice, sendo o raio do vórtice interno menor ou igual ao raio do vórtice exterior.
7. Método para a microscopia STED e RESOLFT de acordo com a reivindicação 6, em que a mudança de fase tem um valor arbitrário, mais preferencialmente de 1 π radianos.
8. Método para a microscopia STED e RESOLFT de acordo com qualquer uma das reivindicações 5-7, em que um atraso de fase ) da máscara de fase de perfil bivortex é representado pela seguinte função matemática:

Φ^,θ) ηθ ηθ + απ if r<r, if r₂ >r>r.

onde r é a distância perpendicular ao eixo ótico, φ é o ângulo azimutal, e η e r₂ definem o raio do vórtice interno e externo, respetivamente, n é um número inteiro que equivale a 1 para melhor resolução e a, que por defeito consiste de 1, é um parâmetro entre 0 e 2 que pode ser usado para refinar a distribuição axial do feixe.
9. Método para a microscopia STED e RESOLFT de acordo com qualquer uma das reivindicações 5-8, segundo a qual o passo de modulação compreende ainda mais a utilização de funções de fase de compensação ou correção na placa de fase ou num dispositivo modulador de luz espacial.