KR101501512B1

KR101501512B1 - 2차원 위상정합 비선형광학 구조조명 현미경 이미징 장치 및 그 방법

Info

Publication number: KR101501512B1
Application number: KR20130136271A
Authority: KR
Inventors: 이재용; 이은성; 이상원; 박주현
Original assignee: 한국표준과학연구원
Priority date: 2013-11-11
Filing date: 2013-11-11
Publication date: 2015-03-18

Abstract

본 발명은 2차원 위상정합 비선형광학 구조조명 이미징 방법 및 2차원 위상정합 CARS 구조조명 현미경을 제공한다. 이 2차원 위상정합 비선형광학 구조조명 이미징 방법은 펌프광 주파수를 가진 펌프광을 제공하는 단계; 상기 펌프광을 정방형 격자패턴으로 공간 진폭 변조하여 정방형 격자 진폭 구조조명을 측정 대상에 평행하게 조사하는 단계; 스톡스광 주파수를 가진 스톡스광을 상기 측정 대상에 조사하는 단계; 상기 정방형 격자 진폭 구조조명된 펌프광과 상기 스톡스광에 의하여 CARS 여기된 상기 측정 대상의 반스톡스 신호광 공간분포를 측정하여 원시 이미지를 생성하는 단계; 및 상기 원시 이미지를 처리하여 재구성된 물체 이미지를 산출하는 단계를 포함한다.

Description

2차원 위상정합 비선형광학 구조조명 현미경 이미징 장치 및 그 방법{2D Phase-Matched Nonlinear Optical Structured Illumination Microscopy Apparatus and Method of The Same}

본 발명은 초고분해능 비선형광학 구조조명 이미징에 관한 것으로, 더 구체적으로 2차원 위상정합 구조조명된 간섭성 반스톡스(anti-Stokes) 라만 산란 현미경에 관한 것이다.

최근 광학 이미징 기술의 초고분해능을 구현하는 방법으로 STED(stimulated emission depletion), PALM(photoactivation localization microscopy), fPALM(fluorescence PALM), 또는 SIM(structured illuminationmicroscopy)등의 기술이 제안되고 있다. 이 기술들은 광 회절한계를 뛰어넘는 높은 분해능을 제공하고 있다.

현재까지 제안된 초고분해능 이미징 기법을 사용하면, 100 nm 이하의 공간분해능이 원격장(far-field) 광학 이미징으로 가능하다는 것이 실험적으로 보고되고 있다. 그러나, 대부분 특수하게 고안된 형광체에 의존하여 이미지 컨트라스트를 구현한다는 점과 과도한 측정시간(수 분 - 수 시간)은 실용화의 걸림돌이다.

한편, 구조조명 현미경(structured illumination microscopy: SIM)은 회절한계 공간주파수 대역폭 너머에 존재하는 시료의 높은 공간주파수(초고분해능) 성분을 낮은 공간주파수 성분으로 변환한다. 이에 따라, 상기 구조조명 현미경은 일반 현미경으로 측정할 수 없는 시료를 측정 가능한 상태로 만든다. 이후, 이미지 복원처리과정(image reconstruction process)을 통해 높은 분해능의 이미지가 얻어질 수 있다. 여기서, 무아레(Moire) 효과를 이용한 이미지 공간주파수 하향변환 (frequency down conversion)을 위해서, 상기 구조조명 현미경에는 특정한 격자 패턴의 구조조명이 요구된다. 전시야 방식의 구조조명 현미경(SIM) 기술은 레이저 이미지 스캔 또는 긴 시간이 소요되는 통계적 이미지 프로세싱 등의 과정을 요구하지 않는다. 따라서, 전시야 (full-field) 방식의 구조조명 현미경(SIM) 기술은 실시간 측정의 관점에서 장점을 가진다.

상기 구조조명을 이용한 방법은 원리적으로 형광 시료 뿐만 아니라 비형광시료에 대해서도 초고분해능 이미징을 수행할 수 있다. 그런나, 비형광 시료에 대한 구조조명 이미징을 위한 장치 구현과 이미지 데이터 처리 방법이 용이하지 않다. 따라서, 최근까지도 정립된 기술이 없는 상황이다.

간섭성이 없는 조명(incoherent illumination) 또는 형광체의 방출광(emission light)을 이용하는 기존의 구조조명 이미징 방법은 비교적 간단한 장치 구현과 광학 이론체계에 바탕을 둔다. 반면, 레이저 광원으로 조명되는 투과/반사/산란체의 구조조명 이미지 형성(image formation)은 수학적으로 보다 복잡한 간섭성 결상 이론(coherent imaging theory)에 의해 기술되어야 한다. 특히, 구조조명의 광 진폭에 대하여 비선형적으로 여기되는 시료의 초고분해능 이미지 재구성에 필요한 구조조명 이미지 취득 방법과 데이터 처리 알고리즘은 종래의 구조조명 이미징 방법에 상당한 수정이 요구된다.

한편, 비선형광학 이미징 방법은 종래 형광 이미징 방법 달리 시료를 표지(labeling)하는 형광체의 도움 없이 무표지(label-free) 분자 컨트라스트 이미징을 구현할 수 있는 장점을 가진다. 또한, 비선형광학 이미징 방법은 종래의 선형광학 구조조명 이미징에 비해 공간분해능 향상 효과를 보다 더 증가시킬 수 있는 가능성을 지니고 있다.

본 발명의 해결하고자 하는 일 기술적 과제는 분자진동 컨트라스트를 갖는 간섭성 반스톡스 라만 산란(coherent anti-Stokes Raman scattering: CARS) 분광법에 기초한 2차원 초고분해능 구조조명 현미경을 제공하는 것이다.

본 발명의 해결하고자 하는 일 기술적 과제는 2차원 위상정합 CARS 구조조명 현미경 광학계의 구성 방법, 원시 이미지 데이터 취득법, 및 초고분해능 이미지 데이터 처리 알고리즘 체계를 제공하는 것이다. 상기 초고분해능 이미지 데이터 처리 알고리즘 체계는 종래의 비간섭성(incoherent) 구조조명 이미징 또는 선형광학(linear optics) 구조조명 이미징 방법, 그 장치 구성, 및 이미지 취득/처리 알고리즘과 상이하다.

상기 2차원 위상정합 CARS 구조조명 현미경 구현을 통해 이루고자 하는 CARS 컨트라스트 이미징의 2차원 공간분해능 향상 효과는 광학 회절 한계치 대비 최고 3배이다.

본 발명의 일 실시예에 따른 2차원 위상정합 비선형광학 구조조명 이미징 방법은 펌프광 주파수를 가진 펌프광을 제공하는 단계; 상기 펌프광을 정방형 격자패턴으로 공간 진폭 변조하여 정방형 격자 진폭 구조조명을 측정 대상 평면에 평행하게 조사하는 단계; 스톡스광 주파수를 가진 스톡스광을 상기 측정 시료 평면에 조사하는 단계; 상기 정방형 격자 진폭 구조조명된 펌프광과 상기 스톡스광에 의하여 CARS 여기된 상기 측정 대상의 반스톡스 신호광 공간분포를 측정하여 원시 이미지를 생성하는 단계; 및 상기 원시 이미지를 처리하여 재구성된 물체 이미지를 산출하는 단계를 포함한다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 원시 이미지를 처리하여 재구성된 물체 이미지를 산출하는 단계는: 상기 정방형 격자 진폭 구조조명의 방위별 위상 조합에 의해 결정되는 스펙트럼 혼합 행렬의 역행렬을 구하는 단계; 상기 원시 이미지들을 푸리에 변환하여 원시 이미지 스펙트럼을 산출하는 단계; 상기 원시 이미지 스펙트럼으로 구성된 스펙트럼 열 벡터와 상기 스펙트럼 혼합 행렬의 역행렬을 이용하여 상기 원시 이미지 스펙트럼을 구성하는 측정 스펙트럼 구성항을 추출하는 단계; 상기 측정 스펙트럼 구성항을 공간주파수 되돌림하여 가상 스펙트럼 구성항을 산출하는 단계; 상기 가상 스펙트럼 구성항을 선형 결합하여 가상 이미지 스펙트럼을 형성하는 단계; 및 상기 가상 이미지 스펙트럼을 푸리에 역변환하여 물체 이미지 또는 가상 이미지를 산출하는 단계;를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 정방형 격자 패턴은 서로 직교하는 2 방위의선형격자 진폭 구조조명 패턴일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 정방형 격자 패턴은 2 방위 여기 진폭 위상 조합에 의하여 2축 위상 공간의 13 개의 위상 벡터 점으로 표시될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 2차원위상정합 CARS 구조조명 현미경은 펌프광 주파수를 가지는 펌프광을 제공하는 펌프광원; 상기 펌프광을 정방형 격자패턴으로 공간 진폭 변조하여 정방형 격자 진폭 구조조명을 제공하는 구조조명 패턴 형성부; 상기 정방형 격자 진폭 구조조명을 측정 대상에 제공하는 하부 대물 렌즈부;

상기 스톡스광 주파수를 가지는 스톡스광을 제공하는 스톡스광원; 상기 스톡스광을 반사시키고 상기 정방형 격자 진폭 구조조명된 펌프광과 상기 스톡스광에 의하여 CARS 여기된 상기 측정 대상의 반스톡스 신호광을 투과시키는 이색성 거울; 상기 이색성 거울에 의하여 반사된 스톡스광을 상기 측정 대상에 제공하는 상부 대물 렌즈부; 및 상기 이색성 거울을 투과하는 상기 반스톡스 신호광의 2차원 공간 분포를 측정하여 원시 이미지를 생성하는 측정부를 포함한다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 측정부는 상기 반스톡스 신호광의 2차원 공간 분포에 의한 원시 이미지를 측정하고, 상기 원시 이미지를 처리하여 물체 이미지를 재구성하는 처리부를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 구조조명 패턴 형성부는 상기 측정 대상의 상 공액면(image conjugate plane)에 배치될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 간섭성 반스톡스 라만 산란(coherent anti-Stokes Raman scattering: CARS)에 의한 무표지 분자진동 컨트라스트를 갖는 2차원 초고분해능 비선형광학 구조조명 이미징 기술이 제공된다. 상기 2차원 초고분해능 비선형광학 구조조명 이미징 기술은 회절한계치 대비 최고 3배의 공간분해능 향상 효과를 제공할 수 있다.

본 발명에 의한 상기 2차원 위상정합 CARS 구조조명 이미징 기술은 종래의 비간섭성 구조조명 이미징 방법 또는 선형광학 구조조명 이미징 방법을 동원하여 획득할 수 없는 분자진동 이미지 컨트라스트와 2차원 공간분해능 향상도를 제공할 수 있다.

도 1은 단방향 위상정합 CARS(Coherent Anti-stokes Raman Scattering) 구조조명 현미경의 구성을 나타내는 개념도이다.
도 2는 1차원 구조조명에 의한 CARS 이미징 간섭성 전달함수(Coherent Transfer Function;CTF) 확장 개념을 나타내는 도면이다.
도 3은 간섭성 이미징 시뮬레이션 결과를 나타내는 도면이다. (a) 진폭 물체 이미징 테스트 타켓, (b) 일반 2차원 간섭성 이미징 결과, (c) 1차원 CARS 구조조명 이미징 기법 적용 결과.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 2차원 위상정합CARS 구조조명 현미경의 장치 구성도이다.

도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 직교 2 방위 진폭 구조조명에 의한 광 격자 패턴 강도를 나타낸다. (a1) 수직 방위각 구조조명, (a2) 수평방위각 구조조명, (b) 선형광학 구조조명, (c) 위상정합 CARS 구조조명.

도 6은 직교 2 방위 진폭 구조조명에 의한 유효 간섭성 전달 함수 확장을 나타낸다. (a) 선형광학 구조조명 효과, (b) 위상정합 CARS 구조조명 효과.

도 7은 직교 2 방위 진폭 구조조명 광격자 패턴 변위를 설명하는 도면이다. (a) 선형광학 구조조명 강도분포, (b) 위상정합 CARS 구조조명 강도분포, (C)격자 위상 변위점.

도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 이지징 처리 방법을 설명하는 흐름도이다.

도 9는 공간주파수 하향 변환된 측정 스펙트럼 구성항에 대한 공간주파수 영역 재구성 복원 위치를 나타낸다.

도 10은 직교 2 방위 진폭 구조조명에 의한 초고분해능 이미지 복원과 공간주파수 전달영역 확장 결과를 나타내는 도면이다.

비선형광학 이미징 기술과 초고분해능 구조조명 이미징 기술을 결합한 예로써, 1차원(단방향) 위상정합 비선형광학 구조조명 현미경 기법이 제안되었다.

도 1은 단방향 위상정합 CARS(Coherent Anti-stokes Raman Scattering) 구조조명 현미경의 구성을 나타내는 개념도이다.

도 1을 참조하면, 1차원 위상정합 비선형광학 구조조명 현미경이 개시된다. 비선형광학 시료를 조사(illumination)하는 두 개의 경사각을 갖는 입사 레이저가 상기 시료 면에 선형격자 형태(grating pattern)의 구조조명을 형성한다. 상기 구조조명의 공간 변조 위상을 변화시키면서 측정한 시료의 이미지 데이터는 소정의 알고리즘으로 처리되어, 초고분해능 이미지로 복원된다.

펌스 레이저(130)는 펌프광(21)을 출력하고, 제1 거울(132)에 의하여 반사되어 빔스플릿터(134)에 제공된다. 상기 빔 스플릿터(134)는 입사광의 일부를 투과시키고 나머지를 반사시킨다. 투과된 펌프광은 위치 이동이 가능한 제2 거울(138)에 의하여 반사되어 시료(20)에 경사한다. 또한, 상기 빔 스플릿터(134)에서 반사된 펌프광은 제3 거울(136)에 의하여 반사되어 상기 시료(20)에 경사 입사한다. 상기 시료(20)는 시료 지지대(150)에 장착된다. 상기 투과된 펌프광과 상기 반사된 펌프광은 상기 시료의 하부면에서 상기 시료에 제공된다.

스톡스 레이저(166)는 스톡스광(22)을 출력한다. 상기 스톡스광(22)은 이색성 거울(164)을 통하여 반사되어 대물 렌즈부(162)를 통하여 상기 시료(20)의 상부면으로부터 상기 시료(20)에 제공된다. 상기 대물 렌즈부(162)는 상기 시료의 상부면에 배치된다. 상기 시료(20)는 상기 펌프광(21) 및 스톡스광(22)을 제공받아 비선형광학 현상에 의하여 반스톡스 신호광(23)을 출력할 수 있다.

상기 펌프광(21), 스톡스광(22), 및 반스톡스 신호광(23)은 위상정합 조건을 충족한다. 상기 반스톡스 신호광(23)은 상기 이색성 거울(164)을 투과하여 측정부(170)에 제공된다. 상기 측정부(170)는 상기 반스톡스 신호광(23)의 공간 분포를 이미징할 수 있다. 상기 측정부(170)는 상기 반스톡스 신호광을 반사시키는 거울(172), 상기 스톡스광을 집속하는 렌즈(174), 노이즈를 제거하는 밴드패스필터(176), 및 적외선 카메라(178)를 포함할 수 있다.

도 2는 1차원 구조조명에 의한 CARS 이미징 간섭성 전달함수(Coherent Transfer Function;CTF) 확장 개념을 나타내는 도면이다.

도 2를 참조하면, 1차원 위상정합 비선형광학 구조조명 현미경은, 일반 간섭성 이미징의 측정가능 공간주파수 대역 한계

를

의 범위로 3배 확장하는 효과를 제공할 수 있다. 이에 따라. 1차원 위상정합 비선형광학 구조조명 현미경은 실공간(real space) 공간분해능을 향상하는 이론적 기법을 사용한다. 한 방향으로만 공간적 분포 변화가 있고 수직한 다른 방향으로는 무한히 길게 연장된 1차원 물체인 경우에, 상기 이론적 기법은 적용될 수 있다.

도2(b) 참조하면, 2차원 평면 상에서 크기가 유한하고 임의의 형상을 갖는 물체에 대하여, 상기 1차원 위상정합 비선형광학 구조조명 현미경 이미징을 적용하면, 확장된 측정가능 공간주파수 대역의 실질적인 형태가 비등방적이다. 또한, 상기 측정가능 공간주파수 대역 간의 경계가 불연속적인 문제가 발생한다.

즉, 종래에 제안된 상기 1차원 위상정합 비선형광학 구조조명 현미경을 이용해 임의 형상의 2차원 미소 물체를 이미징하면, 선형격자 구조조명 방위각 방향으로는 공간분해능 향상 효과가 얻어질 수 있다. 그러나 상기 구조조명 방위각에 수직한 방향으로는 일반 간섭성 이미징과 동일한 공간분해능이 얻어진다.

도 3은 간섭성 이미징 시뮬레이션 결과를 나타내는 도면이다. (a) 진폭 물체 이미징 테스트 타겟, (b) 일반 2차원 간섭성 이미징 결과, (c) 1차원 CARS 구조조명 이미징 기법 적용 결과.

도 3을 참조하면, 2차원 이미징 테스트 타겟(a)을 이용한 상기 1차원 위상정합 비선형광학 구조조명 현미경의 광학 시뮬레이션 결과(c)는 일반 간섭성 이미지(b)보다 구조조명 방위각 방향의 공간분해능이 향상된 것을 수 있다. 그러나, 본래 물체의 형상으로부터 예측 불가능한 상당히 왜곡된 이미지 결함(artifact)이 나타나는 문제점이 있다. 이 문제점은 해결해야 할 중대한 과제이다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 분자진동 컨트라스트를 갖는 간섭성 반스톡스 라만 산란(coherent anti-Stokes Raman scattering: CARS) 분광법에 기초한 2차원 초고분해능 구조조명 현미경을 구현하기 위해서, 2차원 위상정합된 CARS구조조명 현미경 장치와 원시 이미지 데이터 (raw image data) 측정법 및 초고분해능 이미지 처리 알고리즘 체계가 제공된다.

이하, 첨부한 도면들을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예들을 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되어지는 실시예들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 실시예는 개시된 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되어지는 것이다. 도면들에 있어서, 구성요소는 명확성을 기하기 위하여 과장되어진 것이다. 명세서 전체에 걸쳐서 동일한 참조번호로 표시된 부분들은 동일한 구성요소들을 나타낸다.

[구조조명 이미징 기법의 구현 원리]

광학 현미경에서의 공간분해능 한계는 이상적으로 무한히 작은 물체라 할지라도 회절현상에 의한 유한한 점퍼짐(point spreading)으로 나타난다. 공간분해능 한계는 파장이

인 빛을 사용하는 수치구경

의 광학 시스템에서

로 주어지는 아베 회절한계(Abbe diffraction limit) 값에 의해 결정된다.

물체의 광학적 강도 분포는 공간주파수(spatial frequency) 스펙트럼으로 취급될 수 있다. 이 경우, 이미징 시스템이 상면(image plane)으로 정보화하여 전달 가능한 물체공간주파수 대역에는 차단주파수(cutoff frequency)라는 상한선이 존재한다. 상기 차단 주파수를 넘어서는 고주파수 성분의 물체 고유 정보는 이미징 과정에서 손실될 수 있다.

형광체와 같은 비간섭성 시료를 대상으로 하는 이미징 시스템의 공간주파수 영역특성(spatial frequency response)은광전달함수 (optical transfer function: OTF)로 기술된다. 상기 광전달 함수(OTF)는 강도 차단 주파수

를가진다. 즉, 강도 차단 주파수

를 반지름으로 하는 원 내부로 정의되는 2차원 공간주파수 영역이 비간섭성 이미징의 이론적 측정가능 대역(spatial frequency passband)이 된다.

한편, 레이저와 같이 간섭성을 갖는 광원을 사용하여 비형광(투과/반사/산란) 시료를 이미징하는 광학 시스템에서의 상 형성(image formation)은, 물체의 광 복소진폭(complex amplitude) 분포와 이에 대한 공간주파수 영역특성(spatial frequency response)인 간섭성 전달 함수 (coherent transfer function: CTF)로 기술된다. 이 때, 상기 간섭성 전달 함수(CTF)는 진폭 차단 주파수

를가진다. 따라서, 간섭성 이미징에 있어서의 시료의 측정가능 대역(spatial frequency passband)은 진폭 차단 주파수

를 반지름으로 하는 원 내부로 정의되는 2차원 공간주파수 영역으로 제한된다.

광학 이미징 시스템은 물체 강도 또는 복소 진폭 분포의 공간주파수를 상면으로 전달하는 과정에서 상기 차단 주파수 한계 내의 물체 정보만을 전달한다. 따라서, 본래의 물체 분포와 달리 선명도가 저하된 상(image)이 형성된다. 이 때, 동일한 광학 이미징 시스템이라 하더라도, 사용하는 광원과 관찰 대상 물체의 간섭성 유무에 따라 형성되는 상의 모양과 공간분해능 특성이 상이하게 나타난다.

이는 광원 및 물체의 간섭성 여부에 따라 이미징 시스템의 공간주파수 영역 특성이 각각 광전달 함수(OTF) 또는 간섭성 전달 함수(CTF)로 다르게 표현될 뿐 아니라, 결상 이론의 전개에 사용되는 수학적 체계가 각기 다르기 때문이다.

먼저, 비간섭성 이미징의 공간분해능 향상을 위한 구조조명 방법을 간략하게 설명한다. 고주파수 성분을 포함하는 임의 형태의 강도 물체(intensity object)에 특정 주기(period)

의선형격자패턴조명(linear grating pattern illumination)을 특정 방향으로인가한다. 상기 선형격자패턴 조명은 물체의 공간주파수스펙트럼을 상기 격자패턴 주기의 역수

만큼주파수 하향 변환(frequency down conversion)하여 유효 발광체 분포(effective emitter distribution)를 형성한다. 이에 따라, 구조조명 광학 시스템은 상기 차단 주파수

를 넘어서는 물체의 공간주파수 스펙트럼을 측정가능 대역(spatial frequency passband)으로 이동시키는 역할을 한다. 이후, 이미지 처리(image processing)과정은,본래 물체의 투과대역 스펙트럼(passband spectrum)과 하향이동된 스펙트럼(down-shiftedspectrum)이 중첩된 상태로 측정된 이미지 데이터로부터 각 스펙트럼 성분을분리하여 원상 복원한다.결과적으로, 구조조명 광학 시스템은 광학 시스템의 본래차단 주파수(cutoff frequency)를증가시키는 효과가 나타난다.

2차원 구조조명 이미징의 경우, 복수의 방위각으로 선형격자 패턴조명을 인가하여 이미지 데이터가 얻어진다. 이미지 데이터로부터 공간주파수 스펙트럼을 재구성하면 측정가능 공간주파수 대역(spatial frequency passband)이 확장된 2차원 물체 스펙트럼이 얻어진다. 따라서, 상기 2차원 확장된 물체 스펙트럼을 역 푸리에 변환(inverse Fourier transform)하면 실공간(real space)에서의 물체 이미지가 얻어지고, 상기 물체 이미지의 2차원 이미지 공간분해능이 향상된다.

물체스펙트럼에 대한 구조조명에 의한 유효 발광체 스펙트럼의공간주파수 이동량(shift)과 방향(direction)은,격자 패턴 조명의격자 주기(grating period)와 격자 벡터(grating vector) 방향에 의해 결정되며, 분해능 향상 정도와 유효 방향에 영향을 끼친다. 선형광학 구조조명법에서 생성할 수 있는 광격자 패턴의 최고 공간주파수

는 OTF의차단 주파수

와 같다. 따라서, 공간분해능 향상의 효과는 최대 2배이다. 2차원 구조조명 이미징에서 방위각에 따라 공간분해능을 균일하게 향상시키기 위해서, 상기 선형격자 패턴 조명의 상기 격자 벡터(grating vector) 방향은 2차원 평면 전체 360°방위각을 3등분한{0^o, 60^o, 120^o}일 수 있다.측정된 구조조명 이미지에 포함된 하향이동공간주파수 성분의 분리와 복원은실공간(real space) 이미지를 푸리에 변환하여 공간주파수 영역(spatial frequency domain)에서 이미지 데이터를분석하여 이루어진다. 이 때, 상기 하향이동공간주파수 성분의수학적 해를 얻기 위해서는 각 상기 격자 벡터방향에서 3개의 상대 위상변위를 갖는 조명에 의한원시이미지 데이터가 요구된다. 상기 상대 위상변위의 조합으로는{0^o, 120^o, 240^o}이 바람직하다.

한편, 간섭성 구조조명 이미징에서의 초고분해능 구현 방법은 개념 상 앞서 기술한 비간섭성 구조조명 이미징 방법과 유사하다. 간섭성 구조조명 이미징에서 진폭 물체(amplitude object)의 높은 2차원 공간주파수 성분은 간섭성 구조조명에 의해 하향 변환된다. 이에 따라, 진폭 차단 주파수

로 특정되는 측정가능 대역(spatial frequency passband)에서 원시 이미지를 측정한 후, 물체 본래의 공간주파수 스펙트럼 성분을 분리/추출/재구성하는 계산 과정(super-resolution image reconstruction)을 거쳐초고분해능 이미지가 복원된다.

그러나, 간섭성 구조조명 이미징의 실제 구현은, 구조조명 패턴의 형성 방법과 초고분해능 이미지 복원을 위한 광학 이론 및 계산 알고리즘에 있어서 비간섭성 구조조명 이미징과 매우 상이하다. 비간섭성 이미징의 경우, 측정 이미지의 강도 분포 함수가 선형적인 물리 법칙을 따른다. 따라서, 측정 이미지의 강도 분포 함수는 푸리에 변환(Fourier transform) 관계에 있는 공간주파수 스펙트럼으로 간편히 기술된다. 선형격자패턴 조명의 형성 및 이미지 측정을 구조조명 방위각 별로 독립 시행한다. 이어서, 개별 1차원구조조명 이미지 처리 결과들을 모두 선형 중첩함으로써 2차원 초고분해능 구조조명 이미지를 복원할 수 있는 장점이 있다.

반면, 간섭성 이미징의 경우, 빛의 복소 진폭이 수학적 기술에 있어서 선형적인 물리량인데 반하여 일반적인 2차원 광 검출기에서 측정되는 광 강도가 간섭성 상 형성(coherent image formation)을 기술하는 수학적 체계에서 비선형적이다. 따라서, 선형광학에 근간한 기존의 이론적 취급에 수정이 가해져야 한다. 보다 실제적으로, 2차원 간섭성 구조조명 효과를 구현하기 위해서는 독립적인 방위각별 격자패턴으로 형성된 이미지 처리 결과를 중첩하여 사용할 수 없는 난점이 존재한다. 즉, 간섭성 이미징에서의 2차원 구조조명 패턴 형성과 이미지 처리는, 확장하고자 하는 공간주파수 스펙트럼 대역의 하향 변환 주파수에 부합하는 복수의 격자패턴 조명을 동시에 전사(projection)하여 원시 이미지 데이터를 얻은 후 이를 일괄적으로 취급하여 목표로 하는 확장 간섭성 전달 함수(extended coherent transfer function)에 의한 이미징 결과와 동일한 효과를 복원해내는 해석적 이미지 처리 알고리즘을 탐색하여 적용해야 한다.

[2차원 위상정합 CARS 구조조명 현미경의 구성]

본 발명에서 제안하는 2차원 위상정합 비선형광학구조조명 현미경 기술이 이하 설명된다.

도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 2차원 위상정합 CARS 구조조명 현미경의 장치 구성도이다.

도 4를 참조하면, 2차원 위상정합 CARS 구조조명 현미경(200)는 펌프광 각주파수를 가지는 펌프광(21)을 제공하는 펌프광원부(210), 상기 펌프광(21)을 정방형 격자패턴으로 공간 진폭 변조하여 정방형 격자 진폭 구조조명을 제공하는 구조조명 패턴 형성부(220), 상기 정방형 격자 진폭 구조조명을 측정 대상(20)에 제공하는 하부 대물 렌즈부(232), 상기 스톡스광 각주파수를 가지는 스톡스광(22)을 제공하는 스톡스광원부(240), 상기 스톡스광(22)을 반사시키고 상기 정방형 격자 진폭 구조조명된 펌프광과 상기 스톡스광에 의하여 CARS 여기된 상기 측정 대상(20)의 반스톡스 신호광(23)을 투과시키는 이색성 거울(248), 상기 이색성 거울(248)에 의하여 반사된 스톡스광(23)을 상기 측정 대상에 제공하는 상부 대물 렌즈부(234), 및 상기 이색성 거울을 투과하는 상기 반스톡스 신호광의 2차원 공간 분포를 측정하여 원시 이미지를 생성하는 측정부(250)를 포함한다.

펌프광원부(210)는 펌프 레이저(211), 광섬유(212), 시준 렌즈(collimating lens,213)를 포함할 수 있다. 상기 펌프 레이저는 펌프광 각주파수(

)를 가지는 펌스광을 출력할 수 있다. 상기 펌프광(21)은 상기 광섬유(212)를 통하여 가이드될 수 있다. 상기 광섬유(212)의 출력광은 상기 시준 렌즈(213)에 제공될 수 있다. 상기 시준 렌즈는 평행광을 출력할 수 있다. 상기 평행한 펌프광은 상기 구조조명 패턴 형성부(220)에 제공될 수 있다.

상기 구조조명 패턴 형성부(220)는 편광판(222), 빔스플릿터(224), 및 공간 광 변조기(spatial light modulator,226)를 포함할 수 있다. 상기 편광판(222)은 상기 평행한 펌프광을 제공받아 선편광된 펌프광을 출력할 수 있다. 상기 선편광된 펌프광은 상기 빔스플릿터(224)에 제공될 수 있다. 상기 빔스플릿터(224)는 입사광을 투과시키고 상기 공간 광 변조기(226)에서 반사된 반사광을 90도 꺾어 출력할 수 있다. 상기 빔스플릿터(224)를 투과한 펌프광은 상기 공간 광 변조기(226)에 제공될 수 있다. 상기 공간 광 변조기(226)는 상기 측정 대상(20)의 상 공액면(image conjugate plane)에 배치될 수 있다.

상기 공간 광 변조기(226)는 정방형 격자패턴 또는 2차원 위상정합 CARS 구조조명 패턴을 생성할 수 있다. 상기 공간 광 변조기(226)는 2차원 액정 디스플레이(liquid crystal display; LCD)형 공간 광 변조기(spatial light modulator: SLM), 2차원 배열형 디지털 거울 소자 (digital mirror device: DMD), 또는 2차원 회절격자(2D diffraction grating)일 수 있다. 상기 공간 광 변조기(226)는 상기 측정 대상의 상 공액면(image conjuage plane)에 위치되어, 조사되는 펌프광을 공간적으로 2차원 진폭 변조할 수 있다. 상기 상 공액면에 조사되는 펌프광은 미리 공간적으로 균일한 강도와 위상을 갖도록 빔 특성을 조절하는 것이 바람직하다. 이에 따라, 상기 공간 광 변조기(222)는 2차원 위상정합 CARS 구조조명 패턴을 생성할 수 있다. 2차원 진폭 변조된 펌프광 분포는 상기 측정 대상에 투사될 수 있다. 이를 위하여, 상기 2차원 위상정합 CARS 구조조명 펌프광은 상기 빔스플릿터(224)에 의하여 반사되어 투사 렌즈(projection lens,227)에 제공될 수 있다. 상기 투사 렌즈(227)는 펌프광을 거울(228)에 제공할 수 있다. 상기 거울(228)는 펌프광을 하부 대물 렌즈부(232)에 제공할 수 있다. 축소 광학계 (reduction optics)는 하부 대물 렌즈부(232)와 투사 렌즈(projection lens,227)를 포함할 수 있다. 상기 축소 광학계는 2차원 위상정합 CARS 구조조명 펌프광을 상기 측정 대상에 투사할 수 있다.

스톡스광원부(240)은 스톡스 레이저(241), 광섬유(242), 및 시준 렌즈(collimating lens,243), 및 투사 렌즈(projection lens,246)를 포함할 수 있다. 스톡스 레이저(241)는 스톡스광 각주파수(

)를 가지느 스톡스광(22)을 출력할 수 있다. 상기 스톡스광(22)은 상기 광섬유(242)를 통하여 가이드되어 시준 렌즈(243)에 제공될 수 있다. 상기 시준 렌즈(243)는 평행광을 출력할 수 있다. 상기 시준 렌즈를 통과한 상기 스톡스광은 상기 투사 렌즈(246)에 제공될 수 있다. 상기 투사 렌즈를 통과한 상기 스톡스광은 이색성 거울(248)에 제공될 수 있다. 상기 이색성 거울(248)은 상기 스톡스광을 반사시킬 수 있다. 반사된 스톡스광은 상부 대물 렌즈부(234)에 제공될 수 있다. 상기 상부 대물 렌즈부(234)는 상기 측정 대상에 평행한 스톡스광을 제공할 수 있다.

이색성 거울(248)은 상기 스톡스광을 반사시키고, 상기 상부 매물 렌즈부(234)를 통하여 제공되는 반스톡스 신호광(23)을 투과시킬 수 있다. 상기 반스톡스 신호광(23)은 상기 측정부(250)에 제공될 수 있다.

상기 시료(측정 대상, 20)는 비선형광학 현상을 유발할 수 있는 물질일 수 있다. 상기 시료(20)는 시료 지지대(236)에 장착되고, 상기 시료 지지대(236)는 이동수단(238)에 의하여 이동될 수 있다.

상기 측정부(250)는 상기 반스톡스 신호광(23)의 2차원 공간 분포에 의한 원시 이미지를 측정할 수 있다. 상기 측정부는 CARS 이색성 거울(258), CARS 밴드 패스 필터(252), 및 경통렌즈(254), 및 2차원 광검출기(256)를 포함할 수 있다. 상기 CARS 이색성 거울(258)은 상기 반스톡스 신호광을 반사시켜 상기 CARS 밴드 패스 필터(252)에 제공할 수 있다. 상기 CARS 밴드 패스 필터(252)는 상기 반스톡스 신호광에서 노이즈를 제거하여 경통렌즈(254)에 제공할 수 있다. 상기 경통 렌즈(254)는 상기 2차원 광검출기(256)에 상기 반스톡스 신호광을 제공할 수 있다. 상기 2차원 광검출기(256)는 상기 반스톡스 신호광의 공간 분포를 측정하여 원시 이미지를 생성할 수 있다. 상기 원시 이미지는 2 방위 비선형 여기 진폭 위상 조합에 따라 13개일 수 있다.

본 발명에 이용되는 CARS 여기 광원은 간섭성이 우수한 펌프광과 스톡스광을 포함할 수 있다.

측정 대상의 CARS 여기를 위하여 필요한 다른 하나의 여기광인 스톡스광은 측정 대상면을 기준으로 펌프광 입사단의 반대편에 위치한 상부 대물렌즈부를 통하여 측정 대상을 조명한다. 이 때, 스톡스광 입사단에 놓인 스톡스광 시준 렌즈(collimating lens)와 스톡스광 투사 렌즈(projection lens)는 스톡스광 대물렌즈의 후방 초점면(back focal plane) 위에 스톡스광을 집속한다. 따라서, 측정 대상은 공간적으로 균일한 강도와 위상을 갖는 평행파 스톡스광으로 조명될 수 있다.

상기 2차원 진폭 구조조명된 펌프광과 상기 평행파 스톡스광으로 CARS 여기된 상기 측정 대상의 반스톡스(anti-Stokes) 신호광 공간 분포는2차원 광 검출기(2D CCD camera)로 측정될 수 있다. 상기 반스톡스(anti-Stokes) 신호광은 스톡스광 입사단에 설치한 상부 대물렌즈부와 경통 렌즈(tube lens)를 통해 전시야(full-field)확대상(magnified image)으로 변환될 수 있다. 이 때, 상기 스톡스광 입사단에 놓인 단파장-투과 이색성 거울(short-pass dichroic mirror)은 측정 대상을 여기하는 상기 스톡스광은 반사시키고, 상기 측정 대상으로부터 발생한 상기 반스톡스 신호광은 투과시킬 수 있다. 또한, 상기 CARS 이미지 검출을 위한 2차원 광 검출기 앞에는 반스톡스 신호광만을 여과시키는 대역투과필터(bandpass filter)가 설치될 수 있다. 이에 따라, 이미지 측정시, 신호대잡음비(SNR)가 향상될 수 있다.

상기 처리부(260)는 2차원 위상정합된 CARS 펌프광 진폭 구조조명 패턴을 생성하고, 공간 광 변조기(226)를 구동하고 제어할 수 있다. 또한, 상기 처리부(226)는 구조조명 위상조합에 따른 전시야 CARS 구조조명 이미지(원시 이미지)를 순차적인 취득할 수 있다.

상기 처리부(260)는 상기 원시 이미지를 처리하여 2차원 초고분해능 구조조명 이미지(물체 이미지)를 산출할 수 있다. 상기 처리부(260)는 상기 원시 이미지를 처리하여 물체 이미지를 재구성할 수 있다. 상기 이미지 처리 방법은 추후 설명한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 현미경의 비선형광학 이미지 컨트라스트는 간섭성 반스톡스 라만 산란(coherent anti-Stokes Raman scattering: CARS)일 수 있다. CARS 비선형광학 이미지 컨트라스트에 기초한 2차원 초고분해능 구조조명 이미징 장치는 측정 대상의 CARS 신호 생성을 위해 위상정합(phase matching) 조건을 만족하는 펌프/스톡스광 입사 구도와 초고분해능 간섭성 비선형광학 구조조명 이미지 획득에 요구되는 2차원 진폭 구조조명 패턴 형성 조건을 고려하여 구성한다.

도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 직교 2 방위 진폭 구조조명에 의한 광 격자 패턴 강도를 나타낸다. (a1) 수직 방위각 구조조명, (a2) 수평방위각 구조조명, (b) 선형광학구조조명, (c) 위상정합 CARS 구조조명.

도 6은 직교 2 방위 진폭 구조조명에 의한 유효 간섭성 전달 함수 확장을 나타낸다. (a) 선형광학 구조조명 효과, (b) 위상정합 CARS 구조조명 효과.

도 7은 직교 2 방위 진폭 구조조명 광격자 패턴 변위를 설명하는 도면이다. (a) 선형광학 구조조명 강도분포, (b) 위상정합 CARS 구조조명 강도분포, (C)격자 위상 변위점.

도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 이지징 처리 방법을 설명하는 흐름도이다.

도 9는 공간주파수 하향 변환된 측정 스펙트럼 구성항에 대한 공간주파수 영역 재구성 복원 위치를 나타낸다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 소정의 2차원 패턴으로 설계한 CARS 여기(excitation) 펌프/스톡스광 진폭 구조조명이 측정 대상에 투사(projection)되고, 측정 시료로부터 발생한 CARS 신호(또는 반스톡스 신호광)의 전시야(full-field) 광 강도 분포가 이미징된다.

도 8을 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 2차원 위상정합비선형광학 구조조명 이미징 방법은 펌프광 주파수를 가진 펌프광을 제공하는 단계(S110); 상기 펌프광을 정방형 격자패턴으로 공간 진폭 변조하여 정방형 격자 진폭 구조조명을 측정 대상에 평행하게 조사하는 단계(S120); 스톡스광 주파수를 가진 스톡스광을 상기 측정 대상에 조사하는 단계(S130); 상기 정방형 격자 진폭 구조조명된 펌프광과 상기 스톡스광에 의하여 CARS 여기된 상기 측정 대상의 반스톡스 신호광 공간분포를 측정하여 원시 이미지를 생성하는 단계(S140); 및 상기 원시 이미지를 처리하여 재구성된 물체 이미지를 산출하는 단계(S150)를 포함한다.

상기 원시 이미지를 처리하여 재구성된 물체 이미지를 산출하는 단계(S150)는 상기 정방형 격자 진폭 구조조명의 방위별 위상 조합에 의해 결정되는 스펙트럼 혼합 행렬의 역행렬을 구하는 단계(S151); 상기 원시 이미지들을 푸리에 변환하여 원시 이미지 스펙트럼을 산출하는 단계(S152); 상기 원시 이미지 스펙트럼으로 구성된 스펙트럼 열 벡터와 상기 스펙트럼 혼합 행렬의 역행렬을 이용하여 상기 원시 이미지 스펙트럼을 구성하는 측정 스펙트럼 구성항을 추출하는 단계(S153); 상기 측정 스펙트럼 구성항을 공간주파수 되돌림하여 가상 스펙트럼 구성항을 산출하는 단계(S154); 상기 가상 스펙트럼 구성항을 선형 결합하여 가상 이미지 스펙트럼을 형성하는 단계(S155); 및 상기 가상 이미지 스펙트럼을 푸리에 역변환하여 물체 이미지 또는 가상 이미지를 산출하는 단계(S156)를 포함할 수 있다.

상기 정방형 격자 패턴은 서로 직교하는 2 방위의 선형격자 진폭 구조조명 패턴일 수 있다. 상기 정방형 격자 패턴은 2 방위 여기 진폭 위상 조합에 의하여 2축 위상 공간의 13 개의 위상 벡터 점으로 표시될 수 있다.

[2차원 위상정합 CARS 구조조명을 위한 광학변수 설정]

본 발명이 이루고자하는 2차원 위상정합 CARS 구조조명 이미징에 필요한 2차원 진폭변조(amplitude modulation) 구조조명 패턴의 광학변수 설정에 관하여 설명한다. 상기 2차원 위상정합 CARS 구조조명은 주어진 비선형광학 측정 대상(시료)에 대하여 CARS 신호광(반스톡스 신호광)을 발생시킴과 동시에 2차원 주기 격자(2D periodic grating) 형태의 광파 분포를 시료 면에 형성해야 한다.

측정하고자 하는 시료의 분자진동 각주파수가

로 주어질 때, CARS 신호광 생성을 위해서는 광 주파수가 다른 두 종류의 여기광으로서 각주파수

를 갖는 펌프광과 각주파수

를 갖는 스톡스광이 다음의 조건을 만족해야 한다.

(1)

주어진 진동 주파수 공명(vibrational frequence resonance) 조건을 만족하는 펌프광과 스톡스광에 대하여 상기 시료가 생성하는 반스톡스광은 CARS 신호이다. 상기 반스톡스광의 각주파수는

(2)

로 주어진다.

이 때, 진동 주파수 공명 조건을 만족하는 펌프광과 스톡스광에 의한 CARS 신호 (반스톡스광) 생성이 효율적으로 일어나기 위해서는, 펌프광과 스톡스광 간의 상호작용에서 위상정합 (phase matching) 조건이 만족되어야 한다. 즉, 상기 펌프광, 스톡스광, 반스톡스광의 파수 벡터(wave vector)를

,

라 할 때,

(3)

의 조건이 성립되도록 CARS 여기광(펌프광/스톡스광)과 CARS 신호광(반스톡스광)의 광파 진행방향을 설정해야 한다. 각주파수가

인 광파가 굴절률

의 매질을 진행할 때 파수 벡터

의 크기

를 파수(wave number)라 한다. 이 때,

는 진공 중 빛의 속도이며,

는 각주파수가

인 광파의 진공 중에서의 파수를 의미한다.

CARS 신호 생성을 위한 상기 진동 주파수 공명 조건과 위상정합 조건을 만족시킴과 동시에 시료 면에 주기 격자 형태의 구조조명을 조사할 수 있는 이미징 광학계의 기하학적 구성 형태는 도 1에 도시되었다. 2개의 펌프광은 이미징 광학계 광축에 대칭적으로 각각

과

의 각도로 경사지게 입사한다. 또한, 스톡스광은 상기 펌프광의 진행 종방향(longitudinal direction)과 반대 방향으로 상기 광축을 따라 입사한다. 따라서, 반스톡스광이 스톡스광 진행의 역방향으로 생성될 수 있다.

상술한 위상정합 CARS 구조조명 이미징 구도에서, 같은 크기의 파수

를 가지는 두 펌프광의 광축 방향 파수는

이다. 시료 면에 평행한 파수는

로 주어진다. 수학식(3)의 CARS 위상정합 조건을 만족하기 위해서 입사하는 펌프광의 위상정합 각도

는

(4)

이 되도록 한다.

상기 위상정합 각도

로 경사 입사하는 두 펌프광은 굴절률

의 시료 내에 파수가

인 정상파(standing wave)를 형성한다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 정상파는 CARS 여기 펌프광의 진폭 구조조명 격자 패턴으로 제공될 수 있다.

이 때, 상기 CARS 여기 펌프광 진폭 구조조명 격자의 공간주파수는

이 된다. 시료에서 생성되는 CARS 신호광 공간 분포를 이미징하는 광학계의 진폭 차단 주파수(amplitude cutoff frequency)

와 같도록 설정될 때, 간섭성 구조조명 이미징 기법에 의한 이미지 공간분해능은 최대로 향상될 수 있다. 시료 면의 CARS 신호광 분포를 전시야 이미징하는 수치구경

인 광학계의 진폭 차단 주파수는, 반스톡스광의 진공 중 파수가

일 때

이다. 따라서, 상기

의 공간분해능 최대화 조건을 만족하는 데 필요한 CARS 신호광 이미징 광학계의 대물렌즈 수치구경은

(5)

으로 설정될 수 있다.

도 5의 (a1) 및 (a2)를 참조하면, 상기 CARS 위상정합 조건을 만족하는 두 펌프광에 의한 진폭 구조조명은 파수

의 정상파 선형격자 패턴 구조조명을 형성한다. 격자 벡터(grating vector) 방향은 시료 면 위에서 서로 반대 방향으로 진행하는 상기 두 펌프광 성분의 파수 벡터 방향과 같다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 2차원 위상정합 CARS 구조조명 이미징을 위해서는 도 5(a1)과 도 5(a2)에 각각 도시한 서로 직교한 2 방위의 개별 선형격자 진폭 구조조명을 중첩하여 도 5(b)형태의 구조조명이 시료에 조사될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 2차원 위상정합 CARS 구조조명 현미경은, 도 4에 도시한 바와 같이 2차원 공간 광 변조기(spatial light modulator: SLM)를 이용하여 도 5(b)의 형태로 펌프광을 공간적으로 2차원 진폭 변조한다. 이후, 축소 광학계(reduction optics)는 축소된 구조조명을 시료에 투사한다. 그러나, 도 1을 참조하면, 단방향 위상정합 CARS 구조조명 현미경은 CARS 여기 펌프광의 위상정합각(phase matching angle) 경사 입사법을 사용한다.

본 발명의 일 실시에 따르면, 상기 시료에 형성하는 2차원 펌프광 진폭 구조조명의 직교한 2-방위 정상파 파수는 CARS 위상정합 조건을 만족하는

이 되어야 한다. 상기 2차원 펌프광 진폭 구조조명을 구성하는 4개의 광파 성분은 각각

,

의 파수 벡터를 가진다.

공간주파수 벡터와 파수 벡터는

의 관계에 있다. 따라서, 상기 4개의 광파 성분으로 이루어진 2차원 진폭 구조조명은 차단 주파수

의 간섭성 전달 함수(CTF)를 각각

,

의 공간주파수 벡터만큼 변위시킬 수 있다.

이에 따라, 도 6(a)을 참조하면, 상기 2차원 진폭 구조조명은 선형 간섭성 이미징의 유효 간섭성 전달 함수(effective CTF)를 확장하는 효과를 지닌다.

[2차원 위상정합 CARS 구조조명에 의한 비선형광학 이미징 수식화]

상술한 2차원 위상정합 CARS 구조조명에 의한 비선형광학 이미지 형성은 공간주파수 영역에서 모델링될 수 있다. 이에 따라, 원시 이미지 데이터(raw image data)의 취득 및 이미지 처리(image processing)를 통해 초고분해능 이미지를 재구성하는 수학적 체계와 알고리즘을 설명한다.

상기 공간주파수 영역 이미지 분석/처리의 기본 개념은, 구조조명된 비선형광학 물체의 이미지를 간섭성 구조조명에 의해 유도된 공간주파수 하향변환 스펙트럼(down-converted spectrum) 간의 상관혼합 (correlation mixing)으로 모델링한다. 이에 따라, 물체의 초고분해능 공간주파수 스펙트럼 성분을 분리하는 역혼합 행렬(unmixing matrix)이 도출될 수 있다. 또한, 적절한 원시 구조조명 이미지 측정 및 계산을 통해 추출한 물체의 초고분해능 스펙트럼 성분을 재구성하여 물체 본래의 확장된 공간주파수 스펙트럼(extended image spectrum)이 복원될 수 있다.

우선, 간섭성 광원의 조명에 선형적으로 반응하는 진폭 물체의 강도 이미지 형성을 기술하기 위하여 관련 물리량을 다음과 같이 정의한다.

: 시료 분포함수 (Sample distribution)

: 조명 필드 패턴 (Illumination field pattern in field amplitude)

: 발광 물체 복소 진폭(Emitting object disturbance in field amplitude)

: 이미지된 광파 복소진폭(Imaged field disturbance in field amplitude)

: 간섭성 퍼짐 함수(Coherent spreading function; CSF)

: 측정 이미지 강도 분포(Detectable image intensity distribution)

: 2차원 공간 변위 벡터

공간 변조된 복소 진폭을 갖는 조명 필드 패턴(구조조명 광파)

로 조명되는 진폭 물체(시료 분포함수)

에 의하여 형성되는 측정 이미지 강도 분포(원시 이미지에 대응)

는

(6)

으로 주어지며, 상기 이미지 강도 분포의 공간주파수 스펙트럼

은

(7)

으로 주어진다. 이 때,

은 2차원 공간 변위 벡터이고,

는 2차원 공간주파수 벡터이다. 수식에 사용된 표기인

와

는 각각 함수의 컨볼루션(convolution) 연산과 자기상관(auto-correlation) 연산을 의미한다. 대문자화된 함수 또는 ~ 표기가 된 함수는 푸리에 변환(Fourier transform

)된 것을 의미한다. 특별히, 간섭성 점퍼짐 함수(CSF)의 푸리에 변환인 간섭성전달함수 (CTF)는

로 표기하며, 비간섭성 점퍼짐 함수(PSF)는 CSF와

의 관계가 성립한다. 따라서, PSF의 푸리에 변환은

로 주어지며, 이를 광전달함수 (OTF)라 명하는 것이 관례이다.

비선형 감수율(nonlinear susceptibility)

를 갖는 분자진동의 공간적 밀도가

으로 주어지는 시료에서 발생하는 CARS 신호광 복소 진폭

은

(8)

로 표현된다. 이 때,

와

는 각각 펌프광과 스톡스광의 복소 진폭을 의미한다. 따라서, CARS 비선형 여기 진폭(nonlinear excitation amplitude)을

로 정의하면, 공간적 분포 함수

를 갖는 시료로부터 얻어지는 간섭성 CARS 진폭 이미지와 CARS 강도 이미지(원시 이미지)는

(9)

(10)

로 기술된다. 또한, 상기 CARS 진폭 이미지와 상기 CARS 강도 이미지는 2차원 공간주파수 영역 [

]으로 변환하여 각각 다음과 같은 이미지 스펙트럼으로 표현될 수 있다.

(11)

(12)

앞서 설명한 대로 2차원 위상정합된 CARS 구조조명을 구성하는 4개의 펌프광 성분의 중첩 진폭은,

(13)

으로 표현된다. 광축을 따라 역진행(counter-propagating)하는 스톡스광의 진폭은

으로 주어진다. 이 때, 상기 4개의 펌프광 성분이 갖는 시료 면 파수 벡터는

,

이다. 상기 중첩된 4개의 펌프광 성분을 x축과 y축 방향으로 각각 선형격자 정상파를 형성하는CARS 위상정합 펌프광 쌍(phase matching pair)의 복소 진폭

와

로 나누어 표현하면,

(14)

이 된다. 따라서, 시료 면

에서의 비선형 여기 진폭(nonlinear excitation amplitude)

는CARS 위상정합 조건에 의해 다음과 같이

(15)

계산된다. 이를 광파의 복소 진폭 형태로 다시 표현하면

(16)

이 된다.

도 5의 (c)를 참조하면, 2차원 위상정합 CARS 펌프광 구조조명으로 생성된 정방형 격자 패턴의 비선형 여기 진폭은

와 같이 1개의 DC 광파와 상기 펌프광 진폭 구조조명 광파에 대해 공간주파수 벡터가 2배인4개의 진폭 구조조명 광파로 이루어진다.

또한,

는 각각 상기 비선형 여기 진폭 구조조명의 직교한 2 방위인 x축과 y축 방향으로의 격자 위상이다. 상기 격자 위상은 펌프광 진폭 구조조명의 격자 위상

과

,

의 관계가 있다.

따라서, 5개의 광파 성분으로 이루어진 상기 비선형 여기 진폭은, 차단 주파수

를 반지름으로 하는 간섭성 전달 함수(CTF)를 각각

의 공간주파수 벡터만큼 변위시키는 것과 유사한 역할을 한다.

따라서, 도 6(b)를 참조하면, 상기 비선형 여기 진폭은 CARS 비선형광학 이미징의 유효 간섭성 전달 함수(effective CTF)를 최대 3배까지 확장하는 효과를 제공한다.

2차원 위상정합 CARS 구조조명에 의한 강도 이미지의 공간주파수 스펙트럼

은 수학식(12)와 수학식(16)으로부터

(17)

으로 표현된다. 이것은 다음과 같이 전개할 수 있다.

(18)

이 때,

은 각 스펙트럼 성분

의 위상이며, 시료의 공간주파수 스펙트럼

가구조조명에 의해 공간주파수 변위된 함수를 다음과 같이 정의하여 표기하였다.

(19)

[목표로 하는 확장 간섭성 전달 함수에 의한 가상 초고분해능 이미지 수식화]

앞에서 설명한 2차원 위상정합 CARS 구조조명 방법을 사용하여 도 6(b)에 도시한 유효 간섭성 전달함수(effective CTF)확장 효과를 모사하는 가상(virtual)의 초고분해능 광학계가 구현될 수 있다. 이 경우, 목표로 하는 가상 간섭성 전달함수(CTF)

는

(20)

이 된다. 이 때, 가상 CTF

는 이미징 광학계 본래의 간섭성 전달 함수

와 공간주파수 벡터

만큼 각각 원점이 변위된 4개의 추가된 간섭성 전달 함수들이 중첩된 형태이다. 상기 추가된 간섭성 전달 함수의 공간주파수 변위 벡터는,

와

로 주어진다. 상기 공간주파수 변위 벡터는 2차원 위상정합 CARS 구조조명을 통해 생성한 비선형 여기 진폭

의 구성 광파와 공간주파수 벡터가 일치해야 한다. 이 때, 상기 추가된 모든 간섭성 전달 함수의 공간주파수 변위 크기는 펌프광 진폭 구조조명공간주파수의 2배가 되도록 (

)로 설정된다.

상기 가상 CTF

를 갖는 초고분해능 이미징 광학계가 생성하는 간섭성 이미지의 공간주파수 스펙트럼은

이다. 따라서, 수학식(20)을 이용해 수식을 전개하면,

(21)

으로 표현된다. 이 때,

로 표시한 연산은 두 함수의 교차상관(cross-correlation)이다. 가상 이미지 스펙트럼

은 모두 13개의 스펙트럼 구성항

으로 구성되는데,

가 전체 확장 CTF를 구성하는 5개의 개별 요소 CTF에 의한 독립적 이미지 강도 스펙트럼의 합인 반면, 나머지 모든

항은 서로 다른 요소 CTF에 의한 이미지 진폭 스펙트럼 간의 교차상관 양상을 가진다.

[확장 CTF 가상 이미지와 위상정합 CARS 구조조명 이미지 간의 수학적 관계]

확장 CTF를 갖는 가상의 초고분해능 이미징 광학계에서 얻을 수 있는 이미지[수학식(21)으로 표현]를 2차원 간섭성 구조조명 이미지 측정 데이터(원시 이미지)[수학식(18)로 표현]로부터 복원하는본 발명의 이미지 처리 알고리즘에 대하여 설명한다.

상기 확장 CTF에 의한 가상 이미지 스펙트럼

과 상기 2차원 위상정합 CARS 구조조명 이미지 스펙트럼(원시 이미지 스펙트럼)

은 서로 같은 갯수의 함수항으로 구성된다. 상기 두 이미지 스펙트럼을 각각 구성하는 동일 차수

의 함수항

과 함수항

는 다음과 같이 일대일 대응되는 해석식이 성립한다.

(22)

즉, 실제 측정된 이미지 데이터(원시 이미지)

에 포함된 측정 스펙트럼 구성항

은 획득을 목표로 하는 가상 스펙트럼 구성항

에 대하여

의 공간주파수 변위만 이루어진 동일한 함수이다.

따라서, 적절한 측정을 통하여 상기 각 측정 스펙트럼 구성항

을 독립적으로 구하면, 수학식(22)의 대응관계를 이용하여 모든 차수의 상기 가상 스펙트럼 구성항

을 취득할 수 있다. 이에 따라, 목표로 하는 가상 이미지 스펙트럼

을 재구성할 수 있다.

[구조조명 원시 이미지로부터 측정 스펙트럼 구성항 획득 방법]

본 발명의 구조조명 물체에 대해 측정한 원시 이미지는 푸리에 변환되어 원시 이미지 스펙트럼을 제공할 수 있다. 상기 원시 이미지 스펙트럼

은 구조조명의 2-방위 진폭 위상 조합

이 주어질 때, 다음과 같이 측정 스펙트럼 구성항

들의 선형적 합으로 기술된다.[수학식(18) 참조]

(23)

따라서, 미지의 13개 측정 스펙트럼 구성항

를 구하기 위해서는, 적절히 선택된 13개의 2-방위 비선형 여기 진폭 위상조합

에 대해 구조조명 이미지 스펙트럼을 측정하고 이를 기술하는 연립 선형대수 방정식

(24)

으로부터 상기 측정 스펙트럼 구성항

의 해(solution)을 찾아야 한다. 이 때,

은 상기 위상조합

의 설정에 따라 결정되는 13 x 13스펙트럼 혼합 행렬(spectral mixing matrix)이다.

상기 2-방위 비선형 여기 진폭 패턴의 위상 조합

의 설정에 채택될 수 있는 각각의 방위별 위상값은

(25)

(26)

같이 되는 것이 바람직하다. 상기 제시한 구조조명 방위별 위상의 조합에 의해 결정되는 13 X 13스펙트럼 혼합 행렬

의 판별식은

(27)

의 조건을 만족시키도록 해야 한다.

일례로써, 본 발명에서 제공하는 상기 2-방위 비선형 여기 진폭 위상 조합은,

(28a)

(28b)

와 같이 상기 2-방위 구조조명에 대한 위상 인덱스 조합

이 서로 다른 13개의

조합으로구성될 수 있다.[수학식(25),수학식(26), 수학식(27) 참조]

본 발명의 일 실시예에 따르면, 2-방위 비선형 여기 진폭의 위상 조합은 도 7(c)에 도시한 2축 위상 공간의 13개 위상 벡터 점으로 표시할 수 있다. 또한, 상기 2-방위 비선형 여기 진폭의 위상 조합 변경에 따른 2차원 펌프광 진폭 구조조명 패턴의 겉보기 변화는 도 7(a)에 도시한 정방형 격자 구조조명 패턴이 상기 13개 위상 벡터에 대응하는 변위만큼 이동하는 효과로 나타난다.

상기 스펙트럼 혼합 행렬(spectral mixing matrix)

의 역행렬(matrix inverse)을 스펙트럼 역혼합 행렬(spectral unmixing matrix)

이라한다. 상기 2-방위 진폭 위상 조합

에 대하여구조조명된 원시 이미지 스펙트럼으로 형성한 열 벡터(column vector)

로부터

(29)

의 행렬 연산을 통하여 미지의 13개 측정 스펙트럼 구성항

에 대한 해를 구할 수 있다.

[초고분해능 이미지 스펙트럼 복원 및 실공간 이미지 재구성]

상기 방법을 통해 획득한구조조명된 원시 이미지의 측정 스펙트럼구성항

을 이용하여 목표로 하는 초고분해능 이미지를 재구성하는 방법을 설명한다.

상기 측정 스펙트럼구성항

은 각각 일대일 대응되는 가상 스펙트럼구성항

이공간주파수 원점 방향으로 특정 공간주파수 벡터만큼 이동된 함수이다. 상기 측정 스펙트럼구성항

은 확장 CTF에 의한초고분해능 이미지를 구성하는요소 스펙트럼이다.

따라서,목표로 하는 초고분해능의 가상 이미지(물체 이미지)의 스펙트럼의 재구성은,측정 이미지 스펙트럼의 각구성항

을 상응하는 가상 스펙트럼구성항

본래의 공간주파수 위치로 되돌림(spectral back-shift)으로써 이루어질 수 있다.측정 이미지 스펙트럼 구성항 중,

항을 제외한모든

항을 도9에 도시한 바와 같이 대응되는 가상 스펙트럼구성항

의 공간주파수 영역으로재배치시켜서가상 스펙트럼구성항

화시킨다. 이후 모두를 선형적으로 중첩하면 확장 CTF에 의한 이미지 스펙트럼과 동등한 초고분해능 이미지 스펙트럼으로 재구성된다.

또한, 초고분해능의 가상 이미지 스펙트럼을 역 푸리에변환(inverse Fourier transform)하면 실공간(real space)에서의 물체 이미지로 복원된다.

[본 발명에 의한 2차원 위상정합 CARS 구조조명 현미경의 공간분해능 특성]

상기 설명한 2차원 위상정합 CARS 구조조명에 의한 원시 이미지 측정과 공간주파수 영역 이미지 스펙트럼 재구성 계산을 적용해 복원시킨 비선형광학 시료의 초고분해능 이미지 스펙트럼은 본 발명이 목표로 하는 CARS 이미징 광학계의 간섭성 전달 함수(CTF) 확장 효과를 포함한다.

도 10은 직교 2 방위 진폭 구조조명에 의한 초고분해능 이미지 복원과 공간주파수 전달영역 확장 결과를 나타내는 도면이다.

도 10을 참조하면, 도3(a)에 도시한 2차원 비선형광학 시료(측정 대상)을 대상으로 한 일반 간섭성 이미징과 본 발명의 2차원 위상정합 CARS 구조조명 이미징의 컴퓨터 시뮬레이션 결과를 설명한다.

본 발명의 2차원 위상정합 CARS 구조조명 이미징에 의한 비선형광학 물체의 이미지 스펙트럼(도10(b) 하단 참조)은 일반 간섭성 이미징에 의한 이미지 스펙트럼(도10(a) 하단 참조)과 비교할 때, 비선형 여기 진폭물체 고유의 공간주파수 스펙트럼 정보를 취득할 수 있는 영역이 확장된다.

즉, 2차원 비선형 여기 진폭 물체의 공간주파수 스펙트럼을 취득할 수 있는 차단 주파수 한계가 본 발명에서 채용한 비선형 여기 진폭 구조조명의 직교한 2개 방위각에 대하여 최대 3배 확장됨을 알 수 있다.

결과적으로, 본 발명의 2차원 위상정합 CARS 구조조명 이미징에 의해 차단 주파수 한계가 확장된 비선형 여기 진폭 물체의 공간주파수 스펙트럼을 역 푸리에 변환(inverse Fourier transform)하면 실공간(real space)에서 광 회절한계를 넘어서는 간섭성 이미지를 얻을 수 있다. 즉, 도 10(a)에 도시한 일반 간섭성 이미지에 비하여, 2차원 공간분해능이 3배 향상된 초고분해능 간섭성 이미지(도 10(b) 참조)가 취득될 수 있다.

또한, 본 발명에 의한 2차원 위상정합 CARS 구조조명 이미징은 2-방위각 진폭 구조조명 측정과 2차원 간섭성 이미징 이론에 기초한 이미지 처리 알고리즘을 제공한다. 이에 따라, 단방향진폭 구조조명에 의한 1차원 간섭성 이미징을 수학적으로 고려한 종래의 1차원 위상정합 CARS 구조조명에 비교할 때, 차단 주파수 증대 효과의 공간주파수 영역 등방성을 제공하는 장점이 있다.

보다 상세하게, 종래의 1차원 위상정합 CARS 구조조명 이미징은 측정 대상이 단방향으로 공간분포 변화가 있고 수직한 다른 방향으로는 무한히 길게 연장된 1차원 물체인 경우에만 적용이 가능하였다. 즉, 크기가 유한하고 임의의 형상을 갖는 2차원 물체에 대하여 상기 1차원 위상정합 비선형광학 구조조명 현미경 이미징을 적용하면, [도3(b) 참조] 간섭성 전달 함수의 실질적인 확장 형태가 비등방적이다. 따라서, 복원된 이미지는 왜곡된다. 따라서, 본래 물체의 형상으로부터 예측 불가능한 이미지 결함(artifact)이 나타나는 심각한 문제점이 존재하였다.

210: 펌프 광원부
220: 구조조명 패턴 형성부
232: 하부 대물렌즈부
234: 상부 대물렌즈부
240: 스톡스 광원부
250: 측정부

Claims

펌프광 주파수를 가진 펌프광을 제공하는 단계;
상기 펌프광을 정방형 격자패턴으로 공간 진폭 변조하여 정방형 격자 진폭 구조조명을 측정 대상에 평행하게 조사하는 단계;
스톡스광 주파수를 가진 스톡스광을 상기 측정 대상에 조사하는 단계;
상기 정방형 격자 진폭 구조조명된 펌프광과 상기 스톡스광에 의하여 CARS 여기된 상기 측정 대상의 반스톡스 신호광 공간분포를 측정하여 원시 이미지를 생성하는 단계; 및
상기 원시 이미지를 처리하여 재구성된 물체 이미지를 산출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 2차원 위상정합 비선형광학 구조조명 이미징 방법.
제1 항에 있어서,
상기 원시 이미지를 처리하여 재구성된 물체 이미지를 산출하는 단계는:
상기 정방형 격자 진폭 구조조명의 방위별 위상 조합에 의해 결정되는 스펙트럼 혼합 행렬의 역행렬을 구하는 단계;
상기 원시 이미지들을 푸리에 변환하여 원시 이미지 스펙트럼을 산출하는 단계;
상기 원시 이미지 스펙트럼으로 구성된 스펙트럼 열 벡터와 상기 스펙트럼 혼합 행렬의 역행렬을 이용하여 상기 원시 이미지 스펙트럼을 구성하는 측정 스펙트럼 구성항을 추출하는 단계;
상기 측정 스펙트럼 구성항을 공간주파수 되돌림하여 가상 스펙트럼 구성항을 산출하는 단계;
상기 가상 스펙트럼 구성항을 선형 결합하여 가상 이미지 스펙트럼을 형성하는 단계; 및
상기 가상 이미지 스펙트럼을 푸리에 역변환하여 물체 이미지 또는 가상 이미지를 산출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 2차원 위상정합 비선형광학 구조조명 이미징 방법.
제1 항에 있어서,
상기 정방형 격자 패턴은 서로 직교하는 2 방위의 선형격자 진폭 구조조명 패턴인 것을 특징으로 하는 2차원 위상정합 비선형광학 구조조명 이미징 방법.
제1 항에 있어서,
상기 정방형 격자 패턴은 2 방위 여기 진폭 위상 조합에 의하여 2축 위상 공간의 13 개의 위상 벡터 점으로 표시되는 것을 특징으로 하는 2차원 위상정합 비선형광학 구조조명 이미징 방법.
펌프광 주파수를 가지는 펌프광을 제공하는 펌프광원;
상기 펌프광을 정방형 격자패턴으로 공간 진폭 변조하여 정방형 격자 진폭 구조조명을 제공하는 구조조명 패턴 형성부;
상기 정방형 격자 진폭 구조조명을 측정 대상에 제공하는 하부 대물 렌즈부;
스톡스광 주파수를 가지는 스톡스광을 제공하는 스톡스광원;
상기 스톡스광을 반사시키고 상기 정방형 격자 진폭 구조조명된 펌프광과 상기 스톡스광에 의하여 CARS 여기된 상기 측정 대상의 반스톡스 신호광을 투과시키는 이색성 거울;
상기 이색성 거울에 의하여 반사된 스톡스광을 상기 측정 대상에 제공하는 상부 대물 렌즈부; 및
상기 이색성 거울을 투과하는 상기 반스톡스 신호광의 2차원 공간 분포를 측정하여 원시 이미지를 생성하는 측정부를 포함하는 것을 특징으로 2차원 위상정합 CARS 구조조명 현미경.
제5 항에 있어서,
상기 측정부는 상기 반스톡스 신호광의 2차원 공간 분포에 의한 원시 이미지를 측정하고,
상기 원시 이미지를 처리하여 물체 이미지를 재구성하는 처리부를 더 포함하는 것을 특징으로 2차원 위상정합 CARS 구조조명 현미경.
제5 항에 있어서,
상기 구조조명 패턴 형성부는 상기 측정 대상의 상 공액면(image conjugate plane)에 배치되는 것을 특징으로 하는 2차원 위상정합 CARS 구조조명 현미경.