KR20120066485A - 단일세포 내 지질의 병리적 변화 진단 시스템 및 신약스크리닝 시스템 - Google Patents

단일세포 내 지질의 병리적 변화 진단 시스템 및 신약스크리닝 시스템 Download PDF

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Abstract

본 발명은 비선형광학현미경을 이용한 단일세포 내 지질의 병리적 변화 진단 시스템 및 신약스크리닝 시스템에 관한 것으로, 보다 상세하게는 비선형광학현미경을 이용하여 세포에 어떠한 표지나 파괴없이 단일세포 내에 비정상적으로 침착된 미세지질을 이미지화함과 동시에 이미징된 지질 성분을 분석하여 단일세포 내의 미세한 병리학적 변화를 진단함으로써 지질 관련 질병의 진행 단계를 판단할 수 있는 비선형광학현미경을 이용한 단일세포 내 지질의 병리적 변화 진단 시스템에 관한 것이다. 또한, 상기 진단 시스템을 이용하여 단일세포 내의 미세지질을 이미지화함과 동시에 단일세포 내 집적된 지질액적(lipid droplet)을 분석함으로써, 특정 약물에 대한 세포 내 지질의 정성적 또는 정략적 변화를 측정하여 특정 약물에 대한 활성여부를 판단할 수 있는 신약스크리닝 시스템에 관한 것이다.

Description

단일세포 내 지질의 병리적 변화 진단 시스템 및 신약스크리닝 시스템{System for diagnosing pathologic change of lipid in single cell and Screening system for new medicine}
본 발명은 비선형광학현미경을 이용하여 세포를 어떠한 표지나 파괴 없이 세포 내에 비정상적으로 침착된 미세지질을 이미지화함과 동시에 이미징된 지질의 성분을 분석하여 단일세포의 미세한 병리학적 변화를 진단함으로써 지질 관련 질병의 진행 단계를 판단할 수 있는 단일세포 내 지질의 병리적 변화 진단 시스템 및 비선형광학현미경을 이용하여 단일세포 내의 미세지질을 이미지화함과 동시에 단일세포 내 집적된 지질액적(lipid droplet)을 분석함으로써 특정 물질에 대한 세포 내 지질의 정성적 또는 정략적 변화를 측정하여 특정 물질에 대한 활성여부를 판단할 수 있는 신약스크리닝 시스템에 관한 것이다.
지질은 동맥경화 및 비만의 진행 단계와 연관되어 있다. 질병의 초기 단계에서 지질 체류는 주요한 개시 사건인 것으로 생각되고 있다. 동맥경화의 경우 소위 "내막 체류에 이은 현상(response-retention)" 가설에 대한 구체적인 사항은 밝혀져 있지 않으나, 동맥경화성 지단백이 내막에 축적되고, 죽종형성(atherogenesis)이 유도된다고 강조하고 있다. 이 모델에 따르면, 침투된 지단백은 세포외 기질(extracellular matrix, ECM), 특히 프로테오글리칸(proteoglycan)과 결합하고, 이들 지단백-프로테오글리칸 복합체는 분비된 사이토카인과 지질을 포함하는 거품세포(foam cell)의 분화에 의한 대식세포의 모집과 같은 동맥경화 현상을 유도한다. 반면, 지질 함량은 진행 단계에서 동맥경화 병반 취약성을 결정하는 결정적인 역할을 한다. 상처받기 쉬운 병반은 콜라겐이 많이 있는 중심부 대신에 지질이 많이 있는 중심부의 소프트 그루얼(soft gruel) 단계를 포함한다. 사실상, 병소의 지질 성분은 병반 파열과 혈전증에 직접적으로 연관되어 있다는 몇몇 연구들이 보고되어 있다. 진행된 죽상 중심부(atheromatous core)에는 콜레스테롤(유리형 및 에스테르화된 형 둘 다), 인지질, 트리아실글리세롤, 및 지방산을 포함되어 있다. 주요 구성성분인 콜레스테롤은 판형, 바늘형 및 때때로 핼릭스형 등의 다양한 외형을 가진 결정 형태로 존재할 수 있다. 세포막 콜레스테롤과는 달리, 진행된 병반에서 관찰되는 콜레스테롤 결정 구조는 세포외 지질로 활성이 없다. 최근에, 버마니(Virmani) 등은 파열된 병반은 절단된 관상동맥에서 침식 또는 안정된 병반보다는 괴저 중심부에서 콜레스테롤 클레프트 또는 결정을 포함하여 잠재적으로, 병반 취약성을 나타내는 것이라고 보고한 바 있다.
동맥경화를 진단함에 있어서 중요한 척도는 다음과 같다. 본격적인 지질의 침착은 대식세포(macrophage)라 하는 특정 면역세포에 의해 진행되는데, 활성화된 대식세포는 과량의 지질을 함유하게 되고 거품세포(foam cell)로 분화하게 된다. 이러한 거품세포의 등장은 동맥경화의 중요 척도로 인식되고 있으나, 현재의 이미징 기술로는 조직 내에 있는 거품세포를 이미징하는 것이 불가능한 일이었다. 또한, 매우 심화된 단계의 동맥경화에서는 콜레스테롤이 결정 상태(cholesterol crystals)로 존재하는데 심화된 정도에 따라 콜레스테롤 결정의 양이 다르게 나타난다. 콜레스테롤 결정 역시, 조직의 파괴 없이 이미징하는 것은 현재의 이미징 기술로는 불가능하다.
비만의 경우 세포 내 지질액적의 반경이 늘어나며 지질의 축적을 진행하게 된다. 지질액적의 크기가 점점 커지면서 비만세포로 분화가 되어가는데, 지질액적의 개수가 증가하는 동맥경화의 거품세포와는 다른 경과를 보인다. 지질액적의 크기의 분포가 증가함에 따라, 비만의 정도를 판단하게 되지만, 분화 정도의 정량적 지표는 전무하다.
한편, 비선형광학현미경(Coherent anti-Stokes Raman scattering, CARS) microcopy)은 최근에 표적 분자의 표지 및 표본 고정 없이 생체 내 분자 진동을 추적하여 생체 내 조직의 3차원 화학적 이미징을 위한 가장 실용적인 수단으로 대두되었다. CARS 현미경은 형광 표지 기술의 바람직하지 않은 바이어스가 입증되어 살아있는 생물체에서 지질 대사에 대한 실물 크기의 생물학적 연구에 이용되어 왔다. 최근에, 생체 내 피부 조직을 이미징하기 위한 비디오 레이트 CARS 현미경이 개발되었다. CARS 프로세스의 비선형 특징 때문에, 표본에 대한 촘촘한 초점의 빠른 스캐닝은 종래의 라만 현미경과 달리 3차원 초미세 분할로 된 진동 차이에 따른 이미지의 실시간 수집이 가능하다. 주변 조직과 비교하여 2700 내지 3000 cm-1의 CARS 스펙트럼에서 강하고 특징적인 진동 사인을 나타내면서 탄화수소 결합이 풍부하기 때문에, CARS 현미경은 특히 지질의 선택적 이미지에 적합하다. 그러나, 지질 조성물을 넘어서 단순한 진동 조직학의 세밀한 화학적 분석 및 단일세포 내 지질 분석은 여전히 CARS 측정으로는 한계가 있다.
최근 유전체학의 혁명적인 발전을 통해 얻은 결과를 안전하고 효과적인 신약 개발에 활용하는 시도를 하고 있으며, 신약 개발의 실패에 따른 막대한 손실을 줄이기 위해 고품질의 정보를 얻을 수 있는 새로운 도구를 필요로 하고 있다.
일반적으로 세포를 이용한 신약후보물질의 스크리닝 방법으로는 질병과의 상관성이 입증된 특정 유전자에 작용하는 화합물을 발굴하는 표적 기반 에세이(target-based assay) 방법과 물질을 처리한 후에 표현되는 세포의 형질(phenotype)의 변화를 알아보는 표현형 기반 에세이(phenotype-based assay)이 사용된다.
살아있는 세포의 고감도 형광 이미지 검출, 분석 기술을 통합하여, 세포내에서 일어나는 다양한 시간적, 공간적 현상에 대한 정보를 제공할 수 있는 HCS(High Content Screening) 기법이 제안되었다. 세포의 형광측정을 기반으로 한 HCS 분석은 이미 잘 정립된 형광현미경 분석법과 HTS(High Throughput Screen) 분석기술 플랫폼을 바탕으로 빠른 속도로 성장하고 있으며, 대규모의 다국적 제약회사들이 이러한 장비와 분석기술을 활용하는 연구 분야에 비중을 높여가고 있다.
지금까지의 HCS 신약 스크린 기술은 시료에 형광을 낼 수 있는 표지자를 붙이거나 방사능 물질을 사용하여 자외선이나 레이저광을 조사한 후 발생한 빛을 탐지하여 연구하였다. 시료 자체의 그대로 모습이 아닌 이물질과 엉켜있는 상태를 보는 것이다. 이러한 이물질은 때때로 바이오 시료의 활성을 떨어뜨려 생체시료의 거동에 대한 온전한 정보를 얻지 못하게 한다. 또한 형광용 색소는 장시간 빛에 노출되면 표백효과가 있어 이미징이 불가능해지는 문제점도 갖고 있다.
따라서, 무표지 세포분석을 위한 레이저분광, 질량분석, 이온전도도 이미징 및 편광분석 등 기존에는 세포를 대상으로 한 분석에 활용되지 않았던 새로운 바이오 분석기술을 이용하여 세포의 상태에 대한 다원화된 정보를 획득함으로써 현재 시장을 장악하고 있는 형광기반 HCS 장비 및 관련제품에 의한 분석정보와는 차별화된 고품질의 바이오 정보(ultra-high biocontent)를 제공할 수 있는 세포기반 신약스크린 기술을 개발한다면 기존 제품과의 경쟁력을 가지고 새로운 시장을 개척할 수 있을 것으로 예상된다.
이에, 본 발명자들은 비선형광학현미경 및 이미지 분석 유니트를 이용하여, 세포 내 표지 없이 이미지화시켜서, 이미지화된 세포 내에 집적된 지질의 양, 성상, 크기 등 세포 내 지질의 병리적 변화를 분석하는 방법을 알게 되어 본 발명을 완성하게 되었다. 따라서, 본 발명은 단일세포 내 지질의 병리적 변화 진단 시스템, 이의 병리적 변화 진단방법, 이를 이용한 신약스크리닝 시스템 및 신약 스크리닝 방법을 제공하는데 목적이 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명은 단일세포 내 지질의 병리적 변화 진단 시스템에 관한 것으로서, 스톡스광 및 펌프광을 선택적으로 조사하여 컴바인드 레이저 빔을 발생시키는 근적외선 펄스 레이저 유니트; 상기 근적외선 펄스 레이저 유니트로부터 전달된 컴바인드 레이저 빔이 조사되는 시료가 장착된 플랫홈; 상기 시료에서 발생된 CARS 신호를 수집하여 입체 영상을 제공하는 En face CARS 이미지 모드 검출 유니트; 및 상기 검출된 En face CARS 이미지로부터 단일세포 내의 지질 이미지 분석을 제공하는 이미지 분석 유니트를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 단일세포 내 지질의 병리적 변화 진단 방법에 관한 것으로서, 상기 병리적 변화 진단 시스템을 이용하여, 지방전구세포 내에서　지질액적(lipid droplet)을 이미지화하여　단일세포 내　지질액적의　병리적 변화를 분석하는 것을 다른 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 단일세포 내 지질의 병리적 변화 진단 방법에 관한 것으로서, 스톡스광과 펌프광을 시료에 조사하여 산란되는 CARS(coherent anti-Stokes Raman scattering) 지질 신호의 파장 및 세기를 측정하는 단계; 상기 신호를 3 차원 이미지로 검출하는 단계; 및 상기 이미지에서 지질의 구조를 이미지 분석 소프트웨어를 이용하여 분석하는 단계를 포함하는 것을 또 다른 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 신약스크리닝 시스템에 관한 것으로서, 상기 병리적 변화 진단 시스템을 이용하는 것을 또 다른 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 신약스크리닝 방법에 관한 것으로서, 신약스크리닝 시스템을 이용하여, 지방세포 내의　지질액적을 이미지화하여　지질액적의　병리적 변화를 추적 분석하는 하는 것을 또 다른 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 신약스크리닝 방법은 지방분화세포에 신약후보물질을 트랜스펙션(transfection)시키는 단계; 트랜스펙션된 지방분화세포를 지방세포로 분화유도시키는 단계; 지방세포를 이미지화하는 단계; 및 이미지화된 지방세포 내의 지질액적의 병리적 변화를 추적 분석하는 단계; 를 포함하는 것을 또 다른 특징으로 한다.
본 발명의 단일세포 내 지질의 병리적 변화 진단 시스템 및 진단방법은 염색 등에 따른 세포 손상 없이, 또한 표지 없이 3 차원적으로 세포 내 지질을 선택적으로 이미징 함으로써 비만 진행 단계를 추적 진단할 수 있다. 또한, 이를 통하여 비만 방지 및/또는 비만 저감 효과가 있는 신약을 개발하기 위한 효과적인 신약스크리닝 시스템 및 방법을 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 지질 선택적 3 차원 이미징 분석이 가능한 CARS 현미경 측정 플랫홈을 도시한 것이다.
도 2는 지방세포로 유도된 실험군과 대조군을 96-웰 플레이트에 주입한 것 예로서, 파란부위는 실험군으로서, 중 가로축(3~11)은 염기서열이 각각 다른 siRNA를 트랜스펙션 시킨 지방세포를 나타내며, 세로축(B~G)은 동일한 지방세포를 나타내며, 빨간부위는 대조군을 siRNA를 트랜스펙션 시키지 않은 대조군을 나타낸다.
도 3은 실시예에서 실시한 이미지-프로
Figure pat00001
플러스의 Stage-Pro에서 샘플 패턴 기능을 이용하여 좌표설정하는 작업을 캡쳐한 사진을 나타낸 것이다.
도 4는 siRNA 트랜스펙션 하지 않은 3T3-L1 지방전구세포(대조군)를 지방세포로 분화유도하기 시작한 후, 4일 내지 7 일간 CARS 이미징화한 사진이다.
도 5는 CARS 현미경으로 촬영된 이미지에서 단일 세포 내에 집적된 지질액적을 이미지-프로
Figure pat00002
플러스 소프트웨어(또는 프로그램)를 이용하여 분석하는 과정을 나타낸 사진이다.
도 6의 A 및 B 각각은 실험예에서 실시한 siRNA 트랜스펙션 없이 지방세포 분화유도한 대조군의 시간경과에 따른 지질액적의 평균크기변화 및 평균세기변화를 측정한 결과이다.
도 7의 A 및 B는 실험예에서 실시한 siRNA 트랜스펙션 시킨 지방세포 분화유도한 실험군의 siRNA 염기서열 종류에 따른 지질액적의 평균크기변화 및 평균세기변화를 측정한 결과로서, 지방세포로 분화유도시킨지 7 일차에 측정한 결과이다.
본 발명에서 사용하는 용어인 'CARS'는 비선형광학현미경(Coherent Anti-stokes Raman Scattering)을 의미한다. 또한, 본 발명에서 사용하는 용어 '지질의 병리적 변화' 또는 '세포 내 병리적 변화'란 '세포 내 존재하는 지질액적의 크기변화, 성상변화, 양적변화 등의 모든 변화'를 의미한다.
이하, 본 발명의 더욱 상세하게 설명한다.
본 발명은 스톡스광 및 펌프광을 선택적으로 조사하여 컴바인드 레이저 빔을 발생시키는 근적외선 펄스 레이저 유니트; 상기 근적외선 펄스 레이저 유니트로부터 전달된 컴바인드 레이저 빔이 조사되는 시료가 장착된 플랫폼; 상기 시료에서 발생된 CARS 신호를 수집하여 입체 영상을 제공하는 En face CARS 이미지 모드 검출 유니트; 및 상기 검출된 En face CARS 이미지로부터 단일세포 내의 지질 이미지 분석을 제공하는 이미지 분석 유니트를 포함하는 단일세포 내 지질의 병리적 변화 진단 시스템에 관한 것이다.
본 발명의 단일세포 내 지질의 병리적 변화 진단 시스템은 세포 내 지질의 탄화수소의 진동을 통해 이미지가 뚜렷하게 구별되는 지질에 대한 선택적 3 차원 이미징과 점 스펙트럼 분석이 가능한 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 단일세포 내 지질의 병리적 변화 진단 시스템에 있어서, 상기 근적외선 펄스 레이저 유니트는 서로 다른 파장의 스톡스광, 펌프광 및 탐칭광을 선택적으로 조사하여 컴바인드 레이저 빔을 발생시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 본 발명의 단일세포 내 지질의 병리적 변화 진단 시스템은 광대역 멀티플렉스 CARS 현미 분광 유니트와 En face CARS 이미지 모드 검출 유니트 사이에 배치되어, 상기 시료에서 발생된 CARS 신호를 선택적으로 각 유니트로 전달하는 이색 미러를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 단일세포 내 지질의 병리적 변화 진단 시스템은 플랫폼의 상기 시료에서 발생된 CARS 신호를 수집하여 스펙트럼을 검출하는 광대역 멀티플렉스 CARS 현미 분광 유니트를 더 포함할 수도 있다.
본 발명의 세포 내 지질의 병리적 변화 진단 시스템을 도 1를 참조하여 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
상기 근적외선 펄스 레이저 유니트는 스톡스광 및 펌프광을 선택적으로 조사하여, 또는 서로 다른 파장의 스톡스광, 펌프광 및 탐침광;을 선택적으로 조사하여 컴바인드 레이저 빔을 발생할 수 있으며, 상기 빔은 지질의 탄화수소 부분을 진동시켜 3 차원 이미지뿐만 아니라 이에 따른 라만 쉬프트를 동시에 평가할 수 있다.
구체적으로, 지질의 3 차원 이미징을 위해 스톡스광과 펌프광을 시료에 조사하며, 탐침광은 지질의 스펙트럼 분석을 위해 사용할 수 있어 3 차원 이미징 시 기계적 셔터를 통해 차단될 수 있다.
지질의 3차원 이미징을 위해, 상기 근적외선 펄스 레이저 유니트의 여기빔을 통해 얻은 지질의 CARS 신호가 전체 탄화수소의 진동 부분을 포함하도록 대역폭은 2700 내지 3050 cm-1인 것이 바람직하다.
또한, 상기 CARS 신호 수집 시간은 1.0 s/frame 이하, 바람직하게는 1.0 ~ 0.5 s/frame, 더욱 바람직하게는 1.0 ~ 0.7 s/frame 이다. 그리고, 공간적 밀도는 횡방향 0.4 ㎛ 이하, 더욱 바람직하게는 0.4 ~ 0.2 ㎛이며, 축방향이 1.3 ㎛ 이하인 것이, 더욱 바람직하게는 1.3 ~ 1.0 ㎛인 것이 좋다.
또한, 상기 멀티플렉스 CARS 현미 분광 유니트는 시료에서 발생된 CARS 신호를 수집하여 스펙트럼을 검출할 수 있으며, 대한민국 공개특허 제2009-0024965호에 기재된 것을 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 단일세포 내 지질의 병리적 변화 진단 시스템은 상기 광대역 멀티플렉스 CARS 현미 분광 유니트와 En face CARS 이미지 모드 검출 유니트 사이에 배치되어, 상기 시료에서 발생된 CARS 신호를 선택적으로 각 유니트로 전달하는 이색 미러를 포함할 수 있다.
상기 이색 미러는 1000 nm 미만의 파장을 반사시키고, 그 이상의 파장을 투과시키는 특징을 가지고 있다.
상기 이색 미러를 이용하여, 지질의 3 차원 이미징을 위해서는 스톡스광과 펌프광을 시료에 조사하여 645 내지 675 nm 범위의 CARS 지질 신호를 대역 투과 필터를 통해 분리하고 en face CARS 이미징 모드 검출 유니트를 통해 검출하여 3 차원 이미지를 얻을 수 있다.
또한, 지질의 스펙트럼 분석을 위해서는 광대역 멀티플렉스 CARS 현미 분광 유니트를 셋업 전환하고, 포인트-스캔 모드로 레이저-스캐너를 조정하여 시료에 탐침광을 50 내지 150 ms 동안 조사하여 멀티플렉스 CARS 신호가 발생시키고, 상기 신호는 격자형 모노크로매터를 투과하여 스펙트럼 분석이 가능하도록 할 수 있다.
이때, 상기 탐치광은 3.5 cm-1 이하의 협대역 파장을 갖는 것이 바람직하며, 이로부터 발생하는 반-스톡스 신호는 620 내지 640 nm 범위에서 나타날 수 있다.
본 발명은 상기 검출된 En face CARS 이미지로부터 단일세포 내의 지질 이미지 분석을 제공하는 이미지 분석 유니트를 포함하고 있는 것에 또 다른 특징이 있으며, 상기 이미지 분석 유니트는 지질 이미지를 통한 병리적 변화를 분석할 수 있는 것이라면 특별히 한정하지 않고, 어떤 것이든지 사용할 수 있으나, 이미지 프로
Figure pat00003
플러스(Image pro
Figure pat00004
plus) 소프트웨어를 포함하는 이미지 분석 유니트를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 이미지 분석 유니트를 통하여, 검출된 En face CARS 이미지로부터 단일세포 내의 지질 이미지를 효과적으로 정량적, 정성적 분석을 하여 단일세포 내 병리적 변화를 효과적으로 분석할 수 있다.
또한, 본 발명의 단일세포 내 지질의 병리적 변화 진단 시스템에서 사용하는 시료는 어떠한 고정이나 염색 처리되지 않는 것으로, 동물에서 적출된 세포라면 특별히 제한하지는 않으며, 예를 들면, 동물에서 적출한 지방전구세포를 분화유도시킨 지방세포일 수 있으며, 바람직하게는 3T3-L1 또는 ADSC(Adipose-derived stem cell) 중에서 선택된 지방전구세포를 분화유도시킨 지방세포일 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 단일세포 내 지질의 병리적 변화 진단 시스템을 통해 얻은 지질의 3 차원 이미지에서 초기 단계에 해당하는 시료의 경우, 지질 액적(lipid droplet, 거품세포)이 표면 내막에서 관찰되며, 중기 단계에 해당하는 시료의 경우, 지질 액적의 수가 현저히 증가한다.
본 발명은 앞서 설명한 병리적 변화 진단 시스템을 이용하여, 지방세포 내의　지질액적을 이미지화하여　지질액적의　직경, 크기(또는 부피), 총량 등의 병리적 변화를 측정 및 분석하여 단일세포 내 지질의 병리적 변화 진단 방법을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 단일세포 내 지질의 병리적 변화 진단 방법은
스톡스광과 펌프광을 시료에 조사하여 산란되는 CARS(coherent anti-Stokes Raman scattering) 지질 신호의 파장 및 세기를 측정하는 단계; 상기 신호를 3 차원 이미지로 검출하는 단계; 및 상기 이미지에서 지질의 구조를 이미지 분석 소프트웨어를 이용하여 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
그리고, 상기 이미지 분석 소프트 웨어는 지질 이미지를 통한 병리적 변화를 분석할 수 있는 소프트웨어라면 특별히 한정하지 않고, 어떤 것이든지 사용할 수 있으나, 이미지 프로
Figure pat00005
플러스(Image pro
Figure pat00006
plus) 소프트웨어를 사용하는 것이 바람직하다.
상기 병리적 변화 진단 방법의 시료는 앞서 설명한 단일세포 내 지질의 병리적 변화 진단 시스템 시료에 대한 내용과 동일하다.
그리고, 상기 신호는 대역 투과 필터를 통해 수집되어 en face CARS 이미징 모드 검출 유니트를 통해 검출되어 3 차원 이미지로 얻을 수 있다.
또한, 본 발명은 앞서 설명한 단일세포 내 지질의 병리적 변화 진단 시스템을 포함하는 신약스크리닝 시스템 및 신약스크리닝 방법에 관한 것으로서, 이를 통하여, 현재 시장을 장악하고 있는 형광기반 HCS 장비 및 관련제품을 대체할 수 있는 세포의 상태에 대한 다원화된 정보를 획득이 가능한 새로운 바이오 분석기술을 제공할 수 있다. 구체적으로는, 세포에 대한 표지 없이 단일세포 자체 내에 변화를 정량적, 정성적으로 분석함으로써, 단일세포가 어떠한 단계의 분화 과정에 있는 지를 직접 측정 및 이미지 분석 소프트웨어를 이용하여 분석함으로써, 특정 물질 또는 유전자 변이에 의한 단일세포의 변화를 추적 분석이 가능한 바, 효과적으로 신약물질 도출을 위한 신약스크리닝 시스템 및 신약스크리닝 방법을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 신약후보물질에 대한 단일세포 또는 지방전구세포 내의 지질액적을 이미지화하여 지질액적의 병리적 변화 등을 정성적, 정략적으로 측정하기에 매우 적합한 바, 특정 물질의 비민방지약효평가를 할 수 있는 신약스크리닝 시스템 및 신약스크리닝 방법을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 신약스크리닝 시스템 및 방법은 지방분화세포에 신약후보물질을 트랜스펙션(transfection)시키는 단계; 트랜스펙션된 지방분화세포를 지방세포로 분화유도시키는 단계; 지방세포를 이미지화하는 단계; 및 이미지화된 지방세포 내의 지질액적의 병리적 변화를 추적 분석하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.
그리고, 지방세포를 이미지화하는 단계는 지방세포를 이미지화하는 단계는
스톡스광 및 펌프광을 선택적으로 조사하여 컴바인드 레이저 빔을 발생시키는 근적외선 펄스 레이저 유니트; 상기 근적외선 펄스 레이저 유니트로부터 전달된 컴바인드 레이저 빔이 조사되는 시료가 장착된 플랫폼; 상기 시료에서 발생된 CARS 신호를 수집하여 입체 영상을 제공하는 En face CARS 이미지 모드 검출 유니트; 및 상기 검출된 En face CARS 이미지로부터 단일세포 내의 지질 이미지 분석을 제공하는 이미지 분석 유니트;를 포함하는 시스템을 이용하여 지방세포의 지질액적을 이미지화할 수 있다.
그리고, 상기 시스템은 광대역 멀티플렉스 CARS 현미 분광 유니트와 En face CARS 이미지 모드 검출 유니트 사이에 배치되어, 상기 시료에서 발생된 CARS 신호를 선택적으로 각 유니트로 전달하는 이색 미러를 더 포함할 수 있다.
또한, 상기 시스템은 플랫폼의 상기 시료에서 발생된 CARS 신호를 수집하여 스펙트럼을 검출하는 광대역 멀티플렉스 CARS 현미 분광 유니트를 더 포함할 수 있다.
그리고, 상기 시스템의 각 유니트 및 이색 미러는 앞서 설명한 단일세포 내 지질의 병리적 변화 진단 시스템의 유니트 및 이색 미러의 특징과 동일하다.
그리고, 상기 신약후보물질은 본 발명에서 특별히 한정하지 않으며, 구체적인 예를 들면, siRNA(small interference RNA), 화합물, 천연물 및 단백질 중에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다. 단, 하기의 실시예는 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
준비예 : CARS 이미징 플랫홈의 준비
지질 선택적 3차원 현미경 이미징 및 점 스펙트럼 분석을 위해 같은 플랫홈 상에 광대역 멀티플렉스 CARS 현미 분광계와 레이저-스캐닝 CARS 현미경을 동시에 설치하였다.
도 1에 도시된 바와 같이, 레이저-스캐닝 CARS 현미경은 격자형 단색화장치(grating monochromator, Triax320; Horiba Jobin Yvon)가 장착되어 있는 변형 레이저-스캐닝 공초점 현미경(IX81/FV300; Olympus, Japan)과 3 가지 색을 동시에 발생할 수 있는 CARS 여기 빔을 발생하는 근적외선(near-IR) 펄스 레이저 시스템으로 구성되어 있다.
출력전력의 10%를 분할하면서 이를 펄스 지연선 (delay line)을 통해 현미경으로 전달하여 CARS 스톡스 빔을 발생하기 위해, 76 MHz의 반복률에서 10W 평균 전력 7ps 펄스 열을 전달하는 1064 nm 모드 락 네오디뮴 바나데이트(Nd:VO4) 레이저(picoTrain; High Q Laser Production GmbH, Hohenems, Austria)를 사용하였다.
흡수선량(intracavity) 이중 광학 파라메트릭 오실레이터(Levante; APE GmbH, Berlin, Germany)를 동시에 펌핑하기 위해 상당부분의 파워(9 W)을 사용하여 776.7 nm 파장에서 6 ps, 76 MHZ 펄스 열에서 1.3W CARS 탐침 빔을 발생시켰다. 800 mW 평균 출력 파워와 약 35 nm로 조정된 펄스 대역폭, 76 MHZ에서 일반 반복률을 유지하기 위한 1064 nm CARS 스톡스 빔과 동시에 활동적으로 발생하는 출력 펄스 트레인 및 캐비티 안정화 피드백 서보(cavity stabilization feedback servo)를 이용하여 동일 펄스 타이밍을 제공하는 광대역 펨토초 모드 락 티타늄-사파이어 레이저로부터 817 nm 파장에 집중되어 있는 멀티플렉스 CARS 펌프 빔을 발생시켰다.
각 빔 경로(path)에 위치한 망원경의 빔 확대기(beam expander)를 조정하여 각 레이저의 빔 직경 및 디버전스(divergence)를 매치되도록 조정한 후, 3개의 CARS 여기 빔은 2개의 빔 컴바이닝 옵틱스(beam combining optics)를 순차적으로 이용하여 동일선상으로 겹쳐지도록 하였다.
펌프 및 탐침 빔은 50:50 광대역 빔분리기(CVI Melles Griot, Albuquerque, NM)에서 연결되고, 스톡스 빔은 730-960 nm의 범위의 근적외선 파장에 대해 고반사율을 가지며, 1064 nm에서 스톡스 빔에 대해 높은 투과율을 갖는 색 이색 거울(dichroic mirror, Chroma Technologies Corp., Rockingham, VT)와 연결하였다.
컴바인드 레이저 빔은 600 nm 이상의 파장에 대해 약 95%의 투과율을 갖는 한 쌍의 갈바노미터 미러로 구성된 두 축을 갖는 빔 스캐닝 유닛(FV300)을 통해 1.2 NA 60X water-immersion microscope objective(UPlanSApo UIS2; Olympus)로 전달하였다. 그리고, 시료의 레이저에 의한 손상을 피하기 위해, ND 필터(neutral density filter)로 각 레이저 출력 파위을 감쇄하여 시료를 조명하는 컴바인드 레이저 빔의 평균 출력을 총 40 mW 이하로 제한하였다.
요약하자면, CARS 플랫폼을 사용하여 표지 없이 지질 선택적으로 이미징을 수행하기 위해, 빔의 대역폭을 전체 CH 진동 부분을 포함하도록 라만 이동에서 2700 내지 3050 cm-1의 범위로 확장하여 다양한 변형을 겪고 있는 세포의 지질액적을 이미지화 하였다.
두 번째로, 표지 없는 바이오 이미징을 위한 통상의 라만 현미경과 비교하여 수집 시간이 1.0s/frame이고, 공간적 밀도(spatial resolution)는 횡방향(x-y)은 0.4㎛이고 축방향(z-direction)은 1.3㎛으로 하여, 250×50 ㎛2의 최대이미징 영역(maximum field)를 갖는 2 차원 이미징을 개선하였다.
세 번째로, CARS 현미경은 동맥경화성 지질의 스펙트럼 분석을 위한 광대역 멀티플렉스 CARS 셋업으로 쉽게 전환될 수 있게 하였다.
실시예
(1) 3 T3 - L1 지방전구세포 배양
10% FBS(Fetal Bovine Serum), 페니실린(penicillin, 100 units/ml) 및 스트렙토마이신(streptomycin, 100 ug/ml))이 포함된 DMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Medium, GibcoBRL사의 11995) 기본배지에서, 쥐의 지방전구세포인 3T3-L1(ATCC, CL-173)을 37℃ 및 5% CO2 조건으로 배양하였다.
(2) 실험군 제조 : siRNA 트랜스펙션 ( transfection ) 및 지방세포로 분화유도
siRNA를 LipofectamineTM 2000 reagent(invitrogen사)를 이용하여 상기 배양된 3T3-L1 지방전구세포에 다음과 같은 방법으로 트랜스펙션하였다.
Opti-MEM reduced media(invitrogen) 25 ㎕에 하기 표 1의 서열번호를 갖는 siRNA 각각 5 pmol과 LipofectamineTM 2000 0.25 ㎕를 각각 넣고 5분간 상온에서 반응시킨 뒤, 둘을 섞어서 다시 20 분간 반응시켜서 DNA 시약 복합체를 제조하였다.
다음으로, DMEM 기본배지에서 Opti-MEM reduced media로 배지를 교환해 준 지방전구세포에 상기 DNA 시약 복합체 넣고 4시간 배양하여 트랜스펙션시켜서, 하기 표 1의 서열번호를 갖는 siRNA가 트랜스펙션된 53개의 지방전구세포를 각각 제조하였다.
다음으로, 0.5 mM의 3-이소부틸-1-메틸잔틴(3-isobutyl-1-methylxanthine, Sigma사의 I5879)와 1 μM의 덱사메타손(dexamethasone, Sigma사의 D4902)이 첨가된 DMEM으로 배지를 바꾸고, 상기 트랜스펙션 지방전구세포 각각을 지방세포로 분화를 유도하여 53개의 실험군을 제조하였다.
구분 유전자 siRNA 서열(sequence) 서열번호
전사인자
(Transcription factor)		 CEBP A UGAAGCACAAUCGAUCCAU(dTdT) 1
CEBP B GACAAAGCAUGAGCGACGAGU(dTdT) 2
CEBP D CAGCUAAGGUACAUUUGUA(dTdT) 3
CREB CUGUACAUAUGCUACUGAU(dTdT) 4
PPARa GAAGAUUCCCAGAAAGUUA(dTdT) 5
PPARg AGUAUGGUGUCCAUGAGAU(dTdT) 6
SREBP-1C(Srebf1) CACAGUUCCCUAGUCAUCU(dTdT) 7
지방세포분화
Adipocyte differentiation(Endocrine responses and signal transduction)		 ADRP CAUUCAAGAUCAGGCCAAA(dTdT) 8
beta-catenin GUUUUAGGCCUGUUUGUAA(dTdT) 9
BFGF GAGAGAGGAGUUGUGUCUA(dTdT) 10
bmp2 CAGACAUUACUGAUCUGAU(dTdT) 11
CB1(Cnr1) GUGUGUGAUUGUAAGUGUA(dTdT) 12
EGF CAGGAAUGGAGGCUGUGAA(dTdT) 13
impdh1 CCAAUGAAGUACGGAAGGU(dTdT) 14
lpin1 GACUGUAUACGAGCUCACU(dTdT) 15
MCPIP CUAUGAUGACCGCUUCAUU(dTdT) 16
socs3 AGUCAUCUCUCGGUCAGUA(dTdT) 17
Estrogen receptor α (Esr1) CAGACUAGACUGUGCUUGA(dTdT) 18
acrp30 GAGAAGCCGCUUAUGUGUA(dTdT) 19
AKT1 CCACGGAUACCAUGAACGA(dTdT) 20
IGF-1 receptor CUCUUCUCCGGCAACUGAU(dTdT) 21
IR(Insr) CGUUCCUCUCACUGUCAGA(dTdT) 22
IRS-1 CAGUCAACCAGAUGUACAA(dTdT) 23
Kif3a GGUUGGCCUUUAAGCUCCU(dTdT) 24
MTTP GUGAUGAUGAUCAAGUGAU(dTdT) 25
PI3K(Pik3r1) AGUUUCCCACCCUAGUGUA(dTdT) 26
PKA CCUCGCUUCUAGCUUAGCU(dTdT) 27
PKC B CGUACUCCAGUCCUACCUU(dTdT) 28
PTEN CAGGAAUGAACCAUCUACA(dTdT) 29
지질&
포도당대사체
(Lipid & glucose metabolism)		 ABCD2 UGUUCUGGGUCUUCGAUGA(dTdT) 30
ACC1(Acaca) CUCAACCACUAUGGCAUGA(dTdT) 31
ACC2(Acacb) CUCUGAUGAGGACCCUAGU(dTdT) 32
adiponectin R1 GACUUGGCUUGAGUGGUGU(dTdT) 33
apoB48 receptor CUCAGAGGGCGAGAUCCAA(dTdT) 34
CD36/FAT CUGAGUAGGUUUUUCUCUU(dTdT) 35
DGAT ACUAUCCAGAACUCCAUGA(dTdT) 36
GLUT-1(Slc2a1) GUGUACUGCGGCCUGACUA(dTdT) 37
GLUT-4(Slc2a4) GAUUGAACAGAGCUACAAU(dTdT) 38
HSL(Lipe) GACUCUAGCUUUGCUCACA(dTdT) 39
leptin CUAUUGUGACUGACUCUAU(dTdT) 40
PERILIPIN A(Plin) CAGAACACUCUCCGGAACA(dTdT) 41
UCP2 GACUAGGAAUGCUGUCAGU(dTdT) 42
ABCA1 GUGUCUACGUGCAACAGAU(dTdT) 43
LCAT GUGUUCAUUUCCACACCAA(dTdT) 44
사이토카인
(Cytokine)		 IL-1b CAGGCUCCGAGAUGAACAA(dTdT) 45
IL-6 CAGAAACCGCUAUGAAGUU(dTdT) 46
TNFa(TNF) GUCCAACUCUGUGCUCAGA(dTdT) 47
세포주기
단백질
(Cell cycle protein)		 CDC25A CACAUCUACGAGGAGAGUA(dTdT) 48
CDC6 CGUAGACCAGUCUGAGUGU(dTdT) 49
E2F1 CACGAUCCAUACCCUCUGU(dTdT) 50
HDAC1 GAGGUUGAUAGCCUAGCUU(dTdT) 51
HMGA1 GUGAAGUGCCAACUCCGAA(dTdT) 52
RB CAGUUGAUCUAGAUGAGAU(dTdT) 53
(3) 대조군 제조 : 3 T3 - L1 지방세포로 분화유도
상기 배양한 3T3-L1 지방전구세포를 이용하여, 0.5 mM의 3-이소부틸-1-메틸잔틴(3-isobutyl-1-methylxanthine, Sigma사의 I5879)와 1 μM의 덱사메타손(dexamethasone, Sigma사의 D4902)이 첨가된 DMEM으로 배지를 바꾸고 2 일간 배양하였다. 다음으로, 10 ㎍/ml 인슐린(insulin, Sigma사의 I2643)만 첨가된 배지에서 다시 2일간 배양하였다.
다음으로, 지방전구세포에 사용된 상기 DMEM 기본배지로 이틀마다 교환하여 총 7 일간 배양하여 지방세포로 분화를 유도하였다.
(4) Motorized stage 및 stage 좌표설정
상기 지방세포로 유도된 실험군과 대조군을 도 2에 나타낸 바와 같이 96-웰 플레이트에 각각 5×104 cells/well씩 주입하였다. 여기서, 도 2의 실험군(파란부위) 중 가로축(3~11)은 염기서열이 각각 다른 siRNA를 트랜스펙션시킨 지방세포를 나타내며, 세로축(B~G)은 동일한 지방세포를 나타낸다.
96-웰 플레이트에서 각각의 웰의 한가운데 동일한 부분을 이미징하기 위하여 ProScanTM Motorized Stage System(PRIOR scientific)을 상기 준비예의 CARS 현미경에 상기 실험군과 대조군이 주입된 96-웰 플레이트를 장착하였고, 프로그램은 이미지 프로
Figure pat00007
플러스(image-Pro
Figure pat00008
Plus) 소프트웨어(프로그램)로 연동하여 조정하였다.
이미지 프로
Figure pat00009
플러스의 Stage-Pro에서 샘플 패턴(Sample Pattern) 기능을 이용하여 좌표를 설정하고, stage를 원하는 위치로 이동시킬 수 있다. 96-웰 플레이트의 가장자리를 제외한 실험에 이용하는 가운데 60개 웰의 outer pattern을 도 3에 나타낸 바와 같이 지정하고 웰의 지름을 입력하여 윤곽(outline)을 잡은 뒤, 현재위치(current position)를 설정하면, 현재 웰의 XY좌표가 결정된다. 그리고, 좌표와 웰의 지름이 자동으로 계산되어서 각각의 웰의 같은 부분을 찾을 수 있다.
(5) 96-웰 플레이트에서 분화된 지방세포의 CARS 이미징
CARS 현미경을 이용하여 세포의 이미지를 측정하였다. 지질이 아닌 부분은 빨간색으로 나타나고, 신호가 나타나는 노란색부터 신호가 가장 강한 흰색까지는 지방이 축적된 지질액적(lipid droplet)을 나타내며, 세포 내의 지질액적을 바닥부터 1㎛ 단위로 촬영하였다.
도 4는 siRNA 트랜스펙션 하지 않은 3T3-L1 지방전구세포(대조군)를 지방세포로 분화유도하기 시작한 후, 4일 내지 7일간 CARS 이미징화한 사진으로서, 단일세포 내 지질액적의 변화를 알 수 있다.
도 4를 살펴보면, 지방세포로 분화될 수로, 흰색으로 표시되는 지질액적의 크기, 부피 및 양이 증가하는 것을 확인할 수 있다.
(6) 지방 단일 세포 내의 지질 이미지 분석
CARS 현미경으로 촬영된 이미지에서 단일 세포 내에 집적된 지질액적을 도 5에 나타낸 바와 같이 이미지 프로
Figure pat00010
플러스소프트웨어를 이용하여 분석하였다.
(6-1) 측정
96 웰의 바닥으로부터 일정한 높이의 단면 이미지에서 AOI(Area of interest) 도구를 이용하여 세포의 외곽선을 따라 그려서 단일 세포의 영역을 표시하였다. 표시된 영역 안에서 지질을 나타내는 노란색부터 흰색까지 선택하고 마스크를 적용하면 지질이 아닌 영역은 검정, 지질 부분은 흰색으로 표시가 된다. 다음으로 이를 카운트(count)하면서 흰색으로 표시된 영역이 측정하였다.
(6-2) 단일 세포 내의 지질액적 세기(intensity) 측정을 이용한 지질 부피(크기) 분석
위의 측정결과를 엑셀시트(EXCEL sheet)로 옮기면, 각각의 범주에 해당하는 수치가 면적(area)으로, 범주의 개수가 총갯수(total count)로 나타난다. 면적은 단일 세포 부분의 안에 있는 지질액적의 넓이를 나타내고, 총갯수는 지질액적의 갯수를 나타낸다. 이렇게 구한 단면의 넓이를 각 세포 별로 더해준 후 세포 안에 있는 지질액적의 총수로 나누어 주면 평균 넓이가 된다.
이 값의 양의 제곱근을 구함으로써 세포별 지질액적의 반지름에 비례하는 값을 얻게 되며 이를 크기(또는 부피)로 정한다. 또한, 각 세포 별 평균크기(또는 평규부피)와 지질액적의 총수를 곱하면 각 세포 당 지질액적의 총량이 된다. 이 값은 앞서 세포 별로 단면의 넓이를 모두 더한 값에 해당한다.
실험예 : 신약후보물질의 약효평가 실험
(1) 대조군의 단일세포별 지질액적의 평균크기 및 평균세기 측정
siRNA 트랜스펙션 없이 지방세포 분화유도한 대조군(도2의 2B~2G)을 분화유도하기 시작한 지 4일부터 7일까지 단일세포별 지질액적의 크기를 1일 간격으로 측정하고 각각의 평균값을 7일차의 단일세포별 지질액적의 평균값으로 정규화(normalize)하여, 시간 변화에 따른 지질액적의 평균크기(D) 및 평균세기(I, intensity) 변화 양상을 관찰하였으며, 그 결과를 도 6의 A 및 B에 각각 나타내었다.
도 6을 살펴보면, 시간이 흐를수록 지방세포의 지질액적의 평균크기 및 평균세기가 증가하는 것을 확인할 수 있다.
(2) siRNA 트랜스펙션된 단일세포별 지질액적의 평균크기 및 평균세기 측정
각 siRNA의 효과를 분석하기 위해, 같은 상태의 같은 세대의 세포를 준비하여, 트랜스펙션 없이 지방세포로 분화유도하여 음성대조군(negative control)을 제조였으며, 분화유도 후, 7일째 되는 날의 평균크기 및 평균세기를 측정하였다.
서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 8 또는 서열번호 36의 염기서열을 갖는 siRNA를 지방전구세포에 각각 트랜스펙션한 후, 세포단면의 지질액적의 이미지 분석을 통해 세포 내 지질액적의 평균 크기를 단일세포 별로 측정하고 이를 통계적으로 분석한 후, 정상적인 비만분화세포를 대상으로 측정 한 세포 별 지질액적의 평균크기 및 평균세기를 비교함으로써 비만이 얼마나 억제되었는지를 분석하였으며, 7일 차의 지질액적의 평균크기 및 평균세기 측정한 후, 측정된 값을 상기 음성대조군의 평균크기 및 평균세기로 나누어서, 지질액적의 병리적 변화를 살표보았으며, 그 결과를 도 7의 A 및 B에 나타내었다.
구체적으로는 시간이 경과함에 따라 단위세포당 지질액적 양의 분포가 변화되는 양상을 관찰하기 위해 다수의 세포를 대상으로 단일세포별 지질액적의 평균크기인 DL을 구한 후 로그(log)을 취하여 이 값의 돗수분포를 구하였다. 그리고, 단일세포 내 지질액적의 평균크기와 평균세기는 독립적인 결과 값이기 때문에 이와 같은 분석을 통해 단일세포 내 지질액적의 크기 및 세기의 추이를 독립적으로 비교, 관찰하는 것이 가능하다.
도 7의 결과를 비교해보면, siRNA 트랜스펙션된 단일세포별 지질액적의 평균크기 및 평균세기 값이 음성대조군의 평균크기 및 평균세기 보다 낮은 값을 보이는 것을 확인할 수 있으며, 이를 통하여 siRNA에 의해 세포의 지방화 억제 효과가 있음을 확인할 수 있다.
상기 실시예 및 실험예를 통하여, siRNA가 트랜스펙션된 지방세포(실험군)와 일반 지방세포(대조군)에서 얻은 결과를 비교 분석함으로써, 실험군 단일세포 내의 지질액적의 크기 및 양적 증가가 억제되었는지의 여부를 확인할 수 있다. 그리고, 이를 통하여 비만 억제 또는 감소시킬 수 있는 신약후보물질의 용이하고 정확하게 스크리닝 할 수 있음을 확인할 수 있었다. 또한, 본 발명의 단일세포 내 지질의 병리적 변화 진단 시스템 및/또는 신약스크리닝 시스템을 이용하여 비만 억제 또는 감소 신약후보물질뿐만 아니라, 이 외의 신약후보물질을 효과적이고 높은 신뢰성으로 스크리닝할 수 있다.
<110> KOREA RESEARCHI INSTITUTE OF STANDARDS AND SCIENCE <120> System for diagnosing pathologic chage of lipid in single cell and Screening system for new medicine <160> 53 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CEBP A <220> <223> T=dt <400> 1 ugaagcacaa ucgauccaut t 21 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CEBP B <220> <223> T=dt <400> 2 gacaaagcau gagcgacgag utt 23 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CEBP D <220> <223> T=dt <400> 3 cagcuaaggu acauuuguat t 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CREB <220> <223> T=dt <400> 4 cuguacauau gcuacugaut t 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPARa <220> <223> T=dt <400> 5 gaagauuccc agaaaguuat t 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPARg <220> <223> T=dt <400> 6 aguauggugu ccaugagaut t 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SREBP-1C(Srebf1) <220> <223> T=dt <400> 7 cacaguuccc uagucaucut t 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADRP <220> <223> T=dt <400> 8 cauucaagau caggccaaat t 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-catenin <220> <223> T=dt <400> 9 guuuuaggcc uguuuguaat t 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BFGF <220> <223> T=dt <400> 10 gagagaggag uugugucuat t 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bmp2 <220> <223> T=dt <400> 11 cagacauuac ugaucugaut t 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CB1(Cnr1) <220> <223> T=dt <400> 12 gugugugauu guaaguguat t 21 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGF <220> <223> T=dt <400> 13 caggaaugga ggcugugaat t 21 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> impdh1 <220> <223> T=dt <400> 14 ccaaugaagu acggaaggut t 21 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lpin1 <220> <223> T=dt <400> 15 gacuguauac gagcucacut t 21 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MCPIP <220> <223> T=dt <400> 16 cuaugaugac cgcuucauut t 21 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> socs3 <220> <223> T=dt <400> 17 agucaucucu cggucaguat t 21 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Estrogen receptor alpha (Esr1) <220> <223> T=dt <400> 18 cagacuagac ugugcuugat t 21 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> acrp30 <220> <223> T=dt <400> 19 gagaagccgc uuauguguat t 21 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AKT1 <220> <223> T=dt <400> 20 ccacggauac caugaacgat t 21 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGF-1 receptor <220> <223> T=dt <400> 21 cucuucuccg gcaacugaut t 21 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IR(Insr) <220> <223> T=dt <400> 22 cguuccucuc acugucagat t 21 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IRS-1 <220> <223> T=dt <400> 23 cagucaacca gauguacaat t 21 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kif3a <220> <223> T=dt <400> 24 gguuggccuu uaagcuccut t 21 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MTTP <220> <223> T=dt <400> 25 gugaugauga ucaagugaut t 21 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PI3K(Pik3r1) <220> <223> T=dt <400> 26 aguuucccac ccuaguguat t 21 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PKA <220> <223> T=dt <400> 27 ccucgcuucu agcuuagcut t 21 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PKC B <220> <223> T=dt <400> 28 cguacuccag uccuaccuut t 21 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PTEN <220> <223> T=dt <400> 29 caggaaugaa ccaucuacat t 21 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ABCD2 <220> <223> T=dt <400> 30 uguucugggu cuucgaugat t 21 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACC1(Acaca) <220> <223> T=dt <400> 31 cucaaccacu auggcaugat t 21 <210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACC2(Acacb) <220> <223> T=dt <400> 32 cucugaugag gacccuagut t 21 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> adiponectin R1 <220> <223> T=dt <400> 33 gacuuggcuu gaguggugut t 21 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> apoB48 receptor <220> <223> T=dt <400> 34 cucagagggc gagauccaat t 21 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD36/FAT <220> <223> T=dt <400> 35 cugaguaggu uuuucucuut t 21 <210> 36 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DGAT <220> <223> T=dt <400> 36 acuauccaga acuccaugat t 21 <210> 37 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GLUT-1(Slc2a1) <220> <223> T=dt <400> 37 guguacugcg gccugacuat t 21 <210> 38 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GLUT-4(Slc2a4) <220> <223> T=dt <400> 38 gauugaacag agcuacaaut t 21 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSL(Lipe) <220> <223> T=dt <400> 39 gacucuagcu uugcucacat t 21 <210> 40 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> leptin <220> <223> T=dt <400> 40 cuauugugac ugacucuaut t 21 <210> 41 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PERILIPIN A(Plin) <220> <223> T=dt <400> 41 cagaacacuc uccggaacat t 21 <210> 42 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UCP2 <220> <223> T=dt <400> 42 gacuaggaau gcugucagut t 21 <210> 43 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ABCA1 <220> <223> T=dt <400> 43 gugucuacgu gcaacagaut t 21 <210> 44 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LCAT <220> <223> T=dt <400> 44 guguucauuu ccacaccaat t 21 <210> 45 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1b <220> <223> T=dt <400> 45 caggcuccga gaugaacaat t 21 <210> 46 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 <220> <223> T=dt <400> 46 cagaaaccgc uaugaaguut t 21 <210> 47 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNFa(TNF) <220> <223> T=dt <400> 47 guccaacucu gugcucagat t 21 <210> 48 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDC25A <220> <223> T=dt <400> 48 cacaucuacg aggagaguat t 21 <210> 49 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDC6 <220> <223> T=dt <400> 49 cguagaccag ucugagugut t 21 <210> 50 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E2F1 <220> <223> T=dt <400> 50 cacgauccau acccucugut t 21 <210> 51 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HDAC1 <220> <223> T=dt <400> 51 gagguugaua gccuagcuut t 21 <210> 52 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMGA1 <220> <223> T=dt <400> 52 gugaagugcc aacuccgaat t 21 <210> 53 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RB <220> <223> T=dt <400> 53 caguugaucu agaugagaut t 21

Claims (16)

  1. 스톡스광 및 펌프광을 선택적으로 조사하여 컴바인드 레이저 빔을 발생시키는 근적외선 펄스 레이저 유니트;
    상기 근적외선 펄스 레이저 유니트로부터 전달된 컴바인드 레이저 빔이 조사되는 시료가 장착된 플랫폼;
    상기 시료에서 발생된 CARS 신호를 수집하여 입체 영상을 제공하는 En face CARS 이미지 모드 검출 유니트; 및
    상기 검출된 En face CARS 이미지로부터 단일세포 내의 지질 이미지 분석을 제공하는 이미지 분석 유니트
    를 포함하는 단일세포 내 지질의 병리적 변화 진단 시스템.
  2. 제 1 항에 있어서, 근적외선 펄스 레이저 유니트는 서로 다른 파장의 스톡스광, 펌프광 및 탐칭광을 선택적으로 조사하여 컴바인드 레이저 빔을 발생시키는 것을 특징으로 하는 단일세포 내 지질의 병리적 변화 진단 시스템.
  3. 제 1 항에 있어서, 광대역 멀티플렉스 CARS 현미 분광 유니트와 En face CARS 이미지 모드 검출 유니트 사이에 배치되어, 상기 시료에서 발생된 CARS 신호를 선택적으로 각 유니트로 전달하는 이색 미러를 더 포함하는 단일세포 내 지질의 병리적 변화 진단 시스템.
  4. 제 1 항에 있어서, 플랫폼의 상기 시료에서 발생된 CARS 신호를 수집하여 스펙트럼을 검출하는 광대역 멀티플렉스 CARS 현미 분광 유니트를 더 포함하는 단일세포 내 지질의 병리적 변화 진단 시스템.
  5. 제 1 항에 있어서,
    시료가 동물의 세포인 것을 특징으로 하는 단일세포 내 지질의 병리적 변화 진단 시스템.
  6. 제 5 항에 있어서,
    세포는 지방전구세포가 분화된 지방세포인 단일세포 내 지질의 병리적 변화 진단 시스템.
  7. 제 1 항에 있어서,
    CARS 신호의 대역은 2700 cm-1 내지 3050 cm-1인 단일세포 내 지질의 병리적 변화 진단 시스템.
  8. 제 1 항에 있어서,
    CARS 신호의 수집 시간은 1.0 s/frame 이하이고, 공간적 해상도는 횡방향이 0.4 ㎛ 이하이며, 축방향이 1.3 ㎛ 이하인 단일세포 내 지질의 병리적 변화 진단 시스템.
  9. 제 3 항에 있어서,
    이색 미러는 1000 ㎚ 미만의 파장을 반사시키고, 1000 ㎚ 이상의 파장은 투과시키는 것을 특징으로 하는 단일세포 내 지질의 병리적 변화 진단 시스템.
  10. 스톡스광과 펌프광을 시료에 조사하여 산란되는 CARS(coherent anti-Stokes Raman scattering) 지질 신호의 파장 및 세기를 측정하는 단계;
    상기 신호를 3 차원 이미지로 검출하는 단계; 및
    상기 이미지에서 지질의 구조를 이미지 분석 소프트웨어를 이용하여 분석하는 단계
    를 포함하는 단일세포 내 지질의 병리적 변화 진단 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 소프트웨어는 이미지 프로
    Figure pat00011
    플러스(Image pro
    Figure pat00012
    plus)인 것을 특징으로 하는 단일세포 내 지질의 병리적 변화 진단 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항의 병리적 변화 진단 시스템을 포함하는 신약스크리닝 시스템.
  13. 제 12 항에 있어서, siRNA(small interference RNA), 화합물, 천연물 및 단백질 중에서 선택된 1종 이상의 신약후보물질의 약효평가를 하는 신약스크리닝 시스템.
  14. 제 12 항에 있어서, 서열번호 1 내지 서열번호 53 중에서 선택된 1종 이상의 염기서열을 갖는 siRNA의 비만방지약효평가를 하는 신약스크리닝 시스템.
  15. 제 12 항의 신약스크리닝 시스템을 이용하여, 지방세포 내의　지질액적을 이미지화하여　지질액적의　병리적 변화를 추적 분석하는 신약스크리닝 방법.
  16. 지방분화세포에 신약후보물질을 트랜스펙션(transfection)시키는 단계;
    트랜스펙션된 지방분화세포를 지방세포로 분화유도시키는 단계;
    지방세포를 이미지화하는 단계; 및
    이미지화된 지방세포 내의 지질액적의 병리적 변화를 추적 분석하는 단계;
    를 포함하는 신약스크리닝 방법.


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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR101501512B1 (ko) * 2013-11-11 2015-03-18 한국표준과학연구원 2차원 위상정합 비선형광학 구조조명 현미경 이미징 장치 및 그 방법

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