CN117413171A - 受激拉曼散射层析成像系统与方法 - Google Patents
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Abstract
受激拉曼散射层析成像系统包括生用于成第一输入光束的装置、用于生成第二输入光束的装置、物镜、聚光器和探测器。第一输入光束是相位调制光束，而第二输入光束是振幅调制光束。物镜被配置为将第一和第二输入光束引导到样品上。聚光器被配置为从样品收集输出光束。检测器被配置为检测输出光束的与第一输入光束相对应的至少一部分。系统还包括用于从输出光束的所检测到的部分形成样品深度分辨图像的装置。
Description
技术领域
本公开宽泛但不排他地涉及受激拉曼散射层析成像系统和方法。
背景技术
三维(3D)光学显微镜(例如共聚焦显微镜、多光子显微镜和谐波发生显微镜)是一种强大的成像工具，以提供有关活体组织和细胞的时空信息(例如结构和架构、代谢功能、神经元网络、细胞分裂和迁移等)的重要数据。传统的3D体积数据可以通过扫描物镜或样品台来获取一系列二维(2D)切片图像(例如光栅扫描)，经由逐点或行扫描以机械的方式在Z方向上获取。传统的3D显微成像技术的主要局限性在于，通常用于点扫描的密集聚焦的高斯光束在浑浊介质(例如组织)中会因折射率不连续而产生强烈的光散射，光穿透力有限(约100-200μm)，因此无法进行深层组织的体积成像。为了减轻散射效应，在先进的3D成像技术(例如光片显微镜、双光子显微镜、光学相干显微镜)中，非衍射贝塞尔光束在其传播路径上遇到散射之后具有固有的自重建能力，可用于帮助穿透浑浊组织的深层区域，在这些区域中，衍射和散射是主要的。然而，贝塞尔光束显微镜通常提供的是样品的投影图像，其中的深度信息会丢失。
受激拉曼散射(SRS)显微镜是一种新兴的无标记化学成像技术，其具有生物分子特异性，该生物分子特异性已在生物和生物医学系统中得到广泛应用。为了提高传统高斯光束SRS 3D成像的成像深度，采用配合贝塞尔光束激发的光学投影层析技术(OPT)，从一系列2D图像中检索多投影角度的3D SRS图像，但是基于OPT的SRS 3D成像仍然需要机械旋转样品台或入射光束，其不适合快速的体内生物/生物医学应用。
因此，需要提供一种能够解决至少部分上述问题的层析成像系统和方法。
发明内容
根据第一方面，提供了一种受激拉曼散射层析成像系统，该系统包括：用于生成第一输入光束的装置，其中所述第一输入光束是相位调制的；用于生成第二输入光束的装置，其中所述第二输入光束是振幅调制的；物镜，该物镜被配置为将所述第一输入光束和所述第二输入光束引导到样品上；聚光器，该聚光器被配置为从所述样品收集输出光束；检测器，该检测器被配置为检测所述输出光束的与所述第一输入光束相对应的至少一部分；以及用于从所述输出光束的所检测到的部分形成所述样品的深度分辨图像的装置。
根据第二方面，提供了一种受激拉曼散射层析成像方法，该方法包括：生成第一输入光束，其中所述第一输入光束是相位调制的；生成第二输入光束，其中所述第二输入光束是振幅调制的；将所述第一输入光束和所述第二输入光束引导到样品上；从所述样品收集输出光束；检测所述输出光束的与所述第一输入光束相对应的至少一部分；以及从所述输出光束的所检测到的部分形成所述样品的深度分辨图像。
还公开了一种三维体积成像方法，该方法包括第二方面的方法。
附图说明
通过以下的书面描述(仅以举例说明的方式)并结合附图，本发明的实施例对于本领域普通技术人员来说可以被更好地理解且是显而易见的：
图1示出了根据示例实施例的SRST成像系统的示意图。
图2包括2a至2c，示出了相位调制的示例以及由此产生的具有拍频模式的光束。
图3包括3a至3g，示出了使用含有聚苯乙烯(PS)和聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)珠的样品对SRST进行的性能评估。
图4包括4a至4e，示出了使用小鼠耳部皮肤的样品对SRST和传统SRS之间进行的性能比较。
图5包括5a至5f，示出了使用DPBD晶体、大葱和猪肉组织的样品对SRST与传统SRS之间进行的性能比较。
图6示出了根据示例实施例的大葱中的叶绿体SRS光谱。
图7包括7a和7b，示出了轴向分辨率测量的示例方法。
图8包括8A至8C，分别示出了经典、间质和促神经(proneural)GBM组织的代表性表位检测(epi-detected)高光谱SRS图像。
图9包括9A至9E，示出了使用深度学习算法对GBM亚型进行SRST诊断的图解。
图10示出了根据示例实施例的SRST方法的流程图。
图11示出了根据示例实施例的原始SRST图像、所检索的SRST图像和传统SRS之间的信噪比(SNR)的比较。
图12包括12(a)至12(f)，示出了SRST在强背景溶剂中的SNR的模拟结果。
具体实施方式
本公开涉及无z扫描SRS层析成像技术(SRST)，该技术能够通过与非衍射零阶贝塞尔光束相关的光拍频技术(OBT)实现3D SRS深层化学成像，而无需对样品或物镜进行机械扫描。在SRST中，样品由通过使用空间光调制器(SLM)生成的具有可调谐光拍频模式的贝塞尔光束照射，SLM在空间频域中对样品的深度分辨化学信息进行编码。通过实施逆快速傅立叶变换(IFFT)可以快速检索3D SRS层析照片。本公开还从理论上示出了基于贝塞尔光束OBT的独特SRST成像方法的推导和分析，并且还有基于贝塞尔光束OBT的SRST成像系统的开发，以从实验上展示SRST在多种样品(例如聚合物珠模型、拉曼活性晶体、植物细胞和生物组织)上进行无标记体积较深层化学成像的能力。
图1示出了根据示例实施例的SRST成像系统100的示意图。飞秒(fs)激光源(InsightDS dual，Spectra-Physics，未示出)具有两个激光输出(一个波长为1041nm的激光输出用作斯托克斯光束102；另一个可调谐输出(波长为680～1300nm)用作泵浦光束104)，该飞秒激光源用于SRST成像中的组织激发。泵浦光束104和斯托克斯光束102的脉宽均约为100fs，以80MHz的重复频率运行。泵浦光束104由空间光调制器(SLM)106(PLUTO BB，Holoeye)进行相位调制。斯托克斯光束102通过使用螺旋仪108(AX251-B，Thorlabs)转换为贝塞尔光束，并且通过电光调制器(EOM)(APE-Berlin，未示出)以20MHz的频率进行振幅调制。泵浦光束104和斯托克斯光束102利用二向色镜110结合在一起。接收该泵浦光束104和斯托克斯光束102的透镜L1(f＝100mm)的焦平面上的环形图案通过4-f系统成像到多光子扫描显微镜(MPM-4R，Thorlabs)的振镜上，然后通过该显微镜中的另一个内部4-f系统进一步投射到水浸显微镜物镜112(Apo LWD 25X，1.10w，尼康)的后孔径上。在向前方向上，使用聚光器114(CC Achromat/Aplanat，N.A.＝1.4，尼康)来收集透射的泵浦光束和透射的斯托克斯光束。透射的泵浦光束利用带通滤波器组116(Semrock)与透射的斯托克斯光束进行光谱隔离(即屏蔽透射的斯托克斯光束)，并且通过大面积光电二极管118(FDS1010，Thorlabs)进行检测。使用锁定放大器120(APE-Berlin)来解调滤波后的泵浦光束，以获取样品的SRS信号(即受激拉曼损耗(SRL))。深度分辨SRST图像可以从SRS信号中快速检索到，例如通过实施逆快速傅立叶变换。
在SRS成像中，样品在通过高数值孔径(N.A.)物镜的紧密聚焦下，由共线泵浦光束(ωp)和斯托克斯光束(ωS)(ωS＜ωp)照射。生成的SRS信号与泵浦光束强度和斯托克斯光束强度的乘积IpIS成正比。如果泵浦激发光束和斯托克斯激发光束都是用于激发样品的贝塞尔光束，则它们的强度分布可以表示为Iρ(r，z)＝Iρ(z)|J0(krρr)|2，其中ρ可以是p(泵浦)或S(斯托克斯)。Iρ(z)是沿轴向方向的强度分布，J0(krρr)是第一类零阶贝塞尔函数；krρ是横向波矢量，r是横向坐标。由于贝塞尔光束是非常细的针状光束，因此通过忽略其横向维度，就可以表示3D样品f(x，y，z)的2D投影SRS图像F(x，y)：
光拍频技术(OBT)要求贝塞尔泵浦光束包含具有空间频率Δkz的拍频模式，即Ip(z)变为Ip(z)[cos(Δkzz)+1]，然后2D投影F(x，y，Δkz)将反映样品在空间频域中的深度信息，如下所示：
在Δkz空间中，公式(2)中的余弦函数的频率与z成正比，即在较深z处的物体在Δkz空间中振荡得更快。其逆傅立叶变换为：
其中，Δkz的范围为Δkz，min到“*”表示卷积。等式(3)右侧的三个项分别代表获取的图像f(x，y，z′)Ip(z′)IS(z′)、镜像f(x，y，-z′)Ip(-z′)IS(-z′)和直流(DC)分量Cδ(z′)。通过将照明函数Ip(z′)IS(z′)归一化，但是省略镜像和直流分量，即可得到重建的3D图像f(x，y，z′)。
轴向分辨率由等式(3)中的正弦函数确定，其中半最大全宽(FWHM)为：
轴向分辨率与Δkz，max-Δkz，min的拍频频率范围成反比。
参考图1，使用SLM 106在泵浦光束104上施加相位模式，以生成贝塞尔光束。在SLM106之后可以形成具有光拍频模式的贝塞尔泵浦光束104，从而在显微镜物镜的后孔径上出现两个同心环。最终，贝塞尔泵浦光束的光拍频模式通过4-f系统(L1和显微镜物镜112)投射到样品上。在物镜112的后孔径上，贝塞尔斯托克斯光束102形成单个环。这两个光束的乘积在样品中仍具有拍频模式。
为了阐明SRST的OBT中生成拍频模式的机制，图2a示出了SLM 106上相位模式的一些示例。在一个示例实施中，相位模式由两个具有不同汇聚角的轴锥相位组成。还示出了显微镜物镜112的后孔径上的相应强度分布(参见图2b中的环)。外环和内环的半径分别为r1和r2。每个环在穿过显微镜物镜之后都会在样品上产生贝塞尔光束。两个叠加的贝塞尔光束具有不同的轴向波矢量，即而/>其中λp是泵浦波长，n是样品的折射率，/>R是物镜的后孔径的半径。它们的干涉会在样品中产生沿着贝塞尔光束的光拍频模式。拍频频率Δkz为：
根据等式(5)，能够通过改变r1或r2来调整拍频频率Δkz。图2c中示出了具有拍频模式的相应的贝塞尔拍频光束。
与频域光学相干层析成像(FD-OCT)类似，等式(3)包括所检索的图像、镜像和直流分量。在FD-OCT中，它们可能会彼此重叠，导致所检索的图像无法分辨。但是SRST的优点是不存在这种重叠问题。透镜L1和物镜形成4-f系统(参见图1)，因此样品上的光束就是在SLM106之后的光束图像。根据等式(2)，对于任意的Δkz，样品上的z＝0平面是相位 为零的平面。由于SLM 106上相位模式的中心像素的相位对于任意的Δkz均为零，因此，样品上的z＝0平面仅是SLM 106的像平面。贝塞尔光束在SLM 106之后形成，因此，只有当z＞0时，照明函数Ip(z)>0。因此，根据示例实施例，所检索的SRST中的图像能够与镜像和直流分量区分开来。此外，OCT需要样品外的参考臂来生成干涉图，这使其成像仅限于反射模式(尽管适用于大多数生物成像)，与OCT不同的是，根据示例实施例的基于OBT的SRST能够用于透射和反射模式的生物成像，无需外部参考臂，因为在SRST中，干涉图直接在样品内部生成，用于3D组织成像。
上文参考图1所述的SRST系统的示例已经制作完成并进行了测试，同时还与成像应用中的传统SRS进行了比较。该系统的一些SRST成像参数设置如下，当然其也可以包括其他参数，而且可以进行各种变化：
(i)Δkz空间中的成像范围和步长：在根据示例实施的SRST成像中，141帧相位模式逐一显示在SLM 106上，这些相位模式生成贝塞尔泵浦光束104的141个拍频频率Δkz，范围从0到0.68μm-1，步长为0.0049μm-1。对每个相位模式顺次采集141幅原始SRS图像，以形成图像堆栈。然后，通过逆快速傅里叶变换(IFFT)从SRS原始图像的堆栈中快速检索3D深度分辨SRST图像。
(ii)样品中贝塞尔光束的长度：在示例SRST系统中，泵浦光束和斯托克斯贝塞尔光束的长度约为200μm。
(iii)激光功率：对于示例SRST系统，样品上的平均激光功率通常为PSRST＝100mW，对于传统SRS系统，平均激光功率通常为Pcon-SRS＝10mW，而对于SRST系统，相应的峰值功率密度为 对于传统SRS系统，相应的峰值功率密度为 这里，f＝80MHz是激光重复频率；τ＝100fs是脉冲宽度；A＝π(d/2)2＝0.7μm2是焦斑面积，其中半径/>C＝1/40是缩放因子，其是高斯光束和贝塞尔光束之间沿轴向方向的长度比。贝塞尔光束的激光功率沿轴向方向扩散，因此SRST成像中的峰值功率密度相对较低。
(iv)成像时间：在一个示例中，对于SRST，典型像素驻留时间为ΔτSRST＝45μs，而对于传统SRS，典型像素驻留时间为Δτcon-SRS＝11μs。选择这样的像素驻留时间是为了保持适当的信噪比(SNR)水平，以获得样品的高质量SRST成像。对于512×512像素数，SRST成像的2D光栅扫描速率为12秒，传统SRS成像的2D光栅扫描速率为3秒。使用的SLM 106(PLUTOBB，Holoeye)的帧频约为60Hz，而显微镜中的Z电机扫描频率为50Hz。
示例成像应用中使用的化学和生物样品包括聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)和聚苯乙烯(PS)珠、1，4-二苯基丁-1，3-二炔(DPBD)晶体、大葱、猪肉组织和小鼠耳朵。
第一种成像样品包括聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)和聚苯乙烯(PS)。在该示例中，将混合的10μm聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)和聚苯乙烯(PS)珠嵌入2wt％固化琼脂糖凝胶模型中，以用于SRST成像。珠凝胶模型尺寸设计为2x2x3cm3，泵浦(800nm)和斯托克斯(1040nm)激光束在珠模型中的散射平均自由路径分别为65μm和55μm。PMMA珠在2950cm-1(O-CH3中C-H的对称振动和CH2的不对称振动)处产生SRS信号，而PS珠则在2950cm-1和3050cm-1两个拉曼位移处产生SRS信号。PS在2950cm-1和3050cm-1处的SRS强度比约为0.8:1。在这两个拉曼位移处，琼脂糖凝胶的SRS信号比PS和PMMA弱得多，这是因为其使用的浓度较低(约2wt％)。PMMA珠的SRS图像是通过将2950cm-1处的SRS图像减去3050cm-1处的SRS图像得到的，SRS图像被归一化为SRS强度比。
例如，如上所述的聚合物珠琼脂糖凝胶中的泵浦光束和斯托克斯光束的散射平均自由路径可以根据米氏散射模型进行估算。模型中混合珠的浓度Nsphere约为105sphere/mm3；PMMA和PS在800nm波长(泵浦光束)下的折射率分别为1.48和1.58([https://refractiveindex.info/])。模型中琼脂糖凝胶的折射率约为1.34。为了简化米氏散射建模，假设所有珠的平均折射率均约为1.53。通过将上述参数输入米氏散射计算模型[https://omlc.org/calc/mie_calc.html]，得到珠的米氏散射截面积σ为153.77μm2，散射系数μs为σNsphere＝153.77cm-1。因此，在800nm波长处，泵浦光束在珠凝胶模型中的散射平均自由路径约为65μm。同样，在波长1040nm(斯托克斯波长)处，散射系数μs的计算值为181.61cm-1，因此在波长为1040nm处，斯托克斯光束在珠凝胶模型中的散射平均自由路径/>约为55μm。
图3示出了基于嵌入琼脂糖凝胶模型基质中的10μm聚苯乙烯(PS)和聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)混合珠的示例SRST系统的性能评估。图3a和图3b中分别示出了嵌入上述琼脂糖凝胶模型中的混合的10μm聚苯乙烯(PS)和聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)珠的化学选择SRST图像和传统点扫描高斯光束SRS图像。模型中珠的Z深度用伪色标尺表示。根据示例实施例的SRST系统能正确识别不同模型深度中不同聚合物珠的深度分辨化学信息，这与传统的点扫描SRS成像几乎完全相同。为了说明SRST中如何确定珠的深度信息，作为示例，选择图3a中较深的珠(珠1)和较浅的珠(珠2)进行观察。图2c示出了沿着横跨这两个珠的直线在空间频域中测量的数据。清楚地表明，z深度较深的珠沿着Δkz轴线振荡得更快，这与等式(2)的预测一致。图3d示出了珠1和珠2在x-z平面上的SRST图像，证实了SRST在无z扫描3D成像方面的光学切片能力。
图3e和3f中分别显示了SRST和传统SRS中的珠簇，以展示根据示例实施例的SRST技术在深层3D化学成像方面的优势。该珠簇的顶层大约在z＝21μm处。比较z＝32μm处的SRST和SRS图像，SRST提供的SRS信号要强得多。在较深的深度z＝46μm处，SRST中仍能清晰地观察到珠，深层区域中珠的SRST图像亮度仅比在z＝21μm和z＝32μm处浅层珠的SRST图像亮度稍暗(参见图3e)。相比之下，z＝46μm处珠的传统高斯光束SRS信号电平要比较浅珠的信号电平弱得多(参见图3f)。结果证实，SRST成像中使用的贝塞尔光束在绕过散射障碍物之后会自重建，这使得根据示例实施例的SRST技术能够更好地到达样品中其他较浅珠的阴影下的较深珠，从而实现较深层组织成像。
为了定量分析基于贝塞尔光束OBT的SRST所改善的成像深度，图3g示出了SRST(线302)与传统高斯光束SRS显微镜(线304)相比，不同深度处珠的归一化SRS强度。这些图用指数衰减函数I＝I0exp(-z/z0)拟合，其中z0是穿透深度。对于SRST，z0＝130μm(95％置信区间：[77μm,183μm])，而对于传统SRS，z0＝58μm(95％置信区间：[42μm,73μm])。可以看出，与传统的SRS显微镜相比，根据示例实施例的SRST技术可以将穿透深度提高2倍以上，这进一步肯定了SRST在较深层组织3D成像方面的潜力。对比图3a和图3b也可以清楚地观察到这种增强效果，其中在SRST中位于较深层深度的珠(如珠1)看起来比传统SRS图像中的珠要亮得多，这证明贝塞尔光束比高斯光束在样品中的光穿透深度更深。
根据示例性实施例，基于贝塞尔束OBT的SRST系统还可以用于生物样品中的深层组织成像。例如，图4a和4b示出了不同深度处小鼠耳部皮肤的SRST和传统SRS图像(蛋白质和脂质的CH3伸展在2935cm-1处的拉曼位移)的比较。在较靠近皮肤表面(z＝20μm)时，SRST和SRS成像都能清楚地看到富含脂质的皮脂腺；而在更深入组织中时，SRST显示的SRS信号比传统SRS成像要强得多，例如图4a和图4b中箭头标示的位置。图4c比较了图4a和图4b中所选择区域(椭圆)中的强度。不同深度处的SRST图像的测量强度归一化为接近表面(z＝20μm)的强度。传统SRS图像的强度也以同样方式归一化。图4c清楚地示出了随着组织深度的增加，SRST的强度衰减速度比传统SRS慢得多，这证明SRST对较深层组织成像的能力更强。图4d和4e比较了SRST和传统SRS的3D图像，反映出SRST和传统SRS在更靠近皮肤表面的组织区域中提供了非常相似的图像，但是SRST在较深组织深度中提供了清晰得多的图像。
根据示例实施例的SRST系统还可以用于对各种成像目标(例如生物组织、拉曼活性晶体和植物细胞)进行3D体积较深层分子成像(图5)。为了获得更好的可视化，如图5a至5c所示，深度信息通过使用伪彩色标尺呈现。
图5a示出了1,4-二苯基-1,3-二炔(DPBD)晶体(C≡C的2216cm-1)的SRST 3D图像。DPBD是一种有用的拉曼标签，其广泛应用于追踪生物样品中的小分子和靶向细胞器。图5d比较了在两个不同深度处基于根据示例实施例的系统的SRST图像和传统点扫描SRS图像。在SRST和传统SRS成像中，较浅深度(例如z＝40μm)处的结晶生成相似的SRS信号水平，而较深的结晶(由箭头所标记)(例如z＝133μm)在SRST中可以被清晰地发现，但是在传统SRS中几乎看不到。SRST显示出更好的成像深度。
图5b显示了大葱中的叶绿体在2935cm-1处的SRST 3D图像(在2935cm-1处的SRST信号包含C-H伸展的SRS和叶绿素的双光子吸收，如下所述)。大多数叶绿体分布在更靠近植物组织表面的地方，因此即使在黑暗环境下也能进行有效的光合作用。图5e比较了基于根据示例实施例的系统的SRST图像和图5b中方框标出的所选择区域的传统SRS图像。在SRST中(例如，z＝45μm)可以清晰地观察到一些叶绿体(由箭头所标记)，而相应的传统SRS图像在同一位置几乎没有显示任何信号。这可能是由于在SRS成像中的高斯光束照射下，那些较深的叶绿体处于一些较浅叶绿体的阴影之下(例如在z＝27μm处)；而根据示例实施例的SRST系统中使用的贝塞尔光束可以绕过植物细胞中较浅的叶绿体而到达较深的叶绿体。
在本示例中，通过使用光谱聚焦SRS系统测量大葱叶片中的叶绿体的SRS光谱。每次测量都可以覆盖166cm-1的光谱范围，因此泵浦光束的中心波长被移位了四次，以覆盖2786～3045cm-1的整个光谱范围。在所有四次测量中，都能清楚地观察到在2900～2950cm-1处的拉曼峰值(参见图6)，这与CH3振荡相对应。在不同类型的叶绿素中通常都能观察到CH3基团。此外，还观察到强烈的非化学特异性双光子吸收背景(约为拉曼峰值强度的70％)。在超过3000cm-1后，信号由于来自水的SRS信号而增加。
图5c给出了猪肉组织中脂肪的SRST 3D成像(脂质的CH2的2845cm-1)的另一个示例。在SRST成像中，即使在较深层组织区域中，也能清晰地观察到脂滴的3D形态和分布，脂滴在细胞和组织生理(例如能量储存)中发挥着关键作用。图5f比较了基于根据示例实施例的系统的SRST图像和图5c中方框标注的所选择区域的传统SRS图像。例如，在z＝15μm处，具有三个用箭头标记的小脂滴。在使用高斯光束照明的传统SRS成像中，光影会在较深的脂滴(例如z＝31μm)中产生伪影(也用箭头标记)，但是在SRST成像中，由于贝塞尔光束在组织中传播的自重建特性的优点，不会观察到此类伪影。上述结果进一步证明，根据示例实施例的基于贝塞尔光束OBT的SRST是一种强大的无标记3D分子成像工具，用于生物和生物医学系统中的体积较深层组织成像。
还比较了根据示例实施例的SRST和传统SRS成像的轴向和横向分辨率。在SRST中，深度分辨率由等式(4)确定，而Δkz的范围由等式(5)计算。在根据示例实施例的SRST成像中，r1是固定的，对应于N.A.＝nsin(α)＝0.54，r2从0.5r1到r1，对应于N.A.＝nsin(β)从0.27到0.54，其中n＝1.33是所用组织的折射率(接近水的折射率)。因此，对于λp＝800nm，Δkz的范围为0～0.68μm-1。由于F(x,y,Δkz)是Δkz的偶函数，因此用于成像检索的Δkz的有效拍频频率范围可以在-0.68至0.68μm-1之间变化，这与SRST成像中5.6μm的深度分辨率相对应。该预测的SRST深度分辨率与测量的5.49μm的深度分辨率一致(参见下文计算结果)。与使用相同N.A.＝0.54的传统点扫描SRS相比，对于λp＝800nm和λS＝1041nm，沿轴向方向(2λ/N.A.2)的艾里斑(Airy disk)的半最大全宽(FWHM)分别为5.5μm和7.1μm。传统SRS成像中深度分辨率约为 另一方面，横向方向上的非衍射贝塞尔光束尺寸可以被向下挤压到比高斯光束(λp＝800nm，N.A.＝0.54)在样品中的横向分辨率(约0.90μm)小约1.33倍。因此，根据示例实施例的SRST成像与传统SRS具有相似的轴向分辨率，但是横向分辨率更高，用于实现具有亚细胞分辨率的无标记3D体积深层组织成像。
图7a示出了浸入水中的DPBD晶体在x-z平面中的SRST图像。图7b示出了沿图7a中所示白线的晶体和水界面的强度曲线。通过使用误差函数对数据进行拟合，其中A1、A2和z0为拟合参数。拟合结果绘制成曲线702。轴向分辨率可以定义为拟合函数h(x)内部的高斯函数的FWHM，即分辨率/>如强度曲线所示和上文所述。
根据示例实施例的表位检测SRST技术还可以应用于以亚微米分辨率对整个胶质母细胞瘤(GBM)组织标本中的瘤内异质性和分子亚型进行快速、无标记的分子评估。图8A至8C示出了使用根据示例实施例的SRST系统在拉曼位移2850和2940cm-1处几秒钟内获得的三种GBM亚型(分别为经典型、间充质型和促神经型)的代表性SRS图像。在2850cm-1处，由于脂质分子中CH2键的对称伸展，GBM中的脂质分布可视化(图8中的第一列)，而由于脂质和蛋白质中CH3键的伸展，2940cm-1拉曼位移的共振使组织的亮度均匀(第二列)。为了提高蛋白质的特异性，从2940cm-1处减去2850cm-1处的SRS图像，以突出蛋白质的分布(第三列)。此外，将2850cm-1和减去的图像叠加在一起，以示出包括髓鞘蛋白在内的细胞形态(最后一列)。一般来说，可以观察到髓鞘的密度和完整性按照促神经-典型-间充质的顺序递减，这表明SRST成像技术具有无染色的组织学潜力，可用于快速GBM分子亚型分类。
SRS成像结果显示，无染色SRST组织学图像和2D亚型图均可在20-30分钟内获得。将理解的是，在另选实施例中，例如通过使用更快的扫描仪，所需的时间还可以进一步缩短。这种性能优于传统的单细胞RNA测序。尽管SRS组织学结果评估脱髓鞘状态作为新的诊断特征，但是异质性映射则揭示了肿瘤内异质性的新见解。尽管GBM组织的主要比例与基因组分析的诊断结果一致，但是发现在标本中的剩余图像片的重要(non-trivial)部分属于其他分子亚型，这意味着无标记SRS成像揭示的GBM异质性程度很高。
在进一步的实施中，利用深度学习算法对从每个GBM组织的高光谱SRS成像中检索到的SRS光谱进行研究，以确定GBM分子亚型。通过对512x512像素进行平均，整个组织图像的每个图像片都会生成单一光谱，用于亚型之间的比较。一般来说，在MES-CL-PN排序中，CH2和CH3伸展峰值(2850和2940cm-1)有所降低。相反，GBM亚型的蛋白质光谱彼此相似，表明所嵌入的诊断信息相对较少。为了验证SRS成像的SRS光谱信息是否能为GBM亚型提供显著的诊断性能，将SRS光谱提供给二次支持向量机模型。如混淆矩阵(图9A)所示，对训练组和验证组按80/20的比例进行人工验证，诊断准确率为80.6％。通过平均面积积分约为0.89的接受者操作特征(ROC)曲线，进一步证实了深度学习诊断模型的稳健性(图9C至9E)。因此，本实施例中开发的深度学习算法可以进一步扩展到SD-SRST 3D成像，用于无染色脑肿瘤诊断和精准神经外科手术的肿瘤边缘分界。
图10示出了根据示例实施例的受激拉曼散射层析成像方法的流程图。在步骤1002，生成第一输入光束。第一输入光束为相位调制的。在步骤1004，生成第二输入光束。第二输入光束为振幅调制的。在步骤1006，将第一和第二输入光束引导到样品上。在步骤1008，收集来自样品的输出光束。在步骤1010，检测输出光束的与第一输入光束相对应的至少一部分。在步骤1012，根据输出光束的所检测到的部分形成样品的深度分辨图像。
如上所述，传统的3D体积成像面临以下挑战，例如(i)需要荧光标记(共焦荧光显微镜)，这可能会扰乱活细胞和组织中的病理生理环境；(ii)由于聚焦高斯光束照明在浑浊组织中的散射，成像深度较短，这些挑战阻碍了其在生物系统中快速动态和功能性3D成像的广泛应用。根据示例实施例，基于贝塞尔光束-光学拍频技术(OBT)的无z扫描受激拉曼散射层析成像(SRST)可以解决上述问题，以实现无标记的体积较深层组织成像。在示例实施例中，无需在组织深度上进行激光聚焦的机械扫描，只需通过SLM以电子方式改变投射在泵浦光束上的相位模式，就能在样品中快速生成用于光学切片的泵浦光束的光学拍频模式，这是由于两个重叠的贝塞尔光束发生了干涉。拍频的贝塞尔泵浦光束和样品中的贝塞尔斯托克斯光束的叠加产生了深度编码的SRS，用于3D SRS成像。因此，通过实施IFFT，可以快速检索出具有亚细胞分辨率的体积样品的深度分辨3D化学分布。
上述示例证明了本发明的基于贝塞尔光束OBT的SRST技术的实用性，该技术能够对多种样品(例如，嵌入琼脂糖凝胶中的聚合物珠(PMMA和聚苯乙烯)、拉曼活性晶体、植物细胞和生物组织(小鼠耳部皮肤、猪肉组织))进行体积较深层化学成像。为了提高3D SRS成像深度，基于OBT的SRST成像采用了无衍射的零阶贝塞尔光束作为泵浦光束和斯托克斯光束，这些光束具有自重建特性，可超越光路途中遇到的障碍，对浑浊介质中的散射效应具有显著的抵抗力。贝塞尔光束传播的独特自重建能力已在利用SRST进行较深层3D化学成像中得到证实，这一点已在上述示例中清楚地示出。这些示例证实了贝塞尔光束在障碍物后传播的自修复能力，从而照亮了障碍物阴影下的分子，消除了SRS成像中的阴影伪影，而且当贝塞尔光束在具有散射弹性特性的高散射介质中传播时，能量损耗相对较低。因此，根据示例实施例的基于贝塞尔光束OBT的SRST成像可以在较深层生物医学成像中取得进展，在这种成像中，浑浊介质中的衍射和散射阻碍了使用传统高斯光束SRS显微镜形成紧密聚焦。
将理解的是，SRST本质上是一种多路复用检测技术(即原始图像数据以投影图像的形式获取，而不是逐层扫描)，只要噪声与样品无关，SRST就能因费尔盖特效益而提高检索图像的信噪比。事实上，根据示例实施例，SRS的噪声与样品无关，因为SRS受限于激发激光束的射出噪声，这是激光源的固有特性。在图3所示的示例中，从原始数据到检索的SRST，信噪比提高了5.3倍。检索到的SRST图像的最终信噪比不受SRST成像中样品中的溶剂背景的影响。
作为说明，图11比较了珠的SRST原始数据、检索的SRST图像(图3a)和传统SRS(图3b)的信噪比(SNR)。结果表明，由于费尔盖特效益，从原始数据(SNR＝3)到检索的SRST(SNR＝16)，信噪比提高了约5.3倍。检索到的SRST的信噪比与传统SRS成像的信噪比(SNR＝21)相当，尽管SRST的峰值功率密度低4倍，导致局部信号弱16倍；但是平均功率高10倍，导致噪声高倍。
为了说明溶剂背景信号不会降低SRST成像的信噪比，图12中示出了SRS模拟结果。具体来说，模拟中使用的两个不同样品分别如图12a和12b所示：样品I是不含溶剂的z＝100μm处的珠，而样品II是溶剂中的同一珠(溶剂跨度为40～160μm，溶剂背景信号电平为珠的60％)。SRST中的原始数据(投影图像)记录了两个样品在Δkz空间(傅立叶域)的SRS信号，分别绘制在图12c和12d中。图12e和12f分别示出了SRST图像沿z轴的强度曲线，其是通过图12c和12d中绘制的曲线的逆快速傅里叶变换(IFFT)而得到的。在图12c至12f中，一组曲线代表纯珠SRS信号，而另一组曲线代表纯珠SRS信号+噪声。
所示原始数据中的噪声应与样品无关。在某些实施中，图12c和12d中添加了相同的泊松噪声(7×10-5nJ/像素)。图12d中的信号电平(约为7×10-3nJ/像素)远高于图12c(约为5×10-4nJ/像素)，因为溶剂在投影图像中会产生强得多的背景信号。最后，检索到的SRST图像(图12e和12f)的信噪比几乎相同，这证明了SRS背景信号较强的溶剂不会影响SRST成像的最终信噪比。
将理解的是，在SRST的贝塞尔光束照明下，激光功率沿轴向方向传播(约200μm示例实施例)。因此，与传统的高斯SRS成像相比，SRST需要高得多的激光总功率才能在样品上实现相同的局部功率密度。由于光损伤主要取决于样品上的局部功率密度，因此在SRST成像中使用较高的总功率不会损伤样品。在目前的SRST示例中，SRST(100mW)中样品上的激光总功率大约是传统SRS(10mW)的10倍，但是不会对样品造成光损伤。另一方面，如果总功率超过约30mW，则在传统SRS中就会观察到明显的光损伤。
在改进的成像模式中，即在所谓的频域SRST(FD-SRST)中，预计SRST能够显著提高成像速度。这可以解释如下：根据等式(5)，具有多个波长分量Δλp的宽带激光源λp可用来生成多个Δkz。因此，在FD-SRST中，SRS信号可以由光谱仪检测，在光谱仪中，每个像素都会记录光谱，并且通过利用IFFT获取的光谱可轻松揭示深度信息。只需进行一次2D光栅扫描，即可快速获得3D图像。因此，3D成像速度可以与2D成像速度一样快。在这种实施例中，泵浦光束和斯托克斯贝塞尔光束都应是宽带光束。同时，两种光束都应是啁啾光束，从而即使在宽带激励下，也能应用光谱聚焦技术选择特定的拉曼峰值，以用于快速3D SRS成像。
将理解的是，根据示例实施例的贝塞尔光束-OBT方法的无Z扫描光学切片特性并非仅适用于SRST 3D成像，而是普遍适用的。如所述的OBT方法实际上可以容易适用于任何其他非线性光学成像模式，以用于快速3D组织成像。例如，通过用光电倍增管(PMT)取代光电二极管，当前基于OBT的SRST系统可用于相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)层析成像，以从较深层组织区域收集3D CARS信号。如果在SRST成像系统中仅使用泵浦光束或斯托克斯光束，则OBT-SRST技术可以简化为二次/三次谐波发生(SHG/THG)层析成像、荧光层析成像和多光子层析成像。此外，SRST成像中的贝塞尔光束-OBT方法还与超分辨显微镜技术兼容，诸如受激发射耗尽(STED)显微镜、饱和受激拉曼散射显微镜和高阶相干拉曼散射显微镜(如果使用高净空物镜)，以实现快速超分辨3D较深层组织成像。
综上所述，示例实施例提供了一种无Z扫描的受激拉曼散射层析成像技术(SRST)，该技术能够通过使用与自重构贝塞尔光束耦合的光学拍频技术(OBT)来实现，以利用亚细胞分辨率实现无标记体积化学成像的较深层穿透。无需沿轴向方向进行机械扫描，通过利用相位调制器对贝塞尔泵浦光束的光拍频频率进行电子调谐，就能在空间频域中对有关体积组织的深度分辨SRS信号进行编码，并且因此可以通过实施IFFT来检索深度分辨SRST，以进行3D SRS成像。示例实施例还说明，与传统的点扫描高斯光束SRS显微镜相比，基于贝塞尔光束OBT的SRST成像在高散射介质中的成像深度至少提高了2倍。在多种样品(例如拉曼活性晶体、生物组织和植物细胞)上演示了SRST技术在无标记体积较深层分子成像方面的实用性，其在穿透深度方面优于传统的SRS显微镜。贝塞尔光束-OBT方法在SRST中的无z扫描光学切片能力的通用性实际上可以很容易地扩展到任何其他非线性光学成像模式，以用于生物和生物医学系统中的深部组织体积3D成像。因此，SRST中用于无z扫描光学切片的强大贝塞尔光束-OBT方法可能会对整个高级3D显微成像应用领域产生重大影响。
本领域技术人员将理解，在不脱离宽泛描述的本发明的范围的情况下，可以对具体实施例中所示的本发明进行许多变化和/或修改。因此，本发明的实施例在所有方面均应视为示例性的而非限制性的。
Claims (25)
1.一种受激拉曼散射层析成像系统，该系统包括：
用于生成第一输入光束的装置，其中所述第一输入光束是相位调制的；
用于生成第二输入光束的装置，其中所述第二输入光束是振幅调制的；
物镜，该物镜被配置为将所述第一输入光束和所述第二输入光束引导到样品上；
聚光器，该聚光器被配置为从所述样品收集输出光束；
检测器，该检测器被配置为检测所述输出光束的与所述第一输入光束相对应的至少一部分；以及
用于从所述输出光束的所检测到的部分形成所述样品的深度分辨图像的装置。
2.根据权利要求1所述的系统，其中，用于生成所述第一输入光束的所述装置包括激光光源的第一输出，并且其中用于生成所述第二输入光束的所述装置包括所述激光光源的第二输出。
3.根据权利要求2所述的系统，其中，所述激光光源包括宽带飞秒激光光源。
4.根据前述权利要求中任一项所述的系统，其中，所述第一输入光束包括泵浦光束，并且所述第二输入光束包括斯托克斯光束。
5.根据权利要求4所述的系统，其中，用于生成所述第一输入光束的所述装置还包括空间光调制器，所述空间光调制器用于基于预定模式对所述泵浦光束进行相位调制。
6.根据权利要求4或5所述的系统，其中，用于生成所述第二输入光束的所述装置还包括电光调制器，所述电光调制器用于以预定频率对所述斯托克斯光束进行振幅调制。
7.根据权利要求4至6中任一项所述的系统，其中，所述泵浦光束和所述斯托克斯光束包括共线贝塞尔光束。
8.根据前述权利要求中任一项所述的系统，其中，所述物镜包括水浸显微镜物镜。
9.根据前述权利要求中任一项所述的系统，该系统还包括位于所述聚光器之后的带通滤波器组，所述带通滤波器组被配置为光谱地隔离所述输出光束的与所述第一输入光束相对应的所述部分。
10.根据前述权利要求中任一项所述的系统，其中，所述检测器包括光电二极管。
11.根据前述权利要求中任一项所述的系统，其中，用于形成所述样品的深度分辨图像的所述装置包括锁相放大器，所述锁相放大器用于解调来自所述样品的所述输出光束的所检测到的部分。
12.根据权利要求11所述的系统，其中，所述锁相放大器被配置为基于逆快速傅里叶变换解调所述输出光束的所检测到的部分。
13.根据前述权利要求中任一项所述的系统，其中，所述输出光束包括来自所述样品的反射光束。
14.根据权利要求1至12中任一项所述的系统，其中，所述输出光束包括来自所述样品的透射光束。
15.一种受激拉曼散射层析成像方法，该方法包括：
生成第一输入光束，其中所述第一输入光束是相位调制的；
生成第二输入光束，其中所述第二输入光束是振幅调制的；
将所述第一输入光束和所述第二输入光束引导到样品上；
从所述样品收集输出光束；
检测所述输出光束的与所述第一输入光束相对应的至少一部分；以及
从所述输出光束的所检测到的部分形成所述样品的深度分辨图像。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述第一输入光束包括泵浦光束，并且所述第二输入光束包括斯托克斯光束。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述泵浦光束使用空间光调制器基于预定模式进行相位调制。
18.根据权利要求16或17所述的方法，其中，所述斯托克斯光束使用电光调制器按预定频率进行振幅调制。
19.根据权利要求16至18中任一项所述的方法，其中，生成所述泵浦光束和所述斯托克斯光束包括形成共线贝塞尔光束。
20.根据权利要求15至19中任一项所述的方法，其中，形成所述样品的深度分辨图像包括使用锁相放大器解调来自所述样品的所述输出光束的所检测到的部分。
21.根据权利要求20所述的方法，其中，解调所述输出光束的所检测到的部分包括应用逆快速傅里叶变换。
22.一种三维体积成像方法，该方法包括根据权利要求15至21中任一项所述的方法。
23.根据权利要求22所述的三维体积成像方法，其中，所述样品包括化学样品或生物样品。
24.根据权利要求22或23所述的三维体积成像方法，其中，所述样品是无标记的。
25.根据权利要求22至24中任一项所述的三维体积成像方法，其中，将所述第一输入光束和所述第二输入光束引导到所述样品上包括引导所述第一输入光束和所述第二输入光束而不扫描所述第一输入光束或所述第二输入光束在所述样品的深度上的焦点。
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