JPWO2011099269A1 - 顕微鏡及び観察方法 - Google Patents

Abstract

空間分解能を向上することができる顕微鏡、及び観察方法を提供する。本発明の一態様に係る顕微鏡は、レーザ光源（１０）と、レーザ光源からのレーザ光を試料に集光する対物レンズ（１６）と、レーザ光を試料（１７）に照射した際に、試料（１７）からの信号光として検出する検出器（２２）と、を備え、レーザ光の強度が最大の時に、信号光の飽和又は非線形な増加が生じることによってレーザ光の強度と信号光の強度との関係が非線形になる非線形領域となるようレーザ光の強度を変化させて試料に照射し、レーザ光の強度に応じた信号光を検出器（２２）で検出し、信号光の飽和成分又は非線形な増加成分に基づいて観察を行うものである。

Description

本発明は、顕微鏡、及び観察方法に関する。

一般に顕微鏡では、空間分解能が回折限界によって制限されている。従って、従来の顕微鏡では光の波長と開口数が決まってしまうと、空間分解能を一定以上に向上させることができないという問題点があった。

空間分解能を向上するための蛍光顕微鏡が、本件出願の発明者らによって提案されている（特許文献１）。この蛍光顕微鏡では、蛍光の飽和成分に基づいて観察している。

国際公開第２００６／０６１９４７号

しかしながら、上記の蛍光顕微鏡では、蛍光以外について、空間分解能を向上することができないという問題点がある。

本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであって、空間分解能を向上することができる顕微鏡、及び観察方法を提供することを目的とする。

本発明の第１の態様による顕微鏡は、光を出射する少なくとも一つの光源と、前記光源からの光を集光して試料に照射するレンズと、前記光を前記試料に照射した際に、前記試料での多光子遷移過程により発生する信号光として検出する少なくとも一つの検出器と、を備え、前記光の強度が最大の時に、前記信号光の非線形光学効果により発生する飽和又は非線形な増加が生じることによって光の強度と前記信号光の強度との関係が非線形になる非線形領域となるよう前記光の強度を変化させて試料に照射し、前記光の強度に応じた前記信号光を前記検出器で検出し、前記信号光の飽和成分又は非線形な増加成分に基づいて観察を行うものである。これにより、非線形光学損失に起因する信号光の飽和又は非線形な増加に基づいて観察することができるため、高調波発生を検出しなくても、高い空間分解能で観察することができる。

本発明の第２の態様による顕微鏡は、上記の顕微鏡であって、前記光源からの光と同じ波長の反射光、透過光、及び散乱光の少なくとも一つを前記信号光として、前記検出器が検出し、高次の非線形光学効果を含む他の光学効果により光高調波が発生することで、前記信号光が飽和するものである。

本発明の第３の態様による顕微鏡は、上記の顕微鏡であって、多光子遷移によって発生した散乱光を前記信号光として前記検出器が検出し、前記非線形光学効果を含む他の光学効果により光高調波が発生することで、前記信号光が飽和するものである。

本発明の第４の態様による顕微鏡は、上記の顕微鏡であって、前記検出器がハイパーレイリー散乱、ラマン散乱、誘導ラマン散乱、コヒーレントアンチストークスラマン散乱、四光波混合、誘導放出、差周波発生、和周波発生、及び高調波発生のうちの少なくとも一つを検出し、前記検出器で検出される信号光が、前記光源からの光との波長差を利用して、前記光から分離されていることを特徴とするものである。これにより、様々な光を用いて、高分解能での観察が可能になる。

本発明の第５の態様による顕微鏡は、上記の顕微鏡であって、前記光の強度が時間に応じて変化するよう強度変調する変調器をさらに備え、前記光がピークとなる時間において信号光が前記非線形領域となる強度で試料に照射され、前記変調器で強度変調しながら、前記光と前記試料の相対位置を変化させるよう走査し、前記試料から出射した信号光を前記検出器で検出し、前記検出器で検出された信号光から、前記変調器での変調周波数に対する高調波成分を取り出して観察を行うものである。これにより、簡便に非線形光学損失に起因する飽和又は非線形な増加を発生させることができる。

本発明の第６の態様による顕微鏡は、上記の顕微鏡であって、前記試料からの信号光が、前記変調器で強度変調された光のｎ光子反応（ｎは１以上の自然数）によって生成され、前記変調器での変調周波数に対する（ｎ＋１）次以上の高調波成分を取り出して、観察を行うことを特徴とするものである。これにより、１光子反応、及び多光子反応においても、試料に入射する光強度を高くしなくても、飽和又は非線形な増加を発生させることができる。

本発明の第７の態様による顕微鏡は、上記の顕微鏡であって、前記試料に波長の異なる２つの光が照射され、前記２つの光が同じ変調周波数、かつ同じ位相で変調され、前記試料からの信号光が、前記変調器で変調された２つの光のｍ光子反応（ｍは２以上の自然数）によって生成され、前記変調周波数に対する（ｍ＋１）次以上の高調波成分を取り出して、観察を行うことを特徴とするものである。これにより、試料に入射する光強度を高くしなくても、多光子反応の飽和又は非線形な増加を発生させることができる。

本発明の第８の態様による顕微鏡は、上記の顕微鏡であって、前記試料に波長の異なる２つの光が照射され、前記２つの光が異なる変調周波数で変調され、前記２つの光の変調周波数の和、又は差に応じた周波数で復調していることを特徴とするものである。

本発明の第９の態様による顕微鏡は、上記の顕微鏡であって、前記光の強度が時間に応じて変化するよう強度変調され、前記光源がパルス光源であり、前記パルス光源の繰り返し周波数が、強度変調の変調周波数よりも高くなっているものである。

本発明の第１０の態様による顕微鏡は、上記の顕微鏡であって、前記信号光が前記非線形領域となる第１の強度と、前記第１の強度と異なる第２の強度の少なくとも２つの強度とで前記試料に照射されるよう前記光の強度を変化させ、前記第１の強度での信号光の強度及び前記第２の強度での信号光の強度に基づいて信号光の飽和成分又は非線形な増加成分を算出するものである。これにより、簡易な構成で飽和又は非線形な増加成分に基づく観察を行うことができる。

本発明の第１１の態様による顕微鏡は、上記の顕微鏡であって、波長差に応じて分離された前記信号光を複数の前記検出器で検出するものである。

本発明の第１２の態様による観察方法は、光を試料に照射し、前記試料を観察する観察方法であって、前記光を集光して、前記試料に照射することで、前記試料での多光子遷移過程による信号光を発生させ、前記光の強度が最大の時に、前記試料からの信号光が、非線形光学効果により発生する前記信号光の飽和又は非線形な増加によって光の強度と信号光の強度との関係が非線形になる非線形領域となるよう、前記光の強度を変化させて、前記試料と前記光との相対位置を変化させるよう走査し、前記試料からの信号光を検出し、前記検出された信号光の飽和成分又は非線形な増加成分に基づいて観察を行うものである。これにより、非線形光学損失に起因する信号光の飽和又は非線形な増加に基づいて観察することができるため、高調波発生を検出しなくても、高い空間分解能で観察することができる。

本発明の第１３の態様による観察方法は、上記の観察方法であって、前記試料の近傍に金属探針を配置した状態、又は前記試料に金属粒子を添加した状態で、前記光を試料に照射することを特徴とするものである。これにより、簡便に、非線形光学損失による飽和又は非線形な増加の発生、及びその飽和又は非線形な増加に基づく観察を行うことができる。

本発明の第１４の態様による観察方法は、上記の観察方法であって、前記試料の近傍に配置された金属探針を走査しながら、前記光を試料に照射して、て、前記信号光を検出することを特徴とするものである。これにより、簡便に、非線形光学損失による飽和又は非線形な増加の発生、及びその飽和又は非線形な増加に基づく観察を行うことができる。

本発明によれば、空間分解能を向上することができる顕微鏡、及び観察方法を提供することができる。

図１は、本発明の実施形態にかかるレーザ顕微鏡の構成を示す図である。 図２は、散乱光、反射光の空間分布を模式的に示す図である。 図３Ａは、変調されたレーザ光とレーザ光照射によって発生する散乱光の強度変化を模式的に示す図である。 図３Ｂは、変調されたレーザ光とレーザ光照射によって発生する散乱光の強度変化を模式的に示す図である。 図４は、レーザ光強度に対する反射光及び高調波の強度の関係を模式的に示す図である。 図５は、反射光強度の周波数に対するパワースペクトルを模式的に示す図である。 図６Ａは、反射光の空間分布を模式的に示す図である。 図６Ｂは反射光の１次の周波数成分の空間分布を模式的に示す図である。 図６Ｃは、反射光の強度を２次の高調波周波数２ｆ_ｍで復調した信号を模式的に示す図である。 図７Ａは、スポット中心における、反射光強度のパワースペクトルを模式的に示す図である。 図７Ｂは、スポット端部における、反射光強度のパワースペクトルを模式的に示す図である。 図７Ｃは、中心と端部の間における、反射光強度のパワースペクトルを模式的に示す図である。 高次の変調高調波成分を検出した場合の光学伝達関数に示す図である。 図９Ａは、レーザ光と散乱光の関係を示す図である。 図９Ｂは、レーザ光と第２高調波の関係を示す図である。 図９Ｃは、入射光とＣＡＲＳ光の関係を示す図である。 図９Ｄは、入射光と、誘導ラマン散乱光の関係を示す図である。 図１０は、入射光強度に対する復調信号を示す図である。 図１１は、入射光強度に対する復調信号を示す図である。 図１２は、入射光強度に対する復調信号を示す図である。 図１３は、入射光強度の変調レンジを変えた時の、点像分布関数を示す図である。 図１４は、本実施形態にかかるレーザ顕微鏡の具体的構成例を示す図である。 図１５は、金薄膜表面の非線形な反射特性を示す図である。 図１６は、ＬＢＯ結晶表面の非線形な反射特性を示す図である。 図１７は、金微粒子からの非線形な散乱特性を示す図である。 図１８は、Ｌ−ＡｌａｎｉｎｅからのＣＡＲＳ光の飽和特性を示す図である。

以下、本発明を適用した具体的な実施の形態について、図面を参照しながら詳細に説明する。ただし、本発明が以下の実施の形態に限定される訳ではない。また、説明を明確にするため、以下の記載及び図面は、適宜、簡略化されている。

実施の形態１．
本実施形態では反射光、散乱光、又は透過光の飽和を利用して、空間分解能を向上している。すなわち、反射光、透過光、又は散乱光の飽和成分について観察することにより、空間分解能を向上している。本発明の実施の形態１にかかるレーザ顕微鏡は共焦点顕微鏡であり、レーザ走査方式の顕微鏡である。このレーザ顕微鏡について図１を用いて説明する。図１は本発明にかかるレーザ顕微鏡の構成を模式的に示す図である。１０は光源、１１は変調器、１２はビームスプリッタ、１３はスキャナ、１４はレンズ、１５はレンズ、１６は対物レンズ、１９はフィルタ、２０はレンズ、２１はピンホール、２２は検出器、２３はロックインアンプ、２４は処理装置である。図１に示すレーザ顕微鏡では、反射光（あるいは散乱光）を検出する。

光源１０は照明光を連続発振するレーザ光源であり、例えば、連続発振Ａｒイオンレーザ又は、可視域の波長を持つ半導体レーザを用いることができる。ここで、レーザ波長をλとする。照明光となるレーザ光は変調器１１によって強度変調され、周波数ｆ_ｍの周期関数となる。ここでは、レーザ光の強度がコサイン関数となるように強度変調する。強度変調の周波数をｆ_ｍ、角周波数をω_ｍ（＝２πｆ_ｍ）、時間をｔとすると、レーザ光強度は１＋ｃｏｓ（ω_ｍｔ）に比例する。強度変調されたレーザ光強度はω_ｍｔ＝２ｎπで最大となり、ω_ｍｔ＝（２ｎ＋１）πで最小となる（ｎは任意の自然数）。なお、初期位相は０としている。ここでは例えば、ｆ_ｍ＝１００ｋＨｚで強度変調している。変調器１１には電気光学変調器や音響光学変調器等を用いることができる。

強度変調されたレーザ光は、ビームスプリッタ１２に入射する。ビームスプリッタ１２は入射光のほぼ半分の光を反射し、残り半分の光を透過する。ビームスプリッタ１２を透過したレーザ光は、スキャナ１３に入射する。スキャナ１３は、レーザ光を走査して、レーザ光の伝播方向を変化させる。これにより、試料１７におけるレーザ光の位置が変化する。なお、上記の説明では、スキャナ１３を用いたが、スキャナ１３の代わりに駆動ステージ等を用いても良い。レーザ光を走査させる代わりに、試料１７を載置するステージ等を駆動しても良い。もちろん、これらを組み合わせても良い。例えば、Ｘ方向はスキャナ１３で走査し、Ｙ方向はステージで走査しても良い。すなわち、レーザ光と試料１７との相対位置を変化させて走査を行う構成であればよい。なお、２次元方向のみの走査に限らず、３次元に走査するようにしてもよい。

スキャナ１３で走査されたレーザ光はレンズ１４、レンズ１５を通過する。レンズ１４、１５で屈折された光は、対物レンズ１６に入射する。対物レンズ１６は試料１７上あるいは試料１７内にレーザ光を集光する。照明光であるレーザ光が試料１７に入射されると、その照明光が散乱あるいは反射する。従って、試料１７からは、散乱光、又は反射光の一方、あるいは両方が出射する。以下、レーザ光に応じて試料１７から出射した光を散乱光／反射光と称する。

試料１７から出射した散乱光／反射光は、対物レンズ１６に入射する。散乱光／反射光は、対物レンズ１６により屈折され、レンズ１５、及びレンズ１４に入射する。レンズ１５、１４で屈折された散乱光／反射光は、スキャナ１３でデスキャンされる。そして、スキャナ１３でデスキャンされた散乱光／反射光は、ビームスプリッタ１２で反射されて、フィルタ１９に入射する。

フィルタ１９は、例えば、光学フィルタであり、波長に応じて光を分離する。フィルタ１９は、レーザ光の波長を透過して、光高調波を遮断する。すなわち、フィルタ１９は、試料１７から出射した散乱光／反射光から基本波のみを取り出す。従って、第２高調波やそれ以上の光高調波は、フィルタ１９によって遮光される。

フィルタ１９を透過した散乱光／反射光は、レンズ２０を通過する。レンズ２０は、ピンホール２１に入射する。ピンホール２１には、その中心において、散乱光／反射光が通過するよう光透過孔が形成されている。すなわち、ピンホール２１の光透過孔が光軸上に配置されている。対物レンズ１６、レンズ１５、レンズ１４、及びレンズ２０は、試料１７での像が、ピンホール２１に結像するよう配置されている。ピンホール２１を通過した散乱光／反射光は、検出器２２に入射する。検出器２２は、入射した散乱光／反射光の強度を測定する。

検出器２２に入射する散乱光／反射光は、強度変調されたレーザ光に基づくものとなる。検出器２２は光電子増倍管などのセンサである。この検出器２２は受光した光の強度に応じた検出信号をロックインアンプ２３に出力する。ロックインアンプ２３は所定の繰り返し周波数をロックインして、検出器２２からの信号をロックイン検出する。ここで、ロックインアンプ２３には変調器１１からの参照信号が入力されており、変調器１１での変調周波数ｆ_ｍのｎ倍（ｎは２以上の整数）の周波数で信号を復調する。例えば、変調周波数ｆ_ｍを１００ｋＨｚとした場合、２００ｋＨｚ、３００ｋＨｚ・・・の周波数で復調が行われる。これにより、高次の変調周波数成分を抜き出して検出することができる。

また、処理装置２４は試料１７が走査されている間、ロックイン検出を行うようスキャナ１３、変調器１１、及びロックインアンプ２３を制御する。さらに処理装置２４はロックインアンプ２３から出力された信号に基づいて光学像を形成する。すなわち、試料１７が走査されている間、検出された信号に基づいて光学像を形成する。処理装置２４で所定の操作を行うことにより、光学像を画面上に表示させたり、光学像のデータを記憶することができる。これにより、散乱光、又は反射光による光学像の観察、撮像を行うことができる。

本実施形態にかかるレーザ顕微鏡は共焦点顕微鏡を構成している。すなわち、点光源であるレーザ光源１０と試料１７とが共役な結像関係になるように配置され、かつ試料１７とピンホール２１とが共役な結像関係となるように配置されている。これにより、共焦点光学系を介して散乱光／反射光を検出することができる。よって、空間分解能を向上することができる。

次に、光の飽和を利用した高分解能検出の原理について図２〜図４を用いて説明する。以下の説明では、反射光を検出する例に付いて説明する。図２はレーザ光及び反射光の強度の空間分布を示す図である。図２において横軸は位置、縦軸は光の強度を示している。図３Ａ及び図３Ｂは強度変調したレーザ光の強度及び反射光の時間変化を示す図である。図３Ａ及び図３Ｂにおいて横軸は時間、縦軸は光の強度を示している。また、図２、図３Ａ及び図３Ｂにおいて、実線がレーザ光強度を示しており、破線が反射光強度を示している。説明の明確化のため、図２、図３Ａ及び図３Ｂでは、反射光の飽和が無い状態で、反射光とレーザ光の強度が一致するものとして図示している。図４はレーザ光強度と、試料から出射する光の強度の関係を示す図である。図４において、横軸はレーザ光強度、縦軸は信号光の強度を示している。

図２に示すようにレーザ光の強度はスポット中央（ｘ＝ａの位置）でピークとなり、スポット中央から離れるにしたがって強度が弱くなる。本実施の形態では、レーザ光を強度変調している。従って、ｘ＝ａの部位でのレーザ光強度の時間変化は図３Ａに示すようになり、ｘ＝ｂの部位でのレーザ光強度の時間変化は図３Ｂに示すようになる。すなわち、レーザ光が強度変調されているため、いずれの位置においてもレーザ光はコサイン関数に応じて変化する。ここで、ｘ＝ａはピーク位置であり、ｘ＝ｂはピーク位置からずれた位置である。そのため、どのタイミングにおいてもｘ＝ａでのレーザ光強度はｘ＝ｂでのレーザ光強度よりも強くなる。

レーザ光の強度が大きくなると、反射光の飽和が発生する。レーザ光強度が非常に高い場合、例えば、非線形の光学効果によって、レーザ光の光高調波が発生する。すなわち、レーザ波長の整数倍の波長を持つ光が発生する。光高調波が発生しただけ、元のレーザ光の強度が減少し、高調波損失が発生する。なお、高調波損失とは、試料からの散乱光、透過光、反射光等の信号光が、より高次の非線形光学効果や他の光学効果により光強度を損失し、飽和する現象をいう。従って、この高調波損失は、非線形な光学損失（以下、非線形光学損失と称する）ということができる。すなわち、非線形光学損失が発生した分だけ、反射光が弱くなる。以下、試料において発生した、レーザ光の光高調波をレーザ高調波とする。基本波であるレーザ波長をλとすると、レーザ高調波の波長はｎλ（ｎは２以上の自然数）となる。さらに、以下の説明では、レーザ高調波を反射光の光高調波とすることもある。また、以下の説明において、反射光は、レーザ光の波長と同じ波長のものを示している。

図４に示すようにレーザ光が弱いときは、レーザ光と反射光が比例するが、レーザ光強度が強くなっていくと、レーザ光と反射光とが比例しなくなる。このように、レーザ光強度を大きくしても、得られる反射光は比例して大きくならず、飽和するようになる。すなわち、非線形光学損失に起因する飽和が無ければ、図４の破線に示すようにレーザ光強度に比例して反射光強度が大きくなっていくが、実際には実線のように、あるレーザ光強度から飽和が発生し、反射光強度が頭打ちとなる。なお、本明細書において、非線形光学損失による飽和とはレーザ光の強度と反射光の強度との関係が線形の関係から離れることをいう。すなわち、図４において破線と実線とが離れる程度の反射光強度であれば反射光成分の飽和が発生する。換言すると、反射光の飽和が発生する飽和領域は、レーザ光の強度に対する反射光の強度の関係が非線形となる非線形領域となる。非線形領域では、レーザ波長と同じ波長の反射光は、反射光の光高調波分だけ少なくなる。

このような反射光の飽和は、レーザ強度が大きいほど発生しやすい。さらに、レーザ強度が大きいほど飽和の度合いが大きくなる。従って、図２に示す空間分布を有するレーザ光では、ピーク位置（ｘ＝ａ）に近いほど飽和しやすく、ピーク位置で最も反射光の飽和の度合いが大きい。また、図３Ａ及び図３Ｂに示すようなコサイン関数に強度変調されたレーザ光では、ピークとなる時間（ω_ｍｔ＝２ｎπ）に近いほど飽和しやすく、ピークとなる時間で最も反射光の飽和の度合いが大きい。

ここで、ｘ＝ｂの部位ではいずれの時間においても反射光の飽和が発生せず、ピーク位置（ｘ＝ａ）の周辺で反射光の飽和が発生する程度の強度を持つレーザ光を試料１７に照射したものとする。これにより、図２に示す破線で示されるような強度分布となる反射光が出射する。すなわち、図２では、ピーク位置（ｘ＝ａ）の近傍において、レーザ光と反射光とで強度に差が生じ、ピーク位置から離れるとレーザ光の波形と反射光の波形とが略一致する。

さらに、強度変調されたレーザ光に対する反射光の強度は図３Ａの破線で示されたものとなる。すなわち、ｘ＝ａの部位ではレーザ光が強いため、反射光が飽和する。そして、図３Ａに示すように、反射光の飽和はピークとなる時間（ω_ｍｔ＝２ｎπ）の周辺で発生し、ピークとピークの間の時間（ω_ｍｔ＝（２ｎ＋１）π）の周辺では発生しない。すなわち、図３Ａでは、ピークとなる時間の近傍において、レーザ光と反射光とで強度に差が生じ、ピークとなる時間から離れるとレーザ光と反射光とが一致する。一方、ｘ＝ｂの部位ではレーザ光が弱いため、いずれの時間においても反射光の飽和が発生しない。そのため、レーザ光強度と反射光強度が比例しており、図３Ｂではこれらが一致して図示されている。

ｘ＝ｂの部位では反射光強度が１＋ｃｏｓ（ω_ｍｔ）に比例したものとなる。一方、ｘ＝ａの部位では、反射光の飽和により反射光強度がピークとなる時間の周辺で弱くなっているため、１＋ｃｏｓ（ω_ｍｔ）に比例したものにはならない。すなわち、ｘ＝ａの部位では、反射光強度に２次、３次、・・・の高調波成分（変調器１１による強度変調に対する高調波）が表れる。これらを検出することで、レーザ光のスポット中心部のみの情報を取り出すことが可能になる。すなわち、強度変調の高調波成分にはレーザ光のスポット中心の情報が含まれている。

飽和が無い場合の反射光の強度は、反射率と入射光強度に比例する。レーザ光の強度はＢ・（１＋ｃｏｓ（ω_ｍｔ））と表され、（１＋ｃｏｓ（ω_ｍｔ））に比例する。なお、Ｂは振幅である。飽和がある場合、反射光強度は（１＋ｃｏｓ（ω_ｍｔ））の関数となる。よって、反射光強度をテイラー展開すると、（１＋ｃｏｓ（ω_ｍｔ））のべき級数で表される。すなわち、（１＋ｃｏｓ（ω_ｍｔ））のｎ乗の項が現れる。そして、（１＋ｃｏｓ（ω_ｍｔ））^２にはｃｏｓ（２ω_ｍｔ）の項が、（１＋ｃｏｓ（ω_ｍｔ））^３にはｃｏｓ（３ω_ｍｔ）の項が表れる。このように、変調高調波の成分が現れる。なお、変調高調波とは、変調器１１によるレーザ光強度の強度変調に対する高調波で、レーザ光の光高調波、すなわち、波長λ／ｎの光と区別するために用いられる。

ここで、図３Ａの破線に示す反射光強度をフーリエ変換して変調周波数に対するスペクトルを求めると、その振幅スペクトルは図５に示すようになる。図５は変調周波数に対する振幅スペクトルを模式的に示す図である。反射光は周期関数となるので、そのスペクトルは所定の周波数にピークを持つ線スペクトルとなる。

上述のように反射光には変調高調波成分が表れるので、ｆ_ｍ、２ｆ_ｍ、３ｆ_ｍ、４ｆ_ｍ・・・の位置にピークが表れる。ここで、レーザ光の振幅をＢとすると、ｎｆ_ｍの位置のピークの高さはＢ^ｎに比例する。例えば、ｆ_ｍの位置のピークはＢに比例し、２ｆ_ｍの位置のピークはＢ^２に比例する。

このような、変調高調波成分を有する反射光の空間分布及び変調高調波成分の空間分布を図６Ａ〜図６Ｃに示す。図６Ａは信号光の空間分布を示す図であり、図２の破線で示した空間分布と同じものである。また、図６Ｂに１次（ω_ｍ）の成分を示し、図６Ｃに２次（２ω_ｍ）の成分（２次の変調高調波成分）を示している。図６Ａ〜図６Ｃにおいて、横軸は位置、縦軸は光強度を示している。なお、説明の明確化のため、それぞれの図において、縦軸を異なるスケールで示している。

図６Ｂの空間分布は１次の成分であるため、Ｂに比例する。また図６Ｃに示す空間分布は２次の成分であるためＢ^２に比例する。従って、図６Ｂ及び図６Ｃに示すように２次の成分の空間分布におけるピークの半値幅は１次の成分よりも細くなる。同様にｎ次の成分はＢ^ｎに比例するため、より高次の成分ほど、ピークの半値幅が狭くなる。すなわち、高次の成分ほど、ピークの幅が狭くなり、ピークが急峻になる。よって、より高次の成分を検出すれば、実質的な反射光スポットは点像分布関数のべき乗で得られ、空間分解能を向上することができる。検出する成分の次数に比例して、空間分解能を向上することができる。なお、１次の成分と全ての変調高調波成分を足し合わせたものは図６Ａに示すものとなる。また、図６Ｂ、及び図６Ｃに示す空間分布はそれぞれ反射光の飽和成分に基づくものとなる。反射光の飽和成分に基づいて、変調高調波成分の空間分布が変化する。すなわち、反射光の飽和成分の強度に応じて、変調高調波成分の強度が変化する。このように反射光の飽和成分に基づいて試料を観察することにより、空間分解能を向上することができる。

上記のように、試料上における空間的な位置に応じて、飽和度合いが異なっている。すなわち、レーザ光のスポット中心位置（ｘ＝ａ）では飽和度合いが大きく、レーザ光のスポット端部（ｘ＝ｂ）では、飽和が発生しない。また、スポット端部とスポット中心の間の位置では、飽和度合いがスポット中心よりも低くなる。従って、各位置での反射光強度をフーリエ変換して変調周波数に対する振幅スペクトルを求めると、図７Ａ〜図７Ｃに示すようになる。
図７Ａでは、スポット中心（ｘ＝ａ）での振幅スペクトルを示し、図７Ｂはスポット端部（ｘ＝ｂ）での振幅スペクトルを示し、図７Ｃはその間における振幅スペクトルを示している。従って、例えば、周波数２ｆ_ｍの信号成分によって観察を行うことで、分解能を向上することができる。もちろん、ｎ次の成分に着目して、観察を行っても良い。変調周波数のｎ倍の周波数で復調することで、高空間分解能での観察が可能になる。

高次の変調高調波成分を検出した場合の光学伝達関数の一例を図８に示す。図８に示すように、より高次になるほど空間分解能が向上する。なお、共焦点検出法と組み合わせることにより、さらなる空間分解能の向上が可能である。このように本実施の形態は、３次元の全ての方向に対して空間分解能を向上することができる。なお、本発明の検出方法を用いずに、共焦点検出法あるいは２光子応答を用いたものは２ωの光学伝達関数と略同じものとなる。

例えば、２次の変調高調波成分を検出することにより、１次の周波数成分を検出した場合と比べて２倍の空間分解能で検出することができる。このように２次、３次の変調高調波成分を検出することにより、空間分解能を２倍、３倍にすることができる。従って、回折限界を超えた空間分解能で検出することが可能になり、従来のレーザ顕微鏡に比べて高分解能で検出することができる。もちろん、ｎ次の成分を検出することにより、空間分解能をｎ倍にすることができる。さらに、損失した光高調波ではなく、レーザ波長λの反射光を検出している。換言すると、検出器２２で反射光を受光して、非線形光学損失分を検出している。従って、高いＳ／Ｎで検出することができる。
また、照明光と同じ波長の反射光を検出しているため、高次の非線形効果を観察する場合でも、レーザ光と同じ波長の光を検出すればよい。すなわち、基本波の検出で、非線形効果に基づく観察が可能になる。レーザ光の波長を短くした場合でも、通常の光学系での検出を行うことが可能となる。例えば、紫外域の光を光学系内を伝搬させる必要がなくなるので、通常仕様のレンズ、ミラー等を用いることができる。すなわち、非線形光学損失を計測しているため、短波長用の光学部品や計測器を準備しなくても、容易に高次の非線形応答を確認することができる。よって、可視域用の光学系を用いながらも、高い分解能を実現することができる。非線形の応答を分離検出することにより、回折限界を越えた空間分解能で試料の形状を３次元観察することができる。

上述のようにｎ次（ｎは２以上の自然数）の成分を取り出して検出することにより、空間分解能を向上することができる。従って、ロックインアンプ２３で所定の周波数で固定して、ロックイン検出を行う。このとき、ロックインアンプ２３の検出周波数は、変調周波数ｆ_ｍのｎ倍（ｎは２以上の自然数）とする。また、照明光がピークとなる位相でロックインして検出を行う。これにより、高感度の検出を行うことができ、より高次の変調高調波成分を検出することができるようになる。従って、空間分解能をより向上することができる。このように、レーザ光の変調周波数ｆ_ｍの整数倍であるので、その周波数帯域を電気的にフィルタリングすれば、非常に高感度に変調高調波成分を取り出すことが可能になる。なお、ロックイン検出に限らず、ハイパスフィルタを用いて変調高調波を検出することも可能である。

なお、変調器１１での変調周波数ｆ_ｍは、試料１７の走査に比べて十分速いものとする。すなわち、光学像の１画素分を走査する時間に複数のピークが含まれるよう、変調周波数を高くする。例えば、光学像の１画素に対応する走査時間が１ｍｓｅｃとした場合、変調周波数を１００ｋＨｚとする。この場合、１画素を走査する時間内にレーザ光のピークが１００回出現する。変調周波数を試料の走査に比べて速くすることにより、１画素を走査する時間内に飽和が発生する回数を増やすことができるので、正確に検出を行うことができる。

本発明では、反射光の飽和の度合いが大きいほど、飽和を検出しやすくなり分解能を向上することができる。しかし、レーザ光強度を大きくするためレーザ光の強度（密度）を強くすると、試料の損傷が発生するおそれがある。この場合、光源にパルスレーザ光源を用いることが好ましい。この場合、例えば、図３Ａの点線に示すコサイン関数が包絡線となり、レーザ光は、この包絡線に応じたパルス強度となる。パルスレーザ光源を用いることにより、飽和に達する光強度（密度）を実現しながらも、全体の光照射量を低くすることができる。よって、試料の損傷を防ぐことができる。ここで、パルスレーザ光の繰り返し周波数は、変調周波数に比べて十分高いものとする。すなわち、変調の１周期の間に複数のパルスを含むよう、それぞれの周波数を設定する。例えば、変調周波数１００ｋＨｚの場合、繰り返し周波数８０ＭＨｚのものを用いることができる。この場合、１周期の間に８００パルスが含まれる。このようにパルスレーザ光の繰り返し周波数を変調周波数に比べて高くすることにより、正確に検出を行うことができる。

なお、レーザ光を強度変調する関数は周期関数であれば、コサイン関数以外の関数でもよい。ここで、レーザ光の強度が最大となるタイミングでは、レーザ光強度を信号光の飽和が生じる強度とする。すなわち、レーザ光が最大となるタイミングにおいて、信号光の飽和が発生し、レーザ光と信号光の関係が非線形となる非線形領域で、レーザ光が試料に照射されればよい。

また、本実施の形態にかかるレーザ顕微鏡は、コンフォーカル光学系を有していない構成とすることも可能である。すなわち、ピンホール２１を取り除き、コンフォーカル顕微鏡ではない光学顕微鏡とすることも可能である。この場合、焦点位置以外からの信号光は、レーザ光の密度が低いため信号光の飽和が小さい。すなわち、焦点位置以外の箇所では、レーザ光強度が低く、信号光が非線形領域でない線形領域となる。従って、焦点位置以外からの信号光の、飽和成分が小さくなる。これにより、コンフォーカル光学系を用いない構成でも、Ｚ方向に分解能を向上することができる。すなわち、焦点位置から光軸方向にずれた位置では、信号光が線形領域となる。そのため、信号光の飽和が生ぜず、焦点位置及びその近傍のみからの情報を抽出することができる。これにより、コンフォーカル光学系を用いない簡易な構成で、３次元観察が可能になる。もちろん、コンフォーカル光学系を有するレーザ顕微鏡とすることにより、分解能をさらに向上することが可能になる。

上記の説明では、反射光を検出するようにしたが、試料を透過した透過光を検出するようにしてもよい。この場合、対物レンズ１６の反対側に検出器２２を配置する。この場合も、波長差を利用して、レーザ高調波成分と基本周波数成分の透過光を分離するようにする。さらには、散乱光（レイリー散乱、ミー散乱）に基づいて観察するようにしてもよい。従って、本発明は図１に示す構成以外の光学顕微鏡によっても実現可能である。すなわち、図１では落射照明型のレーザ顕微鏡を用いて説明したが、本発明は、透過照明型の光学顕微鏡に対して用いることもできる。透過光、又は散乱光を測定する場合、透過照明型の光学顕微鏡に対して、上記の手法を利用する。もちろん、透過光と散乱光を同時に検出しても良い。また、反射光、又は散乱光に基づく観察を行う場合、落射照明型の光学顕微鏡に対して、上記の手法を利用する。

実施の形態２．
本実施の形態では、非線形光学効果によって発生する信号光の飽和成分に基づいて観察する。例えば、非線形光学効果によって試料で発生する散乱光等を検出する。この場合、レーザ波長と異なる波長の散乱光とを検出する。例えば、ハイパーレイリー散乱、高調波発生、ラマン散乱、コヒーレントアンチストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ）、四光波混合、誘導放出、差周波発生、和周波発生、パラメトリック蛍光、又は誘導ラマン散乱（ＳＲＳ）等の各種光を検出するようにしてもよい。散乱光には、非線形光学効果によって発生する散乱光も含まれる。非線形光学効果や他の光学効果の発生により、光強度の損失、すなわち、高調波損失が発生する。ここで、高調波損失とは、信号光における高調波損失で、レーザ光（基本波）における高調波損失とは異なる概念である。この高調波損失は、非線形な光学損失（以下、非線形光学損失と称する）となる。
入射するレーザ光と異なる波長の散乱光等を検出する場合、レーザ波長の光が検出器２２に入射しないようにする。すなわち、波長の差を用いて、レーザ波長の光と、レーザ高調波を分離する。この場合、例えば、バンドパスフィルタ等の光学フィルタや、ダイクロイックミラーを用いる。すなわち、レーザ波長と異なる波長の散乱光等（ラマン散乱、ハイパーレイリー散乱、誘導ラマン散乱、コヒーレントアンチストークスラマン散乱、高調波発生、パラメトリック蛍光、四光波混合、誘導放出、和周波発生、差周波発生等）を検出する場合、波長差を利用して、レーザ光（基本波）と信号光を分離するようにする。例えば、バンドパスフィルタ等の光学フィルタや、ダイクロイックミラーを用いる。検出器と試料の間に、レーザ光を遮光する光学素子を配置する。なお、散乱光を検出する場合、光源１０を対物レンズ１６の反対側に配置しても良い。すなわち光源１０と反対側に、試料１７を透過した散乱光を検出するようにしてもよい。

このように、試料からの散乱光等を試料から出射する信号光として検出器２２で検出する。そして、変調器１１の変調高調波成分を用いて観察すればよい。本実施形態においても２次以上の変調周波数で、復調すれば良い。さらに、復調する周波数を選択することで、非線形光学損失の飽和を生じさせるレーザ光強度が高くなるのを防ぐことができる。この場合、復調する周波数は、検出する光の種類に応じて変化する。例えば、多光子反応の場合、線形領域においても２次の成分（周波数２ｆ_ｍ）が現れる。このため、３次以上の変調高調波で復調することが望ましい。以下に、好適な復調周波数に付いて、図９Ａ〜図９Ｄを用いて説明する。

（１光子反応について）
まず、実施の形態１で示した１光子反応、すなわち線形の応答における、レーザ光強度と散乱光強度の関係を図９Ａに示す。図９Ａでは、横軸がレーザ光強度Ｉ_ｅｘ、縦軸が散乱光強度Ｉ_ｓｃａｔとなっている。なお、図９Ａに示す散乱光は、レーザ波長と同じ波長の散乱光である。例えば、レイリー散乱やミー散乱は、１光子反応によって出射される。すなわち、線形光学効果による散乱光である。飽和がない場合、レーザ光と散乱光は、リニアに変化する。そして、レーザ光強度が高くなると、散乱光の飽和が発生する。この場合、散乱光は、変調するレーザ光強度の１乗に応じた１乗応答となる。

線形の光学効果による信号光の場合、レーザ光と信号光の関係は、図９Ａに示すようになる。すなわち、レーザ波長と同じ波長の散乱光、反射光、あるいは透過光は、図９Ａに示す関係となる。この場合、上記の通り、２次以上の変調高調波を用いて観察を行う。例えば、検出器２２で検出した検出光を周波数２ｆ_ｍで復調する。換言するとロックインアンプ２３のロックイン周波数を２ｆ_ｍとする。また、この場合、レーザ光と同じ波長の信号光を検出し、それ以外の波長の光をフィルタ１９で除去する。

（２光子反応について）
一方、非線形光学効果である２光子反応における、レーザ光と信号光の関係は図９Ｂに示すようになる。図９Ｂでは、信号光を第２高調波発生（ＳＨＧ）とした場合を示している。図９Ｂでは、横軸がレーザ光強度Ｉ_ｅｘ、縦軸が第２高調波強度Ｉ_ＳＨＧとなっている。第２高調波発生は、２光子の反応による応答である。すなわち、第２高調波発生（ＳＨＧ）は、変調するレーザ光強度の２乗に応じた２乗応答となる。飽和がない場合、強度変調したレーザ光（変調光）の２乗と第２高調波（光高調波）は、リニアに変化する。そして、レーザ光強度が高くなると、ＳＨＧの飽和が発生する。例えば、ＳＨＧの飽和が生じない線形領域において、レーザ光強度Ｉ_ｅｘが（１＋ｃｏｓ（ω_ｍｔ））に比例する場合、ＳＨＧ強度Ｉ_ＳＨＧは（１＋ｃｏｓ（ω_ｍｔ））^２に比例する。これを展開すると、以下のようになる。
Ｉ_ＳＨＧ＝１＋２ｃｏｓ（ω_ｍｔ）＋ｃｏｓ^２（ω_ｍｔ） ・・・（１）

なお、上記の式（１）、及び以下の式（２）では、説明の簡略化のため、比例係数を１としている。ここで、ｃｏｓ（２ω_ｍｔ）を用いてｃｏｓ^２（ω_ｍｔ）を変形すると、以下の式（２）になる。
Ｉ_ＳＨＧ＝１＋２ｃｏｓ（ω_ｍｔ）＋（１＋ｃｏｓ（２ω_ｍｔ））／２・・・(２)

従って、２乗応答であるＳＨＧの場合、ＳＨＧの非飽和成分（線形成分）自体に１次の成分だけでなく、２次の成分が含まれることになる。レーザ光の変調周波数（ｆ_ｍ）に対して、ＳＨＧには、１次の成分（ｆ_ｍ）と２次の変調高調波成分（２ｆ_ｍ）が存在している。すなわち、線形領域におけるＳＨＧ強度にも２次の変調高調波成分が含まれることになる。

この場合、３次以上の成分を用いて観察を行う。例えば、検出器２２で検出した検出光を周波数３ｆ_ｍで復調する。換言するとロックインアンプ２３のロックイン周波数を３ｆ_ｍとする。また、この場合、レーザ光の２倍の波長の信号光を検出し、レーザ光と同じ波長の光並びに３次以上のレーザ高調波の光をフィルタ１９で除去する。

（コヒーレントアンチストークスラマン散乱について）
次に、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光の強度Ｉ_ＣＡＲＳについて、図９Ｃを用いて説明する。コヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させる場合、ポンプ光とストークス光を照射する。すなわち、２つのレーザ光源を用いて、同時に２つのレーザ光を試料の同じ位置に照射する。ポンプ光はストークス光と異なる波長になっている。ここで、ポンプ光強度をＩｐとし、ストークス光強度をＩｓとする。この場合、ＣＡＲＳ光の飽和が生じない線形領域では、ＣＡＲＳ光強度Ｉ_ＣＡＲＳは、Ｉｐ^２Ｉｓに比例する。

従って、ポンプ光強度Ｉｐを強度変調して、ストークス光強度Ｉｓを強度変調しない場合、ストークス光強度Ｉｓが一定となる。よって、変調するポンプ光の２乗（Ｉｐ^２）に応じてＣＡＲＳ光強度Ｉ_ＣＡＲＳが変化する２乗応答となる。この場合、図９Ｂで説明した第２高調波（光高調波）と同様に、３次以上の成分を用いて観察する。例えば、検出器２２で検出した検出光を周波数３ｆ_ｍで復調する。換言するとロックインアンプ２３のロックイン周波数を３ｆ_ｍとする。

反対に、ポンプ光強度Ｉｐを強度変調せずに、ストークス光強度Ｉｓを強度変調する場合、ポンプ光強度Ｉｐが一定となる。よって、強度変調するストークス光の１乗（Ｉｓ）に応じてＣＡＲＳ光強度Ｉ_ＣＡＲＳが変化する１乗応答となる。よって、図９Ａで説明した散乱光と同様に、２次以上の変調高調波を用いて観察する。例えば、検出器２２で検出した検出光を周波数２ｆ_ｍで復調する。換言するとロックインアンプ２３のロックイン周波数を２ｆ_ｍとする。

もちろん、ポンプ光強度Ｉｐ及び、ストークス光強度Ｉｓの両方を強度変調してもよい。この場合、ポンプ光強度Ｉｐ及び、ストークス光強度Ｉｓを同じ周波数ｆ_ｍで強度変調すると、４次以上の成分（周波数４ｆ_ｍ）を用いて観察する。同じ変調周波数で、ポンプ光強度Ｉ及び、ストークス光強度Ｉｓの両方を強度変調する場合、同位相にそろえることが好ましい。すなわち、２つの光が最大強度で試料に照射されるタイミングを一致させることが好ましい。
あるいは、ポンプ光強度Ｉｐ及び、ストークス光強度Ｉｓを異なる周波数で強度変調しても良い。異なる周波数で強度変調した場合、２つの周波数の差又は和の周波数の整数倍で復調する。例えば、ポンプ光の変調周波数をｆ_ｍ＿ｐとし、ストークス光の変調周波数をｆ_ｍ＿ｓとした場合、その差の整数倍の周波数ｎ（２ｆ_ｍ＿ｐ―ｆ_ｍ＿ｓ）又はその和の整数倍の周波数ｎ（２ｆ_ｍ＿ｐ＋ｆ_ｍ＿ｓ）で復調する。

（誘導ラマン散乱について）
誘導ラマン散乱光強度Ｉ_ＳＲＳについて、図９Ｄを用いて説明する。誘導ラマン散乱光を発生させる場合、ポンプ光とストークス光を照射する。すなわち、２つのレーザ光源を用いて、同時に２つのレーザ光を試料の同じ位置に照射する。ポンプ光はストークス光と異なる波長になっている。ここで、ポンプ光強度をＩｐとし、ストークス光強度をＩｓとする。この場合、信号光の飽和が生じない線形領域では、誘導ラマン散乱光強度Ｉ_ＳＲＳは、ＩｐＩｓに比例する。従って、ポンプ光強度Ｉとストークス光強度Ｉｓのいずれか一方を強度変調する場合、強度変調するレーザ光の１乗応答となる。よって、図９Ａで説明した散乱光と同様に、２次以上の成分を用いて観察する。また、ポンプ光強度Ｉとストークス光強度Ｉｓの両方を同じ変調周波数で強度変調する場合、２乗応答となる。よって、３次以上の変調高調波を用いて観察する。同じ変調周波数で、ポンプ光強度Ｉ及び、ストークス光強度Ｉｓの両方を強度変調する場合、同位相にそろえることが好ましい。すなわち、２つの光が最大強度で試料に照射されるタイミングを一致させることが好ましい。
あるいは、ポンプ光強度Ｉｐ及び、ストークス光強度Ｉｓを異なる変調周波数で強度変調しても良い。異なる変調周波数で強度変調した場合、２つの周波数の差又は和の周波数の整数倍で復調する。例えば、ポンプ光の変調周波数をｆ_ｍ＿ｐとし、ストークス光の変調周波数をｆ_ｍ＿ｓとした場合、その差ｎ（ｆ_ｍ＿ｐ―ｆ_ｍ＿ｓ）又はその和ｎ（ｆ_ｍ＿ｐ＋ｆ_ｍ＿ｓ）で変調する。なお、ポンプ光強度Ｉ及び、ストークス光強度Ｉｓの両方で変調する場合、同位相にそろえることが好ましい。このように、２つのレーザ光入射させる場合、１つ目の変調周波数の整数倍と、２つ目の変調周波数の整数倍の和、又は差の周波数で復調する。

このように、強度変調するレーザ光の次数に応じて、高分解能観察を実現するための復調周波数の次数を選択する。多光子反応などの非線形光学反応では、強度変調するレーザ光が信号光強度に寄与する次数よりも高い次数で、復調することが望ましい。例えば、強度変調したレーザ光強度をｎ乗すると、線形領域が実現できるとする。すなわち、強度変調したレーザ光強度をＩ_ｍとし、信号光強度Ｉとすると、線形領域では、Ｉ_ｍのｎ乗（Ｉｍ^ｎ）に比例する。この場合、１次高い（ｎ＋１）で復調することが好ましい。このように、復調する次数を選ぶことで、本発明による観察手法を複雑な多光子反応にまで拡張することができる。さらに、レーザ光強度が高くなるのを防ぐことができる。

具体的には、１つのレーザ光を照射する場合、あるいは、２つ以上のレーザ光を照射する構成において、１つのレーザ光のみを強度変調した場合、信号光（散乱光）を生成する応答の次数に応じて、復調周波数を選択する。すなわち、試料からの信号光が、強度変調されたレーザ光のｎ光子反応（ｎは１以上の自然数）によって生成される場合、変調周波数に対する（ｎ＋１）次以上の変調高調波成分を取り出して、観察を行う。例えば、１光子反応の場合、２以上の変調高調波成分を取り出し、２光子反応の場合、３以上の変調高調波成分を取り出すことが好ましい。これにより、高分解能での観察が可能になる。
さらには、特許文献１で示した蛍光についても、２光子蛍光を検出する場合は、３次の変調周波数で復調し、３光子蛍光を検出する場合は、４次の変調周波数で復調する。

また、２つ以上のレーザ光を照射する構成において、２つ以上のレーザ光を同じ変調周波数で強度変調する場合も、信号光（散乱光）を生成する応答の合計次数に応じて、復調周波数を変える。すなわち、試料１７からの信号光が、強度変調された２つのレーザ光のｍ光子反応（ｍは２以上の自然数）によって生成される場合、変調周波数に対する（ｍ＋１）次以上の変調高調波成分を取り出して、観察を行う。換言すると、２つのレーザ光を用いる場合、非線形光学効果に寄与する２つのレーザ光の光子数（合計光子数）よりも大きい次数で、復調することが好ましい。これにより、レーザ光強度を高くしなくても、高分解能での観察が可能になる。例えば、ＣＡＲＳ光では、ポンプ光の２光子反応、ストークス光の１光子反応となる。ポンプ光及びストークス光を変調して、ＣＡＲＳ光を検出する場合、（２＋１）＝３光子反応となる。よって、４次以上の変調周波数で復調することが好ましい。なお、２つのレーザ光を強度変調して、試料に照射する場合、強度変調の位相を同じにすることが好ましい。

次に、非線形光学損失の飽和に付いて説明する。レーザ光強度を非常に高くすると、図４で示した第２高調波（光高調波）による非線形光学損失にも飽和が生じる。すなわち、第２高調波（光高調波）自体が飽和していくことになる。この場合、３次高調波（光高調波）、あるいはそれ以上の次数の光高調波による非線形光学損失が発生する。従って、レーザ光強度を非常に高くしていくと、２次の変調高調波成分が低下する。このような高次の非線形光学損失について、図１０を用いて説明する。

図１０は、第３高調波発生などの３光子反応における、１次〜４次の成分ω_ｍ〜４ω_ｍを算出したシミュレーション結果を示すグラフである。図１０において、横軸は入射光強度、縦軸は、復調信号、すなわち、変調高調波成分（１次を含む）毎の信号光強度である。この復調信号に、信号光の飽和成分が現れる。図１０では、１次から４次の成分をそれぞれ（Ｆｕｎｄｍｅｎｔａｌ）、（Ｓｅｃｏｎｄ ｈａｒｍｏｎｉｃ）、（Ｔｈｉｒｄ ｈａｒｍｏｎｉｃ）及び（Ｆｏｒｔｈ ｈａｒｍｏｎｉｃ）として示している。

３光子反応の場合、上記の通り、信号光の飽和が発生していない線形領域においても、３次の成分が現れる。よって、線形領域では、入射光強度に応じて、２次と３次の成分がほぼ同じ傾きで上昇していく。そして、飽和が発生する非線形領域では、４次の成分が現れる。４次の成分の上昇は、２次と３次の成分の飽和に起因している。また、４次の成分も飽和する。この場合、５次や６次の成分が現れることになる。すなわち、４次の成分の非線形光学損失は、５次や６次の成分（図１０では図示せず）として出現する。

さらに、図１０中の２次成分等には、逆ピークが発生する（例えば、図１０中のＡ点）。なお、逆ピークとは、強度が急峻に減少する点をいう。実際には、この逆ピークでは強度が０近傍まで急激に減少することが本件出願の発明者によって発見されている。

ここで、スケールを変えて、復調信号を示すと図１１のようになる。図１１は、１次〜４次の成分を示している。図１１に示すように、２次〜４次の変調成分は、負の値を取る。さらに、各次数において、位相が異なっていることを示している。

このように、入射光（励起光）の強度によって、変調成分の強度が大きく変化する。すなわち、レーザ光強度を高くしたとしても、変調高調波成分の飽和が現れないようなレーザ光強度が存在する。従って、逆ピークとなるレーザ光強度では、ある次数の飽和成分が現れないことになる。さらには、あるレーザ光強度では、変調高調波成分の位相が逆転し、変調高調波成分が負の値を取ることもある。従って、逆ピークとなる強度を含むようにレーザ光強度を設定すると、点像分布関数が大きく変化することになる。

ここで、強度変調するレーザ光強度のレンジに、逆ピークが含まれるようにする。この場合、点像分布関数が大きく変化する。この点像分布関数を算出したシミュレーション結果について、図１２、及び図１３を用いて説明する。

図１２には、入射光強度に対する復調信号を示す図であり、図１０に対応する図である。図１２では、１次乃至４次の成分と合計成分を示している。なお、変調する入射光強度（レーザ光強度）のレンジを説明するため、図１２の縦方向の点線及び実線に示すように、ある５つの入射光の値をａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅとする。図１２から明らかなように、ｄ、ｅ、ｃ、ｂ、ａの順で入射光強度が大きくなっている。

まず、レーザ光強度の最大がａになるように強度変調した時の点像分布関数は、図１３ａに示すようになる。この場合、入射光強度の変調レンジが０〜ａとなっている。なお、図１３ａは１次成分の点像分布関数を示している。
次に、レーザ光強度の最大値がｂとなるようにした場合に付いて説明する。この場合、入射光強度の変調レンジが０〜ｂとなっている。３次成分の点像分布関数は、図１３のｂに示すようになる。レーザ光スポットの中心位置では、入射光強度が最大ｂとなる。図１２に示すように、レーザ光強度ｂよりも少し小さい入射光強度が３次成分の逆ピークに対応している。よって、レーザ光スポットの中心位置から少し離れると、３次成分の飽和が発生しない。すなわち、スポットから少し離れた位置では、３次成分の飽和が小さくなる。よって、スポット中心の近傍で点像分布関数が極小値を取る。そして、極小値は、図１３ｂに示すようにリング状となる。

次に、入射光強度の最大値がｃになるように強度変調した場合の３次成分の点像分布関数を図１３ｃに示す。同様に、入射光強度の最大値がｄになるように変調した場合の３次成分の点像分布関数を図１３ｄに示す。図１３ｂ〜図１３ｄに示すように、３次の点像分布関数は、変調レンジに応じて変化する。また、逆ピークを含む変調レンジになるようにレーザ光強度を高くすると、３次成分の点像分布関数は、リング状の極小値を持つ。スポット中心からの極小値の位置は、変調レンジと逆ピークの関係に応じて異なっている。このように、入射光強度の変調レンジに応じて、点像分布関数が異なることになる。実際に観察する像は、様々な点像分布関数の合成である。従って、この観点から画像解析を行うことで、より分解能を向上することができる。

次に、入射光強度の最大値がｄになるように強度変調した場合の４次成分の点像分布関数を図１３ｅに示す。この場合、スポット中心で極小値となり、スポット中心の周りにリング状の極大値が存在する。さらに、リンク状の極大値のさらに外側に、リング状の極小値が存在する。よって、実質的に点像分布関数を小さくすることができる。これにより、３次の変調周波数で復調する場合よりも空間分解能を高くすることができる。

次に、上記の信号光の飽和を検出するレーザ顕微鏡の具体的構成例に付いて説明する。図１４は、透明な試料３４を透過した透過光／散乱光と試料３４からの反射光／散乱光を信号光として検出する構成を示す図である。図１４では、繰り返し周波数が８０ＭＨｚのパルスレーザ光源（図１４では、省略）を用いている。ここでは、波長１２００ｎｍの超短パルスレーザ光源を光源として用いている。もちろん、試料に応じてレーザ光源を変えることができる。レーザ光源は、モード同期チタンサファイアレーザ＋ＯＰＯ（光パラメトリック発振器）であり、パルス幅は、例えば、２００ｆｓｅｃである。また、ＢＢＯやＬＢＯ等の非線形光学結晶を試料３４として用いている。なお、図１４では、非コンフォーカル光学系で透過光を検出している。また、図１４に示す構成では、非線形光学損失と、高調波発生の両方で観察を行っている。

そして、レーザ光を変調器３１で強度変調する。変調器３１は例えば、ＡＯＭ（音響光学変調器）であり、単一周波数（例えば、２ＭＨｚ）で強度変調している。変調周波数は、レーザ光のパルスの繰り返し周波数よりも十分低く設定する。変調器３１で変調されたレーザ光は、ビームスプリッタ３２に入射する。ビームスプリッタ３２では、一部の光が透過して、残りの光が検出器３９の方向に反射される。この検出器３９から出力された信号は、参照信号としてロックインアンプ４０に入力される。ビームスプリッタ３２を通過したレーザ光は、レンズ３３で屈折された試料３４に入射する。

試料３４を透過した透過光／散乱光は、対物レンズ３５で屈折される。透過光／散乱光は、ダイクロイックミラー３６を介して、検出器４１に入射する。検出器４１は、例えば、フォトダイオード（ＰＤ）である。レーザ波長λの光を受光する。また、ダイクロイックミラー３６は、レーザ高調波をミラー３７の方向に反射する。従って、レーザ高調波である波長λ／ｎ（ｎは２以上の自然数）の光は、ミラー３７で反射されて、検出器４２に入射する。検出器４２は、例えば、光電子増倍管（ＰＭＴ）又はフォトダイオード（ＰＤ）である。

また、試料３４で反射した反射光／散乱光は、対物レンズであるレンズ３３を介してビームスプリッタ３２に入射する。そして、反射光／散乱光はビームスプリッタ３２でラインフィルタ４３の方向に反射される。ラインフィルタ４３は、例えば、波長λの光を透過させ、波長λ／２以下の光を遮光するフィルタである。これにより、波長差に応じて、信号光を分離することができる。

試料３４において発生する光高調波は、位相整合条件に合致する方向にしか伝播しない。そのため、試料３４の結晶軸と入射偏光方向との角度によっては、光高調波が発生しているにも関わらず、信号をあまり検出できない場合が生じる。（Ｍｏｒｅａｕｘ，ＪＯＳＡ Ｂ，１７（２０００）１６８５）しかしながら、高調波損失を測定する場合、光高調波の伝播方向は、測定結果になんら影響を与えない。入射光の偏光方向は、光高調波の発生効率に寄与するのみであるため、非線形光学損失を測定する顕微鏡では、より試料の形状を忠実に反映する観察像が得られる。このように、非線形光学損失を検出して画像化する場合と、試料から発生する光高調波を検出して画像化する場合とで、画像コントラストの形成メカニズムが大きく異なる。よって、基本波の光を検出することで、非線形光学損失を測定することが可能になる。

検出器３８、検出器３９、検出器４１、及び検出器４１は、受光した光の強度に応じた検出信号をロックインアンプ４０に出力する。そして、これらの検出信号はロックインアンプ４０によって復調される。検出器４１、検出器３８では、レーザ基本波の測定が行われる。すなわち、検出器４１は、レーザ光と同じ波長の散乱光／透過光を検出し、検出器３８は、レーザ光と同じ波長の散乱光／反射光を検出する。検出器４２には、ダイクロイックミラー３６、及びミラー３７を介して、透過光／散乱光が入射している。よって、レーザ光の第２高調波、第３高調波等、すなわち、レーザ波長λのｎ倍（ｎは２以上の整数）の光を検出する。これにより、高調波発生分が検出される。検出器３９は、レーザ光の強度変化を測定する。
どの程度、高次の応答まで確認することができるかは、基本波の強度測定の信号対雑音比で決定される。非線形光学損失の計測では、レーザ光そのものが信号光であるため、非常に多くの光子を信号として利用することができる。このため、検出器のダイナミックレンジ一杯を利用して計測でき、信号対雑音比を非常に高くすることができる。また、非線形光学損失の測定にロックイン検出を利用することも有効である。一般的なフォトダイオードでは、１００ｄＢ程度の検出ダイナミックレンジを有するため、高次の非線形応答も容易に計測することができる。

例えば、波長４００ｎｍレーザ光を用いて、試料の超解像観察を行うと、高次の非線形応答は、レーザ集光点の中心部分のみで生じる。このため、復調周波数を大きくすれば、より高い分解能を得ることができる。さらに、試料３４には、非線形光学結晶に限らず、石英、半導体、金属を用いることができる。試料３４としては、各材料のナノ粒子（直径数１０〜数１００ｎｍ）を用いる。そして、試料３４の表面で生じる非線形光学損失を測定し、画像化する。また、コラーゲン、ミオシン、チューブリン、脂質等の効率よく光高調波を生じる生体分子（Ｃａｍｐａｇｎｏｌａ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１（２００３）１３５６， Ｄｅｂａｒｒｅ，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄ，３（２００６）４７）を用いることも可能である。すなわち、試料３４が、光高調波を効率よく発生する材料であることが好ましい。

金属にレーザ光を照射する場合、金属表面でのプラズモン共鳴を利用することで、反射光を効率よく飽和させることができる。すなわち、プラズモン共鳴によって電場強度が増強するため、非線形の光学反応が効率よく発生する。この場合、金属粒子や金属探針を試料の近傍に配置してもよい。これにより、第２高調波発生、誘導ラマン散乱、コヒーレントアンチストークスラマン散乱を効率よく発生させることができる。金属粒子や金属探針を走査しながら、信号光を検出する場合、空間分解能を改善された近接場顕微鏡像を得ることもできる。

さらに、プラズモン自身も飽和する。この場合、試料である金属自身が、蛍光観察における蛍光色素のようなサンプルプローブとなる。よって、低いレーザ強度で高調波損失が発生する。これにより、効率よく反射光を飽和させることができる。金属をサンプルプローブとして利用する場合、金属粒子を観察対象となる試料に含ませる。すなわち、蛍光標識のように、試料に金属粒子を添加する。また、金属は、蛍光色素と異なり褪色がない。よって、レーザ光強度を上げた場合でも、寿命の問題がなく、長時間利用することができる。金属微細構造のプラズモン共鳴波長を入射することによって、より効率的に飽和が発生する。

実施例．
実際の測定結果を図１４〜図１７に示す。図１４は、金薄膜表面の非線形な反射特性を示す図である。図１４の測定では、レーザ波長を７８０ｎｍとした。図１５は、ＬＢＯ結晶表面の非線形な反射特性を示す図である。図１５の測定では、レーザ波長を７８０ｎｍとした。図１６は、金微粒子からの非線形な散乱特性を示す図である。図１６の測定では、レーザ波長を５２０ｎｍとし、直径５０ｎｍの金微粒子を用いた。図１７は、Ｌ−ＡｌａｎｉｎｅからのＣＡＲＳ光の飽和特性を示す図である。図１７の測定では、ストークス光波長を８２０ｎｍ、ポンプ光を７８５ｎｍとした。また、ストークス光強度を３１００ｋＷ／ｃｍ^２で一定とし、ポンプ光を変調した。

図１４乃至図１７に示すように、入射光強度が弱い領域では、入射光強度と信号光強度が比例するが、入射光強度が強くなると、信号光強度が飽和することが得られた。

その他の実施の形態．
上記の説明では、変調器を用いてレーザ光強度を変化させたが、これ以外の方法によってレーザ光強度を変化させても良い。たとえば、特表２００６／０６１９４７号に示したように、ＮＤフィルタなどのフィルタを用いてレーザ光を減衰させる。フィルタを用いることで、レーザ光強度を段階的に変化させることができる。そして、レーザ光強度が最大となるときに、信号光の飽和が発生するようにする。これにより、同様の効果を得ることができる。例えば、信号光が非線形領域となる第１の強度と、第１の強度と異なる第２の強度の少なくとも２つの強度とで試料に照射されるようレーザ光の強度を変化させる。そして、第１の強度での信号光の強度及び前記第２の強度での信号光の強度に基づいて信号光の飽和成分を算出する。

さらには、各種の信号光をマルチチャンネルで同時に検出するようにしてもよい。すなわち、複数の検出器を設けて、それぞれの検出器で、異なる種類の信号光を検出する。この場合、信号光の種類に起因する波長差に応じて、信号光を分離すれば良い。

さらに、上記の説明では、非線形光学効果により発生する信号光の飽和成分に基づいて、観察を行ったが、非線形光学効果により発生する信号光の非線形な増加成分に基づいて、観察を行っても良い。例えば、過飽和吸収体を試料等とする場合、信号光に非線形な増加が生じる。すなわち、レーザ光と信号光が非線形な関係ではなくならず、レーザ光強度の増加に応じて、信号光が急激に増加する。このような場合、高次の変調周波数で復調することで、信号光の非線形な増加成分を取り出すことができる。これにより同様の効果を得ることができる。また、上記の説明では、レーザ光を出射するレーザ光源を用いたが、レーザ光以外の光を出射する光源を用いてもよい。信号光は、試料での多光子遷移過程により発生する光であればよい。

この出願は、２０１０年２月１０日に出願された日本出願特願２０１０−２７８３８を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。

本発明は、例えば、各種の光を検出して、観察を行う顕微鏡、及び観察方法に好適である。

１０ 光源
１１ 変調器
１２ ダイクロイックミラー
１３ スキャナ
１４ レンズ
１５ レンズ
１６ 対物レンズ
１７ 試料
１９ ダイクロイックフィルタ
２０ レンズ
２１ ピンホール
２２ 検出器
２３ ロックインアンプ
２４ 処理装置
３１ 変調器
３２ ビームスプリッタ
３３ レンズ
３４ 試料
３５ 対物レンズ
３６ ダイクロイックミラー
３７ ミラー
３８ 検出器
３９ 検出器
３０ ロックインアンプ
４１ 検出器
４２ 検出器

上記のように、試料上における空間的な位置に応じて、飽和度合いが異なっている。すなわち、レーザ光のスポット中心位置（ｘ＝ａ）では飽和度合いが大きく、レーザ光のスポット端部（ｘ＝ｂ）では、飽和が発生しない。また、スポット端部とスポット中心の間の位置では、飽和度合いがスポット中心よりも低くなる。従って、各位置での反射光強度をフーリエ変換して変調周波数に対する振幅スペクトルを求めると、図７Ａ〜図７Ｃに示すようになる。
図７Ｃでは、スポット中心（ｘ＝ａ）での振幅スペクトルを示し、図７Ａはスポット端部（ｘ＝ｂ）での振幅スペクトルを示し、図７Ｂはその間における振幅スペクトルを示している。従って、例えば、周波数２ｆ_ｍの信号成分によって観察を行うことで、分解能を向上することができる。もちろん、ｎ次の成分に着目して、観察を行っても良い。変調周波数のｎ倍の周波数で復調することで、高空間分解能での観察が可能になる。

検出器３８、検出器３９、検出器４１、及び検出器４２は、受光した光の強度に応じた検出信号をロックインアンプ４０に出力する。そして、これらの検出信号はロックインアンプ４０によって復調される。検出器４１、検出器３８では、レーザ基本波の測定が行われる。すなわち、検出器４１は、レーザ光と同じ波長の散乱光／透過光を検出し、検出器３８は、レーザ光と同じ波長の散乱光／反射光を検出する。検出器４２には、ダイクロイックミラー３６、及びミラー３７を介して、透過光／散乱光が入射している。よって、レーザ光の第２高調波、第３高調波等、すなわち、レーザ波長λのｎ倍（ｎは２以上の整数）の光を検出する。これにより、高調波発生分が検出される。検出器３９は、レーザ光の強度変化を測定する。
どの程度、高次の応答まで確認することができるかは、基本波の強度測定の信号対雑音比で決定される。非線形光学損失の計測では、レーザ光そのものが信号光であるため、非常に多くの光子を信号として利用することができる。このため、検出器のダイナミックレンジ一杯を利用して計測でき、信号対雑音比を非常に高くすることができる。また、非線形光学損失の測定にロックイン検出を利用することも有効である。一般的なフォトダイオードでは、１００ｄＢ程度の検出ダイナミックレンジを有するため、高次の非線形応答も容易に計測することができる。

Claims (14)

1. 光を出射する少なくとも一つの光源と、
   前記光源からの光を集光して試料に照射するレンズと、
   前記光を前記試料に照射した際に、前記試料での多光子遷移過程により発生する信号光を検出する、少なくとも一つの検出器と、を備え、
   前記光の強度が最大の時に、前記信号光の非線形光学効果により発生する飽和又は非線形な増加が生じることによって光の強度と前記信号光の強度との関係が非線形になる非線形領域となるよう前記光の強度を変化させて試料に照射し、
   前記光の強度に応じた前記信号光を前記検出器で検出し、前記信号光の飽和成分又は非線形な増加成分に基づいて観察を行う顕微鏡。
2. 前記光源からの光と同じ波長の反射光、透過光、及び散乱光の少なくとも一つを前記信号光として、前記検出器が検出し、
   高次の非線形光学効果を含む他の光学効果により光高調波が発生することで、前記信号光が飽和することを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡。
3. 多光子遷移によって発生した散乱光を前記信号光として前記検出器が検出し、
   前記非線形光学効果を含む他の光学効果により光高調波が発生することで、前記信号光が飽和することを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡。
4. 前記検出器がハイパーレイリー散乱、ラマン散乱、誘導ラマン散乱、コヒーレントアンチストークスラマン散乱、四光波混合、誘導放出、高調波発生、差周波発生、及び和周波発生のうちの少なくとも一つを検出し、
   前記検出器で検出される信号光が、前記光源からの光との波長差を利用して、前記光から分離されていることを特徴とする請求項３に記載の顕微鏡。
5. 前記光の強度が時間に応じて変化するよう強度変調する変調器をさらに備え、
   前記光がピークとなる時間において信号光が前記非線形領域となる強度で試料に照射され、
   前記変調器で強度変調しながら、前記光と前記試料の相対位置を変化させるよう走査し、前記試料から出射した信号光を前記検出器で検出し、
   前記検出器で検出された信号光から、前記変調器での変調周波数に対する高調波成分を取り出して観察を行う請求項１乃至４のいずれか１項に記載の顕微鏡。
6. 前記試料からの信号光が、前記変調器で強度変調された光のｎ光子反応（ｎは１以上の自然数）によって生成され、
   前記変調器での変調周波数に対する（ｎ＋１）次以上の高調波成分を取り出して、観察を行うことを特徴とする請求項５に記載の顕微鏡。
7. 前記試料に波長の異なる２つの光が照射され、
   前記２つの光が同じ変調周波数、かつ同じ位相で強度変調され、
   前記試料からの信号光が、強度変調された２つの光のｍ光子反応（ｍは２以上の自然数）によって生成され、
   前記変調周波数に対する（ｍ＋１）次以上の高調波成分を取り出して、観察を行うことを特徴とする請求項１乃至６のいずれか１項に記載の顕微鏡。
8. 前記試料に波長の異なる２つの光が照射され、
   前記２つの光が異なる変調周波数で変調され、
   前記２つの光の変調周波数の和、又は差に応じた周波数で復調していることを特徴とする請求項１乃至６のいずれか１項に記載の顕微鏡。
9. 前記光の強度が時間に応じて変化するよう強度変調され、
   前記光源がパルス光源であり、
   前記パルス光源の繰り返し周波数が、強度変調の変調周波数よりも高くなっている請求項１乃至８のいずれか１項に記載の顕微鏡。
10. 前記信号光が前記非線形領域となる第１の強度と、前記第１の強度と異なる第２の強度の少なくとも２つの強度とで前記試料に照射されるよう前記光の強度を変化させ、
    前記第１の強度での信号光の強度及び前記第２の強度での信号光の強度に基づいて信号光の飽和成分又は非線形な増加成分を算出する請求項１乃至４のいずれか１項に記載の顕微鏡。
11. 波長差に応じて分離された前記信号光を複数の前記検出器で検出することを特徴とする請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の顕微鏡。
12. 光を試料に照射し、前記試料を観察する観察方法であって、
    前記光を集光して、前記試料に照射することで、前記試料での多光子遷移過程による信号光を発生させ、
    前記光の強度が最大の時に、前記試料からの前記信号光が、非線形光学効果により発生する前記信号光の飽和又は非線形な増加によって光の強度と信号光の強度との関係が非線形になる非線形領域となるよう、前記光の強度を変化させて、
    前記試料からの信号光を検出し、
    前記検出された信号光の飽和成分又は非線形な増加成分に基づいて観察を行う観察方法。
13. 前記試料の近傍に金属探針を配置した状態、又は前記試料に金属粒子を添加した状態で、前記光を試料に照射することを特徴とする請求項１２に記載の観察方法。
14. 前記試料の近傍に配置された金属探針を走査しながら、前記光を試料に照射して、前記信号光を検出することを特徴とする請求項１３に記載の観察方法。