JP2022518161A - ２色共焦点共局在化顕微鏡法 - Google Patents

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Abstract

本明細書で開示されるのは、サンプルの２色共焦点共局在化顕微鏡法のための方法および装置である。サンプルは共焦点画像マーカーおよび誘導放出抑制（ＳＴＥＤ）画像マーカーによりラベル付けされる。方法は、第１波長λ１を有する第１共焦点励起パルスおよび第１波長とは異なる第２波長λ２を有する第２共焦点励起パルスを生成することと、第１共焦点励起パルスおよび第２共焦点励起パルスを共焦点へ集光することと、第１波長を有するＳＴＥＤ励起パルスおよび第２波長を有するＳＴＥＤ抑制パルスを生成することと、ＳＴＥＤ励起パルスおよびＳＴＥＤ抑制パルスをＳＴＥＤ焦点へ集光することと、サンプルから放射されるＳＴＥＤ画像マーカーの発光波長λｂの光、および、共焦点画像マーカーの発光波長λａの光を検出することと、を含む。第１波長での（ｎ≧１である）ｎ光子励起はＳＴＥＤ画像マーカーの励起遷移と共鳴し、第２波長はＳＴＥＤ画像マーカーの抑制遷移と共鳴し、第１波長を有する光子および第２波長を有する光子を伴う２光子励起は、共焦点画像マーカーの励起遷移と共鳴する。

Description

本発明は物理学および生物学の分野に属する。特に、本発明はサンプルの２色共焦点共局在化顕微鏡法のための方法および装置に関する。
光学顕微鏡法は、顕微鏡スケールでサンプルの空間的構造を判定するための、特に細胞のような生体サンプル用の多目的なツールである。サンプルの特定の構成要素、例えば特定タンパク質または他の生体分子を蛍光性分子のような画像マーカー（imaging marker）でラベル付けすることで、サンプルの機能に関する知見をさらに提供しうる。サンプルの異なる構成要素を個別に撮像することができるように異なる波長の光を吸収する、および／または放射する２種類の画像マーカーを使うことで、異なる構成要素を区別することができる。異なる構成要素の相対的位置は共局在化顕微鏡法により判定することができて、２つの波長で別々の画像が撮影されて、後で重ね合わせられる。
正確に重ね合わせるのは、例えば色収差のために困難であることがある。これは特に共焦点画像化法に当てはまり、共焦点画像化法では集光された光線のサンプル全体への走査を頼りにしており、異なる焦点での複数の測定値から画像を正しく再構成可能とするためには光線を正確に調整することが必要となる。調整を容易にするため、両方の波長で撮像可能な参照マーカーが例えば調整目標に対して使用される、またはサンプルへ参照マーカーが差し込まれて使用されることがある。あるいは、２光子プロセスが画像マーカーを励起するのに使用されることがあり、同じ波長の光が両方の種類の画像マーカーを励起するのに関与する（”P.Mahou et al., Nature Methods 9,815(2012)”を参照）。
従来の共焦点顕微鏡の空間分解能は光線の焦点サイズにより決定され、したがって回折限界により制限されることがある。回折限界を下回る分解能は、誘導放出抑制（ＳＴＥＤ）顕微鏡法のような超解像技術を用いて実現しうる（例えば、”S.W.Hell, Science 316,1153(2007)”を参照）。ＳＴＥＤは、誘導放出を用いて励起状態を急速に減少させることで画像マーカーの自発的な蛍光を局所的に抑制することを頼りにしている。このため、励起レーザー光に抑制光（depletion beam）が重ね合わせられ、この抑制光によって画像マーカーを誘導放出で励起状態から基底状態へ移動させることができる。抑制光の強度分布は、小さな撮像領域の外にある画像マーカーを抑制光により効果的に消すことができるように変更される。ＳＴＥＤ顕微鏡はパルスレーザーを用いて実現することができて（例えば、”T.A.Klar et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97,8206(2000)”を参照）、２光子励起方式と併用することができる（”G.Moneron and S.W.Hell, Optics Express 17,14567 (2009)”および”P.Bianchini et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.109,6390(2012)”を参照）。
これにより、例えば、第１種類の画像マーカーのＳＴＥＤ画像化と第２種類の画像マーカーの従来の共焦点画像化を併用することで、共局在化顕微鏡法の分解能を改善することができる。しかし、ＳＴＥＤの利用は、追加で必要となる抑制光のために、画像を重ね合わせることをさらに困難にすることがある。 国際公開第２００８／０４０５９０Ａ１号明細書は２色ＳＴＥＤ顕微鏡法の方法を開示しており、サンプルは類似の吸収スペクトルと類似の放出スペクトルのいずれかを有する２つの画像マーカーを用いてラベル付けされる。米国特許出願公開第２０１７／００８２５４６Ａ１号明細書は超解像顕微鏡法の方法を開示しており、励起光の強度は音響光学変調器を使って時間的に周期的に変調され、励起光は一定の強度の抑制光と空間的に重ね合わせられる。
したがって、本発明の目的は、サンプルの２色共焦点共局在化顕微鏡法で調整および画像再構成を簡略化する方法および装置を提供して、撮像の分解能を改善することである。
この目的は、請求項１に係る方法および請求項１３に係る装置により達成される。本発明の実施形態は、従属請求項で詳述される。
サンプルの２色共焦点共局在化顕微鏡法のための本発明の方法は、（１）第１波長を有する第１共焦点励起パルスおよび第１波長λ１とは異なる第２波長λ２を有する第２共焦点励起パルスを生成するステップと、（２）第１共焦点励起パルスおよび第２共焦点励起パルスを共焦点へ集光するステップと、（３）第１波長を有する誘導放出抑制（ＳＴＥＤ）励起パルスおよび第２波長を有するＳＴＥＤ抑制パルスを生成するステップと、（４）ＳＴＥＤ励起パルスおよびＳＴＥＤ抑制パルスをＳＴＥＤ焦点へ集光するステップと、を含む。第１波長での（ｎ≧１である）ｎ光子励起はＳＴＥＤ画像マーカーの励起遷移と共鳴し、第２波長はＳＴＥＤ画像マーカーの抑制遷移と共鳴する。さらに、第１波長を有する光子および第２波長を有する光子を伴う２光子励起は、共焦点画像マーカーの励起遷移と共鳴する。上記のステップの番号付けは明確化のために過ぎず、特定の実行順序を示すものではない。技術的に可能である限り、ステップの順番を変えることができて、方法およびその任意の実施形態は任意の順序でこれらのステップを行うことができる。特に、複数のステップを少なくとも部分的に同時に行ってもよい。
パルスは１つまたは複数の光源、好ましくはレーザーのようなコヒーレントな光源から生成することができる。一例では、第１共焦点励起パルスおよびＳＴＥＤ励起パルスを第１光源から生成することができて、第２共焦点励起パルスおよびＳＴＥＤ抑制パルスを第２光源から生成することができる。各パルスは、例えばピコ秒やフェムト秒のレーザー光源であるパルスレーザー光源から生成することができる、または、例えば連続波レーザー光源の出力を音響光学変調器、電気光学変調器、機械式シャッター、またはこれらの組み合わせを用いて変調することで連続波レーザー光源から生成することができる。各パルスは例えば１０ｆｓ～１０ｎｓの範囲のパルス幅を持つことができて、パルス幅は各パルスで異なることがある。パルスのパルス幅は、パルスの空間平均強度、すなわち、パルスの伝搬方向と垂直な平面上で平均化した強度がパルスの空間平均強度の最大値の１／ｅ２以上である時間と定義される。パルス幅は、例えばサンプルをラベル付けするのに使用される、例えば吸収断面積、励起状態の存続期間、および／または振動緩和の時間尺度に適合された画像マーカーの特性に基づいて選択することができる。第１共焦点励起パルスおよびＳＴＥＤ励起パルスは、第１波長λ１に対応する中心波長を有する。第２共焦点励起パルスおよびＳＴＥＤ抑制パルスは、第１波長とは異なる第２波長λ２に対応する中心波長を有する。第１波長および第２波長は、例えば４００ｎｍ～２２００ｎｍとすることができる。パルスのスペクトル幅は、それぞれのパルス幅によってフーリエ限界状態になりうる、またはフーリエ限界より大きいことがある。
第１共焦点励起パルスおよび第２共焦点励起パルスは、例えばパルスが通過する対物レンズにより、共焦点とも表される共通の焦点へ集光される。同様に、ＳＴＥＤ励起パルスおよびＳＴＥＤ抑制パルスは、ＳＴＥＤ焦点とも表される共通の焦点へ集光される。パルスの焦点は、伝搬方向と垂直な平面内のパルスの強度分布の広がりが極小となる点と定義され、広がりは、例えば各平面内の強度分布の二次モーメントにより数値化されうる。共焦点およびＳＴＥＤ焦点の位置は同一でありうる、または異なることがある。好ましくは、各焦点における対応する強度分布のウエストがそれぞれ波長λ１、λ２より小さくなるようにパルスは強く集光される。強度分布のウエストは、強度が強度分布の最大値の１／ｅ２となる、方位角方向に平均化された最大半径方向距離と定義され、半径方向は各パルスの伝搬方向と垂直である。
サンプルは、２種類の画像マーカー、すなわち共焦点画像マーカーとＳＴＥＤ画像マーカーを含みうる。画像マーカーは、例えば蛍光タンパク質や窒素－空孔中心のようなフルオロフォア（蛍光色素分子）とすることができて、複数の内部状態、例えば電子基底状態マニホールドや電子励起状態マニホールドを持つことがある。共焦点画像マーカーとＳＴＥＤ画像マーカーは異なるエネルギースペクトルを持ち、それに応じて異なる光学特性を示す。
第１波長は、第１波長での（ｎ≧１である）ｎ光子励起がＳＴＥＤ画像マーカーの励起遷移と共鳴するように選択される。ＳＴＥＤ画像マーカーの励起遷移は、ＳＴＥＤ画像マーカーの２つの内部状態の間の光学的励起遷移、例えば電子基底状態マニホールド内の状態とＳＴＥＤ画像マーカーの電子励起状態マニホールド内の状態の間の遷移である。それに応じて、ＳＴＥＤ励起パルスは、ｎ光子を同時に吸収することでサンプル内のＳＴＥＤ画像マーカーを励起しうる。好ましくは、励起遷移は電子基底状態マニホールドの振動基底状態と電子励起状態マニホールドの振動励起状態を結合する。
第２波長は、ＳＴＥＤ画像マーカーの抑制遷移と共鳴するように選択される。ＳＴＥＤ画像マーカーの抑制遷移は、ＳＴＥＤ画像マーカーの２つの内部状態の間の光学的励起遷移、例えばＳＴＥＤ画像マーカーの電子励起状態マニホールド内の状態と電子基底状態マニホールド内の状態の間の遷移である。それに応じて、ＳＴＥＤ抑制パルスは、誘導放出によりサンプル内の励起されたＳＴＥＤ画像マーカーを脱励起しうる。こうしてＳＴＥＤ顕微鏡法を行うことができて、ＳＴＥＤ焦点の付近にあるＳＴＥＤ画像マーカーがＳＴＥＤ励起パルスを用いて励起され、その後に小さな撮像領域の外にある励起されたＳＴＥＤ画像マーカーがＳＴＥＤ抑制パルスにより基底状態へ移動される。それゆえ、励起されたＳＴＥＤ画像マーカーの自然放出による蛍光信号は、主に撮像領域から生じうる。好ましくは、抑制遷移は電子励起状態マニホールドの振動基底状態を電子基底状態マニホールドの振動励起状態へ結合する。
共焦点画像マーカー、ＳＴＥＤ画像マーカー、第１波長、および／または第２波長は、第１波長を有する光子および第２波長を有する光子を伴う２光子励起が共焦点画像マーカーの励起遷移と共鳴するように選択される。共焦点画像マーカーの励起遷移は、共焦点画像マーカーの２つの内部状態の間の光学的励起遷移、例えば共焦点画像マーカーの電子基底状態マニホールド内の状態と電子励起状態マニホールド内の状態の間の遷移である。それに応じて、サンプル内の共焦点画像マーカーは、第１共焦点励起パルスおよび第２共焦点励起パルスからの光子が同時に吸収されることで励起されうる。好ましくは、励起遷移は電子基底状態マニホールドの振動基底状態と電子励起状態マニホールドの振動励起状態を結合する。
この波長の組み合わせを用いて、この方法を、例えばＳＴＥＤ画像マーカーのＳＴＥＤ画像化および共焦点画像マーカーの従来の共焦点画像化により、各波長の光がＳＴＥＤ画像マーカーと共焦点画像マーカーの両方の画像化に関与するようにサンプルの２色共焦点共局在化顕微鏡法を実行するのに用いることができる。これにより、色収差および異なる波長のパルス用の光路の不適切な調整の影響を弱めることで、画像の重ね合わせを改善することができる。異なる種類の画像マーカーを撮像するために異なる波長を使って共焦点共局在化顕微鏡法を実行する場合、各焦点の位置は、例えば色収差や不適切な調整のために異なっていることがあり、それに応じて、正確にはわからないことがある。このため、ＳＴＥＤ画像化および共焦点画像化により得られる画像の再構成および画像の重ね合わせが困難になりうる。前述した方法を用いて、同じ光源および同じ波長を共焦点画像マーカーおよびＳＴＥＤ画像マーカーの撮像に使用することができる。これにより、各焦点の正確な位置決めが可能となり、したがって対応する画像の再構成および重ね合わせを簡略化することができる。さらに、顕微鏡の設定および顕微鏡の調整は、撮像に関与する３つの遷移に対処するのに２つの波長のみが使用されるため、簡略化することができる。
第１共焦点励起パルスおよびＳＴＥＤ励起パルスは、例えば同じ光源から両方のパルスを生成することで、または異なる光源からパルスを生成した後にパルスを空間的に重ね合わせることで、第１光路に沿って伝搬しうる。それに応じて、第２共焦点励起パルスおよびＳＴＥＤ抑制パルスは第２光路に沿って伝搬しうる。第１光路および第２光路は、両方の光路に沿って伝搬するコリメート光が同じ焦点へ集光されるように、光学素子により空間的に重ね合わせることができる。これは、例えば第１光路と第２光路を、ダイクロイックミラーやビームスプリッタなどを使って主光路とも呼ばれる同じ光路に重ね合わせることで実現することができる。他の例では、第１光路および第２光路は焦点においてのみ空間的に重ね合わせることができる、つまり、第１光路および第２光路は焦点においてある角度で交わることがある。この場合、調整可能に取り付けられたミラーのような調整可能な光学素子を、２つの光路を重ね合わせるのに使用することができる。
好ましい実施形態では、方法は、位相パターンおよび／または強度パターンをＳＴＥＤ抑制パルスへ刷り込む（imprinting）ことをさらに含む。位相パターンおよび／または強度パターンは、ＳＴＥＤ抑制パルスの伝搬方向と垂直な、ＳＴＥＤ焦点を含む平面であるＳＴＥＤ焦点面内のＳＴＥＤ抑制パルスの強度分布がＳＴＥＤ焦点で極小値を示すように選択することができる。位相パターンを刷り込むことはＳＴＥＤ抑制パルスの電界の位相を位相シフトφ（ｘ，ｙ）により局所的に変更することを指し、ＳＴＥＤ抑制パルスの伝搬方向と垂直な、所与の位置（ｘ，ｙ）における位相シフトφは位相パターンにより決定される。それに対応して、強度パターンを刷り込むことはＳＴＥＤ抑制パルスの強度を倍率α（ｘ，ｙ）により局所的に変更することを指し、ＳＴＥＤ抑制パルスの伝搬方向と垂直な、所与の位置（ｘ，ｙ）における倍率αは強度パターンにより決定される。一例では、ＳＴＥＤ抑制パルスは当初は一様な位相分布を示すことがあり、ガウス分布またはフラットトップの（均一な）強度プロファイルおよび渦状位相パターンがＳＴＥＤ抑制パルスへ刷り込まれることがある。渦状位相パターンは、方位角方向に０～２πで線形に増える位相を有する位相パターンである。別の例では、中心で極小となる強度分布をＳＴＥＤ抑制パルスへ刷り込み、ＳＴＥＤ焦点上で撮像することができる。位相パターンは、例えば空間的に変動する厚さ、および／または、空間的に変動する屈折率を有する平板のような静的位相マスクや光路長の空間分布を調整することで位相パターンを調整するよう構成されている液晶空間光変調器のような適応式位相マスクなどの、空間的に変動する光路長を有する反射型位相マスクまたは透過型位相マスクを用いて、ＳＴＥＤ抑制パルスに刷り込むことができる。強度パターンは、例えばデジタルマイクロミラーデバイスのような強度変調器、空間的に変動する反射率または透過率を有する反射型位相マスクもしくは透過型位相マスク、または、空間的に変動する電界を用いる電気光学変調器、および／もしくは、空間的に変動する電気光学特性を有する電気光学変調器を用いて、ＳＴＥＤ抑制パルスに刷り込むことができる。
方法は、位相パターンを刷り込む前に位相パターンをＳＴＥＤ抑制パルスの位相分布、特にＳＴＥＤ抑制パルスの初期位相分布に適合させること、および／または、強度パターンを刷り込む前に強度パターンをＳＴＥＤ抑制パルスの強度分布、特にＳＴＥＤ抑制パルスの初期強度分布に適合させること、をさらに含みうる。これは、例えば、ＳＴＥＤ抑制パルスの波面収差または強度の変動を補正することを可能としうる。位相パターンおよび／または強度パターンは、特にＳＴＥＤ焦点におけるＳＴＥＤ抑制パルスの強度が弱められる、および／または、ＳＴＥＤ焦点における最小の強度の幅が縮小されるように、調整することができる。液晶空間変調器のような適応式位相マスク、またはデジタルマイクロミラーデバイスのような調整可能な強度変調器を使用する場合、この方法は、例えば前述の基準を使って各変調器の個々の要素、例えば画素を最適化することを含みうる。
好ましい実施形態では、ＳＴＥＤ焦点におけるＳＴＥＤ抑制パルスの強度は、ＳＴＥＤ焦点面内のＳＴＥＤ抑制パルスの強度分布の最大値の１％未満であり、好ましくは０．１％未満である。これにより、ＳＴＥＤ焦点における抑制確率を減少させながらＳＴＥＤ焦点の周囲の中心領域の外にある励起されたＳＴＥＤ画像マーカーを効果的に抑制して、例えば中心領域からの信号を増大させることができる。ＳＴＥＤ抑制パルスの強度はＳＴＥＤ焦点から離れる場合は大きく増えてもよく、例えばあらゆる半径方向において５０倍より大きく、好ましくは５００倍より大きく、増えてもよい。強度がＳＴＥＤ抑制パルスの強度分布の最大値の１％未満である、ＳＴＥＤ焦点の周りの領域の大きさは、少なくとも一方向で、好ましくはあらゆる半径方向において、第２波長の２０％未満とすることができる。
共焦点面、すなわち共焦点を含む第２共焦点励起パルスの伝搬方向と垂直な平面内の第２共焦点励起パルスの強度分布は、共焦点において極大値、好ましくは最大値を示しうる。これは、共焦点の付近にある共焦点画像マーカーの励起確率を増大させるのに有利となりうる。共焦点面内の第２共焦点励起パルスの強度分布は、例えばガウス分布形状、またはエアリーパターンを有してよい。これは、例えば第２共焦点励起パルスに適切な位相パターンおよび／または強度パターンを刷り込むことで実現することができる。一例では、刷り込まれる位相パターンは、第２共焦点励起パルスが集光される前に空間的に一様な位相分布を示すように選択することができる。別の例では、刷り込まれる強度パターンは、第２共焦点励起パルスが集光される前にガウス分布またはフラットトップの空間強度プロファイルを示すように選択することができる。
ＳＴＥＤ抑制パルスのパルス幅ｔＳＴＥＤは、第２共焦点励起パルスのパルス幅ｔｃｏｎｆより大きくてもよい。一例では、ｔｃｏｎｆは１ｐｓ～１００ｐｓ、ｔＳＴＥＤは１００ｐｓ～１０ｎｓとすることができる。さらに、ＳＴＥＤ抑制パルスのパルスエネルギーは、第２共焦点励起パルスのパルスエネルギーより大きくもよい。ＳＴＥＤ抑制パルスの空間平均強度は、第２共焦点励起パルスの空間平均強度と等しくてもよい。他の例では、ＳＴＥＤ抑制パルスの空間平均強度は、第２共焦点励起パルスの空間平均強度より小さくすることができる。
共焦点における第１共焦点励起パルスと第２共焦点励起パルスの間の遅延時間Δｔｃｏｎｆは、第１共焦点励起パルスおよび／または第２共焦点励起パルスのパルス幅の２５％未満とすることができて、好ましくは１０％未満とすることができる。２つのパルスの間の遅延時間は、２つのパルスの対応する点、例えばパルスの空間平均強度が最大である時点、またはパルスの空間平均強度が最大空間平均強度の特定の割合である最初または最後の時点、の間の到達時間の差分と定義される。一例では、遅延時間Δｔｃｏｎｆは１００ｆｓ未満とすることができて、第１共焦点励起パルスのパルス幅は１００ｆｓ～１０ｐｓとすることができて、ｔｃｏｎｆは１ｐｓ～１００ｐｓとすることができる。
ＳＴＥＤ焦点におけるＳＴＥＤ励起パルスとＳＴＥＤ抑制パルスの間の遅延時間ΔｔＳＴＥＤは、例えばＳＴＥＤ励起パルスがＳＴＥＤ焦点を通過する際、または通過した後にＳＴＥＤ抑制パルスがＳＴＥＤ焦点に到達するように、ＳＴＥＤ励起パルスのパルス幅以上であってもよい。好ましくは、遅延時間ΔｔＳＴＥＤはＳＴＥＤ励起パルスのパルス幅の２倍より小さい。一例では、ＳＴＥＤ励起パルスのパルス幅は１００ｆｓ～１０ｐｓであり、ΔｔＳＴＥＤはＳＴＥＤ励起パルスのパルス幅の１００％～１５０％である。
方法は、サンプルの第１構成要素を共焦点画像マーカーでラベル付けすることと、サンプルの第２構成要素をＳＴＥＤ画像マーカーでラベル付けすることとをさらに含みうる。一例では、サンプルは生体細胞を含む生体サンプルとすることができて、第１構成要素は第１種類のタンパク質、例えば細胞の膜内に配置される特定のタンパク質とすることができて、第２構成要素は第２種類のタンパク質、例えば特定の抗体とすることができる。別の例では、第１構成要素は細胞の特定の部分、例えば核とすることができて、第２構成要素は細胞の異なる部分、例えば細胞膜とすることができる。ラベル付けは、例えば核酸マーカーや抗体マーカーなどの各構成要素に特異的に結合するように構成されている画像マーカーを使うことで、または蛍光タンパク質の発現により、行うことができる。
一実施形態では、第１波長は、第１波長での２光子励起（つまりｎ＝２）がＳＴＥＤ画像マーカーの励起遷移と共鳴するように選択することができる。２光子励起を利用することは、励起確率のＳＴＥＤ励起パルスの強度への非線形な依存のためにＳＴＥＤ画像マーカーがＳＴＥＤ励起パルスにより励起される範囲を減少させるのに有利となりうる。
好ましい実施形態では、方法は、サンプルから放射されるＳＴＥＤ画像マーカーの発光波長λｂの光、および／または、共焦点画像マーカーの発光波長λａの光を検出することをさらに含む。これには、サンプルから放射される各発光波長の光の強度を、例えばフォトダイオードで測定することを特に含みうる。画像マーカーの発光波長は、画像マーカーが自然放出により緩和遷移を受ける際に放出される光子の波長であり、画像マーカーの緩和遷移は画像マーカーの２つの内部状態の間の光学的励起遷移、例えば画像マーカーの電子励起状態マニホールド内の状態と電子基底状態マニホールド内の状態との間の遷移である。画像マーカーが、例えば電子励起状態マニホールドの状態と電子基底状態マニホールドの状態の間で、複数の緩和遷移を受けられる場合、発光波長は各放出スペクトルのピークに対応する波長であり、検出は発光波長の周囲の波長範囲に対して行われうる。一例では、ＳＴＥＤ画像マーカーの発光波長および／または共焦点画像マーカーの発光波長の周囲の５ｎｍ～５０ｎｍの範囲内の光を検出することができる。好ましくは、サンプルから放射される光は、例えば第１波長および／または第２波長の光を除去するために、検出の前にスペクトル的にフィルターされる。検出は、例えば各パルスを生成後の所定の時間間隔にわたって、特に第１共焦点励起パルスおよび第２共焦点励起パルス、ならびに／または、ＳＴＥＤ励起パルスおよびＳＴＥＤ抑制パルスに対して行われうる。一例では、サンプルにより放射される光の積分強度は、各パルスを生成後の１ｎｓ～１００μｓの期間にわたって判定することができる。
方法は、サンプル全体にわたって共焦点を走査して共焦点画像マーカーの空間分布を特徴付ける共焦点画像を取得することと、サンプル全体にわたってＳＴＥＤ焦点を走査してＳＴＥＤ画像マーカーの空間分布を特徴付けるＳＴＥＤ画像を取得することと、をさらに含みうる。走査は、例えば共焦点の位置および／またはＳＴＥＤ焦点の位置を変えることで行うことができる。さらに、またはあるいは、サンプルの位置は共焦点および／またはＳＴＥＤ焦点に対して変更しうる。共焦点および／またはＳＴＥＤ焦点は、例えばサンプル上の着目する所定の１次元または２次元領域全体にわたって、矩形格子などの格子上で走査されうる。好ましくは、共焦点励起パルスのペアおよび／またはＳＴＥＤパルスのペアが生成され、格子の各点へと集光される。サンプルから放射される強度をパルスの各ペアに対して測定することができて、強度は、それぞれ焦点の付近にある共焦点画像マーカーおよびＳＴＥＤ画像マーカーの密度に依存しうる。測定された強度をサンプル上の焦点の位置に関連付けて、例えば焦点の位置の関数として測定された強度を含むように共焦点画像およびＳＴＥＤ画像を形成することができる。
好ましい実施形態では、方法は、共焦点画像とＳＴＥＤ画像を結合して共局在画像を形成することを含み、共局在画像は共焦点画像マーカーの空間分布およびＳＴＥＤ画像マーカーの空間分布の情報を含む。一例では、共焦点およびＳＴＥＤ焦点は同じ格子の全体にわたって走査することができて、共局在画像は、サンプル上の焦点の各位置での共焦点パルスに対して測定された強度、およびＳＴＥＤパルスに対して測定された強度を含みうる。他の例では、異なる格子および／または着目する領域を共焦点パルスおよびＳＴＥＤパルスに対して使用することができて、例えば、ＳＴＥＤパルスに対してより小さな着目する領域およびより微細な間隔の格子、共焦点パルスに対してより大きな着目する領域およびより粗い間隔の格子を使用することができる。
本発明はサンプルの２色共焦点共局在化顕微鏡法のための装置も提供する。この装置は、第１共焦点励起パルスおよび第１波長λ１を有する誘導放出抑制（ＳＴＥＤ）励起パルスを生成するように構成されている第１光源を含む。この装置は、第２共焦点励起パルスおよび第１波長とは異なる第２波長λ２を有するＳＴＥＤ抑制パルスを生成するように構成されている第２光源をさらに含む。好ましくは、いずれの光源もレーザーのようなコヒーレント光源である。光源のそれぞれは、例えばピコ秒レーザー光源やフェムト秒レーザー光源などのパルスレーザー光源とすることができる。光源は、例えばモード同期レーザー光源、Ｑ－スイッチレーザー光源、または利得スイッチ駆動レーザー光源とすることができる。あるいは、光源のそれぞれは、連続波レーザー光源と、連続波レーザー光源により放射されるレーザー光を変調して各パルスを生成するように構成されているパルス整形部とを含みうる。パルス整形部は、例えば機械式シャッター、音響光学変調器、電気光学変調器、またはこれらの組み合わせを含みうる。光源のそれぞれは、各パルスのパルス幅、パルスエネルギー、および／または放射時間を調整するように構成されうる。光源のそれぞれはさらに、トリガー信号、例えば電気トリガー信号を受信してトリガー信号に対してパルスを生成するように構成されうる。
また、装置は、第２共焦点励起パルスへ共焦点位相パターンおよび／または共焦点強度パターンを選択的に刷り込み、ＳＴＥＤ抑制パルスへＳＴＥＤ位相パターンおよび／またはＳＴＥＤ強度パターンを選択的に刷り込むように構成されているビームシェイパーも含む。ビームシェイパーは特に、第２共焦点励起パルスが焦点へ集光される場合に第２共焦点励起パルスの強度分布が焦点において極大値を示し、ＳＴＥＤ抑制パルスが焦点へ集光される場合にＳＴＥＤ抑制パルスの強度分布が焦点において極小値を示すように、各パターンを刷り込むよう構成される。一例では、ビームシェイパーは、トリガー信号を受信すると共焦点用構成とＳＴＥＤ用構成の間で切り替えを行うよう構成することができる。好ましくは、ビームシェイパーは、共焦点位相パターン、共焦点強度パターン、ＳＴＥＤ位相パターン、および／またはＳＴＥＤ強度パターンを調整するように構成されている適応式ビームシェイパーである。
ビームシェイパーは、位相パターンを刷り込むよう構成されている空間的に変動する光路長を持つ反射型または透過型の位相マスク、例えば空間的に変動する厚さ、および／または、空間的に変動する屈折率を持つ平板のような静的位相マスクを含みうる。ビームシェイパーは、位相マスクを第２共焦点励起パルスおよびＳＴＥＤ抑制パルスの光路の中に入れたり外へ出したりするように構成されて、例えばＳＴＥＤ位相パターンを光路内の位相マスクに刷り込み、共焦点位相パターンを光路から除去された位相マスクに刷り込むことができる。好ましくは、ビームシェイパーは適応式位相マスク、例えば光路長の空間分布を調整することで位相パターンを調整するように構成されている反射型または透過型の液晶空間光変調器を含む。適応式位相マスクは、第２共焦点励起パルスおよびＳＴＥＤ抑制パルスの光路内に置くことができる。ビームシェイパーは、例えば刷り込まれる位相パターンを受信した場合、または２つ以上の所定の位相パターンの間で切り替えを行うためのトリガー信号を受信すると、適応式位相マスクを動的に調整するように構成されうる。
あるいは、またはさらに、ビームシェイパーは、強度パターンを刷り込むように構成されている強度変調器、例えば刷り込まれる強度パターンを調整するように構成されているデジタルマイクロミラーデバイスのような調整可能な強度変調器を含みうる。別の例では、強度変調器は、偏光子と、空間的に変動する電界を用いる電気光学変調器、および／もしくは、空間的に変動する電気光学特性を有する電気光学変調器、または、空間的に変動する透過率もしくは反射率を有する減衰マスクを含みうる。
好ましい実施形態では、焦点におけるＳＴＥＤ抑制パルスの強度は焦点面内のＳＴＥＤ抑制パルスの強度分布の最大値の１％未満であり、好ましくは０．１％未満である。ＳＴＥＤ抑制パルスの強度はＳＴＥＤ焦点から離れる場合は大きく増えることがあり、例えばあらゆる半径方向において５０倍より大きく、好ましくは５００倍より大きく、増えることがある。強度がＳＴＥＤ抑制パルスの強度分布の最大値の１％未満である、ＳＴＥＤ焦点の周りの領域の大きさは、少なくとも一方向で、好ましくはあらゆる半径方向において、第２波長の２０％未満とすることができる。
第１光源および／または第２光源は、それぞれ第１波長、第２波長を調整するように構成されうる。一例では、第１光源は第１波長を１００ｎｍ～４００ｎｍだけ調整して、例えば７００ｎｍ～９００ｎｍの間となるように構成されうるチタンサファイアレーザーである。第２光源は第１波長および第２波長を１０ｎｍ～１００ｎｍだけ調整して、例えば６６０ｎｍ～６８０ｎｍの間となるように構成されうる波長可変ダイオードレーザーとすることができる。
好ましい実施形態では、第２光源は第２共焦点励起パルスのパルス幅ｔｃｏｎｆ、および／または、ＳＴＥＤ抑制パルスのパルス幅ｔＳＴＥＤを調整するよう構成されうる。第２光源は、例えばレーザーダイオードへの注入電流を調整して複数のパルスを生成するように構成されている利得スイッチ駆動ダイオードレーザーとすることができる。あるいは、第２光源は、例えば調整可能な減衰器を用いた可変Ｑ値の共振器を有するＱ－スイッチレーザーとすることができる。一例では、第２光源は、１０ｐｓ～１ｎｓのパルス幅、ｔｃｏｎｆおよびｔＳＴＥＤを調整するように構成することができる。
装置は、第１共焦点励起パルスと第２共焦点励起パルスの間の遅延時間Δｔｃｏｎｆ、および／または、ＳＴＥＤ励起パルスとＳＴＥＤ抑制パルスの間の遅延時間ΔｔＳＴＥＤを調整するように構成されている時間遅延部を含みうる。時間遅延部は、ハードウェア、ソフトウェア、またはそれらの組み合わせを使って実現することができる。一例では、時間遅延部は、可変遅延時間だけ離れた２つの電気トリガー信号を生成して、これらのトリガー信号をそれぞれ第１光源、第２光源へ送信するように構成されている電子回路とすることができる。あるいは、時間遅延部は、第１トリガー信号を例えば第１光源から受信して、例えば第２光源へ送信するために、第１トリガー信号を可変遅延時間だけ遅延させることで遅延されたトリガー信号を生成するように構成されうる。時間遅延部は、アナログ信号もしくはデジタル信号、またはソフトウェアによるユーザ入力を受信して、遅延時間Δｔｃｏｎｆおよび／または遅延時間ΔｔＳＴＥＤを設定するように構成されうる。
また、装置は、第１光源および／または第２光源により放射されたレーザーパルスを集光するための対物レンズも含みうる。好ましくは、対物レンズは、０．５より大きい開口数を有する高ＮＡ対物レンズ、特に液浸対物レンズである。対物レンズの光軸は、例えば主光路と一直線にすることができる。一部の例では、装置は、例えば検出のためにサンプルにより放射された光を集めるための、第２対物レンズを含みうる。
好ましい実施形態では、装置は、例えばサンプル全体にわたって共焦点および／またはＳＴＥＤ焦点を走査するために、第１光源および／または第２光源により放射されたパルスの伝搬方向を調整するように構成されているビーム走査装置を含む。ビーム走査装置は、例えば対物レンズの光軸に対する主光路の角度および／または主光路の横方向変位を調整するように構成されうる。好ましくは、ビーム走査装置は、２つの軸に沿って焦点を移動させるよう構成される。ビーム走査装置は、例えばガルバノスキャナ、圧電駆動の架台、またはデジタルマイクロミラーデバイスに取り付けられるミラーなどの可動式ミラーを含みうる。他の例では、ビーム走査装置は音響光学偏向器および／または電気光学変調器を含みうる。あるいは、またはさらに、装置はサンプルの位置を調整するように構成されているサンプル走査装置、例えば１軸、２軸、または３軸の移動ステージを含みうる。
装置は、サンプルから放射される発光波長の光を検出するためにさらに光検出器、例えばフォトダイオードや、ＣＣＤカメラまたはＣＭＯＳカメラのような拡張検出器などの点状検出器を含みうる。光検出器は、特に入射された光の強度を測定して、測定された強度を特徴付ける画像信号、例えば電圧や電流のようなデジタル信号またはアナログ信号を生成するよう構成されうる。また、装置は、光検出器に到達する光をスペクトル的にフィルターするように構成されているフィルター要素も含みうる。フィルター要素は、例えば、第１波長および／または第２波長の光を反射、または吸収するよう構成されうる。
好ましい実施形態では、装置は光検出器から画像信号を取得するように構成されている画像分析部を含む。画像分析部は、特に共焦点に関連付けられる共焦点画像信号とＳＴＥＤ焦点に関連付けられるＳＴＥＤ画像信号を取得するよう構成されうる。共焦点画像信号は、例えば共焦点パルスに対して、例えば共焦点パルスを生成してから１ｎｓ～１００μｓの時間間隔以内に、光検出器により測定された強度でありうる。それに応じて、ＳＴＥＤ画像信号は、例えばＳＴＥＤパルスに対して、例えばＳＴＥＤパルスを生成してから１ｎｓ～１００μｓの時間間隔以内に、光検出器により測定された強度でありうる。画像分析部は、ハードウェア、ソフトウェア、またはそれらの組み合わせを使って実現することができる。
画像分析部は、例えばビーム走査装置および／またはサンプル走査装置から共焦点および／またはＳＴＥＤ焦点の位置を取得し、この位置を各画像信号と関連付けて、例えばそれらの焦点を走査する際の複数の測定値からそれぞれ共焦点画像とＳＴＥＤ画像を生成するよう構成されうる。画像分析はさらに、共焦点画像信号とＳＴＥＤ画像信号を結合して、共焦点画像信号、共焦点、ＳＴＥＤ画像信号、およびＳＴＥＤ焦点についての情報を含む共局在画像を形成するよう構成されうる。共局在画像は、例えば特に複数の測定値に対して、サンプル上の共焦点の位置を伴う共焦点画像信号と、サンプル上のＳＴＥＤ焦点の位置を伴うＳＴＥＤ画像信号とを含みうる。
また、装置は、遅延時間Δｔｃｏｎｆ、遅延時間ΔｔＳＴＥＤ、パルス幅ｔｃｏｎｆ、パルス幅ｔＳＴＥＤ、共焦点位相パターン、共焦点強度パターン、ＳＴＥＤ位相パターン、および／または、ＳＴＥＤ強度パターンを設定するように構成されている制御装置も含みうる。一例では、制御装置は時間遅延部に接続することができて、時間遅延部のパラメータを調整して遅延時間Δｔｃｏｎｆおよび／または遅延時間ΔｔＳＴＥＤを設定するよう構成することができる。別の例では、制御装置は第２光源に接続することができて、第２光源のパラメータを調整して第２共焦点励起パルスおよび／またはＳＴＥＤ抑制パルスのパルス幅ｔｃｏｎｆ、パルス幅ｔＳＴＥＤ、および／または、パルスエネルギーを設定するよう構成することができる。さらに別の例では、制御装置はビームシェイパーに接続することができて、強度パターンおよび／または位相パターンをビームシェイパーへ送信するよう構成することができる。制御装置はさらに、例えば第１光源が第１共焦点励起パルスおよび／またはＳＴＥＤ励起パルスを生成するために、あるいは、時間遅延部またはビームシェイパーが２つの強度パターンおよび／または位相パターンの間で切り替えを行うために、トリガー信号を生成するよう構成されうる。また、制御装置は、例えばサンプル上の共焦点および／またはＳＴＥＤ焦点の位置を設定するために、ビーム走査装置および／またはサンプル走査装置を制御するようにも構成されうる。制御装置は、ハードウェア、ソフトウェア、またはそれらの組み合わせを使って実現することができる。一部の例では、制御装置および画像分析部は、両方の機能性を提供する単一のユニットとすることができる。
以下では、本発明およびその例示の実施形態の詳細な説明が図を参照して与えられる。図は以下の図式を示す。
本発明の例示の一実施形態に係る２色共焦点共局在化顕微鏡法のための装置である。 本発明の一実施形態に係る、第１共焦点励起パルスおよび第２共焦点励起パルスを含むパルス列である。 本発明の一実施形態に係る、誘導放出抑制（ＳＴＥＤ）励起パルスおよびＳＴＥＤ抑制パルスを含むパルス列である。 本発明の例示の一実施形態に係る、第２共焦点励起パルスの強度分布および共焦点位相パターンである。 本発明の例示の一実施形態に係る、ＳＴＥＤ抑制パルスの強度分布およびＳＴＥＤ位相パターンである。 本発明の一実施形態に係る、２色共焦点共局在化顕微鏡法のための方法である。 本発明の例示の一実施形態に係る、共焦点画像マーカーのエネルギースペクトルである。 本発明の例示の一実施形態に係る、ＳＴＥＤ画像マーカーのエネルギースペクトルである。
図１は、本発明の例示の一実施形態に係る、サンプル１０２の２色共焦点共局在化顕微鏡法のための装置１００を示す。サンプル１０２は生体サンプル、例えばタンパク質やＤＮＡのような生体細胞および／または生体分子を含むサンプルであってもよく、顕微鏡スライドやラボオンチップ（lab-on-a-chip）システムのようなサンプルホルダー上に載せることができる。
装置１００は、第１共焦点励起パルス１０６ａおよび誘導放出抑制（ＳＴＥＤ）励起パルス１０８ａを生成するように構成されている第１光源１０４を含む。第１光源１０４は、例えばピコ秒レーザー光源やフェムト秒レーザー光源などのパルスレーザー光源とすることができる。他の例では、第１光源１０４は、連続波レーザー光源と、連続波レーザー光源により放射されるレーザー光を変調して第１共焦点励起パルス１０６ａおよびＳＴＥＤ励起パルス１０８ａを生成するように構成されているパルス整形部とを含みうる。パルス整形部は、例えば機械式シャッター、音響光学変調器、電気光学変調器、またはこれらの組み合わせを含みうる。第１光源１０４は、特に複数のレーザーパルス、例えば第１共焦点励起パルスおよび／またはＳＴＥＤ励起パルスの列を生成するよう構成されうる。パルス１０６ａ、１０８ａは、第１波長とも呼ばれる中心波長λ１を有する。第１波長は、例えば４００ｎｍ～２２００ｎｍとすることができる。一部の例では、第１光源１０４の波長は、例えば第１波長を画像マーカーの励起スペクトルへ適合させるために、調節可能とすることができる。第１光源１０４は、例えばチタンサファイアレーザー、ダイオードレーザー、またはダイオード励起固体レーザーとすることができる。第１光源１０４により放射されるパルス、すなわち第１共焦点励起パルス１０６ａおよびＳＴＥＤ励起パルス１０８ａは、図１で点線で示される第１光路１１０に沿って伝搬する。第１光源１０４により放射されたパルスは、例えば第１光路１１０と垂直な平面内でガウス分布またはフラットトップの空間強度分布を持ちうる。
装置１００は、第２共焦点励起パルス１０６ｂおよびＳＴＥＤ抑制パルス１０８ｂを生成するように構成されている第２光源１１２をさらに含む。第２光源１１２は、例えばピコ秒レーザー光源やフェムト秒レーザー光源などのパルスレーザー光源とすることができる。他の例では、第２光源１１２は、連続波レーザー光源と、連続波レーザー光源により放射されるレーザー光を変調して第２共焦点励起パルス１０６ｂおよびＳＴＥＤ抑制パルス１０８ｂを生成するように構成されているパルス整形部とを含みうる。パルス整形部は、例えば機械式シャッター、音響光学変調器、電気光学変調器、またはこれらの組み合わせを含みうる。第２光源１１２は、特に複数のレーザーパルス、例えば第２共焦点励起パルスおよび／またはＳＴＥＤ抑制パルスの列を生成するように構成されうる。パルス１０６ｂ、１０８ｂは、第２波長とも呼ばれる中心波長λ２を有する。第２波長は第１波長とは異なり、例えばやはり４００ｎｍ～２２００ｎｍとすることができる。一部の例では、第２光源１１２の波長は、例えば第２波長を画像マーカーの励起スペクトルおよび／または放出スペクトルへ適合させるために、調節可能とすることができる。第２光源１１２は、例えばチタンサファイアレーザー、ダイオードレーザー、またはダイオード励起固体レーザーとすることができる。第２光源１１２により放射されるパルス、すなわち第２共焦点励起パルス１０６ｂおよびＳＴＥＤ抑制パルス１０８ｂは、図１で破線で示される第２光路１１４に沿って伝搬する。
第２光源１１２は、第２共焦点励起パルス１０６ｂおよび／またはＳＴＥＤ抑制パルス１０８ｂのパルス幅、パルスエネルギー、および／または、放射時間を調整するよう構成されうる。第２光源１１２は、トリガー信号、例えば電気トリガー信号を受信すると、例えば第２共焦点励起パルス１０６ｂおよび／またはＳＴＥＤ抑制パルス１０８ｂを照射するよう構成されうる。第２光源１１２は、例えばレーザーダイオードへの注入電流を調整して複数のパルスを生成するように構成されている利得スイッチ駆動ダイオードレーザーとすることができる。あるいは、第２光源１１２は、例えば調整可能な減衰器を用いた可変Ｑ値の共振器を有するＱ－スイッチレーザーとすることができる。
装置１００は、図１で二点鎖線で示される主光路１１８上で第１光路１１０と第２光路１１４を空間的に重ね合わせる、重ね合わせ要素１１６をさらに含む。重ね合わせ要素１１６は、例えば第１波長の光を透過して第２波長の光を反射するように構成されているダイクロイックミラーなどのダイクロイックミラーとすることができる。あるいは、重ね合わせ要素１１６はビームスプリッタ、特に偏光ビームスプリッタとすることができる。パルス１０６ａおよびパルス１０８ａはパルス１０６ｂおよびパルス１０８ｂの極性とは異なる偏光を持つことがあり、例えば直交する直線偏光や反対方向の円偏光を持つことがある。好ましくは、重ね合わせ要素１１６の空間的方向は、例えば第１光路１１０と第２光路１１４を互いに対して調整するために、調整可能である。重ね合わせ要素１１６は、例えば手動または自動で調整可能な架台に取り付けることができる。
また、装置１００は、主光路１１８に沿って伝搬する入射光、特にパルス１０６ａ、１０６ｂ、１０８ａ、１０８ｂを焦点１２２へ集光するように構成されている対物レンズ１２０も含む。対物レンズ１２０は、高ＮＡの対物レンズ、例えば０．５より大きい開口数を有する対物レンズとすることができる。一部の例では、対物レンズ１２０は液浸対物レンズ、例えば１．０を超える開口数を有する油浸対物レンズとすることができる。対物レンズは、例えば焦点１２２の位置を調整するために移動可能に取り付けることができる。
焦点１２２の位置はさらに、入射光の伝搬方向および発散に依存することがあり、パルス１０６ａ、１０６ｂ、１０８ａ、１０８ｂのそれぞれに対して異なることがある。光路１１０および光路１１４を、例えば重ね合わせ要素１１６を用いて主光路１１８に対して適切に調整することで、光路１１０および光路１１４に沿って伝搬するパルスを同じ焦点１２２へ集光することができる。焦点１２２の位置を調整するために、装置１００は主光路１１８に沿って伝搬する光の伝搬方向を調整するように構成されているビーム走査装置１２４を含む。これに応じて、焦点１２２の位置は、共焦点励起パルス１０６ａおよび１０６ｂに対して、ＳＴＥＤパルス１０８ａおよび１０８ｂに対してとは異なるように調整されることがある。ビーム走査装置１２４は、例えば対物レンズ１２０の光軸に対する主光路１１８の角度および／または主光路１１８の横方向変位を調整するように構成されうる。好ましくは、ビーム走査装置１２４は、例えばサンプル１０２上の着目する２次元領域全体にわたって焦点１２２を走査するために、焦点１２２を２つの軸に沿って移動させるよう構成される。ビーム走査装置１２４は、例えばガルバノスキャナ、圧電駆動の架台、またはデジタルマイクロミラーデバイスに取り付けられるミラーなどの可動式ミラーを含みうる。他の例では、ビーム走査装置１２４は音響光学偏向器および／または電気光学変調器を含みうる。あるいは、またはさらに、装置１００は、サンプル１０２の位置を調整するように構成されているサンプル走査装置、例えば移動ステージを含みうる。一例では、サンプル走査装置は、例えばサンプル１０２内の焦点１２２の位置の深さを変化させるために、光軸１１８に沿ったサンプル１０２の位置を調整するよう構成することができる。別の例では、サンプル走査装置は２軸または３軸に沿ってサンプル１０２の位置を調整するよう構成することができる。サンプル走査装置は、例えば圧電アクチュエータ、ステッピングモータ、サーボモータ、またはこれらの組み合わせを含みうる。
サンプル１０２により放射、散乱、および／または、透過された光を検出するため、装置１００は、例えばフォトダイオード、光電子増倍管、ＣＣＤカメラまたはＣＭＯＳカメラのような拡張検出器などの点状検出器である、光検出器１２６を含む。光検出器１２６は、特に光検出器１２６に入射した光の強度を測定するよう構成されうる。図１に示される例では、サンプル１０２の少なくとも一部は対物レンズ１２０を介して光検出器１２６上で撮像される。他の例では、例えば対物レンズ１２０に垂直または対向して置かれる第２対物レンズを含む追加の撮像系を、光検出器１２６上で撮像される光を集めるのに使用することができる。また、装置１００は、光検出器１２６に到達する光をスペクトル的にフィルターするフィルター要素１２８をさらに含む。フィルター要素１２８は、例えば１つまたは複数の種類の画像マーカーの発光波長の光を透過しながら第１波長および／または第２波長の光を反射または遮断する、ダイクロイックミラーまたは光学フィルターとすることができる。一部の例では、装置１００は異なるフィルター要素を有する２つの光検出器、例えば第１種類の画像マーカーの発光波長の光を透過するフィルター要素を有する一つの検出器および第２種類の画像マーカーの発光波長の光を透過するフィルター要素を有する別の検出器を含みうる。
装置１００は、位相パターンおよび／または強度パターンを第２光路１１４に沿って伝搬する光に刷り込むように構成されているビームシェイパー１３０を含む。特に、ビームシェイパー１３０は、第２共焦点励起パルス１０６ｂへ共焦点位相パターンおよび／または共焦点強度パターンを刷り込み、ＳＴＥＤ抑制パルス１０８ｂへＳＴＥＤ位相パターンおよび／またはＳＴＥＤ強度パターンを刷り込むよう構成される。共焦点位相パターンおよび／または共焦点強度パターンは、第２共焦点励起パルス１０６ｂの強度分布が焦点１２２において極大値を示すように選択される。ＳＴＥＤ位相パターンおよび／またはＳＴＥＤ強度パターンは、ＳＴＥＤ抑制パルス１０８ｂの強度分布が焦点１２２において極小値を示すように選択される。これは、図３Ａおよび図３Ｂを参照して以下でより詳細に説明される。
ビームシェイパー１３０は、例えば第２光路１１４に沿って伝搬する光に位相パターンを刷り込むために空間的に変動する光路長を有する位相マスク、例えば反射型位相マスクまたは透過型位相マスクを含みうる。光路長は第２波長での光路長であり、位相マスクを透過する場合または位相マスクで反射される場合に、第２波長の光が得る位相シフトを決定する。好ましくは、位相マスクは、光路長の空間分布を調整することで位相パターンを調整するように構成されている適応式位相マスクであり、例えば反射型または透過型の液晶空間光変調器である。液晶空間光変調器は、例えば各画素の液晶を制御するための電極格子を含むシリコン基板上に配置されうる、例えば強誘電性液晶またはネマチック液晶の２次元画素格子を含みうる。別の例では、ビームシェイパー１３０は例えば空間的に変動する厚さおよび／または屈折率を有するガラス板である静的位相マスクを含むことがあり、この位相マスクは第２光路１１４の中に入れたり外へ出したりすることができる。ビームシェイパーは、例えば静的位相マスクが第２光路１１４から除去された場合は共焦点位相パターンを刷り込むことができて、静的位相マスクが光路１１４に置かれた場合はＳＴＥＤ位相パターンを刷り込むことができる。
さらに、またはあるいは、ビームシェイパー１３０は、光の強度を空間的に変調することで第２光路１１４に沿って伝搬する光に強度パターンを刷り込むための強度変調器を含みうる。好ましくは、強度変調器は刷り込まれる強度パターンを調整するように構成されている調整可能な強度変調器である。強度変調器は、例えばデジタルマイクロミラーデバイスとすることができる。別の例では、強度変調器は、偏光子と、空間的に変動する電界を用いる電気光学変調器、および／または、空間的に変動する電気光学特性を有する電気光学変調器を含みうる。強度変調器は、強度変調器により刷り込まれる強度パターンが対物レンズ１２０によりサンプル１０２で上で撮像されるように置くことができる。
装置１００は、第１光源１０４により放射されたパルスと第２光源１１２により放射されたパルスの間の遅延時間Δｔを調整するように構成されている時間遅延部１３２をさらに含む。図１に示される例では、第１光源１０４は、パルスを放射する際に、例えば第１光源１０４の内部モニタ用フォトダイオード上での強度を特徴付ける電気トリガー信号または第１光源１０４からパルスを放射させるのに使用される電気制御信号であるトリガー信号を生成するよう構成される。時間遅延部１３２は、第１光源１０４からのトリガー信号を受信して、トリガー信号に対して調整可能な遅延時間の分だけずらされた遅延されたトリガー信号を生成するよう構成される。第２光源１１２は時間遅延部１３２からの遅延されたトリガー信号を受信し、遅延されたトリガー信号を受信したらパルスを生成するよう構成される。他の例では、時間遅延部１３２は、調整可能な遅延時間の分だけずらされた２つのトリガー信号を生成するよう構成することができて、それぞれのパルスを生成するために一つの信号が第１光源１０４へ送信されて、別の信号が第２光源１１２へ送信される。
また、装置１００は、ビームシェイパー１３０と結合される制御装置１３４と、第２光源１１２と、時間遅延部１３２も含む。制御装置１３４は、ビームシェイパー１３０により例えば共焦点位相パターンおよび／または共焦点強度パターンとＳＴＥＤ位相パターンおよび／またはＳＴＥＤ強度パターンとの間で切り替えを引き起こすよう構成されうる。制御装置１３４はさらに、共焦点位相パターンおよび／または共焦点強度パターン、ならびに、ＳＴＥＤ位相パターンおよび／またはＳＴＥＤ強度パターンを設定するよう構成されうる。また、制御装置１３４は、時間遅延部１３２に対して第１光源１０４により放射されたパルスと第２光源１１２により放射されたパルスの間の遅延時間Δｔを設定するようにも構成されうる。さらに、またはあるいは、制御装置１３４は、第２光源１１２により放射されたパルスの波長、放射時間、パルス幅、および／または、パルスエネルギーを設定するよう構成されうる。また、一部の例では、制御装置１３４は、第１光源１０４により放射されたパルスの波長、放射時間、パルス幅、および／または、パルスエネルギーを設定するために、第１光源１０４と結合することができる。さらに、制御装置１３４は、例えばサンプル１０２上の焦点１２２の位置を制御するため、また光検出器１２６から信号を読み出すために、それぞれビーム走査装置１２４、サンプル走査装置および／または光検出器１２６と結合されうる。
装置１００は、例えば制御装置１３４の一部として、または独立したユニットとして、画像分析部（図１には示されていない）をさらに含みうる。画像分析部は、例えば光検出器１２６により測定された強度を特徴付けることができる、例えばフォトダイオードの電流や電圧である画像信号を、光検出器１２６から取得するよう構成されうる。画像信号はアナログ信号またはデジタル信号とすることができる。画像分析部はさらに、例えばビーム走査装置１２４および／またはサンプル走査装置から、焦点１２２の情報を取得するよう構成されうる。この情報は、例えば光検出器１２６により強度が測定された際のサンプル１０２上での焦点１２２の位置を含みうる。画像分析部は特に、複数の画像信号と、各画像信号に関連付けられる焦点１２２の情報とを結合して画像、例えばサンプル１０２上の焦点１２２の位置の関数として画像信号を特徴付ける画像を形成しうる。
また、画像分析部は第１光源１０４および／または第２光源１１２により放射されたパルスについての情報、例えばパルスの放射時間および種類、つまりパルスが共焦点パルスであるか、またはＳＴＥＤパルスであるか、を取得するようにも構成されうる。例えば、画像分析部は、画像信号が共焦点励起パルス１０６ａおよび１０６ｂ、またはＳＴＥＤパルス１０８ａおよび１０８ｂに対して測定された強度を特徴付けるかどうか、つまり、画像信号が共焦点画像信号であるか、またはＳＴＥＤ画像信号であるか、を決定するよう構成されうる。これに応じて、画像分析部は、複数の共焦点画像信号から共焦点画像を決定し、複数のＳＴＥＤ画像信号からＳＴＥＤ画像を決定するよう構成されうる。さらに、画像分析部は、共焦点画像とＳＴＥＤ画像を結合して共局在画像、例えばサンプル１０２上の焦点１２２の位置の関数として共焦点画像信号およびＳＴＥＤ画像信号を特徴付ける画像を形成するよう構成されうる。
図２Ａは、焦点１２２を含み、焦点１２２において主光路１１８と垂直である焦点面内での第１共焦点励起パルス１０６ａおよび第２共焦点励起パルス１０６ｂの空間平均強度Ｉを時間ｔの関数として模式的に示す。パルス１０６ａ、１０６ｂの焦点１２２への到達時間は遅延時間Δｔｃｏｎｆだけ離れており、この遅延時間は時間遅延部１３２を用いて調整されうる。第２共焦点励起パルス１０６ｂはパルス幅ｔｃｏｎｆを有し、このパルス幅は制御装置１３４により設定されうる。パルス幅ｔｃｏｎｆは例えば１０ｆｓ～１０ｎｓとすることができて、一例では１ｐｓ～１００ｐｓとすることができる。また、第１共焦点励起パルス１０６ａのパルス幅は例えば１０ｆｓ～１０ｎｓとすることができて、一例では１００ｆｓ～１０ｐｓとすることができる。一部の例では、第１共焦点励起パルス１０６ａのパルス幅はｔｃｏｎｆと等しくすることができる。
図２Ｂは、焦点面内でのＳＴＥＤ励起パルス１０８ａおよびＳＴＥＤ抑制パルス１０８ｂの空間平均強度Ｉを時間ｔの関数として模式的に示す。パルス１０８ａ、１０８ｂの焦点１２２への到達時間は遅延時間ΔｔＳＴＥＤだけ離れており、この遅延時間は時間遅延部１３２を用いて調整されうる。ＳＴＥＤ抑制パルス１０８ｂはパルス幅ｔＳＴＥＤを有し、このパルス幅は制御装置１３４により設定されうる。パルス幅ｔＳＴＥＤは例えば１０ｆｓ～１０ｎｓとすることができて、一例では１００ｐｓ～１ｎｓとすることができる。ＳＴＥＤ励起パルス１０８ａのパルス幅は第１共焦点励起パルス１０６ａのパルス幅と等しくてもよく、例えば１０ｆｓ～１０ｎｓとすることができて、一例では１００ｆｓ～１０ｐｓとすることができる。
図３Ａ、３Ｂは焦点面内での第２共焦点励起パルス１０６ｂの空間強度分布３００およびＳＴＥＤ抑制パルス１０８ｂの空間強度分布３０４の例を表し、ｘおよびｙは焦点１２２において主光路１１８と垂直な２つの軸を表す。中央の図の縞模様の領域は、強度が特定の閾値強度より大きい、例えば各強度分布の最大強度の１／ｅ２より大きい範囲を示す。右側の図はそれぞれ、ｙ軸に沿って焦点１２２を通る強度分布３００、３０４を切断したもの３００ｙおよび３０４ｙを示す。
第２共焦点励起パルス１０６ｂの強度分布３００は、焦点１２２において最大値を示す。強度分布３００は、第２共焦点励起パルス１０６ｂの伝搬方向に対して回転対称でありうる。図３Ａに示される例では、強度分布３００ｙは、ｙ軸に沿ってガウス分布形状を有する。他の例では、強度分布３００は、例えばエアリーパターンでありうる。強度分布３００のウエスト、つまり強度が焦点１２２におけるピーク強度の１／ｅ２へと低下する焦点１２２からの平均半径方向距離は、例えば第２波長よりも小さいことがある。強度分布３００は、例えば、ビームシェイパー１３０を用いて空間的に一様な位相シフトφ＝ｃｏｎｓｔの共焦点位相パターン３０２を第２共焦点励起パルス１０６ｂへ刷り込むことで得ることができる。第１共焦点励起パルス１０６ａおよびＳＴＥＤ励起パルス１０８ａは、焦点１２２の付近で強度分布３００に類似した強度分布を有することがあり、つまり、やはり焦点１２２において最大値を示す。
ＳＴＥＤ抑制パルス１０８ｂの強度分布３０４は、焦点１２２において極小値を示す。強度分布３０４は、ＳＴＥＤ抑制パルス１０８ｂの伝搬方向に対して回転対称でありうる。図３Ｂに示される例では、強度分布３０４は、ＳＴＥＤ抑制パルス１０８ｂの伝搬方向と垂直な各方向で高い強度の領域に囲まれ、中心で最小値となるドーナツ状の形状を有する。これに応じて、強度分布３０４は、ｙ軸に沿って焦点１２２で二重ピーク構造を有する。強度分布３０４は、例えばビームシェイパー１３０を用いて渦状ＳＴＥＤ位相パターン３０６をＳＴＥＤ抑制パルスに刷り込むことで得ることができて、位相シフトφは中心に対して方位角方向で線形に０～２πまで増加し、半径方向では一定である。あるいは、π－ステップ位相パターンを、位相シフトがφ＝０である環状領域により囲まれる位相シフトがφ＝πである中心の円形領域を有するＳＴＥＤ位相パターン３０６として使用することができる。
他の例では、強度分布３０４はビームシェイパー１３０、例えばデジタルマイクロミラーデバイスを用いて、対応する強度分布をＳＴＥＤ抑制パルス１０８ｂに刷り込み、この強度分布を焦点面上で撮像することで作ることができる。それに応じて、強度分布３００を作り出すために、入射する第２共焦点励起パルス１０６ｂの強度分布が変更されないように、あるいは、ガウス分布またはフラットトップの強度分布が入射する第２共焦点励起パルス１０６ｂに刷り込まれるように、ビームシェイパー１３０を調整することができる。
好ましくは、ビームシェイパー１３０は、例えば各パルスの空間強度の変動および／または波面の歪みを補正して強度分布３００、３０４を最適化するために、刷り込まれる位相パターンおよび／または強度パターンを調整するよう構成される。焦点１２２におけるＳＴＥＤ抑制パルス１０８ｂの強度、および／または、焦点１２２における最小強度の幅は、例えば位相シフトを渦状位相パターンまたはπ－ステップ位相パターンから始めて局所的に変更してＳＴＥＤ位相パターン３０６を調整することで、最小化することができる。同様に、第２共焦点励起パルス１０６ｂの強度分布３００のウエストは、例えば共焦点位相パターン３０２を調整することで最小化することができる。好ましくは、焦点１２２におけるＳＴＥＤ抑制パルス１０８ｂの強度は強度分布３０４の最大値の１％未満であり、一例では０．１％未満である。ＳＴＥＤ抑制パルス１０８ｂの強度は焦点１２２から離れる場合は大きく増えることがあり、例えばあらゆる半径方向において５０倍より大きく、好ましくは５００倍より大きく、増えることがある。強度が強度分布３０４の最大値の１％未満である、焦点１２２の周りの領域の大きさは、少なくとも一方向で、好ましくはあらゆる半径方向において、第２波長の２０％未満とすることができる。一例では、制御装置１３４はビームシェイパー１３０を用いて、例えば光検出器１２６で強度分布３０４を測定することで、焦点１２２におけるＳＴＥＤ抑制パルス１０８ｂの強度を自動的に最小化するよう構成することができる。
図４は、本発明の一実施形態に係る、サンプルの２色共焦点共局在化顕微鏡法のための方法４００のフローチャートを示す。方法４００は、例えば装置１００を用いて実行することができて、図１を参照して以下で説明される。しかし、これはいかなる形でも制限することを目的とはしておらず、方法４００は、２色共焦点共局在化顕微鏡法のための任意の適切な装置を用いて実行されうる。
共局在化顕微鏡法を実行するため、サンプル１０２は、２種類の画像マーカー、すなわち共焦点画像マーカーとＳＴＥＤ画像マーカーによりラベル付けされる。サンプル１０２をラベル付けすることは方法４００の一部でありうる、または、サンプル１０２は前もってすでにラベル付けされていることがある。２種類の画像マーカーは、特にサンプル１０２の異なる構成要素または異なる部分をラベル付けするのに使用することができて、つまり第１構成要素は共焦点画像マーカーを付着させることでラベル付けすることができて、第２構成要素はＳＴＥＤ画像マーカーを付着させることでラベル付けすることができる。画像マーカーは、例えば蛍光タンパク質や窒素－空孔中心のような蛍光色素分子とすることができる。
共焦点画像マーカーとＳＴＥＤ画像マーカーは異なるエネルギースペクトルを持ち、それに応じて異なる光学特性を示すことで、異なる構成要素を区別するのを可能にしうる。共焦点画像マーカーのエネルギー準位図またはエネルギースペクトル５００、およびＳＴＥＤ画像マーカーのエネルギー準位図またはエネルギースペクトル５０６の例が、それぞれ図５Ａ、５Ｂに示される。各エネルギースペクトルは、それぞれ電子基底状態マニホールド５０２、５０８と電子励起状態マニホールド５０４、５１０とを含む。各マニホールドは複数のサブ振動状態を含みうる。電子基底状態マニホールド５０２、５０８は、例えば、それぞれ振動基底状態５０２ａ、５０８ａと複数の振動励起状態５０２ｂ、５０８ｂを含むことができる。同様に、電子励起状態マニホールド５０４、５１０は、それぞれ振動基底状態５０４ａ、５１０ａと複数の振動励起状態５０４ｂ、５１０ｂを含むことができる。
ステップ４０２では、第１波長λ１を有する第１共焦点励起パルス１０６ａが第１光源１０４から生成され、第２波長λ２を有する第２共焦点励起パルス１０６ｂが第２光源１１２から生成される。その後、パルス１０６ａ、１０６ｂは各光路１１０、１１４に沿って伝搬し、重ね合わせ要素１１６により主光路１１８上で空間的に重ね合わせられる。最終的に、パルス１０６ａ、１０６ｂは対物レンズ１２０により焦点１２２へ集光される。また、共焦点パルス１０６ａ、１０６ｂが収束される点は共焦点と呼ばれることもある。ビームシェイパー１３０を使って、例えば図３Ａを参照して前述したように、第２共焦点励起パルス１０６ｂの強度分布３００が共焦点において極大値を示すように共焦点位相パターンおよび／または共焦点強度パターンを第２共焦点励起パルス１０６ｂに刷り込むことができる。
ステップ４０２は、制御装置１３４を用いて第１共焦点励起パルス１０６ａのパルス幅および／もしくはパルスエネルギーを設定すること、ならびに／または、トリガー信号を制御装置１３４から第１光源１０４へ送信して第１共焦点励起レーザーパルス１０６ａの生成を引き起こすこと、を含みうる。ステップ４０２は、制御装置１３４を用いて、第２共焦点励起パルス１０６ｂのパルス幅および／もしくはパルスエネルギー、ならびに／または、パルス１０６ａとパルス１０６ｂの間の遅延時間Δｔｃｏｎｆを設定すること、をさらに含みうる。前述したように、第１光源１０４は第１共焦点励起パルス１０６ａを放射する際にトリガー信号を時間遅延部１３２へ送信することができて、時間遅延部１３２はこのトリガー信号から、第２共焦点励起パルス１０６ｂが第１共焦点励起パルス１０６ａに対して遅延時間Δｔｃｏｎｆで焦点１２２に到達するように、第２光源１１２が第２共焦点励起パルス１０６ｂを照射するために遅延されたトリガー信号を生成することができる。
好ましくは、パルス１０６ａのパルス幅とパルス１０６ｂのパルス幅は類似しており、パルス１０６ａとパルス１０６ｂの時間的重なりを最大化するように、遅延時間Δｔｃｏｎｆは両方のパルス幅と比べて小さい。これは、焦点１２２の付近にある共焦点画像マーカーの励起確率を増大させるのに有利となりうる。一例では、パルス１０６ａのパルス幅とパルス１０６ｂのパルス幅は等しくすることができる、または２倍未満の差とすることができる。別の例では、遅延時間Δｔｃｏｎｆは２つのパルス幅の短い方の２５％未満であり、好ましくは１０％未満である。遅延時間Δｔｃｏｎｆは、例えば１００ｆｓ未満とすることができて、パルス１０６ａのパルス幅は１ｐｓで、ｔｃｏｎｆ＝１０ｐｓとすることができる。
第１波長を有する光子と第２波長を有する光子を伴う２光子励起が共焦点画像マーカーの励起遷移と共鳴する、つまり、それぞれ第１波長および第２波長に対応する光周波数ν１と光周波数ν２の合計が、電子基底状態マニホールド５０２内の状態と電子励起状態マニホールド５０４内の状態の間のエネルギー差分に対応する周波数に等しいように、第１波長および第２波長が選択される。この場合、電子基底状態マニホールド５０２と電子励起状態マニホールド５０４の間の２光子遷移は、第１共焦点励起パルス１０６ａからの光子と第２共焦点励起パルス１０６ｂからの光子を同時に吸収することで励起されうる。ν１とν２の合計は、例えば状態５０２ａと振動励起状態５０４ｂのうちの一つの間の遷移と共鳴しうる。振動励起状態の共焦点画像マーカーは、例えば図５Ａのくねくねした矢印により示される、サンプル１０２内の環境との相互作用を通して各電子マニホールドの基底状態へ緩和することがある。振動基底状態５０４ａの共焦点画像マーカーは、光周波数νａに対応する共焦点マーカーの発光波長λａで蛍光光子を放出する自然放出により、基底状態マニホールド５０２へ緩和することがある。
ステップ４０４では、パルス１０６ａ、１０６ｂに対してサンプル１０２により放射された蛍光発光が光検出器１２６を使って検出され、サンプル１０２を発生源とする光が対物レンズ１２０を通って光検出器１２６上で撮像される。これには、フィルター要素１２８を用いてサンプル１０２を発生源とする光をスペクトル的にフィルターすることを含みうる。光検出器１２６は、例えばフォトダイオード上の光の強度に比例する電圧または電流を生成するフォトダイオードとすることができて、この電圧または電流は、制御装置１３４または画像分析部により、例えばデジタル画像信号またはアナログ画像信号として読み出すことができる。好ましくは、例えばバックグラウンド信号を弱めるために、検出はパルス１０６ａ、１０６ｂの放射と同期される。このため、光検出器１２６は、例えば制御装置１３４からトリガー信号を受信して測定を始めることがあり、測定は所定の時間、例えば１ｎｓ～１００μｓの間、または第２トリガー信号が受信されるまで行われうる。ステップ４０４は、例えばビーム走査装置１２４および／またはサンプル走査装置からサンプル１０２上の共焦点の位置、すなわちステップ４０２でパルス１０６ａ、１０６ｂが集光する焦点１２２の位置、を決定すること、およびこの情報を画像信号と関連付けることをさらに含みうる。
方法４００は、ステップ４０６でビーム走査装置１２４および／またはサンプル走査装置を使って焦点１２２をサンプル１０２上の新しい位置に合わせた後にステップ４０２および４０４を新しい焦点で繰り返すことをさらに含みうる。一例では、初期位置から始めて、共焦点はサンプル１０２上の着目する領域全体に対して、例えば１次元または２次元の矩形格子を使って、連続的に走査することができる。画像信号および画像信号に関連する共焦点の位置からサンプル１０２上の共焦点の位置の関数として画像信号を特徴付ける共焦点画像を取得し、例えばサンプル１０２全体での蛍光信号の強度の空間分布を決定することができる。この画像から、サンプル１０２内の共焦点画像マーカーの空間分布についての情報を抽出することができる。
ステップ４０８では、ビームシェイパー１３０により刷り込まれた位相パターンおよび／または強度パターンは調整されて、共焦点位相パターンおよび／または共焦点強度パターンからＳＴＥＤ位相パターンおよび／またはＳＴＥＤ強度パターンへと切り替えられる。切り替えは、例えば制御装置１３４からのトリガー信号により引き起こされうる。ステップ４０８は、図３Ｂを参照して前述したように、ＳＴＥＤ位相パターンおよび／またはＳＴＥＤ強度パターンを最適化することを含みうる。ステップ４０８は、ＳＴＥＤ抑制パルス１０８ｂのパルス幅ｔＳＴＥＤおよび／もしくはパルスエネルギー、ならびに／または、ＳＴＥＤ励起パルス１０８ａとＳＴＥＤ抑制パルス１０８ｂの間の遅延時間ΔｔＳＴＥＤを、制御装置１３４を用いて、例えば第２光源１１２および／または時間遅延部１３２の各パラメータを調整することで設定することをさらに含みうる。一部の例では、ステップ４０８は、ＳＴＥＤ励起パルス１０８ａのパルス幅および／またはパルスエネルギーを制御装置１３４を用いて設定することも含みうる。ステップ４０８は、焦点１２２を例えば初期位置に合わせることをさらに含みうる。他の例では、サンプル１０２上の焦点１２２の位置は、ＳＴＥＤパルス１０８ａおよび１０８ｂに対して、共焦点励起パルス１０６ａおよび１０６ｂに対してとは異なることがある。
ステップ４１０では、第１波長λ１を有するＳＴＥＤ励起パルス１０８ａが第１光源１０４から生成され、第２波長λ２を有するＳＴＥＤ抑制パルス１０８ｂが第２光源１１２から生成される。その後、パルス１０８ａ、１０８ｂは各光路１１０、１１４に沿って伝搬し、重ね合わせ要素１１６により主光路１１８上で空間的に重ね合わせられる。最終的に、パルス１０８ａ、１０８ｂは対物レンズ１２０により焦点１２２へ集光される。また、ＳＴＥＤパルス１０８ａ、１０８ｂが収束される点はＳＴＥＤ焦点と呼ばれることもある。ビームシェイパー１３０を使って、例えば図３Ｂを参照して前述したように、ＳＴＥＤ抑制パルス１０８ｂの強度分布３０４が焦点１２２において極小値を示すようにＳＴＥＤ位相パターンおよび／またはＳＴＥＤ強度パターンをＳＴＥＤ抑制パルス１０８ｂに刷り込むことができる。ステップ４１０は、制御装置１３４からトリガー信号を第１光源１０４へ送信してＳＴＥＤ励起パルス１０８ａの生成を引き起こすことを含みうる。前述したように、第１光源１０４はＳＴＥＤ励起パルス１０８ａを放射する際にトリガー信号を時間遅延部１３２へ送信することができて、時間遅延部１３２はこのトリガー信号から第２光源１１２がＳＴＥＤ抑制パルス１０８ｂを照射するように遅延されたトリガー信号を生成することができて、ＳＴＥＤ抑制パルス１０８ｂはＳＴＥＤ励起パルス１０８ａに対して遅延時間ΔｔＳＴＥＤで焦点１２２に到達する。
第１波長での（ｎ≧１である）ｎ光子励起がＳＴＥＤ画像マーカーの励起遷移と共鳴する、つまり、第１波長に対応する光周波数ν１のｎ倍が、基底状態マニホールド５０８内の状態と電子励起状態マニホールド５１０内の状態の間のエネルギー差分に対応する周波数に等しいように、第１波長が選択される。この場合、電子基底状態マニホールド５０８と電子励起状態マニホールド５１０の間の遷移は、ＳＴＥＤ励起パルス１０８ａからのｎ光子を同時に吸収することで励起されうる。図５Ｂに表される例では、第１波長での２光子励起はＳＴＥＤ画像マーカーの励起遷移と共鳴し、つまりｎ＝２である。ｎ光子励起は、例えば状態５０８ａと振動励起状態５１０ｂのうちの一つの間の遷移と共鳴しうる。振動励起状態のＳＴＥＤ画像マーカーは、例えば図５Ｂのくねくねした矢印により示される、サンプル１０２内の環境との相互作用を通して各電子マニホールドの基底状態へ緩和することがある。
光周波数ν２に対応する第２波長が選択されて、電子励起状態マニホールド５１０と電子基底状態マニホールド５０８の間のＳＴＥＤ画像マーカーの抑制遷移と、好ましくは電子励起状態マニホールド５１０の振動基底状態５１０ａと電子基底状態マニホールド５０８の振動励起状態５０８ｂの間の遷移と共鳴する。このようにして、前述したように状態５１０ａへ迅速に緩和することが可能な、励起されたＳＴＥＤ画像マーカーは、ＳＴＥＤ抑制パルス１０８ｂにより誘導される誘導放出により基底状態マニホールド５０８へ移動させることができる。この後の基底状態５０８ａへの緩和によって、ＳＴＥＤ抑制パルス１０８ｂによる再励起を防ぐことができる。ＳＴＥＤ抑制パルス１０８ｂの通過後も振動基底状態５１０ａに留まる、例えば焦点１２２における最小強度の近辺のＳＴＥＤ画像マーカーは、自然放出により光周波数νｂに対応するＳＴＥＤマーカーの発光波長λｂで蛍光光子を放出することで基底状態マニホールド５０８へ緩和することができる。
好ましくは、ＳＴＥＤ抑制パルス１０８ｂのパルス幅ｔＳＴＥＤおよび／またはパルスエネルギーは、例えばＳＴＥＤ画像マーカーの退色を防ぎながら励起されたＳＴＥＤ画像マーカーを確実に効果的に移動させるために、それぞれ、第２共焦点励起パルス１０６ｂのパルス幅ｔｃｏｎｆとパルスエネルギーよりも大きい。一例では、ｔｃｏｎｆは１ｐｓ～１００ｐｓ、ｔＳＴＥＤは１００ｐｓ～１ｎｓとすることができる。ＳＴＥＤ抑制パルス１０８ｂの空間平均強度は、第２共焦点励起パルス１０６ｂの空間平均強度と等しくてもよい。他の例では、ＳＴＥＤ抑制パルス１０８ｂの空間平均強度は、第２共焦点励起パルス１０６ｂの空間平均強度より小さくすることができる。
好ましくは、遅延時間ΔｔＳＴＥＤは、ＳＴＥＤ励起パルス１０８ａが焦点１２２を通過する際、または通過した後にＳＴＥＤ抑制パルス１０８ｂが焦点１２２に到達するように、ＳＴＥＤ励起パルス１０８ａのパルス幅以上である。これは、パルス１０８ａ、１０８ｂによる共焦点画像マーカーの２光子励起を防ぐのに有利となりうる。好ましくは、遅延時間ΔｔＳＴＥＤは、例えば励起されたＳＴＥＤ画像マーカーによる自然放出を抑制するために、ＳＴＥＤ励起パルス１０８ａのパルス幅の２倍より小さい。一例では、ＳＴＥＤ励起パルスのパルス幅は１００ｆｓ～１０ｐｓであり、遅延時間ΔｔＳＴＥＤはＳＴＥＤ励起パルス１０８ａのパルス幅の１００％～１５０％である。
ステップ４１２では、パルス１０８ａ、１０８ｂに対してサンプル１０２により放射される蛍光発光は光検出器１２６を使って検出され、対応する画像信号を制御装置１３４または画像分析部により、例えばステップ４０４に対して前述したように読み出すことができる。蛍光光子はＳＴＥＤ抑制パルス１０８ｂによって脱励起されていない、励起されたＳＴＥＤ画像マーカーにより放出される、つまり、主に焦点１２２におけるＳＴＥＤ抑制パルス１０８ｂの最小強度の近辺のＳＴＥＤ画像マーカーにより放出されることがある。好ましくは、例えばバックグラウンド信号を弱めるために、検出はＳＴＥＤ抑制パルス１０８ｂの放射と同期される。このため、光検出器１２６は、例えば制御装置１３４からトリガー信号を受信して測定を始めることがあり、測定は所定の時間、例えば１ｎｓ～１００μｓの間、または第２トリガー信号が受信されるまで行われうる。ステップ４１２は、例えばビーム走査装置１２４および／またはサンプル走査装置からサンプル１０２上のＳＴＥＤ焦点の位置、すなわちステップ４１０でパルス１０８ａ、１０８ｂが集光する焦点１２２の位置、を決定すること、およびこの情報を画像信号と関連付けることをさらに含みうる。
方法４００は、ステップ４１４でビーム走査装置１２４および／またはサンプル走査装置を使って焦点１２２をサンプル１０２上の新しい位置に合わせた後に、例えばステップ４０６に対して前述したようにステップ４１０および４１２を新しい焦点で繰り返すことをさらに含みうる。したがって、サンプル１０２上のＳＴＥＤ焦点の位置の関数として画像信号を特徴付けるＳＴＥＤ画像を取得し、例えばサンプル１０２内の蛍光信号の強度の空間分布を決定することができる。この画像から、サンプル１０２内のＳＴＥＤ画像マーカーの空間分布についての情報を抽出することができる。
また、方法４００はサンプル１０２上の焦点１２２の位置の関数として共焦点画像信号およびＳＴＥＤ画像信号についての情報を含む共局在画像を形成するために、サンプル１０２上の共焦点の位置の関数として共焦点画像信号を特徴付ける共焦点画像と、サンプル１０２上のＳＴＥＤ焦点の位置の関数としてＳＴＥＤ画像信号を特徴付けるＳＴＥＤ画像とを結合することも含みうる。それに応じて、サンプル１０２内の共焦点画像マーカーとＳＴＥＤ画像マーカーの両方の空間分布についての情報を共局在画像から抽出することができる。
図４に示されるフローチャートは、サンプルの２色共焦点共局在化顕微鏡法の一例を構成するに過ぎず、方法４００は様々な形で変更することができる。特に、図４に示されるフローチャートのステップの順序は例示に過ぎず、方法４００は特定の実行順序に限定されない。技術的に可能である限り、ステップの順番を変えることができて、方法４００は任意の順序でこれらのステップを行うことができる。特に、ステップは少なくとも部分的に、例えばステップ４０２とステップ４０４、または、ステップ４１０とステップ４１２を同時に行うことができる。一例では、ステップ４０２、４０４、４０８、４１０、４１２は、焦点１２２に対して同じ位置を使って実行することができて、サンプル１０２上の焦点１２２の位置は、例えばその後にステップ４０２、４０４、４０８、４１０、４１２を新しい焦点で繰り返すために、後で調整されればよい。別の例では、ステップ４０２とステップ４０４、および／または、ステップ４１０とステップ４１２は、例えば信号対雑音比を向上させるために、サンプル１０２上の焦点１２２の位置を調整することなく繰り返すことができる。また、方法４００は追加のステップ、例えばサンプル１０２をラベル付けすること、または、例えば光路１１０、１１４に沿って伝搬するパルスが同じ焦点１２２へ確実に集光されるように光路１１０および光路１１４を主光路１１８に重ね合わせることも含みうる。
一部の例では、ビームシェイパー１３０は、第２光路１１４に置かれる第１位相マスク、例えば第２光路１１４に恒久的に配置される位相マスク、および第２光路１１４の中に入れたり外へ出したりするように構成されている第２位相マスク、例えば摺動可能および／または回転可能な腕部に取り付けられる位相マスクを含みうる。したがって、ステップ４０８で位相パターンを調整することは、第２位相マスクを第２光路１１４の中に入れたり外へ出したりすることを含みうる。第１位相マスクおよび第２位相マスクのそれぞれは、例えば静的位相マスクとすることができる。好ましくは、第１位相マスクおよび第２位相マスクは、両方の位相マスクを通って伝搬する光に空間的に一様な位相パターンが刷り込まれるように、相補的な位相マスクである。つまり、第１位相マスクが位相φを刷り込む場合に、第２位相マスクは位相φ０－φを刷り込むことができる（φ０は一定であり、φは空間的に変動しうる）。
一例では、第１位相マスクは例えば図３Ｂを参照して前述したようにＳＴＥＤ位相パターンを刷り込むことができて、第２位相マスクは相補的なＳＴＥＤ位相パターンを刷り込むことができる。それに応じて、ビームシェイパーは、第２位相マスクが第２光路１１４から除去された場合はＳＴＥＤ位相パターンを刷り込むことができて、第２位相マスクが第２光路１１４に置かれた場合は共焦点位相パターンを刷り込むことができる。これにより、ＳＴＥＤ抑制パルス１０８ｂの強度分布３０４の質を向上させるのと同時に、静的位相マスクを用いて両方の位相パターンを刷り込むことが可能となる。静的位相マスクは、適応式位相マスクよりもかなり安価となりうる。ＳＴＥＤ抑制パルス１０８ｂは、光学素子の調整に対して典型的には第２共焦点励起パルス１０６ｂよりも敏感である。したがって、ＳＴＥＤ抑制パルス１０８ｂに対して、第２光路１１４に沿った調整可能な光学素子、および／または、可動式の光学素子の個数を削減するのに有利となりうる。
本明細書で開示される本発明の実施形態は、例証を目的とした具体的な例を構成するに過ぎない。本発明は、様々な形で、根本的な基本特性を変更することなく、多くの変更とともに実施することができる。それゆえ、本発明は以下で述べる請求項によってのみ規定される。
１００ ２色共焦点共局在化顕微鏡法のための装置
１０２ サンプル
１０４ 第１光源
１０６ａ 第１共焦点励起パルス
１０６ｂ 第２共焦点励起パルス
１０８ａ 誘導放出抑制（ＳＴＥＤ）励起パルス
１０８ｂ ＳＴＥＤ抑制パルス
１１０ 第１光路
１１２ 第２光源
１１４ 第２光路
１１６ 重ね合わせ要素
１１８ 主光路
１２０ 対物レンズ
１２２ 焦点
１２４ ビーム走査装置
１２６ 光検出器
１２８ フィルター要素
１３０ ビームシェイパー
１３２ 時間遅延部
１３４ 制御装置
ｔｃｏｎｆ 第２共焦点励起パルスのパルス幅
Δｔｃｏｎｆ 第１共焦点励起パルスと第２共焦点励起パルスの間の遅延時間
ｔＳＴＥＤ ＳＴＥＤ抑制パルスのパルス幅
ΔｔＳＴＥＤ ＳＴＥＤ励起パルスとＳＴＥＤ抑制パルスの間の遅延時間
３００ 焦点面内の第２共焦点励起パルスの強度分布
３００ｙ ｙ軸沿いに切断された強度分布３００
３０２ 共焦点位相パターン
３０４ 焦点面内のＳＴＥＤパルスの強度分布
３０４ｙ ｙ軸沿いに切断された強度分布３０４
３０６ ＳＴＥＤ位相パターン
φ パルスに刷り込まれた位相シフト
４００ ２色共焦点共局在化顕微鏡法のための方法
４０２ 共焦点パルスを生成、集光するステップ
４０４ 共焦点パルスにより誘導される蛍光発光を検出するステップ
４０６ 共焦点を調整するステップ
４０８ 位相パターンを調整するステップ
４１０ ＳＴＥＤパルスを生成、集光するステップ
４１２ ＳＴＥＤパルスにより誘導される蛍光発光を検出するステップ
４１４ ＳＴＥＤ焦点を調整するステップ
５００ 共焦点画像マーカーのエネルギースペクトル
５０２ 共焦点画像マーカーの電子基底状態マニホールド
５０２ａ 電子基底状態マニホールド５０２の振動基底状態
５０２ｂ 電子基底状態マニホールド５０２の振動励起状態
５０４ 共焦点画像マーカーの電子励起状態マニホールド
５０４ａ 電子励起状態マニホールド５０４の振動基底状態
５０４ｂ 電子励起状態マニホールド５０４の振動励起状態
５０６ ＳＴＥＤ画像マーカーのエネルギースペクトル
５０８ ＳＴＥＤ画像マーカーの電子基底状態マニホールド
５０８ａ 電子基底状態マニホールド５０８の振動基底状態
５０８ｂ 電子基底状態マニホールド５０８の振動励起状態
５１０ ＳＴＥＤ画像マーカーの電子励起状態マニホールド
５１０ａ 電子励起状態マニホールド５１０の振動基底状態
５１０ｂ 電子励起状態マニホールド５１０の振動励起状態
ν１ 第１波長に対応する第１光周波数
ν２ 第２波長に対応する第２光周波数
νａ 共焦点マーカーの発光周波数
νｂ ＳＴＥＤマーカーの発光周波数

Claims (23)

  1. サンプル（１０２）の２色共焦点共局在化顕微鏡法のための方法であって、前記サンプル（１０２）は共焦点画像マーカーおよび誘導放出抑制（ＳＴＥＤ）画像マーカーによりラベル付けされ、前記方法は、
    第１波長λ１を有する第１共焦点励起パルス（１０６ａ）および前記第１波長とは異なる第２波長λ２を有する第２共焦点励起パルス（１０６ｂ）を生成することと、
    前記第１共焦点励起パルス（１０６ａ）および前記第２共焦点励起パルス（１０６ｂ）を共焦点へ集光することと、
    前記第１波長を有するＳＴＥＤ励起パルス（１０８ａ）および前記第２波長を有するＳＴＥＤ抑制パルス（１０８ｂ）を生成することと、
    前記ＳＴＥＤ励起パルス（１０８ａ）および前記ＳＴＥＤ抑制パルス（１０８ｂ）をＳＴＥＤ焦点へ集光することと、
    前記サンプル（１０２）から放射される前記ＳＴＥＤ画像マーカーの発光波長λｂの光、および、前記共焦点画像マーカーの発光波長λａの光を検出することと、
    を含み、
    前記第１波長での（ｎ≧１である）ｎ光子励起は前記ＳＴＥＤ画像マーカーの励起遷移と共鳴し、
    前記第２波長は、前記ＳＴＥＤ画像マーカーの抑制遷移と共鳴し、
    前記第１波長を有する光子および前記第２波長を有する光子を伴う２光子励起は、前記共焦点画像マーカーの励起遷移と共鳴する、
    方法。
  2. 前記第１共焦点励起パルス（１０６ａ）および前記ＳＴＥＤ励起パルス（１０８ａ）は第１光路（１１０）に沿って伝搬し、
    前記第２共焦点励起パルス（１０６ｂ）および前記ＳＴＥＤ抑制パルス（１０８ｂ）は第２光路（１１４）に沿って伝搬し、
    前記第１光路（１１０）および前記第２光路（１１４）は光学素子（１１６）により空間的に重ね合わせられる、
    請求項１に記載の方法。
  3. 位相パターン（３０６）および／または強度パターンを前記ＳＴＥＤ抑制パルス（１０８ｂ）へ刷り込むことをさらに含み、前記位相パターン（３０６）および／または前記強度パターンは、ＳＴＥＤ焦点面内の前記ＳＴＥＤ抑制パルス（１０８ｂ）の強度分布（３０４）が前記ＳＴＥＤ焦点で極小値を示すように選択される、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記位相パターン（３０６）を前記ＳＴＥＤ抑制パルス（１０８ｂ）の位相分布へ適合させること、および／または、前記強度パターンを前記ＳＴＥＤ抑制パルス（１０８ｂ）の強度分布へ適合させること、をさらに含む、請求項３に記載の方法。
  5. 前記ＳＴＥＤ焦点における前記ＳＴＥＤ抑制パルス（１０８ｂ）の強度は前記ＳＴＥＤ焦点面内の前記ＳＴＥＤ抑制パルス（１０８ｂ）の前記強度分布（３０４）の最大値の１％未満であり、好ましくは０．１％未満である、請求項３または４に記載の方法。
  6. 共焦点面内の前記第２共焦点励起パルス（１０６ｂ）の強度分布（３００）は前記共焦点において極大値を示す、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記ＳＴＥＤ抑制パルス（１０８ｂ）のパルス幅ｔＳＴＥＤは前記第２共焦点励起パルス（１０６ｂ）のパルス幅ｔｃｏｎｆより大きい、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記共焦点における前記第１共焦点励起パルス（１０６ａ）と前記第２共焦点励起パルス（１０６ｂ）の間の遅延時間Δｔｃｏｎｆは前記第１共焦点励起パルス（１０６ａ）および／または前記第２共焦点励起パルス（１０６ｂ）の前記パルス幅の２５％未満であり、好ましくは１０％未満である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記ＳＴＥＤ焦点における前記ＳＴＥＤ励起パルス（１０８ａ）と前記ＳＴＥＤ抑制パルス（１０８ｂ）の間の遅延時間ΔｔＳＴＥＤは前記ＳＴＥＤ励起パルス（１０８ａ）のパルス幅以上である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記サンプル（１０２）の第１構成要素を共焦点画像マーカーでラベル付けすることと、
    前記サンプル（１０２）の第２構成要素をＳＴＥＤ画像マーカーでラベル付けすることと、
    をさらに含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記第１波長での２光子励起は前記ＳＴＥＤ画像マーカーの励起遷移と共鳴する、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記サンプル全体にわたって前記共焦点を走査して共焦点画像マーカーの空間分布を特徴付ける共焦点画像を取得することと、
    前記サンプル全体にわたって前記ＳＴＥＤ焦点を走査してＳＴＥＤ画像マーカーの空間分布を特徴付けるＳＴＥＤ画像を取得することと、
    前記共焦点画像と前記ＳＴＥＤ画像を結合して共局在画像を形成することと、をさらに含み、
    前記共局在画像は前記共焦点画像マーカーの前記空間分布と前記ＳＴＥＤ画像マーカーの前記空間分布の情報を含む、
    請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. サンプル（１０２）の２色共焦点共局在化顕微鏡法のための装置（１００）であって、
    第１共焦点励起パルス（１０６ａ）および第１波長λ１を有する誘導放出抑制（ＳＴＥＤ）励起パルス（１０８ａ）を生成するよう構成されている第１光源（１０４）と、
    第２共焦点励起パルス（１０６ｂ）および前記第１波長とは異なる第２波長λ２を有するＳＴＥＤ抑制パルス（１０８ｂ）を生成するよう構成されている第２光源（１１２）と、
    前記第２共焦点励起パルス（１０６ｂ）が焦点（１２２）へ集光される場合に前記第２共焦点励起パルス（１０６ｂ）の強度分布（３００）が前記焦点（１２２）において極大値を示し、前記ＳＴＥＤ抑制パルス（１０８ｂ）が前記焦点（１２２）へ集光される場合に前記ＳＴＥＤ抑制パルス（１０８ｂ）の強度分布（３０４）が前記焦点（１２２）において極小値を示すように、前記第２共焦点励起パルス（１０６ｂ）へ共焦点位相パターン（３０２）および／または共焦点強度パターンを選択的に刷り込み、前記ＳＴＥＤ抑制パルス（１０８ｂ）へＳＴＥＤ位相パターン（３０６）および／またはＳＴＥＤ強度パターンを選択的に刷り込むように構成されているビームシェイパー（１３０）と、
    を含む、装置（１００）。
  14. 前記ビームシェイパー（１３０）は、前記共焦点位相パターン（３０２）、前記共焦点強度パターン、前記ＳＴＥＤ位相パターン（３０６）、および／または前記ＳＴＥＤ強度パターンを調整するよう構成されている適応式ビームシェイパーである、請求項１３に記載の装置（１００）。
  15. 前記焦点（１２２）における前記ＳＴＥＤ抑制パルス（１０８ｂ）の強度は前記焦点面内の前記ＳＴＥＤ抑制パルス（１０８ｂ）の前記強度分布（３０４）の最大値の１％未満であり、好ましくは０．１％未満である、請求項１３または１４に記載の装置（１００）。
  16. 前記第１光源（１０４）および／または前記第２光源（１１２）はそれぞれ、前記第１波長および前記第２波長を調整するよう構成される、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の装置（１００）。
  17. 前記第２光源（１１２）は前記第２共焦点励起パルス（１０６ｂ）のパルス幅ｔｃｏｎｆおよび／または前記ＳＴＥＤ抑制パルス（１０８ｂ）のパルス幅ｔＳＴＥＤを調整するよう構成される、請求項１３～１６のいずれか一項に記載の装置（１００）。
  18. 前記第１共焦点励起パルス（１０６ａ）と前記第２共焦点励起パルス（１０６ｂ）の間の遅延時間Δｔｃｏｎｆおよび／または前記ＳＴＥＤ励起パルス（１０８ａ）と前記ＳＴＥＤ抑制パルス（１０８ｂ）の間の遅延時間ΔｔＳＴＥＤを調整するように構成されている時間遅延部（１３２）をさらに含む、請求項１３～１７のいずれか一項に記載の装置（１００）。
  19. 前記第１光源（１０４）および／または前記第２光源（１１２）により放射されたパルスを集光するための対物レンズ（１２０）をさらに含む、請求項１３～１８のいずれか一項に記載の装置（１００）。
  20. 前記第１光源（１０４）および／または前記第２光源（１１２）により放射されたパルスの伝搬方向を調整するように構成されているビーム走査装置（１２４）をさらに含む、請求項１３～１９のいずれか一項に記載の装置（１００）。
  21. 前記サンプル（１０２）から放射される発光波長の光を検出するための光検出器（１２６）をさらに含む、請求項１３～２０のいずれか一項に記載の装置（１００）。
  22. 画像分析部をさらに含み、前記画像分析部は、
    共焦点に関連付けられる共焦点画像信号を前記光検出器（１２６）から取得し、
    ＳＴＥＤ焦点に関連付けられるＳＴＥＤ画像信号を前記光検出器（１２６）から取得し、
    前記共焦点画像信号と前記ＳＴＥＤ画像信号を結合して、前記共焦点画像信号、前記共焦点、前記ＳＴＥＤ画像信号、および前記ＳＴＥＤ焦点についての情報を含む共局在画像を形成する、
    よう構成される、請求項２１に記載の装置（１００）。
  23. 前記遅延時間Δｔｃｏｎｆ、前記遅延時間ΔｔＳＴＥＤ、前記パルス幅ｔｃｏｎｆ、前記パルス幅ｔＳＴＥＤ、前記共焦点位相パターン（３０２）、前記共焦点強度パターン、前記ＳＴＥＤ位相パターン（３０４）、および／または前記ＳＴＥＤ強度パターンを設定するように構成されている制御装置（１３４）をさらに含む、請求項１３～２２のいずれか一項に記載の装置（１００）。
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