ES2952763T3 - Método y aparato para la excitación y detección no lineal simultánea de diferentes cromóforos a través de un amplio rango espectral utilizando impulsos de luz de banda ultra ancha y detección resuelta en el tiempo - Google Patents

Abstract

El método y el sistema descritos permiten la detección simultánea de muestras multicolores, por ejemplo en células o tejidos vivos, en una geometría experimental simple. Se basa en combinar fuentes láser ultracortas de banda ultraancha (10) con una configuración de microscopio de fluorescencia capaz de recopilar intensidades de fluorescencia y/o tiempos de llegada de fotones por volumen de excitación, así como señales no lineales, como segundo/tercer armónico y frecuencia suma. generación. En la descripción, el método presentado se denomina "método SyncRGB". (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Método y aparato para la excitación y detección no lineal simultánea de diferentes cromóforos a través de un amplio rango espectral utilizando impulsos de luz de banda ultra ancha y detección resuelta en el tiempo

Campo técnico de la invención

La presente invención se refiere a un método y a un aparato para la formación de bioimagenología no lineal simultánea.

Antecedentes

La microscopía óptica y especialmente la microscopía multifotón (microscopía MP) ha sido una piedra angular de la bioimagenología durante años. La microscopía MP permite obtener imagenología de alta resolución en el plano óptico en tanto que el seccionamiento de la muestra en la dirección de profundidad se realiza por el confinamiento espacial intrínseco del proceso no lineal que crea un fuerte contraste del volumen focal contra el fondo. El confinamiento del volumen focal en tres dimensiones hace posible construir imágenes 3D al mover el volumen focal a través de la muestra. Además, la información contenida por cada píxel en la imagen 3D puede resultar de diferentes procesos de interacción no lineal y realizaciones de medición, es decir, intensidad de fluorescencia, tiempo de vida de fluorescencia o generación de armónicos. Los cromóforos de la muestra se excitan por una fuente de láser impulsado, habitualmente con un ancho de banda estrecho en comparación al espectro de absorción de un tinte habitual, por ejemplo, en el caso de un sistema de láser impulsado convencional de ~100 fs centrado a 800 nm, el espectro de láser tiene un ancho de banda estrecho de ~15nm FWHM, que cubre habitualmente sólo una fracción de un espectro de absorción de tinte, este último que cubre habitualmente rangos espectrales en el espectro visible, con anchos de banda de ~100nm. Un método altamente deseado, especialmente en muestras biológicas, es obtener una excitación simultánea eficiente de múltiples cromóforos y estructuras generadoras de señales no lineales, en tanto que son capaces de distinguir sus señales.

Se han implementado varias técnicas hacia este objetivo en los últimos años que muestran varias limitaciones que se superan por la invención ahora divulgada.

El primer ejemplo combina dos sistemas de láser de femtosegundo comerciales [Spectra-Physics Tsunami (750-950 nm) y Mai Tai (960-1040 nm) con un oscilador paramétrico óptico (OPO) adicional para extender el rango de longitud de onda del sistema Mai Tai (1100-1600 nm) [1]. El sistema en un momento determinado produce dos longitudes de onda láser de excitación distintas, ya sea del sistema Tsunami y Mai Tai o del Tsunami y Mai Tai con el sistema OPAL adicional. La configuración incluye cuatro detectores (Azul 447 ± 30 nm, Verde 520 ± 17,5 nm, Rojo 580130 nm y Rojo Profundo 697 ± 25 nm) y, por lo tanto, es capaz de detectar simultáneamente hasta cuatro cromóforos si los espectros de absorción se traslapan con las dos longitudes de onda de excitación seleccionadas.

El segundo ejemplo consta de usar un láser de femtosegundo (fs), un OPO y una línea de retardo para la sincronización temporal de impulsos de láser [2]. Esta configuración cuando los dos láseres no están sincronizados puede generar fluorescencia de dos fotones azul y roja y una más alta generación de armónicos. Cuando los impulsos del láser de fs y el OPO están sincronizados da lugar a los llamados procesos de dos haces, tal como generación de suma-frecuencia y fluorescencia de dos fotones de dos colores (los dos impulsos de fs que se combinan tienen diferente frecuencia).

El tercer ejemplo usa un láser de fibra de femtosegundos a 1550 nm, seguido por doble desplazamiento al rojo del espectro de láser principal por una fibra de cristal fotónico (PCF), por lo tanto, que produce dos longitudes de onda adicionales, con las tres longitudes de onda duplicadas posteriormente para producir longitudes de onda de excitación fijas centradas en 775, 864 y 950 nm [3].

El cuarto ejemplo es un principio similar en el que un láser de fs de 1030 nm (infrarrojo cercano) y una fibra no lineal se usan para crear simultáneamente radiación de Cherenkov tanto azul (600-800 nm) como desplazada al rojo (1,2-1,4 μm) [4]. Se utiliza un filtro de fuente para seleccionar una de las tres bandas de excitación en el momento y un filtro de emisiones para los tres canales (azul, verde y rojo).

Los cuatro ejemplos anteriores usan la señal de intensidad como realización a fin de distinguir diferentes cromóforos. La microscopía de imagenología de fluorescencia de por vida (FLIM) es un método alternativo para distinguir varios fluoróforos no por su intensidad sino por su contraste de fluorescencia de por vida. Este método se puede utilizar para distinguir tintes que tienen espectros de absorción similares, pero diferentes vidas útiles de estado de excitación. A menudo, esta técnica también se usa para detectar diferencias en el pH local, la temperatura u otros parámetros físicos que influyen en la vida útil de estado excitado de un tinte. La técnica de FLIM se implementa habitualmente con fuentes de excitación tal como láseres de diodo de picosegundos impulsados de una longitud de onda individual o fuentes de láser de femtosegundos sintonizables y la detección de señal es con un solo detector, múltiples detectores o una rejilla acoplada a una disposición de detectores [6].

El artículo [8] de DAAN BRINKS ET AL: "Coherent control of single molecules at room temperature", FARADAY DISCUSSIONS, vol. 153, 22 Julio 2011 (2011-07-22), página 51, GB, ISSN: 1359-6640, DOI: 10.1039/clfd00087j, divulga el control coherente de moléculas individuales a temperatura ambiente, es decir, la observación y manipulación de la interferencia de paquetes de ondas vibracionales en moléculas individuales en condiciones ambientales. La adaptación de la distribución de tiempo y fase del campo de excitación óptica a la dinámica de cada molécula da por resultado un grado superior de control en comparación al enfoque de conjunto. La inversión de fase invierte la respuesta molecular, lo que confirma el control de la coherencia cuántica. Los mapas de fase temporal muestran una rica diversidad en la dinámica de estado excitado entre moléculas diferentes, pero químicamente idénticas. El enfoque presentado en ese artículo se considera prometedor para el control coherente de unidad individual en sistemas multicromofóricos.

Los métodos mencionados anteriormente se limitan por: (a) longitudes de onda de excitación de láser individuales que requieren barrer la longitud de onda de láser o seleccionar una longitud de onda de láser después de otra, dando por resultado un seguimiento no simultáneo de todos los cromóforos en un barrido individual; (b) usar múltiples longitudes de onda de láser que dan por resultado probabilidad incrementada de toxicidad fotoinducida en la muestra; (c) desafiar la coalineación de estos múltiples láseres en el enfoque de un objetivo; (d) requisito de compresión de impulso de cada láser en el plano de muestra para la generación de señal optimizada en una configuración de microscopio; (e) Limitación de la técnica de FLIM: la excitación de un fotón no permite la iluminación de tejido profundo. (f) Un esquema de excitación multilínea de fotones puede dar por resultado el traslape de espectros de excitación y emisión que requieren una filtración compleja, por ejemplo, con filtros multilínea, asociados a la pérdida de señal.

La presente invención se define en las reivindicaciones 1 y 5.

Con la invención, el método de SyncRGB, se superan las limitaciones (a) - (f) y se proporciona un sistema fácil de implementar que requiere habilidades y procedimientos de alineación menores.

Breve descripción

La presente invención define un método para la formación simultánea de imagenología no lineales multicolor de múltiples cromóforos de diferentes tipos en una muestra de acuerdo con la reivindicación 1.

En una posible realización, en el método, la muestra interactúa con al menos dos fotones de los impulsos de luz de banda ultra ancha ultracorta que generan una respuesta no lineal que comprende al menos dos fotones de fluorescencia, generación de armónicos más altos, generación de suma-frecuencia o generación de diferencia-frecuencia.

En una posible realización, la información de señal no lineal resuelta en el tiempo en el método obtenido mediante FLIM de dominio de tiempo mediante intensificadores de imagen conmutados, FLIM de dominio de frecuencia, conteo de fotones individuales correlacionados en el tiempo o cámara de barrido ultrarrápido.

En una posible realización, el método procesa la señal no lineal resuelta en el tiempo que comprende cualquier representación de imagen 1D, 2D o 3D que correlaciona la información de señal no lineal medida con una posición de muestra específica.

La presente invención también define un sistema de acuerdo con la reivindicación 5 configurado para realizar el método definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para la obtención simultánea de imagenología no lineal multicolor de múltiples cromóforos de diferentes tipos en una muestra.

En una posible realización, el sistema de luz de excitación comprende un láser de luz de femtosegundos impulsados de banda ultra ancha ultracorta capaz de generar duraciones limitadas de Fourier de impulsos por debajo de 100 fs.

En una posible realización, la sección de caracterización y compresión de impulsos de la luz de excitación comprende técnicas de caracterización que permiten la medición de la fase espectral y el uso de la información de fase espectral para comprimir el impulso de láser de excitación de banda ultra ancha hasta duraciones ultracortas casi limitadas por Fourier en el plano de muestra.

En una posible realización, la unidad de enfoque de un sistema de luz de excitación comprende uno de los siguientes elementos ópticos: lente individual, combinaciones de lentes, objetivos de microscopio, objetivos de inmersión, objetivos de inmersión y espejos de enfoque.

En una posible realización, los medios para guiar este sistema de luz de excitación a la muestra y la señal no lineal generada posteriormente a los detectores comprenden al menos uno de los siguientes elementos ópticos: espejo metálico, espejo dicroico, prismas, rejillas, o combinaciones de estos elementos.

En una posible realización, la sección para impedir que la luz de excitación alcance el sistema de detección en el sistema de luz de excitación se realiza por filtros ópticos que incluyen filtros de paso de banda, de paso corto y multibanda, o unidades de detección selectiva de longitud de onda, usando elementos dispersivos, tal como prismas, rejillas para lograr la selección de longitud de onda, o usando detectores con sensibilidad de rango de longitud de onda selectiva, por ejemplo, debido a que el transductor optoelectrónico que es con base en material activo óptico con sensibilidad en uno o múltiples rangos de longitud de onda específicos.

En una posible realización, el plano de muestra de un sistema de luz de excitación comprende un tubo fotomultiplicador, PMT, fotodiodo rápido, fotodiodo de avalancha, cámara de barrido ultrarrápido, EM-CCD o sCMOS.

En una posible realización, la sección de detección del sistema de luz de excitación se utiliza para detectar porciones específicas de la señal no lineal de la muestra en el plano de muestra.

En otro ejemplo, la sección de barrido del sistema de luz de excitación comprende microescáneres, nanoescáneres, piezoescáneres o galvoescáneres.

En una posible realización, la sección de control para la correlación de la detección con el barrido en el sistema de luz de excitación se realiza mediante un software de control de dispositivo, tal que la señal no lineal detectada del plano de muestra se puede correlacionar con los puntos de posición de barrido en espacio 1D, 2D o 3D.

En una posible realización, la información de señal no lineal resuelta por la sección de procesamiento de señal del sistema de luz de excitación se correlaciona con la posición de la muestra mediante un software de procesamiento de datos, o manualmente.

En otro ejemplo, el sistema de luz de excitación comprende un software de sección de análisis capaz de determinar parámetros de desintegración a partir de histogramas de tiempo de llegada de fotones.

Descripción general

Para superar las limitaciones de los métodos de la técnica anterior, se aplica una fuente ultrarrápida de banda ultra ancha para la excitación simultánea de múltiples cromóforos, incluso si los dos espectros de absorción de fotones correspondientes están espectralmente bien separados.

En esta solicitud, se considera que un láser de banda ultra ancha es un láser que emite un espectro con un ancho de banda capaz de soportar impulsos de pocos ciclos. Por ejemplo, si el láser tiene una longitud de onda central de 800 nm, se considera un láser de banda ultra ancha si su espectro tiene más de 100 nm de ancho de banda. Esto corresponde a un impulso de 10 fs (menos de 4 ciclos ópticos de duración), asumiendo un perfil espectral y temporal gaussiano. Para unos pocos ciclos, se considera que un impulso láser de pocos ciclos contiene sólo unas pocas oscilaciones del campo eléctrico bajo su envoltura temporal, donde cada oscilación se llama ciclo. Un impulso de láser de pocos ciclos habitualmente tiene entre 1 y 5 ciclos debajo de su envoltura.

Recientemente, se utilizaron láseres de banda ultra ancha para experimentos de control coherente en una configuración de microscopio [7-9], pero hasta donde se sabe, la invención es la primera en la que se utiliza un láser de pocos ciclos ultracortos, de menos de 10 fs, para la bioimagenología multicolor simultánea. Se demuestra un rendimiento ventajoso con muestras pertinentes/representativas, es decir, una muestra de células 2D etiquetadas multicolor, así como un corte de tejido, cuando se compara la calidad de formación de imagenología de tejido multicolor y profundo con la de una fuente de láser de fs impulsada estándar (por ejemplo, >100 fs).

En esta solicitud, se considera que un láser de impulso ultracorto es un láser que emite impulsos de luz ultracortos, con duraciones temporales en el rango de femtosegundos a diez picosegundos. En esta invención, se hace referencia a femtosegundos.

Por el uso de un láser de banda ancha de femtosegundos impulsados ultracorto (de pocos ciclos), se pueden excitar varios cromóforos simultáneamente y la detección se puede resolver con base en la vida útil de fluorescencia o la información de intensidad integrada en el tiempo.

El método de SyncRGB se basa en el principio de la microscopía MP, donde se combinan dos o más fotones de longitud de onda para excitar el cromóforo. En un microscopio MP, la fuente de láser se dirige a la muestra por un espejo dicroico y a través de un objetivo de microscopio de alta apertura numérica (alta NA). Los componentes principales de una configuración de microscopio MP se pueden adquirir por separado y armar para una solución de microscopio personalizada o comprar como una solución de microscopio preconfigurado completamente integrado.

El uso de una fuente de láser de banda ultra ancha implica que para la misma potencia media la intensidad por longitud de onda es menor que en una fuente de láser de banda estrecha a la misma potencia media, debido a que la potencia de láser total se distribuye sobre un área grande en el espacio de frecuencia. Puesto que la intensidad de fluorescencia depende no linealmente de la intensidad de excitación (cuadrática para procesos de dos fotones) y tiene una dependencia r 1 de la duración de impulso ^t , si el impulso se limita por la transformada, el uso de un sistema de impulso ultracorto puede proporcionar suficiente señal incluso cuando sólo hay un traslape parcial de los espectros de excitación con los espectros absorbentes del cromóforo, como se ilustra en la FIGURA 3.a.

Para una relación óptima de señal a ruido y la intensidad de señal, se necesita una distribución de impulso de banda ancha completa y compresión en el enfoque. Para optimizar las distorsiones relacionadas con la dispersión del perfil de impulso temporal en el enfoque, especialmente después de que los impulsos cruzan elementos altamente dispersivos como el objetivo de alta NA, utilizamos la técnica robusta de caracterización de impulso de barrido d de haz individual y bien probada [10,11].

La configuración de la invención permite la detección paralela y simultánea de diversos colores, que es un prerrequisito para la observación de interacciones de proteína-proteína en tiempo real en células vivas y para el seguimiento de la bioenergética clínicamente pertinente de las células.

La implementación del método de SyncRGB requiere: una fuente de láser impulsado de banda ancha ultra corta acoplada a un microscopio, un sistema de medición y control para comprimir y caracterizar el láser impulsado de banda ancha ultra corta, una detección dinámica, medios de filtro para la detección selectiva de longitud de onda de la señal, un software de control que garantiza el barrido sincronizado y la recolección de señales, un software de análisis de datos para el análisis de señales en cada punto de datos.

La detección dinámica se podría implementar utilizando electrónica de conteo de fotones individuales correlacionada en el tiempo, y los medios de filtro podrían ser filtros de paso de banda, filtros de paso corto o detectores sensibles en rangos de longitud de onda específicos.

Las principales ventajas del método son que (i) se detectan diferentes tipos de cromóforos en un barrido individual sin sintonización de láser o múltiples láseres y (ii) la detección de señal se puede realizar con un sólo detector de conteo de fotones. Por lo tanto, el sistema de SyncRGB es más rápido, conduce a una menor fototoxicidad y es mucho más fácil de configurar y usar, creando de esta manera un sistema mucho menos costoso que es más preciso que los sistemas y métodos convencionales.

La compensación del chirrido de impulso introducido por elementos ópticos dispersivos en el microscopio a través de la optimización de impulso de la fuente de láser de banda ultra ancha en el plano de muestra permite condiciones optimizadas en múltiples longitudes de onda adecuadas para excitar múltiples tipos de cromóforos.

La excitación multifotónica crea un volumen muy pequeño y bien definido en tres dimensiones con una intensidad muy alta, que, por lo tanto, está bien discriminado contra el fondo.

Se prevén beneficios similares del uso de esta fuente de láser de banda ultra ancha para la microfabricación no lineal mediante procesos de absorción multifotónica en un material sensible a la luz o mediante un proceso de ablación.

Breve descripción de los dibujos

Para una comprensión más sencilla de la presente solicitud, las FIGURAS anexadas representan realizaciones que, sin embargo, no pretenden limitar el estado de la técnica divulgado en la presente.

Figura 1: Dibujo esquemático de nuestro aparato de acuerdo con la presente invención.

Figura 2: Ampliación del plano de muestra de acuerdo con la presente invención.

Figura 3: Caracterización de impulsos y trazas de barrido d de compresión de la fuente láser de banda ultra ancha y ejemplos de fuentes de muestra y láser de una realización específica de acuerdo con la invención. a) Espectros normalizados de una banda estrecha de 70 fs y de un sistema de láser de banda ultra ancha de 7 fs con espectros de absorción de fotón individual de tintes fluorescentes habituales que forman parte de una muestra. b) Mediciones de autocorrelación del láser de 70 fs en las configuraciones no comprimidas (curvas grises, ancho de impulso de 200 fs) y comprimidas (curvas negras, ancho de impulso de 70 fs), medidas en el enfoque del objetivo de microscopio (FIGURAS 2-44). La duración limitada por Fourier del láser de banda estrecha es de 70 fs, por lo tanto, las mediciones de autocorrelación indican que el láser está cerca de la compresión óptima. c) mediciones de barrido d del láser de banda ultra ancha en el enfoque (44). Superior: Traza de barrido d medido. Inferior: Traza de barrido d recuperado, que corresponde a un impulso de 7 fs a una compresión óptima. d) Comparación de perfiles de intensidad de impulso medidos. Curva negra - impulso de láser de 7 fs medido en el enfoque (44) con barrido d, que tiene casi 80% de la potencia en el pico limitado por transformada. Curva gris: Impulso de láser gaussiano con FWHM de intensidad de 70 fs y la misma potencia de láser promedio que el impulso de 7 fs. La intensidad pico alcanzable con el láser de banda estrecha de 70 fs es aproximadamente 10 veces menor que para el láser de banda ultra ancha de 7 fs.

Figura 4: Comparación de una (a) FLIM MP estándar que usa un láser de fs de banda estrecha individual y (b) datos de FLIM de SyncRGB obtenidos con una realización de la invención que usa un láser de banda ultra ancha para mediciones de MP-FLIM. (a) Imagen de FLIM MP de 2D FluoCellsMR #1 obtenida con sistema láser de banda estrecha de 70 fs a 730 nm, que muestra sólo absorción resonante con DAPI en los núcleos celulares (blanco) y Alexa FluorMR 488 en el citoplasma (blanco), que tienen vidas útiles similares y dan lugar a una vida útil de principio a fin de la célula. Otras áreas en el citoplasma no muestran ninguna señal (negro). (b) Sistema láser de pocos ciclos de banda ultra ancha de 7 fs resonante con los tres cromóforos (DAPI, AlexaMR 488 y Mito TrackerMR Red que etiqueta las mitocondrias ubicadas en el citoplasma) en la muestra simultáneamente, dando lugar a tres vidas útiles distintas de principio a fin de la célula y permitiendo la identificación clara de los constituyentes celulares distintivos (blanco - núcleo/DAPI, gris claro - filamentos de actina/AlexaMR488, gris oscuro - mictocondria/MitoTrackerMR). Ambas imágenes se tomaron con una potencia promedio de 36 mW para ambos sistemas de láser con 110x110 píxeles y un tiempo de permanencia de píxeles de 30 ms.

Descripción de una realización

Se describe una realización de la invención. La descripción de esta realización es ejemplar y no pretende limitar el alcance de la invención.

La FIGURA esquemática del sistema se da en la FIGURA 1, que muestra los componentes principales del método de SyncRGB, junto con una vista de ampliación del plano de muestra en la FIGURA 2. La fuente de luz de banda ultra ancha ultracorta (10) se comprime usando un compresor de impulso óptico (11). Una señal de sincronización electrónica (40) que contiene la información de tasa de repetición de la fuente de luz se conectará para sincronización con la electrónica de detección (36). La luz de banda ultra ancha ultracorta pasa por un elemento óptico parcialmente reflectante (18) antes de alcanzar el elemento de enfoque (20) que enfoca la luz de banda ultra ancha ultracorta en la muestra (24). El volumen focal se barre espacialmente a través de la muestra por barrido de platina (22) o barrido de haz (opción no mostrada en la FIGURA). El barrido se controla por una interfaz de software, en tanto que para una medición de punto individual no se requiere software de control. La señal no lineal se detecta con un detector de recuento de fotones (32), en el camino hacia el detector se impide que la luz de banda ultra ancha ultracorta restante alcance el sistema de detección ya sea por un elemento óptico (26) o usando un transductor optoelectrónico que es insensible al rango de longitud de onda de la luz de banda ultra ancha ultracorta de la fuente de luz. La señal electrónica del detector se conecta a la electrónica de recuento de fotones (36) y junto con la información de la señal de sincronización, la señal resuelta en el tiempo se puede recuperar y leerse por la computadora (41) para construir histogramas de tiempo de llegada de fotones.

La computadora se utiliza para controlar la detección de escáner (22) con el barrido a fin de adquirir la señal no lineal asociada a las posiciones de barrido en el plano de muestra. Los datos se leen con una computadora (41). A partir de los histogramas de tiempo de llegada de fotones recolectados, las vídas útiles de fluorescencia se pueden determinar utilizando un algoritmo de ajuste, incluso si el píxel contiene múltiples cromóforos. A partir de los histogramas de tiempo de llegada de fotones en cada volumen de barrido o píxel, se puede crear una intensidad 2D o 3D de la imagen de FLIM.

Los resultados de una realización específica de la invención, donde se usa un láser de Ti:zafiro de banda ultra ancha ultracorta con espectros de impulso que cubren el rango espectral de 690 a 1040 nm se dan en la FIGURA 3 y la FIGURA 4.

El láser de pocos ciclos se comprime en el enfoque del objetivo del microscopio utilizando el método de barrido d por el registro de las trazas de barrido d (ver FIGURA 3c), que se puede utilizar para determinar la fase espectral del impulso de láser y para comprimir el impulso a su longitud de impulso limitado por transformada, ~7 fs (ver FIGURA 3d). Se muestra adicionalmente el espectro de un láser de fs estándar (aquí un sistema de tsunami de espectrosfísica) (FIGURA 3a) y las curvas de autocorrelación interferométrica obtenidas cuando no se comprime (ver FIGURA 3b, gris oscuro) con una longitud de impulso de aproximadamente ~200 fs y cuando se comprime compensando la dispersión en el camino hacia el enfoque del objetivo de microscopio (gris claro) que alcanza aproximadamente una duración de impulso limitado por transformada de ~70 fs.

La tasa de repetición de láser es de 80 MHz para ambos sistemas de láser. La señal de SINCRONIZACIÓN se recoge por un fotodiodo rápido conectado a una tarjeta de correlación electrónica rápida para mediciones sincronizadas de conteo de fotones individuales correlacionados en el tiempo (TCSPC).

El láser de femtosegundos se acopla a una plataforma de microscopio, pasando un espejo metálico parcialmente reflectante/transmisor y se enfoca usando un objetivo de microscopio, y la señal se recolecta en configuración epi después de pasar un filtro de paso corto de 680 nm y dos filtros adicionales montados en serie. El detector es un PMT de conteo de fotones. La salida de detector se conecta a la tarjeta de correlación electrónica rápida.

Se usa el método de SyncRGB para analizar la señal no lineal de tres tipos de moléculas fluorescentes con emisión en el rango visible, que se define aquí como el rango R: rojo, G: verde y B: azul RGB, de aproximadamente 400 a 700 nm, utilizando el láser de femtosegundos de banda ancha para la excitación de dos fotones y la tecnología de TCSPC para la adquisición de señal no lineal resuelta en el tiempo.

La muestra elegida es una muestra de células fijas (FluoCellMR #1, Thermofisher) etiquetada con tres tintes diferentes. En la FIGURA 3a se muestran los espectros de absorción de dos fotones de esos tres tintes con absorción a través del rango RGB, es decir, DAPI, AlexaMR 488, y CMXRoc (MitoTrackerMR Red).

La muestra se monta en un retenedor de muestra en la parte superior de una platina de barrido controlado por computadora. La platina se barre para mover la muestra a través del vóxel de excitación. Usando una interfaz de software de control, la posición de barrido se puede correlacionar con la información de señal no lineal del plano de muestra.

La información de señal no lineal se procesa para reconstruir los datos de imagen (ver FIGURA 4). En cada posición, la información de señal no lineal resuelta en el tiempo se detecta y recolecta en la forma de histogramas de tiempo de llegada de fotones. Estas señales se analizan posteriormente usando un método de análisis de curva de disminución. En este caso, el tiempo de disminución medio se determina al construir la media sobre los componentes de disminución pesados que resultan de un ajuste multiexponencial de los histogramas de tiempo de llegada de fotones.

Los méritos del método de SyncRGB se hacen evidentes al comparar la información obtenida con una configuración de Microscopía de Imagenología de Fluorescencia de Por Vida de Fluorescencia Multifotónica (MP-FLIM) estándar con base en un láser de femtosegundos de banda relativamente estrecha.

En tanto que para el láser de banda estrecha la potencia de excitación está disponible sólo en un rango espectral restringido y sólo una fracción de los tintes con emisión visible se excitan de manera resonante mediante un proceso de absorción de dos fotones (ver FIGURA 4a), en el caso de la fuente de banda ultra ancha ultracorta, la intensidad de excitación se proporciona en cambio en todo el rango espectral, lo que conduce a condiciones de excitación resonante para los tres tintes dentro de la muestra (FIGURA 4b).

En un barrido de SyncRGB individual, la posición de los múltiples tintes se puede recuperar por lo tanto simultáneamente.

Referencias

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Esta descripción, naturalmente, no impone ninguna restricción a las realizaciones presentadas en este documento, y cualquier persona con conocimiento en este campo podrá prever muchas posibilidades para la modificación de la misma, sin apartarse de la invención como se define en las reivindicaciones.

Las siguientes reivindicaciones definen adicionalmente las realizaciones preferidas.

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Un método para obtener imagenología no lineal multicolor simultánea de múltiples cromóforos de diferentes tipos en una muestra, el método que comprende:

a) emitir impulsos de luz de banda ancha ultracorta desde un sistema láser de pocos ciclos para la excitación de los múltiples cromóforos;

b) enfocar los impulsos de luz de banda ancha ultracorta en el plano de muestra de la muestra;

c) controlar la duración temporal de impulsos de luz de banda ancha ultracorta enfocados en el plano de muestra; d) impedir que los impulsos de luz de banda ancha ultracortos lleguen directamente al sistema de detección;

e) medir las señales no lineales generadas en el plano de muestra;

f) barrer la excitación y la medición en puntos individuales en una dimensión, "1D", o punto por punto en el plano de muestra en dos dimensiones, "2D", o punto por punto a través de planos focales en tres dimensiones, "3D" ;

g) sincronizar la medición de las señales no lineales generadas en el plano de muestra con un detector de conteo de fotones a fin de adquirir información de señal no lineal resuelta en el tiempo en histogramas de tiempo de llegada de fotones desde el plano de muestra;

h) procesar la información de señal no lineal resuelta en el tiempo;

i) analizar la información de señal no lineal resuelta en el tiempo para la determinación de los parámetros de disminución asociados a los histogramas de tiempo de llegada de fotones en los puntos individuales en una dimensión, "1D", o punto por punto en el plano de muestra en dos dimensiones, "2D", o punto por punto a través de planos focales en tres dimensiones, "3D".

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la muestra interactúa con al menos dos fotones de los impulsos de luz de banda ancha ultracorta que generan una respuesta no lineal que comprende al menos dos fotones de fluorescencia, generación de armónicos más altos, generación de suma-frecuencia o generación de diferencia-frecuencia.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la información de señal no lineal resuelta en el tiempo se obtiene mediante Microscopía de Imagenología de Fluorescencia de Por Vida de dominio de tiempo, "FLIM", por intensificadores de imagen conmutados, FLIM de dominio de frecuencia, conteo de fotones individuales correlacionados en el tiempo o cámara de barrido ultrarrápido.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el procesamiento de la señal no lineal resuelta en el tiempo comprende cualquier representación de imagen 1D, 2D o 3D que correlaciona la información de señal no lineal medida con una posición de muestra específica.

5. Un sistema configurado para realizar el método descrito de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para la imagenología no lineal multicolor simultánea de múltiples cromóforos de diferentes tipos en una muestra, que comprende:

a) un sistema de luz de excitación (10) que emite impulsos de láser desde un sistema de láser de pocos ciclos para la excitación de los múltiples cromóforos;

b) un elemento de enfoque (20) ajustado para producir un punto de láser casi limitado por difracción de estos simpulsos de láser de excitación en un plano de muestra (24);

c) una sección de caracterización y compresión de impulsos (11) configurada para controlar los impulsos de láser enfocados para distribuir impulsos limitados por transformada cercana en el plano de muestra (24);

d) un elemento óptico (18) que guía los impulsos de láser al plano de muestra (24) y, por consiguiente, dirige la señal no lineal a los detectores (32);

e) un elemento óptico (26) que impide que los impulsos de láser alcancen directamente a los detectores (32);

f) una electrónica de conteo de fotones (36) configurada para detectar fotones individuales y tiempos de llegada de fotones a partir de la señal no lineal generada a partir de la muestra;

g) una sección de barrido (22) configurada para realizar excitación y medición en puntos individuales en una dimensión, "1D", o punto por punto en el plano de muestra en dos dimensiones, "2D", o punto por punto a través de planos focales en tres dimensiones, "3D";

h) una sección de control (36) para la correlación de la detección con el barrido a fin de adquirir señales no lineales asociadas a las posiciones de barrido en el plano de muestra (24);

i) una sección de procesamiento de señal (41) configurada para proporcionar información con relación a las señales no lineales resueltas en el tiempo;

j) una sección de análisis configurada para determinar los parámetros de desintegración asociados a los histogramas de tiempo de llegada de fotones en cada uno de los puntos individuales en una dimensión, "1D", o punto por punto en el plano de muestra en dos dimensiones, "2D", o punto por punto a través de planos focales en tres dimensiones, "3D".

6. Un sistema de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el sistema de luz de excitación (10) comprende un láser de femtosegundos impulsados ultracortos con un espectro configurado para excitar al menos dos fluoróforos simultáneamente.

7. Un sistema de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el elemento de enfoque (20) comprende uno de los siguientes elementos ópticos: lente individual, combinaciones de lentes, objetivos de microscopio, objetivos de inmersión, objetivos de inmersión, y espejos de enfoque.

8. Un sistema de acuerdo con la reivindicación 5, en donde la sección de caracterización y compresión de impulsos (11) se configura para medir la fase espectral, y con base en la información de fase espectral, comprimir el impulso de láser de excitación de banda ancha a duraciones ultracortas casi limitadas por Fourier en el plano de muestra.

9. Un sistema de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el elemento óptico (18) comprende al menos uno de los siguientes elementos ópticos: espejo metálico, espejo dicroico, prisma, rejilla, o combinaciones de estos elementos.

10. Un sistema de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el elemento óptico (26) comprende al menos uno de filtros ópticos de paso de banda, paso corto y multibanda, unidades de detección selectiva de longitud de onda, usando elementos dispersivos, tal como prismas y rejillas o detectores con sensibilidad de rango de longitud de onda selectiva.

11. Un sistema de acuerdo con la reivindicación 5, en donde los detectores de conteo de fotones (32) comprenden al menos uno de un tubo foto multiplicador individual, "PMT", fotodiodo rápido, fotodiodo de avalancha, cámara de barrido ultrarrápido, sensor de EM-CCD o sCMOS.

12. Un sistema de acuerdo con la reivindicación 5, en donde los detectores de recuento de fotones (32) comprenden múltiples detectores para detectar porciones espectrales específicas de la señal no lineal de la muestra.

13. Un sistema de acuerdo con la reivindicación 5, en donde la sección de control para la correlación de la detección con el barrido se realiza mediante un software de control de dispositivo, que comprende instrucciones para provocar que la sección de control correlacione la señal no lineal detectada del plano de muestra con los puntos de posición de barrido en espacio 1D, 2D o 3D.

14. Un sistema de acuerdo con la reivindicación 5, en donde la sección de procesamiento de señales correlaciona la señal no lineal de resolución de tiempo con la posición de muestra mediante un software de procesamiento de datos, que comprende instrucciones para provocar que la sección de procesamiento de señales correlacione la señal no lineal de resolución de tiempo con la posición de muestra, o manualmente.