WO2015083219A1 - 細胞活性計測装置および計測方法 - Google Patents

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WO2015083219A1
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measurement
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plate
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亮介 高橋
明子 久田
末永　智一
珠玖　仁
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株式会社日立製作所
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Definitions

  • the present invention relates to a cell activity measuring device and a measuring method, and more particularly to a technique for measuring the respiratory activity of a cell.
  • Patent Documents 1 and 2 Electrochemical analysis methods have been disclosed as methods for evaluating the activity of a single mammalian embryo (Patent Documents 1 and 2, Non-Patent Document 1).
  • the methods described in Patent Documents 1 and 2 are characterized in that the respiration activity of cells can be evaluated non-invasively by measuring a reduction current that flows when a constant voltage is applied to a biological sample.
  • Patent Documents 1 and 2 are employed in fertilized egg evaluation of mammalian embryos used for in vitro fertilization in the field of livestock, and fertilization that has been difficult to determine by conventional morphological evaluation. Usefulness has been found in egg evaluation.
  • a fertilized egg which is a biological sample, is manually moved one by one to a sample cell for measurement.
  • the sample cell can hold only six samples, and therefore it is difficult to simultaneously evaluate multiple samples required in the pharmaceutical development field.
  • An object of the present invention is to provide a technique for realizing high throughput in measurement of cell activity.
  • the cell activity measuring device of the present invention has a holding part capable of holding a plate on which a plurality of partition parts for holding cells are formed, and a plurality of partition parts for each of the cells held in the plurality of partition parts. It has a measurement part which measures the electric current which flows in the culture solution in a accommodating part, and a control part which controls the movement of the said holding
  • the cell activity measuring method of the present invention includes (a) a step of preparing a plate in which cells are arranged in a plurality of partition portions of a housing portion having a plurality of partition portions, and (b) a holding portion that holds the plate, And (c) a step of measuring the current flowing in the culture solution in the storage unit for each of the cells held in the plurality of partition units. And the movement of a holding
  • High throughput can be achieved in cell activity measurement.
  • FIG. 5 is a sectional view showing a BB cutting structure of the plate shown in FIG. 4. It is an enlarged plan view which shows the structure of the hole shown in FIG. FIG.
  • FIG. 9 is a partial cross-sectional view showing the EE cutting structure of the hole shown in FIG. 8. It is the top view and transmission figure which show an example of the structure of the well, hole, and nano pillar in the plate shown in FIG. It is a fragmentary top view which shows an example of the structure of the hole in the plate shown in FIG. It is a fragmentary top view which shows an example of the structure which has arrange
  • FIG. 1 It is a block diagram which shows an example of a structure of the microscope system of Embodiment 1 of this invention. It is a block diagram which shows an example of the structure of the reference pole integrated electrode of Embodiment 1 of this invention. It is a fragmentary top view which shows an example of the structure of the screen of the touchscreen used in Embodiment 1 of this invention. It is a fragmentary sectional view which shows an example of the structure in the well at the time of the cell activity measurement of Embodiment 1 of this invention. It is a partial expanded sectional view which shows the detail of the structure at the time of the cell activity measurement shown in FIG.
  • the constituent elements are not necessarily indispensable unless otherwise specified and clearly considered essential in principle. Needless to say.
  • cells are cultured using a culture plate (hereinafter, also simply referred to as a plate), and the respiration rate (activity (activity) of a three-dimensional tissue (spheroid) or two-dimensional planar tissue that is a cell mass is measured.
  • a technique for performing (measurement) which is also simply referred to as activity, will be described.
  • FIG. 1 is a perspective view showing the structure of a plate used in Embodiment 1 of the present invention
  • FIG. 2 is a back view showing the structure of the plate shown in FIG. 1
  • FIG. 3 is a side view showing the structure of the plate shown in FIG. 4
  • FIG. 5 is an enlarged plan view showing an example of a well structure in the plate shown in FIG. 1
  • FIG. 6 is a partial plan view showing an example of a hole arrangement in the plate shown in FIG. 1
  • FIG. 7 is a view of the plate shown in FIG. It is sectional drawing which shows a BB cutting structure.
  • 8 is an enlarged plan view showing the structure of the hole shown in FIG. 6,
  • FIG. 9 is a partial sectional view showing the EE cutting structure of the hole shown in FIG. 8, and
  • FIG. 10 is the well and hole of the plate shown in FIG. It is the top view and transmission diagram which show the structure of a nano pillar.
  • FIG. 11 is a partial plan view showing an example of a hole structure in the plate shown in FIG. 1
  • FIG. 12 is a partial plan view showing an example of a structure in which spheroids are arranged in each hole shown in FIG.
  • the case of measuring the respiration rate of hepatocyte spheroids of individual rats will be described as an example.
  • the measurement can be applied to cell types of various animals and plants. It is not limited.
  • hepatocytes are prepared according to the in situ collagenase perfusion method. Details are as follows. Fisher344 male rats (7-10 weeks old) were laparotomized under pentobarbital anesthesia, a catheter was inserted into the portal vein, and preperfusion solution (containing no Ca 2+ and Mg 2+ , EGTA (glycol ether diamine)). Inject Hanks' solution containing tetraacetic acid).
  • the lower vena cava below the liver is incised to release blood.
  • the chest cavity is opened, the inferior vena cava entering the right atrium is opened, and the inferior vena cava below the liver is stopped and perfusion is performed. After confirming that blood removal from the liver is sufficient, stop perfusion. Then, the perfusion solution is replaced with a collagenase solution to perform perfusion.
  • perfusion is performed using Hank's solution containing 0.05% collagenase, but this is not a limitation. After confirming that the intercellular tissue has been digested by collagenase, the perfusion is stopped. Then, the liver is cut off, minced in an ice-cooled Hanks solution, and dispersed to cells by pipetting.
  • hepatocytes having a survival rate of 85% or more are used for culture.
  • hepatocytes having a survival rate of 85% or more are used for the culture, but it is needless to say that the conditions are not necessarily limited thereto.
  • the preparation of hepatocytes is not necessarily limited to the in situ collagenase perfusion method.
  • the hepatocytes thus obtained were seeded on a resin plate 111 (also called a culture plate, multiwell plate, nanopillar plate, etc.) shown in FIGS.
  • a resin plate 111 also called a culture plate, multiwell plate, nanopillar plate, etc.
  • a plurality of wells (accommodating portions) 112 are formed in a matrix arrangement on the plate 111.
  • a chamfered portion 111b is formed at one of the four corners of the plate 111.
  • Each well 112 has an opening at the top as shown in FIGS. 1, 4 and 7, while a bottom 111a is formed on the side opposite to the opening as shown in FIG.
  • each well 112 is a concave room in which cells can be accommodated and cultured, and each well 112 is partitioned by a well partition wall 119 as shown in FIG. Each well 112 can arrange or take out cells through the opening.
  • each well 112 As shown in FIGS. 5 and 6, a plurality of holes (partition portions) 113 are formed in an orderly manner. As shown in FIGS. 8 and 9, each hole 113 is partitioned by a hole partition wall 115 so that the plan view is circular.
  • nano pillars 114 which are a plurality of protrusions (columns), are formed in an orderly manner.
  • a plurality of holes 113 are arranged in order in each well 112, and a plurality of nanopillars 114 are arranged in each of the plurality of holes 113 in an orderly manner.
  • the hole diameter (diameter of the hole 113) 116 is, for example, 200 ⁇ m
  • the hole height (height of the hole partition wall 115) 117 is, for example, 80 ⁇ m.
  • the pillar region 118 which is a region where the plurality of nanopillars 114 formed in the hole 113 are arranged, has a diameter of, for example, 80 ⁇ m. Furthermore, the diameter of each nanopillar 114 is 2 ⁇ m, for example. In this embodiment, the nanopillar 114 having this size is used, but it is needless to say that the size is not limited to this size.
  • the plurality of nanopillars 114 may be formed over substantially the entire bottom 111a as shown in FIG. 9, or only near the center of the bottom 111a as shown in FIG. It may be formed.
  • FIG. 12 shows a state in which cells are cultured in the plurality of wells 112 of the plate 111 shown in FIG. That is, cells are seeded on a plurality of nanopillars 114 in each of a plurality of holes 113 in each well 112, and the medium is changed every 24 hours, and further cultured for a total of 96 hours to obtain spheroids (many cells). Agglomerated into a three-dimensional state) 100 was formed.
  • the plate 111 in which the spheroid 100 is formed in each of the plurality of holes 113 of each well 112 is prepared by the above method.
  • FIGS. 13A and 13B are diagrams showing an example of the structure of the control robot according to the first embodiment of the present invention.
  • FIG. 13A is a perspective view of the control robot
  • FIG. 13B is a partial perspective view of a plate holding portion
  • FIG. It is a block diagram which shows an example of a structure of the microscope system of Embodiment 1 of invention.
  • 15 is a block diagram showing an example of the structure of the reference electrode integrated electrode according to Embodiment 1 of the present invention
  • FIG. 16 is a partial plan view showing an example of the structure of the screen of the touch panel used in Embodiment 1 of the present invention.
  • 17A and 17B are partial cross-sectional views showing an example of the structure in the well when the cell activity is measured according to the first embodiment of the present invention.
  • 18 is a partial enlarged cross-sectional view showing details of the structure at the time of cell activity measurement shown in FIG. 17, and
  • FIG. 19 is related to the measurement time and the method of the comparative example according to the cell activity measurement method of Embodiment 1 of the present invention. It is a comparison figure which shows an example of measurement time.
  • the cell activity measuring apparatus realizes a high throughput for measuring respiration (cell activity).
  • the cell activity measuring apparatus includes a control robot 200 that controls the position of a plate 111 having a well 112 in which a plurality of holes 113 shown in FIG. 10 that hold cells are formed. Further, the cell activity measuring apparatus includes a scanning electrochemical microscope 300 (see FIG. 15) including the phase contrast microscope 304 shown in FIG.
  • the control robot 200 shown in FIG. 13A includes a control unit that controls the movement of the plate holder (holding unit) 203 that can hold the plate 111 shown in FIG. 13B.
  • the control unit includes an XY axis control unit 201 that moves the plate holder 203 along the XY axis direction, and a Z axis control unit 202 that moves the plate holder 203 along the Z axis direction.
  • the plate holder 203 has a claw portion (not shown) for pressing the chamfered portion 111b of the plate 111 shown in FIG. 4, and the claw portion is arranged on the chamfered portion 111b, so that the plate holder 203
  • the plate 111 can be positioned and fixed.
  • the scanning electrochemical microscope 300 includes an electrode holder 303 that supports an electrode, a potentiod stud 301 that is electrically connected to the electrode and applies a constant voltage, A phase contrast microscope 304.
  • a measurement unit 315 is connected to the potentiostat 301 of the scanning electrochemical microscope 300.
  • the measuring unit 315 measures the current flowing in the culture solution 316 (see FIG. 17) accommodated in the well 112 for each cell held in the plurality of holes 113 of the plate 111.
  • control robot (control unit) 200 measures the selected hole 113 among the plurality of holes 113 of the plate 111 at the measurement position where the current is measured.
  • the movement of the plate holder 203 is controlled so as to be moved to.
  • the electrode for measuring the current is fixed to the electrode holder 303 via a bolt 314, and an electrode scanning motor 302 is connected to the electrode holder 303. Accordingly, the electrode can be moved via the electrode holder 303 by driving the electrode scanning motor 302.
  • a camera system 305 is connected to the phase-contrast microscope 304, and a television monitor 306 and a touch panel (input unit) 307 are connected to them. That is, an image acquired by the camera system 305 of the phase contrast microscope 304 is displayed on the touch panel 307 and the television monitor 306. Note that the television monitor 306 may not be connected as long as at least the touch panel 307 is connected.
  • the movement of the plate holder 203 can be controlled by operating the screen 308 of the touch panel 307 shown in FIG. That is, the movement of the plate holder 203 can be operated by touching the display on the screen 308 of the touch panel 307. For example, by touching the image of the hole 113 displayed on the screen 308 of the touch panel 307 (pressing the image), a specific hole 113 can be selected or the hole 113 to be moved next can be designated.
  • the electrode electrically connected to the potentiostat 301 via the wiring 313 is a reference electrode integrated type in which a reference electrode (reference electrode) 309b and a measurement electrode 309c are integrally formed.
  • This is an electrode (integrated electrode, reference electrode integrated electrode) 309. That is, the reference electrode integrated electrode 309 and the measuring unit 315 are electrically connected via the wiring 313 and the potentiostat 301, and the current flowing in the culture solution 316 shown in FIG. 309.
  • the reference electrode integrated electrode 309 is formed on a platinum (Pt) wire 312 that is a measurement electrode 309 c provided in the vicinity of the center of the glass main body 311 and an outer peripheral portion of the glass main body 311. And a platinum (Pt) film 310 as a reference electrode 309b. Then, the platinum film 310 and the platinum wire 312 are electrically connected to the potentio stud 301 via the wiring 313, respectively.
  • the plate 111 is configured so that the respiration rate (cell activity) of the cell can be measured by the plate 111 (multiwell plate, culture plate) for culturing the cell.
  • a microscope stage that can be installed is incorporated.
  • the electrode to be measured is a reference electrode integrated electrode 309
  • the respiration rate is measured with only one integrated electrode
  • the plate 111 is moved by the operation of the touch panel 307, so that the electrode approaches the sample (cell). To achieve high throughput.
  • the plate 111 in which the spheroid 100 is arranged in each of the plurality of holes 113 is prepared.
  • the movement between the wells 112 in the plate 111 is set.
  • the plate 111 on which the spheroid 100 is disposed is placed on the plate holder 203, and the scanning electrochemical microscope 300 is focused on the spheroid 100. From this position, the plate 111 is lowered 16.5 mm to perform bottom setting.
  • this value (24) is input and the plate 111 is moved.
  • this value is not limited to this value because it changes depending on the thickness of the plate 111 to be used.
  • the reference electrode integrated electrode 309 is installed in the electrode holder 303. Then, the plate 111 is returned to the observation position (measurement position). That is, the plate holder 203 that holds the plate 111 is moved to a measurement position where current is measured.
  • the spheroid 100 to be measured is selected.
  • a microscope image of the spheroid 100 formed on the plate 111 is displayed on the touch panel 307. Furthermore, while viewing the screen 308 of the touch panel 307, the spheroid 100 for measuring the respiration rate is selected by touching the screen 308.
  • the spheroid 100 to be measured that is, the hole 113 is selected.
  • the operator visually checks the screen 308 of the touch panel 307 shown in FIG. 16 to confirm the shape of the spheroid 100, and the shape of the spheroid 100 on the screen is true by visual judgment. Select one that is close to a circle (high circularity (roundness)).
  • the touch screen 308 of the touch panel 307 in the direction to be moved is touched.
  • the screen 308 is scrolled so that the touched position moves to the center of the screen 308.
  • the flow After completion of selection, the flow returns to the first selected spheroid 100, and the respiration rate (cell activity) of the spheroid 100 is measured according to the selected order.
  • the current flowing through the culture solution 316 is measured with respect to the plate 111 in which the spheroid 100 is disposed in each of the plurality of holes 113 and the culture solution 316 is accommodated in each well 112.
  • the measurement is performed by immersing the reference electrode integrated electrode 309 in the culture solution 316 and scanning the reference electrode integrated electrode 309 up and down a plurality of times on the spheroid 100 to be measured.
  • currents are measured at positions near the spheroid 100 (position about several ⁇ m from the cell) and far (position about 150 ⁇ m from the cell).
  • the reduction current flowing when oxygen is converted into water by the reference electrode integrated electrode 309 is measured. Specifically, the reduction current near the spheroid 100 in the region R shown in FIG. 18 and the reduction current at a position of about 150 ⁇ m above the spheroid 100 are measured to calculate the difference therebetween. At this time, in the case of the spheroid 100 having a high activity (a large amount of respiration), the oxygen concentration in the vicinity thereof is low, so the measured value (difference) in this case is a large value.
  • the activity of spheroid 100 is measured by the measurement method as described above.
  • the measurement in the selected second hole 113 is started. That is, by operating the touch panel 307 so that the reference electrode integrated electrode 309 is disposed at a position on the selected second hole 113 (so that the second hole 113 moves to the measurement position), The plate holder 203 is moved.
  • the next measurement is performed while the reference electrode integrated electrode (measurement electrode) 309 is retracted from the culture solution 316 to the outside.
  • the plate holder 203 is moved so that the hole 113 to be moved moves to the measurement position.
  • the movement of the plate holder 203 is controlled to move the position of the selected hole 113 in the other well 112 to the measurement position. Control by part.
  • the spheroid 100 in each of a plurality of (here, ten) holes 113 selected based on the shape of each spheroid 100 is obtained. Finish the current measurement.
  • the method for measuring cell activity according to the first embodiment and a comparative example in which the present inventor has made a comparative study using the two electrodes and looking through a microscope, the two Compare the time spent with the method of manually measuring the current by moving the electrode to the cell position.
  • the spheroid 100 is moved to a dedicated measurement well, the two electrodes are set in an electrochemical microscope, the two electrodes are moved to the position of the spheroid 100 to be measured, and the respiration rate of the spheroid 100 Four processes are required: This requires a total work time of 17 minutes.
  • the measurement order is the selected order, but can be arbitrarily set.
  • the time spent measuring the activity of one spheroid 100 was 3 minutes 5 seconds in total.
  • the time required to measure the respiration rate of one spheroid 100 can be shortened from 17 minutes to 3 minutes and 5 seconds by the method of the comparative example and the method of the first embodiment.
  • the work time can be reduced by 65% from about 3 minutes in the comparative example to 1 minute 5 seconds in the first embodiment (dotted box F2 shown in FIG. 19). ).
  • FIG. 20 and 21 are process diagrams showing an example of the procedure for evaluating the position reproducibility of the control robot shown in FIG. 13, and FIG. 22 is an example of the electrode tip position for each hole in the position reproducibility evaluation of the control robot shown in FIG. FIG. Furthermore, FIG. 23 is a data diagram showing an example of a cell activity evaluation result using the cell activity measuring apparatus according to the first embodiment of the present invention.
  • the 24-well plate 111 is set in the plate holder 203 shown in FIG. 13, the reference electrode integrated electrode 309 is attached to the electrode holder 303 shown in FIG. 15, and the focus of the phase contrast microscope 304 shown in FIG. Match with the electrode tip 309a of the body electrode 309.
  • FIGS. On the touch panel 307 shown in FIG. 16, 10 holes 113 are arbitrarily designated and numbers 1 to 10 are assigned (item number 1 in FIG. 20).
  • the hole 113 with the number 1 is designated and the plate 111 is moved (item number 2.1 in FIG. 20).
  • a microscope image of the hole 113 and the tip of the electrode (shown as a black dot in FIG. 20) 309a is taken, and the electrode position at this time is set as the reference position of the hole number 1 (item number 2.2 in FIG. 20).
  • the hole 113 with the number 2 is designated, and the same operation is performed to set the reference position for the hole number 2 (item number 3 in FIG. 20). This operation is sequentially performed up to the hole 113 with the number 10, and the reference position of each hole 113 is set (item number 4 in FIG. 20). This completes the first course shown in FIG.
  • the hole 113 of number 1 is designated again, the plate 111 is moved, and the same operation as the first cool is repeated (item number 5 in FIG. 20). .
  • the same operation is performed for a total of 10 courses, and all 10 pieces of data are acquired for each hole (item numbers 6 and 7 in FIG. 21). Subsequently, after superimposing all 10 images acquired for each hole, the reference electrode position acquired in the first course of each hole 113 is superimposed on the center S of the hole 113 indicated by the intersection of the 40 ⁇ m long cross. Match.
  • the threshold is set to 20 ⁇ m, and the plate The position reproducibility before and after the movement was judged.
  • the result of having measured the respiration rate using the cell activity measuring apparatus of this Embodiment 1 is shown in FIG. Similar to the case of using the two electrodes of the comparative example, the same respiration rate could be measured when the reference electrode integrated electrode 309 was used.
  • the cell activity measurement method described in the first embodiment may be used when the activity of the spheroid 100 before drug screening is evaluated in advance. Furthermore, in the drug discovery process, it may be used for cell activity evaluation when a drug candidate substance is administered, and its purpose of use is not limited.
  • the plate 111 on which the cells are cultured is used as it is, and the selected hole 113 of the plate 111 is moved to the measurement position at the time of measurement. The time until immediately before the measurement can be shortened.
  • the activity of cells used for evaluation of a large number of drug candidates can be evaluated at high throughput, so that only effective cells can be used for toxicity testing and metabolism of a large number of drug candidates.
  • Various tests such as tests can be performed.
  • candidate substances can be narrowed down early even for a large number of drug candidate substances used in screening for drug development.
  • the operation becomes much easier than the operation while looking into the microscope, and the cell activity measurement operation can be performed efficiently. Can do.
  • the reference electrode integrated electrode 309 in which the reference electrode 309b and the measurement electrode 309c are integrally formed is used as an electrode immersed in the culture solution 316, so that the reference electrode and the measurement electrode Compared to the case where two electrodes formed separately are used, it is possible to easily align the electrodes during measurement.
  • each well 112 of the plate 111 is very narrow, and it is difficult to place two electrodes in this opening, which takes time. In this case, since there is one electrode, it can be easily aligned and arranged in the opening of each well 112.
  • the cell activity measurement work can be performed efficiently, and as a result, the measurement work can be further increased in throughput.
  • the method of selecting the spheroid 100 having a high circularity (roundness) by visual observation when selecting the spheroid 100 (hole 113) for measuring current has been described as an example. .
  • the plate 111 is moved by operating the touch panel 307 and the reference electrode integrated electrode 309 is used. Therefore, it is possible to sufficiently increase the throughput of the cell activity measurement work.
  • the second embodiment realizes further higher throughput of the cell activity measurement work.
  • the first microscope image is displayed on the screen 308 of the touch panel 307.
  • the information on the screen 308 is image-processed to select the hole 113 for measuring current.
  • the hole 113 for measuring current for example, a desired well 112 in the plate 111 is scanned, and image information of the spheroid 100 of each of the plurality of holes 113 in the well 112 is acquired. And the said image information is image-processed, the spheroid 100 whose circularity (roundness) is higher than a threshold value is selected from all the spheroids 100, and those positions are memorize
  • the degree of circularity is obtained from the equation of circular area / (peripheral length) 2 .
  • this spheroid 100 (hole 113) is selected and stored.
  • the method of obtaining the circularity is not limited to the formula of circular area / (peripheral length) 2 , and may be obtained by other methods. Furthermore, it goes without saying that the parameter used as the index is not limited to the circularity.
  • the screen moves to the screen 308 of another well 112 and the same scanning and image processing operations are performed. For example, this operation is repeated for all 10 fields of view. Thereafter, the flow returns to the first spheroid 100 and the respiration rate (activity) is measured.
  • the cost of operation can be reduced by automatically measuring the cell activity.
  • the case where 24 wells 112 are formed on the plate 111 has been described.
  • the number of the wells 112 formed on the plate 111 may be one, or There may be two or more.

Abstract

　細胞を保持する複数のホールが形成されたプレートを保持可能なプレートホルダと、上記複数のホールに保持されたそれぞれの上記細胞ごとに、ウェル内に収容された培養液中を流れる電流を計測する計測部と、上記プレートホルダの移動を制御する制御部と、を有する。さらに、電流計測時に、タッチパネル３０７の操作により、細胞を培養させた上記プレートの、選択された上記ホールを計測位置に移動させるため、細胞活性の計測作業において高スループット化を実現できる。

Description

細胞活性計測装置および計測方法
　本発明は、細胞活性計測装置および計測方法に関し、特に、細胞の呼吸活性を計測する技術に関する。
　医薬品開発プロセスにおいて、動物実験に代わり、細胞を利用したイン・ビトロ（in vitro）アッセイが求められている。特に、薬剤候補物質のスクリーニング、毒性・代謝試験に応用する動きが活発になっている。
　このような背景のもと、動物実験に代わる、細胞を利用した代替法のアプローチは盛んに試みられてきた。
　単一哺乳動物胚の活性度を評価する方法として、電気化学的分析手法が開示されている（特許文献１，２、非特許文献１）。特に、特許文献１，２に記載された方法では、生物試料に一定電圧をかけた際に流れる還元電流を計測することにより、細胞の呼吸の活性度を非侵襲で評価できることを特徴としている。
　また、特許文献１，２に記載された上述の方法は、畜産分野において体外受精に用いる哺乳動物胚の受精卵評価に採用されており、従来の形態学的評価では判定が困難であった受精卵評価に有用性が見出されている。
特許第３６８８６７１号公報 特許第４０９７４９２号公報
"Respiration activity of single bovine embryos entrapped in a cone-shaped microwell monitored by scanning electrochemical microscopy" Hitoshi Shiku, Takuo Shiraishi, Shigeo Aoyagi, Yousuke Utsumi, Masahki Matsudaira, Hiroyuki Abe, Hiroyoshi Hoshi, Shigenobu Kasai, Hiroaki Ohya, and Tomokazu Matsue, Analytica Chimica Acta, 522: 51-58 (2004)
　しかしながら、上記電気化学的分析手法では、生物試料である受精卵を１つずつ手作業で測定用の検体セルに移動しているため、スループットが低くなることが課題である。
　また、検体セルは６つの試料しか保持することができず、したがって、医薬品開発分野で要求される多検体を同時に評価するのは困難である。
　なお、検体セルに代わって９６ウェルや３８４ウェルを保持可能なマルチウェルプレートを使用することも考えられるが、マルチウェルプレートの各ウェルの間隔は非常に狭いため、参照電極と計測用マイクロ電極の２本の電極を用いた計測方法では計測が困難である。
　本発明の目的は、細胞の活性度の計測において高スループット化を実現する技術を提供することにある。
　本発明の上記ならびにその他の目的と新規な特徴は、本明細書の記述および添付図面から明らかになるであろう。
　本願において開示される発明のうち、代表的なものの概要を簡単に説明すれば、以下のとおりである。
　本発明の細胞活性計測装置は、細胞を保持する複数の仕切り部が形成されたプレートを保持可能な保持部と、複数の仕切り部に保持されたそれぞれの細胞ごとに、複数の仕切り部を有する収容部内の培養液中を流れる電流を計測する計測部と、上記保持部の移動を制御する制御部と、を有するものである。そして、上記制御部は、複数の仕切り部のうちの選択された仕切り部を、電流の計測が行われる計測位置に移動させるように、保持部の移動を制御する。
　また、本発明の細胞活性計測方法は、（ａ）複数の仕切り部を有する収容部の複数の仕切り部に細胞を配置したプレートを準備する工程、（ｂ）プレートを保持する保持部を、電流の計測が行われる計測位置に移動させる工程、（ｃ）複数の仕切り部に保持されたそれぞれの細胞ごとに、収容部内の培養液中を流れる電流を計測する工程、を有するものである。そして、複数の仕切り部のうちの選択された仕切り部が計測位置に移動するように、保持部の移動を制御する。
　本願において開示される発明のうち、代表的なものによって得られる効果を簡単に説明すれば、以下のとおりである。
　細胞の活性度の計測において高スループット化を実現することができる。
本発明の実施の形態１で用いられるプレートの構造の一例を示す斜視図である。 図１に示すプレートの構造を示す裏面図である。 図１に示すプレートの構造を示す側面図である。 図１に示すプレートの構造を示す平面図である。 図１に示すプレートにおけるウェルの構造の一例を示す拡大平面図である。 図１に示すプレートにおけるホール配列の一例を示す部分平面図である。 図４に示すプレートのＢ－Ｂ切断構造を示す断面図である。 図６に示すホールの構造を示す拡大平面図である。 図８に示すホールのＥ－Ｅ切断構造を示す部分断面図である。 図１に示すプレートにおけるウェルとホールとナノピラーの構造の一例を示す平面図および透過図である。 図１に示すプレートにおけるホールの構造の一例を示す部分平面図である。 図１１に示す各ホールにスフェロイドを配置した構造の一例を示す部分平面図である。 本発明の実施の形態１の制御ロボットの構造の一例を示す図であり、（ａ）は制御ロボットの斜視図、（ｂ）はプレートの保持部の部分斜視図である。 本発明の実施の形態１の顕微鏡システムの構成の一例を示すブロック図である。 本発明の実施の形態１の参照極一体型電極の構造の一例を示す構成図である。 本発明の実施の形態１で用いるタッチパネルの画面の構造の一例を示す部分平面図である。 本発明の実施の形態１の細胞活性計測時のウェル内の構造の一例を示す部分断面図である。 図１７に示す細胞活性計測時の構造の詳細を示す部分拡大断面図である。 本発明の実施の形態１の細胞活性計測方法に係る計測時間と比較例の方法に係る計測時間の一例を示す比較図である。 図１３に示す制御ロボットの位置再現性評価の手順の一例を示す工程図である。 図１３に示す制御ロボットの位置再現性評価の手順の一例を示す工程図である。 図１３に示す制御ロボットの位置再現性評価におけるホールごとの電極先端位置の一例を示す平面図である。 本発明の実施の形態１の細胞活性計測装置を用いた細胞活性の評価結果の一例を示すデータ図である。
　以下の実施の形態では特に必要なとき以外は同一または同様な部分の説明を原則として繰り返さない。
　さらに、以下の実施の形態では便宜上その必要があるときは、複数のセクションまたは実施の形態に分割して説明するが、特に明示した場合を除き、それらはお互いに無関係なものではなく、一方は他方の一部または全部の変形例、詳細、補足説明などの関係にある。
　また、以下の実施の形態において、要素の数など（個数、数値、量、範囲などを含む）に言及する場合、特に明示した場合および原理的に明らかに特定の数に限定される場合などを除き、その特定の数に限定されるものではなく、特定の数以上でも以下でも良いものとする。
　また、以下の実施の形態において、その構成要素（要素ステップ等も含む）は、特に明示した場合および原理的に明らかに必須であると考えられる場合等を除き、必ずしも必須のものではないことは言うまでもない。
　また、以下の実施の形態において、構成要素等について、「Ａからなる」、「Ａよりなる」、「Ａを有する」、「Ａを含む」と言うときは、特にその要素のみである旨明示した場合等を除き、それ以外の要素を排除するものでないことは言うまでもない。同様に、以下の実施の形態において、構成要素等の形状、位置関係等に言及するときは、特に明示した場合および原理的に明らかにそうでないと考えられる場合等を除き、実質的にその形状等に近似または類似するもの等を含むものとする。このことは、上記数値および範囲等についても同様である。
　以下、本発明の実施の形態を図面に基づいて詳細に説明する。なお、実施の形態を説明するための全図において、同一の機能を有する部材には同一の符号を付し、その繰り返しの説明は省略する。また、図面をわかりやすくするために平面図であってもハッチングを付す場合がある。
　また、以下の実施の形態では、培養プレート（以降、単にプレートとも呼ぶ）を用いて細胞を培養し、細胞塊である三次元組織（スフェロイド）あるいは二次元平面組織の呼吸量測定（活性度（以降、単に活性とも呼ぶ）計測）を行う技術について説明する。
　＜実施の形態１＞
　図１は本発明の実施の形態１で用いられるプレートの構造を示す斜視図、図２は図１に示すプレートの構造を示す裏面図、図３は図１に示すプレートの構造を示す側面図、図４は図１に示すプレートの構造を示す平面図である。また、図５は図１に示すプレートにおけるウェルの構造の一例を示す拡大平面図、図６は図１に示すプレートにおけるホール配列の一例を示す部分平面図、図７は図４に示すプレートのＢ－Ｂ切断構造を示す断面図である。さらに、図８は図６に示すホールの構造を示す拡大平面図、図９は図８に示すホールのＥ－Ｅ切断構造を示す部分断面図、図１０は図１に示すプレートのウェルとホールとナノピラーの構造を示す平面図および透過図である。
　また、図１１は図１に示すプレートにおけるホールの構造の一例を示す部分平面図、図１２は図１１に示す各ホールにスフェロイドを配置した構造の一例を示す部分平面図である。
　本実施の形態１では、個々のラットの肝細胞スフェロイドの呼吸量を計測する場合を一例として取り上げて説明するが、その計測については様々な動植物の細胞種に適用可能であり、特に細胞種は限定されるものではない。
　まず、ラットの肝細胞スフェロイドの呼吸量の計測の準備として、プレート上にスフェロイドを形成するところまでを説明する。
　なお、肝細胞の調製は、インサイチュ(in situ) コラゲナーゼかん流法にしたがう。詳しくは以下の通りである。Ｆｉｓｈｅｒ３４４系雄ラット（７～１０週齢）を、ペントバルビタール麻酔下で開腹し、門脈にカテーテルを挿入して前かん流液（Ｃａ2+とＭｇ2+を含まず、ＥＧＴＡ（グリコールエーテルジアミン四酢酸）を含むハンクス液）を注入する。
　同時に肝臓下部の下大静脈を切開して血液を放出させる。次に胸腔を開き、右心房に入る下大静脈を切開し、肝臓下部の下大静脈をかん止で止めてかん流を行う。肝臓からの脱血が十分になされたことを確認した後にかん流を止める。そして、かん流液をコラゲナーゼ溶液に換えて、かん流を行う。
　本実施の形態１では０．０５％コラゲナーゼを含むハンクス液を用いてかん流を行うが、この限りではない。細胞間組織がコラゲナーゼにより消化されたことを確認した後、かん流を止める。そして、肝臓を切り離し、氷冷したハンクス液中で細切りし、ピペッティングにより細胞まで分散する。
　次いでガーゼろ過により未消化の組織を除去する。細胞懸濁液は、５０Ｇ、１分の遠心分離を数回繰り返して非実質細胞を除去する。次いで等張パーコール液を使用して５００Ｇ、５分の遠心分離で傷害のある肝細胞を除去する。得られた肝細胞の生存率はトリパンブルー排除法で計測し、生存率８５％以上の肝細胞を培養に使用する。ここでは、生存率８５％以上の肝細胞を培養に使用するが、必ずしも当該条件に限らないことは言うまでもない。また、肝細胞の調製は、必ずしもインサイチュコラゲナーゼかん流法に限られるものではない。
　このようにして得られた肝細胞を、図１～図４に示す樹脂製のプレート１１１（培養プレート、マルチウェルプレート、ナノピラープレート等とも呼ぶ）に播種した。図１に示すように、プレート１１１には、複数のウェル（収容部）１１２がマトリクス配列で形成されている。
　また、図４に示すように、プレート１１１の４つの角部のうちの１つの角部には面取り部１１１ｂが形成されている。
　本実施の形態では、２４個のウェル１１２が形成されたプレート１１１（２４ウェルプレート）の場合を取り上げて説明する。
　また、各ウェル１１２は、図１、図４および図７に示すように上部は開口しており、一方、開口側と反対側には、図２に示すように底部１１１ａが形成されている。
　したがって、各ウェル１１２は、細胞を収容して培養を行うことが可能な凹状の部屋であり、図７に示すようにそれぞれのウェル１１２は、ウェル仕切り壁１１９によって仕切られている。そして、各ウェル１１２は、上記開口部を介して細胞の配置または取り出しが行えるようになっている。
　また、各ウェル１１２内には、図５および図６に示すように、複数のホール（仕切り部）１１３が整然と並んで形成されている。各ホール１１３は、図８および図９に示すように、平面視が円形となるようにホール仕切り壁１１５によって仕切られている。
　また、各ホール１１３内には複数の突起（柱部）であるナノピラー１１４が、整然と並んで形成されている。
　したがって、図１０に示すように、各ウェル１１２内には、複数のホール１１３が整然と配置され、さらにこれら複数のホール１１３のそれぞれには、複数のナノピラー１１４が整然と配置されている。
　ここで、ホール径（ホール１１３の直径）１１６は、例えば２００μｍであり、ホール高さ（ホール仕切り壁１１５の高さ）１１７は、例えば８０μｍである。
　また、図１０および図１１に示すように、ホール１１３内に形成された複数のナノピラー１１４が配置された領域であるピラー領域１１８は、その直径が、例えば８０μｍである。さらに、それぞれのナノピラー１１４の直径は、例えば２μｍである。本実施の形態では、このサイズのナノピラー１１４を用いたが、このサイズに限定されないことは言うまでもない。
　また、各ホール１１３において、複数のナノピラー１１４は、図９に示すように、底部１１１ａの略全体に亘って形成されていてもよいし、図１０に示すように、底部１１１ａの中央部付近のみに形成されていてもよい。
　また、本実施の形態では２４ウェルプレート（プレート１１１）を採用する場合を説明したが、ウェル数は２４個に限定されないことは言うまでもない。
　ここで、図１２は、図１に示すプレート１１１の複数のウェル１１２において細胞を培養させた状態を示すものである。すなわち、各ウェル１１２の複数のホール１１３それぞれの複数のナノピラー１１４上に細胞を播種し、そして、この細胞を２４時間毎に培地交換し、さらに、合計９６時間培養を行ってスフェロイド（細胞が多数凝集して三次元状態になったもの）１００を形成した。
　なお、スフェロイド１００を形成させるための方法は、この条件に限らないことは言うまでもない。
　以上の方法により、各ウェル１１２の複数のホール１１３のそれぞれにスフェロイド１００が形成されたプレート１１１を準備する。
　次に、本実施の形態１の細胞活性計測装置とその計測方法について説明する。
　図１３は本発明の実施の形態１の制御ロボットの構造の一例を示す図であり、（ａ）は制御ロボットの斜視図、（ｂ）はプレートの保持部の部分斜視図、図１４は本発明の実施の形態１の顕微鏡システムの構成の一例を示すブロック図である。また、図１５は本発明の実施の形態１の参照極一体型電極の構造の一例を示す構成図、図１６は本発明の実施の形態１で用いるタッチパネルの画面の構造の一例を示す部分平面図、図１７は本発明の実施の形態１の細胞活性計測時のウェル内の構造の一例を示す部分断面図である。さらに、図１８は図１７に示す細胞活性計測時の構造の詳細を示す部分拡大断面図、図１９は本発明の実施の形態１の細胞活性計測方法に係る計測時間と比較例の方法に係る計測時間の一例を示す比較図である。
　本実施の形態１の細胞活性計測装置は、呼吸量（細胞の活性）計測の高スループット化を実現するものである。
　まず、上記細胞活性計測装置の構成について説明する。上記細胞活性計測装置は、図１３に示すように、細胞を保持する図１０の複数のホール１１３が形成されたウェル１１２を有するプレート１１１の位置を制御する制御ロボット２００を備えている。さらに、上記細胞活性計測装置は、図１４に示す位相差顕微鏡３０４を含む走査型電気化学顕微鏡３００（図１５参照）を備えている。
　また、図１３（ａ）に示す制御ロボット２００は、図１３（ｂ）に示すプレート１１１を保持可能なプレートホルダ（保持部）２０３の移動を制御する制御部を備えている。上記制御部は、プレートホルダ２０３をＸＹ軸方向に沿って移動させるＸＹ軸制御部２０１と、プレートホルダ２０３をＺ軸方向に沿って移動させるＺ軸制御部２０２とからなる。
　なお、プレートホルダ２０３は、図４に示すプレート１１１の面取り部１１１ｂを押さえる爪部（図示せず）を有しており、面取り部１１１ｂに上記爪部を配置することで、プレートホルダ２０３上におけるプレート１１１の位置決めと固定を行うことができる。
　また、図１４および図１５に示すように、走査型電気化学顕微鏡３００は、電極を支持する電極ホルダ３０３と、電極と電気的に接続され、かつ一定の電圧を付与するポテンションスタッド３０１と、位相差顕微鏡３０４とからなる。
　さらに、走査型電気化学顕微鏡３００のポテンションスタッド３０１には、計測部３１５が接続されている。計測部３１５は、プレート１１１の複数のホール１１３に保持されたそれぞれの細胞ごとに、ウェル１１２に収容された培養液３１６（図１７参照）中を流れる電流を計測するものである。
　そこで、本実施の形態１の細胞活性計測装置は、その制御ロボット（制御部）２００が、プレート１１１の複数のホール１１３のうちの選択されたホール１１３を、上記電流の計測が行われる計測位置に移動させるように、プレートホルダ２０３の移動を制御するものである。
　なお、図１５に示すように、電流の計測を行う電極は、ボルト３１４を介して電極ホルダ３０３に固定され、さらに、電極ホルダ３０３には電極走査用モータ３０２が接続されている。これにより、電極走査用モータ３０２の駆動により、電極ホルダ３０３を介して上記電極を移動させることができる。
　また、図１４に示すように、位相差顕微鏡３０４にはカメラシステム３０５が接続されており、これらにテレビモニタ３０６と、タッチパネル（入力部）３０７とが接続されている。すなわち、位相差顕微鏡３０４のカメラシステム３０５で取得した画像がタッチパネル３０７とテレビモニタ３０６に映し出される。なお、少なくともタッチパネル３０７が接続されていれば、テレビモニタ３０６は接続されていなくてもよい。
　本実施の形態１の細胞活性計測装置では、図１６に示すタッチパネル３０７の画面３０８を操作してプレートホルダ２０３の移動を制御可能になっている。すなわち、タッチパネル３０７の画面３０８上の表示に触れることでプレートホルダ２０３の移動を操作することができる。例えば、タッチパネル３０７の画面３０８に映し出されたホール１１３の画像に触れる（画像を押す）ことで、特定のホール１１３を選択したり、次に移動するホール１１３を指定したりすることができる。
　また、図１５に示すように、ポテンションスタッド３０１に配線３１３を介して電気的に接続された電極は、参照極(参照電極)３０９ｂと計測電極３０９ｃとが一体に形成された参照極一体型電極（一体型電極、参照電極一体型電極）３０９である。すなわち、参照極一体型電極３０９と計測部３１５とが、配線３１３およびポテンションスタッド３０１を介して電気的に接続されており、図１７に示す培養液３１６中を流れる電流を参照極一体型電極３０９によって計測する。
　参照極一体型電極３０９は、図１５に示すように、ガラス本体部３１１の中心付近に設けられた計測電極３０９ｃであるプラチナ（Ｐｔ）線３１２と、ガラス本体部３１１の外周部に形成された参照極３０９ｂであるプラチナ（Ｐｔ）膜３１０とを有している。そして、プラチナ膜３１０とプラチナ線３１２とが、それぞれ配線３１３を介してポテンションスタッド３０１と電気的に接続されている。
　次に、本実施の形態１の細胞活性計測方法について説明する。
　上述のように、本実施の形態１の細胞活性計測装置では、細胞を培養するプレート１１１（マルチウェルプレート、培養プレート）で細胞の呼吸量（細胞の活性）の計測ができるように、プレート１１１を設置できる顕微鏡ステージを組み込んでいる。これにより、後述する比較例の計測方法で行っているスフェロイド専用の測定ウェルへの移動を行う操作を省略することができる。
　さらに、計測する電極を参照極一体型電極３０９として一体型電極１本のみで呼吸量を計測し、かつ、タッチパネル３０７による操作でプレート１１１を移動させることで、サンプル（細胞）への電極のアプローチの高スループット化を実現するものである。
　ここで、タッチパネル３０７を用いた具体的な操作を説明する。まず、複数のホール１１３内のそれぞれにスフェロイド１００が配置されたプレート１１１を準備する。
　その後、プレート１１１におけるウェル１１２間の移動の設定を行う。ここでは、スフェロイド１００が配置されたプレート１１１をプレートホルダ２０３に設置し、スフェロイド１００に走査型電気化学顕微鏡３００の焦点を合わせる。この位置からプレート１１１を１６．５ｍｍ下降させて、ボトムセットを行う。２４ウェルのプレート１１１を用いる際には、この値（２４）を入力してプレート１１１を移動させるが、使用するプレート１１１の厚さによって変わるため、この値には限定されない。
　次に、参照極一体型電極３０９を電極ホルダ３０３に設置する。そして、プレート１１１を観察位置（計測位置）に戻す。すなわち、プレート１１１を保持するプレートホルダ２０３を、電流の計測が行われる計測位置に移動させる。
　その後、プレート１１１におけるホール１１３間の移動の設定を行う。この位置（計測位置）から０．２ｍｍ下げて、ボトムセットを行う。その際、ホール１１３の深さが８０－１００μｍであるため、この値を入力してホール１１３間の移動を行うが、ホール１１３の深さは種々変わるため、上記値に限定されるものではない。
　次に、測定するスフェロイド１００を選択する。まず、プレート１１１に形成されているスフェロイド１００の顕微鏡の画像をタッチパネル３０７上に映し出す。さらに、タッチパネル３０７の画面３０８を見ながら、呼吸量を計測するスフェロイド１００を、画面３０８に触れることにより選択する。
　この時、スフェロイド１００それぞれの形状に基づいて、計測を行うスフェロイド１００すなわちホール１１３を選択する。
　なお、本実施の形態１の計測では、作業者が目視によって図１６に示すタッチパネル３０７の画面３０８を見て、スフェロイド１００の形状を確認し、画面上でのスフェロイド１００の形状が目視判断で真円に近い（円形度（真円度）の高い）ものを選択する。
　その後、次に計測する別のスフェロイド１００を選択するため、別の視野へ移動させるときには、タッチパネル３０７の、移動させたい方向の画面３０８を触れる。この操作により、触れた位置が画面３０８の中心に移動するように画面３０８がスクロールする。
　この操作を繰り返し、計測を行うと判断したスフェロイド１００のホール１１３を順次記憶させる。
　本実施の形態１では、以上のタッチパネル操作により、例えば、計測対象となる１０個のスフェロイド１００（ホール１１３）を選択する場合を説明するが、選択するスフェロイド１００の数は限定されるものではない。
　選択終了後、最初に選択したスフェロイド１００に戻り、選択した順に従って、スフェロイド１００の呼吸量（細胞の活性）を計測する。
　次に、図１７および図１８に示す参照極一体型電極３０９を用いた細胞の活性の計測方法について説明する。
　図１７に示すように、複数のホール１１３のそれぞれにスフェロイド１００が配置され、かつ各ウェル１１２に培養液３１６が収容されたプレート１１１に対して、培養液３１６中を流れる電流を計測する。
　計測は、図１８に示すように、培養液３１６中に参照極一体型電極３０９を浸し、計測対象のスフェロイド１００上で参照極一体型電極３０９を上下に複数回往復させてスキャニングする。これによって、スフェロイド１００の近傍（細胞から数μｍ程度の位置）と遠方（細胞から１５０μｍ程度の位置）のそれぞれの位置での電流を計測する。
　ここでは、参照極一体型電極３０９によって酸素が水に変換される時に流れる還元電流を計測する。具体的には、図１８に示すＲ部の領域でスフェロイド１００の直ぐ上の近傍の還元電流と、スフェロイド１００の上方１５０μｍ程度の位置での還元電流とを計測して両者の差を算出する。この時、活性度が高い（呼吸量が多い）スフェロイド１００の場合、その近傍での酸素濃度は低いため、この場合の上記計測値（差）は大きな値となる。
　つまり、上記計測値（差）が大きければ大きいほど、そのスフェロイド１００の活性度は高いという結果になる。
　以上のような計測方法でスフェロイド１００の活性を計測する。
　次に、選択された１番目のホール１１３におけるスフェロイド１００の活性の計測が終了した後、選択された２番目のホール１１３での計測に移る。すなわち、選択された２番目のホール１１３上の位置に参照極一体型電極３０９が配置されるように（上記２番目のホール１１３が計測位置に移動するように）、タッチパネル３０７での操作によって、プレートホルダ２０３を移動させる。
　なお、１つのホール１１３におけるスフェロイド１００の電流の計測が終了した後、参照極一体型電極（計測用の電極）３０９を培養液３１６中から外部に退避させている間に、次に計測が行われるホール１１３が計測位置に移動するようにプレートホルダ２０３を移動させておく。
　すなわち、１つのホール１１３での計測が終了したら、その後、参照極一体型電極３０９が上昇している時に、プレートホルダ２０３側を、次に計測が行われるホール１１３が計測位置に移動するように移動させる。
　これは、プレートホルダ２０３の移動機構と、参照極一体型電極３０９の移動機構とが独立しているため、両者を同時に駆動させることが可能になるものである。
　これにより、スフェロイド１００の電流計測の高スループット化を図ることができる。
　また、同一のウェル１１２内のホール１１３に対する電流の計測が終了したら、次に、他のウェル１１２内の選択されたホール１１３の位置を、上記計測位置に移動させるようプレートホルダ２０３の移動を制御部によって制御する。
　以上により、スフェロイド１００の電流の計測とプレートホルダ２０３の移動とを繰り返し行うことにより、スフェロイド１００それぞれの形状に基づいて選択された複数（ここでは、１０個）のホール１１３それぞれでのスフェロイド１００の電流の計測を終える。
　次に、図１９を用いて本実施の形態１の細胞活性計測方法と、本願発明者が比較検討を行った比較例（２本の電極を用いて、かつ顕微鏡を覗き込みながら上記２本の電極を手動で細胞の位置に移動させて電流を計測する方法）とで、費やす時間の比較を行う。
　なお、顕微鏡による画像を見ながら、どのスフェロイド１００を計測するかを選択する工程は、比較例および実施の形態１の何れの方法も共通の作業であるため、図１９に示すプロセスからは除いて示している。
　上記比較例の方法では、スフェロイド１００を専用の測定ウェルに移動し、２本の電極を電気化学顕微鏡にセットし、計測するスフェロイド１００の位置に２本の電極を移動し、スフェロイド１００の呼吸量の計測を行う、という４つのプロセスが必要となる。これにより、合計１７分の作業時間を要する。
　その中でも、特に、後半のプロセスに相当する計測のルーチン作業のみで約３分の計測時間が必要であった（図１９に示す点線囲み部分Ｆ１）。
　一方、本実施の形態１の細胞活性計測方法では、計測する順番は、選択した順番であるが、任意に設定することができる。その結果、１つのスフェロイド１００の活性の計測に費やす時間は、合計３分５秒となった。
　これにより、比較例の方法と実施の形態１の方法とで、１つのスフェロイド１００の呼吸量を計測するために必要な時間は、１７分から３分５秒に短縮することができる。特に、計測のルーチン作業のみに限れば、比較例の約３分から実施の形態１の１分５秒へと６５％の作業時間の短縮を実現することができる（図１９に示す点線囲み部分Ｆ２）。
　次に、本実施の形態１の細胞活性計測装置における制御ロボット２００と走査型電気化学顕微鏡３００の電極の位置再現性について、検証した結果を説明する。
　図２０および図２１はそれぞれ図１３に示す制御ロボットの位置再現性評価の手順の一例を示す工程図、図２２は図１３に示す制御ロボットの位置再現性評価におけるホールごとの電極先端位置の一例を示す平面図である。さらに、図２３は本発明の実施の形態１の細胞活性計測装置を用いた細胞活性の評価結果の一例を示すデータ図である。
　まず、図１３に示すプレートホルダ２０３に２４ウェルのプレート１１１をセットし、図１５に示す電極ホルダ３０３に参照極一体型電極３０９を取り付け、図１４に示す位相差顕微鏡３０４の焦点を参照極一体型電極３０９の電極先端部３０９ａに合わせる。
　続いて行った検証プロセスを図２０、図２１に示す。図１６に示すタッチパネル３０７上で、任意に１０か所のホール１１３を指定し、１から１０の番号を付与した（図２０の項番１）。
　タッチパネル３０７の操作により、番号１のホール１１３を指定し、プレート１１１を移動させる（図２０の項番２．１）。ホール１１３と電極先端部（図２０に黒点として図示）３０９ａの顕微鏡画像を撮影し、この時の電極位置をホール番号１の基準位置と設定する（図２０の項番２．２）。
　次に、番号２のホール１１３を指定し、同様の操作を行い、ホール番号２の基準位置を設定する（図２０の項番３）。この操作を番号１０のホール１１３まで順次行い、各ホール１１３の基準位置を設定する（図２０の項番４）。これにより、図２０に示す１クール目を終了する。
　上記１クール目のホール番号１０の基準値を設定した後に、再び番号１のホール１１３を指定し、プレート１１１を移動させ、１クール目と同様の操作を繰り返し行う（図２０の項番５）。
　さらに、２クール目が終了した後、図２１に示すように、同様の操作を合計１０クール行い、ホール毎に全１０個のデータを取得する（図２１の項番６，７）。続いて、ホール毎に取得した全１０枚の画像を重ねた後、各ホール１１３ともに１クール目に取得した基準電極位置を、長さ４０μｍの十字の交点で示したホール１１３の中心Ｓに重ね合わせる。
　そして、２クール目以降に取得したものと合わせ、計１０個の黒点（電極先端部３０９ａ）が十字内に収まった場合に、ホール１１３の中心Ｓに相当する基準位置から２０μｍの範囲内に収まっていると判断し、移動時の位置の再現性があると判定できる（図２１の項番８）。
  上記にしたがって、プレート移動の前後での位置再現性の検証データを各ホール当たり１０個取得し、プレート移動時の位置再現性を検証した。
　なお、スフェロイド１００の中心から２０－３０μｍ以内では、得られる呼吸量に差がないことがこれまでの実験により明らかになっているため、本実施の形態１では、閾値を２０μｍと設定し、プレート移動の前後での位置再現性を判定した。
　検証の結果、図２２に示すように、１０個のホール１１３の全てにおいて、プレート移動の前後での位置ズレが、予め設定した閾値に収まっていることから、位置再現性があると判定することができる。すなわち、本実施の形態１の細胞活性計測装置は、電気化学計測には十分な位置再現性を保持していることが確認できた。
  また、プレート１１１を用いてスフェロイド１００を形成した後、本実施の形態１の細胞活性計測装置を用いて呼吸量を計測した結果を図２３に示す。比較例の２本の電極を用いた場合と同様に、参照極一体型電極３０９を用いた場合においても、同様の呼吸量を計測することができた。
　なお、本実施の形態１で説明した細胞活性計測方法は、薬剤スクリーニングを行う前のスフェロイド１００の活性を予め評価する際に用いてもよい。さらに、実際に創薬工程において、薬剤候補物質を投与した際の細胞活性評価に用いてもよく、その使用目的は限定されるものではない。
　本実施の形態１の細胞活性計測装置および計測方法によれば、細胞を培養させたプレート１１１をそのまま用い、かつ計測時にプレート１１１の、選択されたホール１１３を計測位置に移動させるため、活性を計測する直前までの時間を短縮することができる。
　これにより、細胞活性の計測作業において高スループット化を実現することができる。
　その結果、膨大な数の医薬品候補物質の評価に利用する細胞の活性を高スループットで評価することができるため、有効な細胞のみを利用して、膨大な数の医薬品候補物質の毒性試験や代謝試験のような各種試験を行うことができる。
　また、細胞の活性の計測において高スループット化を実現することができるため、医薬品開発のスクリーニングに用いる膨大な数の医薬品候補物質に対しても、候補物質の早期の絞り込みを行うことができる。
　その結果、無駄な動物実験や、無用なヒト臨床試験を減少させることができ、新薬開発のコストの低減化を図ることができる。
　また、細胞の活性の計測においてプレート１１１の移動をタッチパネル３０７で操作することにより、顕微鏡を覗き込みながらの作業に比べて遥かに作業が容易になり、細胞の活性の計測作業を効率良く行うことができる。
　これにより、細胞の活性の計測作業をさらに高スループット化することができる。
　また、細胞の活性の計測作業において、培養液３１６に浸す電極として、参照極３０９ｂと計測電極３０９ｃとが一体に形成された参照極一体型電極３０９を採用することにより、参照極と計測電極とが別体で形成された２本の電極を用いる場合に比較して、計測時の電極の位置合わせを容易に行うことができる。
　これは、プレート１１１の各ウェル１１２の開口部が非常に狭いため、２本の電極をこの開口部に配置するのが困難であり、時間がかかるのに対して、参照極一体型電極３０９の場合には、電極が１本のため、位置合わせして各ウェル１１２の開口部に配置合わせすることを容易に行える。
　これにより、細胞の活性の計測作業を効率良く行うことができ、その結果、上記計測作業をさらに高スループット化することができる。
　以上により、非侵襲で、かつ自動で大量のサンプル（細胞）の評価を行うことができる高スループットな細胞活性計測装置および計測方法を実現することができる。
　＜実施の形態２＞
　本実施の形態２では、スフェロイド１００の選択から電流の計測に至るまでの操作を全自動で行う方法について述べる。
　上記実施の形態１では、電流の計測を行うスフェロイド１００（ホール１１３）を選択する際、作業者が目視によって円形度（真円度）が高いスフェロイド１００を選択する方法を一例として取り上げて説明した。
　上記実施の形態１のように、作業者が目視で任意のスフェロイド１００を選択する方法を採用する場合でも、プレート１１１をタッチパネル３０７の操作で移動させ、さらに参照極一体型電極３０９を用いることで、細胞の活性の計測作業の高スループット化は十分に図ることができる。
　そこで、本実施の形態２は、細胞の活性の計測作業の更なる高スループット化を実現するものである。
　ここでは、以下の操作を予め設定しておき、自動で細胞の活性の計測を行う例を示す。
　まず、最初の顕微鏡の画像をタッチパネル３０７の画面３０８に映し出す。この画面３０８の情報を画像処理して電流の計測を行うホール１１３を選択する。
　すなわち、電流の計測を行うホール１１３を選択する際に、例えば、プレート１１１における所望のウェル１１２をスキャンして、そのウェル１１２内の複数のホール１１３それぞれのスフェロイド１００の画像情報を取得する。そして、上記画像情報を画像処理し、全てのスフェロイド１００の中から閾値より円形度（真円度）が高いスフェロイド１００を選択し、それらの位置を記憶する。
　例えば、顕微鏡の二次元画像の画像情報を用いて、円形度を、円面積／（周囲長）2 の式より求める。求めた円形度が閾値より高い場合に、このスフェロイド１００（ホール１１３）を選択・記憶する。
　ただし、円形度の求め方は、円面積／（周囲長）2 の式に限らず、他の方法で求めてもよい。さらに、指標とするパラメータは円形度に限らないことは言うまでもない。
　その後、別のウェル１１２の画面３０８に移り、同じスキャニングと画像処理の作業を行う。例えば、全１０視野でこの作業を繰り返して行う。その後、最初のスフェロイド１００に戻り、呼吸量（活性）を計測する。
　これらプレート１１１の準備から、プレート１１１および参照極一体型電極３０９のそれぞれの移動と位置合わせ、さらに選択されたスフェロイド１００の電流の計測までを自動で実施するものである。
　なお、実施の形態１と同様に、この作業の使用目的は限定されるものではない。
　本実施の形態２の細胞活性計測方法により、プレート１１１の準備から、プレート１１１および参照極一体型電極３０９のそれぞれの移動と位置合わせ、さらに選択されたスフェロイド１００の電流の計測までを自動で実施することにより、細胞活性の計測作業の更なる高スループット化を実現することができる。
　また、細胞活性の計測作業を自動で行うことにより、オペレーションにおけるコストの低減化を図ることができる。
　なお、本実施の形態２の細胞活性計測装置および計測方法によって得られるその他の効果については、実施の形態１のものと同様であるため、その重複説明は省略する。
　以上、本発明者によってなされた発明を発明の実施の形態に基づき具体的に説明したが、本発明は前記発明の実施の形態に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で種々変更可能であることは言うまでもない。
　なお、本発明は上記した実施の形態に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上記した実施の形態は本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。
　また、ある実施の形態の構成の一部を他の実施の形態の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施の形態の構成に他の実施の形態の構成を加えることも可能である。また、各実施の形態の構成の一部について、他の構成の追加、削除、置換をすることが可能である。なお、図面に記載した各部材や相対的なサイズは、本発明を分かりやすく説明するため簡素化・理想化しており、実装上はより複雑な形状となる。
　上記実施の形態１，２では、プレート１１１に２４個のウェル１１２が形成されている場合を説明したが、プレート１１１に形成されているウェル１１２の数は、１個であってもよく、もしくは２個以上の複数であってもよい。
　１００　スフェロイド（細胞）
　１１１　プレート
１１１ａ　底部
１１１ｂ　面取り部
　１１２　ウェル（収容部）
　１１３　ホール（仕切り部）
　１１４　ナノピラー
　１１５　ホール仕切り壁
　１１６　ホール径
　１１７　ホール高さ
　１１８　ピラー領域
　１１９　ウェル仕切り壁
　２００　制御ロボット（制御部）
　２０１　ＸＹ軸制御部（制御部）
　２０２　Ｚ軸制御部（制御部）
　２０３　プレートホルダ（保持部）
　３００　走査型電気化学顕微鏡
　３０１　ポテンションスタッド
　３０２　電極走査用モータ
　３０３　電極ホルダ
　３０４　位相差顕微鏡
　３０５　カメラシステム
　３０６　テレビモニタ
　３０７　タッチパネル（入力部）
　３０８　画面
　３０９　参照極一体型電極（一体型電極）
３０９ａ　電極先端部
３０９ｂ　参照極
３０９ｃ　計測電極
　３１０　プラチナ膜
　３１１　ガラス本体部
　３１２　プラチナ線
　３１３　配線
　３１４　ボルト
　３１５　計測部
　３１６　培養液

Claims (11)

  1. 　細胞を保持する複数の仕切り部が形成されたプレートを保持可能な保持部と、
    　前記複数の仕切り部に保持されたそれぞれの前記細胞ごとに、前記複数の仕切り部を有する収容部内に収容された培養液中を流れる電流を計測する計測部と、
    　前記保持部の移動を制御する制御部と、
    　を有し、
    　前記制御部は、前記複数の仕切り部のうちの選択された仕切り部を、前記電流の計測が行われる計測位置に移動させるように、前記保持部の移動を制御する、細胞活性計測装置。
  2. 　請求項１に記載の細胞活性計測装置において、
    　前記収容部は複数であり、
    　前記複数の収容部のうち、１つの収容部内の前記選択された仕切り部における前記電流の計測が終了した後、
    　前記制御部は、他の収容部内の仕切り部の位置を前記計測位置に移動させるよう前記保持部の移動を制御する、細胞活性計測装置。
  3. 　請求項１に記載の細胞活性計測装置において、
    　前記選択された前記仕切り部は、前記細胞それぞれの形状に基づいて選択された仕切り部である、細胞活性計測装置。
  4. 　請求項１に記載の細胞活性計測装置において、
    　画面上の表示に触れることにより前記保持部の移動を操作する入力部を備えている、細胞活性計測装置。
  5. 　請求項１に記載の細胞活性計測装置において、
    　前記計測部は、参照極と計測電極とが一体に形成された一体型電極と電気的に接続され、
    　前記電流を前記一体型電極によって計測する、細胞活性計測装置。
  6. 　請求項１に記載の細胞活性計測装置において、
    　前記プレートに複数の前記収容部がマトリクス配列で形成されている、細胞活性計測装置。
  7. 　（ａ）複数の仕切り部を有する収容部の前記複数の仕切り部に細胞を配置したプレートを準備する工程、
    　（ｂ）前記プレートを保持する保持部を、電流の計測が行われる計測位置に移動させる工程、
    　（ｃ）前記複数の仕切り部に保持されたそれぞれの前記細胞ごとに、前記収容部内に収容された培養液中を流れる前記電流を計測する工程、
    　を有し、
    　前記複数の仕切り部のうちの選択された仕切り部が前記計測位置に移動するように、前記保持部の移動を制御する、細胞活性計測方法。
  8. 　請求項７に記載の細胞活性計測方法において、
    　前記選択された前記仕切り部は、前記細胞それぞれの形状に基づいて選択された仕切り部である、細胞活性計測方法。
  9. 　請求項７に記載の細胞活性計測方法において、
    　画面を有する入力部の前記画面上の表示に触れることにより前記保持部の移動を操作する、細胞活性計測方法。
  10. 　請求項７に記載の細胞活性計測方法において、
    　前記（ｃ）工程で、１つの前記仕切り部における前記細胞の前記電流を計測した後、計測用の電極を前記培養液中から外部に退避させている時に、次に計測が行われる仕切り部が前記計測位置に移動するように前記保持部を移動させる、細胞活性計測方法。
  11. 　請求項７に記載の細胞活性計測方法において、
    　前記（ａ）工程と前記（ｂ）工程の間に、複数の前記収容部内の前記細胞を画像処理して前記電流の計測が行われる前記仕切り部を選択する（ａ１）工程を有し、
    　前記（ａ１）工程、前記（ｂ）工程および前記（ｃ）工程を自動で実施する、細胞活性計測方法。
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