JP6919243B2 - 複合体ナノ粒子の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、複合体ナノ粒子及びその製造方法、ならびに複合体ナノ粒子を含む組成物に関する。

ナノ粒子は、化粧品、診断薬、及び治療薬などのバイオ医療応用から、配線材、発電・蓄電デバイス、及び発光素子などのエレクトロニクス応用まで幅広い分野で活用され、新規技術の開発も期待されている重要な素材である。従来、物理化学的に合成された金及び酸化チタンなどの微粒子が実用化されてきたが、高機能化や新機能付加に伴い多種多様な金属、及び半導体ナノ粒子が求められている（非特許文献１及び非特許文献２）。特に、セレン化銅インジウムや硫化銅インジウムからなる三元系の化合物ナノ粒子は太陽電池やレーザーなどへの応用が期待されており、様々な物理化学的合成方法が検討されてきた（特許文献１及び特許文献２）。

一般に、物理化学的なナノ粒子の合成方法として、素材を物理的に粉砕や研磨することで微粒子化する方法や、溶液あるいは気相中の原料を結晶成長させる方法などが知られている（非特許文献３及び非特許文献４）。しかし、いずれの方法においても、粒子の粒径制御、粒子同士の凝集防止、粒子表面の柔軟な機能化が課題となっている。

一方、自然界に存在する金属内包性タンパク質を利用したナノ粒子合成方法も知られている（特許文献３）。この方法においては、例えば、内径７ｎｍの内腔を有する外径１２ｎｍのカゴ状タンパク質であるフェリチンやその類縁タンパク質を、極微小な反応ポットとしてナノ粒子を合成する。この方法で合成されたナノ粒子は、タンパク質内部の限られた空間で形成されるため粒子径が均一で、タンパク質で被膜されているので溶液分散性が高く、遺伝子工学的にタンパク質表面を自由に改変でき粒子表面の機能化が容易といった特徴を持つ。さらに、該ナノ粒子は基本的に水溶液中、常温、大気圧の条件下の環境負荷が低いプロセスで合成できる。フェリチンタンパク質を用いて合成されたものとしては、鉄、マンガン、ウラン、鉛、コバルト、ニッケル、銅、クロムなどの金属の酸化物、また、酸化亜鉛、セレン化カドミウム、硫化カドミウムなどの半導体や磁性体などのナノ粒子が知られている(特許文献４、特許文献５及び非特許文献５)。

特許第５５６６９０１号公報 特表２０１４−５０２０５２号公報 特許第３６８３２６５号公報 特許第３７０３４７９号公報 特開２００９―１９０９８２号公報

Ｍａｒｉｅ−Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ Ｄａｎｉｅｌ ａｎｄ Ｄｉｄｉｅｒ Ａｓｔｒｕｃ，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２００４，Ｖｏｌ．１０４，ｐ２９３． Ｓ． Ｍ． Ｇｕｐｔａ, ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｓｃｉ．Ｂｕｌｌ．，２０１１，Ｖｏｌ．５６，ｐ．１６３９． Ｒａｊｉｂ Ｇｈｏｓｈ Ｃｈａｕｄｈｕｒｉ ａｎｄ Ｓａｎｔａｎｕ Ｐａｒｉａ Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２０１２， １１２，ｐ．２３７３． Ｓａｒｉｔａ Ｋａｎｇｏ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３８（２０１３），ｐ．１２３２． Ｉ．Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，２０１０，ｖｏｌ．１８００，ｐ．８４６．

例えば、セレン化銅インジウム等のような三元系の化合物のナノ粒子は太陽電池やレーザーなどへの応用が期待されているが、一般的な物理的合成方法により合成すると、粒子径の制御、粒子同士の凝集防止、及び粒子表面の機能化などが困難であった。
一方、カゴ状タンパク質を微少な反応場として利用する方法によれば、均一な粒径を持ち、溶液分散性に優れ、粒子表面が加工可能な化合物ナノ粒子を得ることが期待されるが、二種類以上の金属を含む化合物を内包したカゴ状タンパク質や、その合成例は、本発明者らが把握する限り、知られていなかった。
そこで、本発明が解決しようとする課題は、内腔を有するタンパク質の内腔に、二種以上の金属を含む化合物を内包した複合体ナノ粒子と、その製造方法を提供することである。

本発明者らは、鋭意検討した結果、内腔を有するタンパク質の内腔を微少な反応場として利用することで、均一な粒径を持ち、溶液分散性に優れるとともに、粒子表面が加工可能な、内腔に二種以上の金属を含む化合物を内包してなる複合体ナノ粒子の合成方法を見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本願発明は、以下のとおりである。
［１］内腔を有するタンパク質と、前記内腔に内包され、少なくとも３つの元素から構成される化合物と、を備え、前記化合物を構成する元素のうち、少なくとも２つの元素が金属元素である、複合体ナノ粒子。
［２］前記化合物が化合物半導体である、［１］に記載の複合体ナノ粒子。
［３］前記化合物を構成する元素が、銅、インジウム、ガリウム及びアルミニウムから選ばれる２つ以上の金属元素を含む、［１］または［２］に記載の複合体ナノ粒子。
［４］前記化合物を構成する元素が、セレン及び／又は硫黄を含む、［１］〜［３］のいずれかに記載の複合体ナノ粒子。
［５］前記化合物がセレン化銅インジウムまたは硫化銅インジウムである、［１］〜［４］のいずれかに記載の複合体ナノ粒子。
［６］平均粒子径が５ｎｍ〜３０ｎｍである、［１］〜［５］のいずれかに記載の複合体ナノ粒子。
［７］内腔を有するタンパク質が、内腔を有する２４量体を形成し得るタンパク質又は内腔を有する１２量体を形成し得るタンパク質である、［１］〜［６］のいずれかに記載の複合体ナノ粒子。
［８］［１］〜［７］のいずれかに記載の複合体ナノ粒子の製造方法であって、（Ａ）系中に、内腔を有するタンパク質、金属イオン、及び陰イオンを存在させて、金属イオンと陰イオンとが結合した化合物前駆体をタンパク質の内腔中に生成する工程と、（Ｂ）系中に、化合物前駆体を構成する金属イオンとは別の金属イオンをさらに存在させて、２種以上の金属イオンと陰イオンとが結合した化合物をタンパク質の内腔中に生成する工程と、を含む、複合体ナノ粒子の製造方法。
［９］（Ａ）工程の系中に存在させる金属イオンが銅イオンであり、（Ｂ）工程の系中に存在させる、化合物前駆体を構成する金属イオンとは別の金属イオンがインジウムイオンである、［８］に記載の複合体ナノ粒子の製造方法。
［１０］（Ｂ）工程において、系を加熱する、［８］または［９］に記載の複合体ナノ粒子の製造方法。
［１１］［１］〜［７］のいずれかに記載の複合体ナノ粒子の製造方法であって、系中に、内腔を有するタンパク質、２種以上の金属イオン、及び陰イオンを存在させて、２種以上の金属イオンと陰イオンとが結合した化合物をタンパク質の内腔中に生成する、複合体ナノ粒子の製造方法。
［１２］［１］〜［７］のいずれかに記載の複合体ナノ粒子と、水と、を含む組成物。

本発明によれば、内腔を有するタンパク質の内腔に、二種以上の金属を含む化合物を内包してなる複合体ナノ粒子と、その製造方法を提供することができる。

図１は合成例１で作製したセレン化インジウム−フェリチン複合体ナノ粒子の無染色サンプルの透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）像である。 図２は合成例１で作製したセレン化インジウム−フェリチン複合体を２．０％の金チオグルコース液で負染色したサンプルのＴＥＭ像である。 図３は合成例１で作製したセレン化インジウム−フェリチン複合体の電子エネルギー損失分光法（ＥＥＬＳ）を用いた元素マッピング像である。 図４は合成例１で作製したセレン化インジウム−フェリチン複合体のエネルギー分散型Ｘ線分析（ＥＤＳ）を用いた元素分析のチャートである。 図５は合成例２において、反応液のｐＨを３．４〜６．２としたときの、セレン化インジウム−フェリチン複合体粒子形成率を示すグラフである。 図６は合成例２において、反応液に含まれるアンモニアの濃度を５０ｍＭ〜２００ｍＭとしたときの、セレン化インジウム−フェリチン粒子形成率を示すグラフである。 図７は合成例２において、反応液の温度を４℃から６０℃としたときのセレン化インジウム−フェリチン粒子の形成率を示すグラフである。 図８は合成例３で作製したセレン化銅−フェリチン複合体の無染色サンプルの透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）像である。 図９は合成例３で作製したセレン化銅−フェリチン複合体を２．０％の金チオグルコース液で負染色したサンプルのＴＥＭ像である。 図１０は合成例３で作製したセレン化銅−フェリチン複合体のＥＥＬＳを用いた元素マッピング像である。 図１１は合成例３で作製したセレン化銅−フェリチン複合体のＥＤＳを用いた元素分析のチャートである。 図１２は合成例４において、反応液のｐＨを３．５〜６．８としたときの、セレン化銅−フェリチン複合体粒子形成率を示すグラフである。 図１３は合成例４において、反応液に含まれるアンモニアの濃度を４０ｍＭ〜９０ｍＭとしたときの、セレン化銅−フェリチン粒子形成率を示すグラフである。 図１４は合成例４において、反応液の温度を４℃から９０℃としたときのセレン化銅−フェリチン粒子形成率を示すグラフである。 図１５は実施例１−１のセレン化銅インジウム−フェリチン複合粒子を２．０％の金チオグルコース液で負染色したサンプルのＴＥＭ像である。 図１６は実施例１−１のセレン化銅インジウム−フェリチン複合粒子のＥＥＬＳを用いた元素マッピング像である。 図１７は実施例１−１のセレン化銅インジウム−フェリチン複合体のＥＤＳを用いた元素分析のチャートである。 図１８は実施例２−１のセレン化銅インジウム−フェリチン複合体のＴＥＭ像である。 図１９は実施例２−１のセレン化銅インジウム−フェリチン複合体のＥＥＬＳを用いた元素マッピング像である。 図２０は実施例２−１のセレン化銅インジウム−フェリチン複合体のＥＤＳを用いた元素分析のチャートである。 図２１は実施例３のセレン化銅インジウム−フェリチン複合体のＸＲＤパターンである。 図２２はセレン化銅−フェリチン複合体を前駆体として作成した実施例３のセレン化銅インジウム−フェリチン複合体（実線）の吸光スペクトルと、セレン化インジウム−フェリチン複合体を前駆体として合成された実施例１−１のセレン化銅インジウム−フェリチン複合体（破線）の吸光スペクトルである。 図２３はセレン化インジウム−フェリチン複合体を前駆体として合成された実施例１−１のセレン化銅インジウム−フェリチン複合体の蛍光スペクトルである。 図２４はアポフェリチンの蛍光スペクトルである。 図２５は実施例３のセレン化銅インジウム−フェリチン複合体の粒度分布を示すグラフである。 図２６は実施例３のセレン化銅インジウム−フェリチン複合体のＴＥＭ計測による粒度分布を示すグラフである。 図２７は実施例４で作製されたセレン化銅インジウム−フェリチン複合体を２．０％の金チオグルコース液で負染色したサンプルのＴＥＭ像である。 図２８は実施例４で作製されたセレン化銅インジウム−フェリチン複合体のＥＥＬＳを用いた元素マッピング像である。 図２９は実施例４で作製されたセレン化銅インジウム−フェリチン複合体のＥＤＳを用いた元素分析のチャートである。 図３０は実施例５において作製した硫化インジウム−Ｄｐｓ複合粒子を２．０％の金チオグルコース液で負染色したサンプルのＴＥＭ像である。 図３１は実施例５において作製した硫化インジウム−Ｄｐｓ複合粒子のＥＤＳを用いた元素分析のチャートである。 図３２は実施例６において作製した硫化銅インジウム−Ｄｐｓ複合粒子のＸＲＤを用いた結晶分析のチャートである。 図３３は実施例６において作製した硫化銅インジウム−Ｄｐｓ複合粒子のＸＰＳを用いた元素分析のチャートである。 図３４は実施例６において作製した硫化銅インジウム−Ｄｐｓ複合粒子のＸＰＳを用いた元素分析のチャートである。 図３５は実施例７において作製した硫化インジウム−フェリチン複合粒子のＴＥＭ像である。 図３６は実施例７において作製した硫化銅インジウム−フェリチン複合粒子のＴＥＭ像である。 図３７は実施例７において作製した硫化銅インジウム−フェリチン複合粒子のＸＲＤを用いた結晶分析のチャートである。

＜複合体ナノ粒子＞
本発明は、内腔を有するタンパク質と、少なくとも３つの元素からなり、前記内腔に内包される化合物と、を備え、前記化合物を構成する元素のうち、少なくとも２つの元素が金属元素である、複合体ナノ粒子を提供する。

用語「内腔を有するタンパク質」とは、内部に空間を有するタンパク質をいう。ここで、前記のタンパク質は単独で内部に空間を有していてもよく、多量体を形成することによって当該多量体の内部に空間を有していてもよい。通常タンパク質としては多量体を形成することによって当該多量体の内部に空間を有するタンパク質を用いる。このような多量体は内腔を有する多量体を形成し得るタンパク質によって形成され得る。ここで、用語「内腔を有する多量体を形成し得るタンパク質」とは、内部に空間を有する多量体を、タンパク質の会合によって、形成する能力を有するタンパク質をいう。このようなタンパク質としては、幾つかのタンパク質が知られている。例えば、このようなタンパク質としては、内腔を有する２４量体を形成し得るタンパク質（例、フェリチン）、および内腔を有する多量体（例、１２量体）を形成し得るタンパク質が挙げられる。内腔を有する多量体を形成し得るタンパク質としては、例えば、内腔を有する１２量体を形成し得るＤｐｓ（ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ ｓｔａｒｖｅｄ ｃｅｌｌｓ）が挙げられる。Ｄｐｓは、分子量約１８ｋＤａの単量体単位からなる１２量体を形成することにより、約５ｎｍの直径の内腔を有する外径９ｎｍからなるかご状構造を形成する。Ｄｐｓは、それが由来する細菌の種類によってはＮａｐＡ、バクテリオフェリチン、ＤｌｐまたはＭｒｇＡと称呼される場合があり、また、Ｄｐｓには、ＤｐｓＡ、ＤｐｓＢ、Ｄｐｓ１、Ｄｐｓ２等のサブタイプが知られている（Ｔ．Ｈａｉｋａｒａｉｎｅｎ ａｎｄ Ａ．Ｃ．Ｐａｐａｇｅｏｒｇｉｏｎ， Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．，２０１０ ｖｏｌ．６７，ｐ．３４１を参照）。したがって、本発明では、用語「Ｄｐｓ」は、これらの別名で称呼されるタンパク質も含むものとする。内腔を有する多量体を形成し得るタンパク質は、そのＮ末端部および／またはＣ末端部が多量体の表面に露出していてもよい。

内腔を有する多量体を形成し得るタンパク質は、原核生物または真核生物に由来するものであってもよい。内腔を有する多量体を形成し得るタンパク質はまた、微生物、昆虫、植物、および哺乳動物等の動物に由来するものであってもよい。

好ましい実施形態では、内腔を有する多量体を形成し得るタンパク質は、内腔を有する多量体を形成し得るタンパク質を産生する微生物に由来するタンパク質であってもよい。このような微生物としては、例えば、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属、エスケリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）属、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）属、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属、サーモシネココッカス（Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）属、およびデイノコッカス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ならびにコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する細菌が挙げられる。
リステリア属に属する細菌としては、例えば、リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）が挙げられる。スタフィロコッカス属に属する細菌としては、例えば、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ Ａｕｒｅｕｓ）が挙げられる。バチルス属に属する細菌としては、例えば、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）が挙げられる。ストレプトコッカス属に属する細菌としては、例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス スイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ）が挙げられる。ビブリオ属に属する細菌としては、例えば、ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）が挙げられる。エスケリシア属に属する細菌としては、例えば、エスケリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）が挙げられる。ブルセラ属に属する細菌としては、例えば、ブルセラ・メリテンシス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ Ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ）が挙げられる。ボレリア属に属する細菌としては、例えば、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ Ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）が挙げられる。マイコバクテリウム属に属する細菌としては、例えば、マイコバクテリウム・スメグマティス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）が挙げられる。カンピロバクター属に属する細菌としては、例えば、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）が挙げられる。サーモシネココッカス属に属する細菌としては、例えば、サーモシネココッカス・エロンガタス（Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ Ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）が挙げられる。デイノコッカス属に属する細菌としては、例えば、デイノコッカス・ラディオデュランス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ Ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）が挙げられる。パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する細菌としては、例えば、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）が挙げられる。コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する細菌としては、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）が挙げられる。

別の好ましい実施形態では、内腔を有する多量体を形成し得るタンパク質は、内腔を有する多量体を形成し得るタンパク質を産生する、哺乳動物等の動物に由来するタンパク質であってもよい。哺乳動物としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ウシ、ウマ、ヤギ、およびブタが挙げられる。

内腔を有する多量体を形成し得るタンパク質としては、耐熱性タンパク質を用いることもまた好ましい。このような耐熱性タンパク質としては、例えば、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）等のパイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌のような好熱性微生物に由来するタンパク質が挙げられる。耐熱性タンパク質を用いることで、内腔を有する多量体の培地からの回収が容易になる。

内腔を有する多量体を形成し得るタンパク質はさらに、天然に生じるタンパク質、または内腔を有する多量体を形成し得るその変異体であってもよい。このような変異体としては、例えば、１または数個（例、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個または１〜５個）のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および／または付加を有する変異体である。当業者であれば、本願明細書中の開示、および当該分野における技術常識に基づき、このような変異体を容易に作製することができる。

例えば、内腔を有する多量体を形成し得るタンパク質は、標的物質に結合し得るペプチド部分をそのＮ末端および／またはＣ末端に付加されたものであってもよい。用語「標的物質に結合し得るペプチド部分」とは、任意の標的物質に対して親和性を有するペプチドを有し、かつ当該標的物質に対して結合できる部分をいう。標的物質に対して親和性を有する種々のペプチドが知られているので、本発明では、このようなペプチドを有する部分を、上記ペプチド部分として用いることができる。標的物質に結合し得るペプチド部分は、任意の標的物質に対して親和性を有する１個のペプチドのみを有していてもよいし、あるいは任意の標的物質に対して親和性を有する同種または異種の複数のペプチドを有していてもよい。標的物質としては、例えば、無機材料および有機材料、あるいは導体材料、半導体材料および磁性体材料が挙げられる。具体的には、このような標的物質としては、金属材料（例、チタン、ニオブ等の金属、および金属酸化物等の金属化合物）、シリコン材料（例、シリコン、およびシリコン酸化物等のシリコン化合物）、炭素材料（例、カーボンナノチューブ、カーボンナノホーン等のカーボンナノ材料）、低分子化合物（例、ポルフィリン等の生体物質、放射性物質、蛍光物質、色素、薬物）、ポリマー（例、疎水性有機ポリマーまたは伝導性ポリマー）、タンパク質（例、オリゴペプチドまたはポリペプチド）、核酸、糖質、脂質が挙げられる。

内腔を有する多量体を形成し得るタンパク質はまた、内腔を有する多量体を形成し得るタンパク質のＮ末端に、分泌シグナルを有していてもよい。分泌シグナルとしては、例えば、糸状菌において作用できるものが挙げられる。このようなシグナル配列としては、例えば、セロビオヒドロラーゼ遺伝子（例、ｃｂｈＩ、ｃｂｈＩＩ）、エンドグルカナーゼ遺伝子、β−グルコシダーゼ遺伝子、およびアミラーゼ遺伝子などの遺伝子由来のシグナル配列が挙げられる。内腔を有する多量体を形成し得るタンパク質が分泌シグナルを有する場合、分泌シグナルが付加された、内腔を有する多量体を形成し得るタンパク質が糸状菌内で発現するが、分泌過程において分泌シグナルは切断され得るので、培地中には、分泌シグナルを含まない、内腔を有する多量体を蓄積させることができる。

本発明において、内腔を有するタンパク質の内腔に内包される化合物は、少なくとも３つの元素からなり、該化合物を構成する元素のうち、少なくとも２つの元素が金属元素である。内腔を有するタンパク質の内腔に内包される化合物は、二種以上の金属を含む。

内腔を有するタンパク質に内包される化合物を構成する元素としては、例えば、銅、銀及び金等の第１１族の元素、亜鉛、及びカドミウム等の第１２族の元素、ホウ素、アルミニウム、ガリウム、インジウム及びタリウム等の第１３族の元素、ケイ素、ゲルマニウム及びスズ等の第１４族の元素、窒素、リン、及びヒ素等の第１５族の元素、ならびに、硫黄、セレン、及びテルル等の第１６族の元素などが挙げられる。

内腔を有するタンパク質に内包される化合物を構成する金属元素としては、銅、インジウム、ガリウム及びアルミニウムから選ばれる２つ以上の金属元素を含むのが好ましく、銅及びインジウムを含むのがより好ましい。また内腔を有するタンパク質の内腔に内包される化合物を構成する元素としては、セレン及び／又は硫黄を含むのが好ましい。本発明において、内腔を有するタンパク質に内包される化合物としては、化合物半導体が好ましく、セレン化銅インジウム及び硫化銅インジウムがより好ましい。

内腔を有するタンパク質の内腔には、二種以上の金属を含む化合物とともに、例えば鉄、ベリリウム、ガリウム、マンガン、リン、ウラン、鉛、コバルト、ニッケル、クロムなどの一種の金属の酸化物、また、セレン化カドミウム、硫化亜鉛、硫化鉄、硫化カドミウムなどの半導体又は磁性体などのナノ粒子等が内包されていてもよい。

本発明の複合体ナノ粒子の平均粒子径は、例えば内腔を有するタンパク質としてフェリチンを用いる場合、５ｎｍ〜３０ｎｍであるのが好ましく、７ｎｍ〜２５ｎｍであるのがより好ましく、７ｎｍ〜２０ｎｍであるのがさらに好ましい。複合体ナノ粒子の平均粒子径は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて観察することにより測定することができる。また、複合体ナノ粒子の粒度分布は例えば、ゼータサイザーナノを用いた動的光散乱法で測定することができる。内腔を有するタンパク質の厚みは０．１ｎｍ〜１０ｎｍであるのが好ましく、０．５ｎｍ〜７ｎｍであるのがより好ましく、１ｎｍ〜５ｎｍであるのがさらに好ましい。タンパク質の内腔に内包されている化合物の粒子径は、１ｎｍ〜２０ｎｍであるのが好ましく、２ｎｍ〜１５ｎｍであるのがより好ましく、２ｎｍ〜７ｎｍであるのがさらに好ましい。

＜複合体ナノ粒子の製造方法＞
次に、本発明の複合体ナノ粒子の製造方法について説明する。
本発明の複合体ナノ粒子の製造方法の一実施形態においては、（Ａ）系中に、内腔を有するタンパク質、金属イオン、及び陰イオンを存在させて、金属イオンと陰イオンとが結合した化合物前駆体を該タンパク質の内腔中に生成する工程（以下、「（Ａ）工程」という）と、（Ｂ）系中に、化合物前駆体を構成する金属イオンとは別の金属イオンをさらに存在させて、２種以上の金属イオンと陰イオンとが結合した化合物をタンパク質の内腔中に生成する工程（以下、「（Ｂ）工程」という）と、を含む。この実施形態は、（Ａ）工程及び（Ｂ）工程の２工程を含み、少なくとも２段階の反応により、タンパク質の内腔中で、２種以上の金属イオンと陰イオンとを結合させた化合物を生成し、複合体ナノ粒子を製造する(第１の実施形態)。

(第１の実施形態)
（Ａ）工程
（Ａ）工程は、内腔を有するタンパク質、金属イオン、及び陰イオンを存在させて、金属イオンと陰イオンとが結合した化合物前駆体を該タンパク質の内腔中に生成する工程である。

（Ａ）工程において、系中に存在させる、内腔を有するタンパク質は、上記＜複合体ナノ粒子＞における「内腔を有するタンパク質」と同様である。

（Ａ）工程において、系中に存在させる金属イオン（「第１の金属イオン」ともいう）は、上記の内腔を有するタンパク質の内腔に内包される化合物を構成する元素のうち、金属元素を供給するイオンである。第１の金属イオンとしては、銅イオン、銀イオン及び金イオン等の第１１族の金属イオン、アルミニウムイオン、ガリウムイオン、インジウムイオン及びタリウムイオン等の第１３族の金属イオンが挙げられる。これらのうち、銅イオン、インジウムイオン、ガリウムイオン及びアルミニウムイオンが好ましく、銅イオン及びインジウムイオンがより好ましい。

系中に第１の金属イオンを存在させるには、第１の金属イオンを供給する化合物を用いることができる。第１の金属イオンを供給する化合物としては、第１の金属イオンの塩（酢酸塩、硫酸塩、硝酸塩、及び塩酸塩等）が挙げられる。銅イオンを供給する化合物の具体例としては、酢酸銅、硫酸銅、及び塩化銅等が挙げられ、インジウムイオンを供給する化合物の具体例としては、例えば硫酸インジウム、及び塩化インジウム等が挙げられる。

（Ａ）工程において、系中に存在させる陰イオンは、上述の内腔を有するタンパク質の内腔に内包される化合物を構成する元素のうち、金属元素以外の元素を供給するイオンである。陰イオンとしては、セレン化物イオン、硫化物イオン、テルル化物イオン、窒化物イオン、リン化物イオン、及びヒ化物イオン等が挙げられる。これらのうち、セレン化物イオン及び硫化物イオンが好ましい。

系中に陰イオンを存在させるには、陰イオンを供給する化合物を用いることができる。陰イオンを供給する化合物の具体例としては、セレノ尿素及びチオ酢酸等が挙げられる。

（Ａ）工程において、系中には、内腔を有するタンパク質、第１の金属イオンを供給する化合物および陰イオンを供給する化合物以外に、緩衝剤、水等の溶媒、塩酸、酢酸、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム等のｐＨ調整剤、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート剤等を含ませることができる。第１の金属イオンを供給する化合物として硫酸インジウムや酢酸銅を用い、陰イオンを供給する化合物としてセレノ尿素及び／又はチオ酢酸を用いる場合には、緩衝剤として酢酸アンモニウム等を用いることができる。またこの場合に、反応液はアンモニア等を含んでいてもよい。さらに、この場合には、溶媒として水を用いることができ、ｐＨ調整剤として塩酸を用いることができる。

好適な一実施形態において、内腔を有するタンパク質としてアポフェリチンを用い、第１の金属イオンを供給する化合物として硫酸インジウムを用い、陰イオンを供給する化合物としてセレノ尿素を用い、これらの成分と、アンモニアと酢酸アンモニウムとを含む反応液を０．５〜２０時間放置して、アポフェリチンの内腔に、化合物前駆体を生成する。この実施形態において、反応液のｐＨは、収率を高める観点から、３．７〜５．１であるのが好ましく、４．３〜４．７であるのがより好ましく、４．４〜４．５であるのがより好ましい。また、この実施形態においては、反応液中の総アンモニアの濃度は、収率を高める観点から、５０ｍＭ〜２００ｍＭであるのが好ましく、６０ｍＭ〜１００ｍＭであるのがより好ましく、８５ｍＭ〜１００ｍＭであるのがさらに好ましい。さらにこの実施形態において、反応液の温度は、収率を高める観点から、４℃〜６０℃であるのが好ましく、４０℃以下であるのがより好ましい。

別の好適な一実施形態において、内腔を有するタンパク質としてアポフェリチンを用い、第１の金属イオンを供給する化合物として酢酸銅を用い、陰イオンを供給する化合物としてセレノ尿素を用い、これらの成分と、アンモニアと酢酸アンモニウムとを含む反応液を６〜１２時間放置して、アポフェリチンの内腔に、化合物前駆体を生成する。この実施形態において、反応液のｐＨは、収率を高める観点から、３．５〜６．８であるのが好ましく、３．７〜５．１であるのがより好ましく、３．９〜５．１であるのがさらに好ましい。また、この実施形態においては、反応液中の総アンモニアの濃度は収率を高める観点から４０ｍＭ〜９０ｍＭであるのが好ましく、５０ｍＭ〜７０ｍＭであるのがより好ましい。さらにこの実施形態において、反応液の温度は、収率を高める観点から４０℃以下であるのが好ましく、４℃〜４０℃であるのがより好ましく、２５℃〜４０℃であるのがさらに好ましく、２５℃〜３５℃であるのがさらに好ましい。

上記とは別の好適な一実施形態において、内腔を有するタンパク質としてアポフェリチンを用い、第１の金属イオンを供給する化合物として硫酸インジウムを用い、陰イオンを供給する化合物としてチオ酢酸を用い、これらの成分と、アンモニアと酢酸アンモニウムとを含む反応液を０．５〜２０時間放置して、アポフェリチンの内腔に、化合物前駆体を生成する。この実施形態において、反応液のｐＨは、収率を高める観点から、３．２〜５．１であるのが好ましく、３．５〜４．７であるのがより好ましく、３．７〜４．５であるのがより好ましい。また、この実施形態においては、反応液中の総アンモニアの濃度は、収率を高める観点から、５０ｍＭ〜２００ｍＭであるのが好ましく、６０ｍＭ〜１５０ｍＭであるのがより好ましく、８５ｍＭ〜１５０ｍＭであるのがさらに好ましい。さらにこの実施形態において、反応液の温度は、収率を高める観点から、４℃〜６０℃であるのが好ましく、４０℃以下であるのがより好ましい。

反応液中の、内腔を有するタンパク質の量は、タンパク質の種類により適宜選択することができるが、例えばアポフェリチン及びＤｐｓの場合だと、０．０１ｇ／Ｌ〜１００ｇ／Ｌであるのが好ましく、０．０５ｇ／Ｌ〜５０ｇ／Ｌであるのがより好ましく、０．１ｇ／Ｌ〜１０ｇ／Ｌであるのがさらに好ましい。反応液中の第１の金属イオンを供給する化合物の量は、最終濃度で０．０１ｍＭ〜１００ｍＭであるのが好ましく、０．０５ｍＭ〜５０ｍＭであるのがより好ましく、０．１ｍＭ〜１０ｍＭであるのがさらに好ましい。また、反応液中の陰イオンを供給する化合物の量は最終濃度で０．０１ｍＭ〜１００ｍＭであるのが好ましく、０．０５ｍＭ〜５０ｍＭであるのがより好ましく、０．１ｍＭ〜１０ｍＭであるのがさらに好ましい。

（Ｂ）工程
（Ｂ）工程は、（Ａ）工程を経た後の系中に、化合物前駆体を構成する金属イオン（第１の金属イオン）とは別の金属イオン（「第２の金属イオン」ともいう）をさらに存在させて、２種以上の金属イオンと陰イオンとが結合した化合物をタンパク質の内腔中に生成する工程である。

（Ｂ）工程において、系中に存在させる第２の金属イオンとしては第１の金属イオンと相違する金属のイオンであればよく、１種であっても２種以上であってもよい。第２の金属イオンは、内腔を有するタンパク質の内腔に内包される化合物を構成する元素のうち、金属元素を供給するイオンである。第２の金属イオンとしては、第１の金属イオンと同様の金属イオンを例示することができ、銅イオン、インジウムイオン、ガリウムイオン及びアルミニウムイオンが好ましく、銅イオン及びインジウムイオンがより好ましい。

（Ｂ）工程において、系中に第２の金属イオンを存在させるには、第２の金属イオンを供給する化合物を用いることができる。第２の金属イオンを供給する化合物としては、第１の金属イオンを供給する化合物と同様の化合物を例示することができる。

（Ｂ）工程においては、系中に、（Ａ）工程において系中に存在させる陰イオンと同じ陰イオンを存在させてもよいし、別の陰イオンを存在させてもよい。（Ｂ）工程において、系中に存在させる陰イオンとしては（Ａ）工程において系中に存在させる陰イオンと同様の金属イオンを例示することができ、セレン化物イオン及び硫化物イオンが好ましい。（Ｂ）工程において系中に存在させる陰イオンは一種であっても二種以上であってもよい。

（Ｂ）工程において、系中に陰イオンを供給する化合物としては、（Ａ）工程において系中に陰イオンを供給する化合物と同様の化合物を例示することができる。（Ｂ）工程において、系中に存在させる陰イオンと、（Ａ）工程において系中に存在させる陰イオンとが同じ場合、（Ｂ）工程において、陰イオンを供給する化合物を追加してもよいし、追加しなくてもよい。

（Ｂ）工程においても、系中に、内腔を有するタンパク質、第２の金属イオンを供給する化合物、陰イオンを供給する化合物以外に、緩衝剤、水等の溶媒、塩酸、酢酸、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム等のｐＨ調整剤、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート剤等を含ませることができる。第２の金属イオンを供給する化合物として硫酸インジウムや酢酸銅を用い、陰イオンを供給する化合物としてセレノ尿素を用いる場合には、緩衝剤として酢酸アンモニウム等を用いることができる。またこの場合に、反応液はアンモニア等を含んでいてもよい。さらに、この場合には、溶媒として水を用いることができ、ｐＨ調整剤として塩酸を用いることができる。

反応液中の第２の金属イオンを供給する化合物の量は、最終濃度で０．０１ｍＭ〜１００ｍＭであるのが好ましく、０．０５ｍＭ〜５０ｍＭであるのがより好ましく、０．１ｍＭ〜１０ｍＭであるのがさらに好ましい。また、反応液中の陰イオンを供給する化合物の量は最終濃度で１００ｍＭ以下であるのが好ましく、５０ｍＭ以下であるのがより好ましく、１０ｍＭ以下であるのがさらに好ましい。（Ｂ）工程において陰イオンを供給する化合物は必須ではないが、陰イオンを供給する化合物を用いる場合、反応液中の陰イオンを供給する化合物の量は最終濃度で０．１ｍＭ以上、より好ましくは０．５ｍＭ以上であるのがより好ましい。

本発明の複合体ナノ粒子の製造方法において、内腔を有するタンパク質の内腔に内包させる化合物を構成する２種以上の金属イオンを系中に存在させる順序は限定されない。例えば、フェリチンの内腔にセレン化銅インジウムを内包させてなる複合体ナノ粒子を作製する場合、（Ａ）工程において、系中に銅イオンを存在させ、（Ｂ）工程において、系中にインジウムイオンを存在させてもよいし、（Ａ）工程において、系中にインジウムイオンを存在させ、（Ｂ）工程において、系中に銅イオンを存在させてもよい。

第１の実施形態により複合体ナノ粒子を作製する場合、収率を高める観点から、（Ｂ）工程において系の温度を２５℃以上６０℃以下となるように加熱するのが好ましく、２５℃以上４０℃以下となるように加熱するのがより好ましい。

内腔を有するタンパク質に内包される化合物が３種以上の金属を含む場合、（Ｂ）工程において、系中に２種以上の金属イオンを存在させることにより、（Ａ）工程で生成した化合物前駆体に２種以上の金属イオンを結合させてもよいし、（Ｂ）工程を２回以上繰り返すことにより、（Ａ）工程で生成した化合物前駆体に２種以上の金属イオンを結合させてもよい。

(第２の実施形態)
本発明の複合体ナノ粒子の製造方法の別の実施形態では、系中に、内腔を有するタンパク質、２種以上の金属イオン、及び陰イオンを存在させて、２種以上の金属イオンと陰イオンとが結合した化合物をタンパク質の内腔中に生成する。この実施形態においては、２種以上の金属イオンと陰イオンとを１段階の反応で結合させてタンパク質の内腔中に内包させる。

２種以上の金属イオンとしては、第１の実施形態において第１の金属イオンとして例示した金属イオンと同様のものを用いることができ、２種以上の金属イオンを供給する化合物としては第１の実施形態において第１の金属イオンを供給する化合物として例示した化合物のうちから２種以上を用いることができる。

第２の実施形態において、２種以上の金属イオンとしては、銅イオン及びインジウムイオンを用いるのが好ましく、これらの金属イオンを供給する化合物としては、酢酸銅および硫酸インジウムが好ましい。

陰イオンとしては、第１の実施形態において説明した陰イオンと同様のものを用いることができ、陰イオンを供給する化合物としては第１の実施形態において説明した陰イオンを供給する化合物と同様のものを用いることができる。陰イオンとしてはセレン化物イオン及び硫化物イオンが好ましく、陰イオンを供給する化合物としてはセレノ尿素及びチオ酢酸が好ましい。

第２の実施形態において、内腔を有するタンパク質、金属イオンを供給する化合物、及び陰イオンを供給する化合物以外に、緩衝剤、水等の溶媒、塩酸等のｐＨ調整剤等を含ませることができる。金属イオンを供給する化合物として硫酸インジウム及び酢酸銅を用い、陰イオンを供給する化合物としてセレノ尿素及びチオ酢酸を用いる場合には、緩衝剤として酢酸アンモニウム等を用いることができる。またこの場合に、反応液はアンモニア等を含んでいてもよい。さらに、この場合には、溶媒として水を用いることができ、ｐＨ調整剤として塩酸を用いることができる。

第２の実施形態において、内腔を有するタンパク質、金属イオンを供給する化合物を二種以上、陰イオンを供給する化合物、緩衝剤、溶媒、ｐＨ調整剤等を含む反応液を０．５〜２０時間放置することにより複合体ナノ粒子が得られる。

第２の実施形態において、反応液中の内腔を有するタンパク質の量は、タンパク質の種類により適宜選択することができるが、例えばアポフェリチンの場合だと、最終濃度で０．０１ｇ／Ｌ〜１００ｇ／Ｌであるのが好ましく、０．０５ｇ／Ｌ〜５０ｇ／Ｌであるのがより好ましく、０．１ｇ／Ｌ〜１０ｇ／Ｌであるのがさらに好ましい。反応液中の金属イオンを供給する化合物の量は、最終濃度で０．０１ｍＭ〜１００ｍＭであるのが好ましく、０．０５ｍＭ〜５０ｍＭであるのがより好ましく、０．１ｍＭ〜１０ｍＭであるのがさらに好ましい。また、反応液中の陰イオンを供給する化合物の量は最終濃度で０．０１ｍＭ〜１００ｍＭであるのが好ましく、０．０５ｍＭ〜５０ｍＭであるのがより好ましく、０．１ｍＭ〜１０ｍＭであるのがさらに好ましい。

本発明の複合体ナノ粒子は、溶液分散性が高く、遺伝子工学的にタンパク質表面を自由に改変でき粒子表面の機能化が容易といった特徴を有しており、例えば、光触媒活性または電気特性等に優れたデバイスおよび材料等の開発に有用である。具体的には、複合体ナノ粒子は、光電変換素子（例、色素増感太陽電池等の太陽電池）、水素発生素子、半導体メモリ素子の作製における材料または構成要素として有用である。

本発明の複合体ナノ粒子および本発明の製造方法により得られる複合体ナノ粒子は、通常、複合体ナノ粒子及び水を含む組成物の状態で得られる。複合体ナノ粒子は分散性に優れるので、該複合体ナノ粒子と水とを含む本発明の組成物も、複合体ナノ粒子と同様の用途等に有用である。本発明の組成物には用途等を考慮して、水及び複合体ナノ粒子以外の成分を含有させることが可能である。本発明の組成物中の、複合体ナノ粒子の濃度は、組成物の用途によって適宜設定することが可能であるが、例えば、太陽電池素子の用途においては、０．０１〜５０質量％であるのが好ましく、０．０５〜３０質量％であるのがより好ましく、０．１〜１０質量％であるのがさらに好ましい。

以下の実施例により、本発明を詳細に説明するが、これらの実施例により本発明が限定されるものではない。

＜合成例１：セレン化インジウム−フェリチン複合体の合成＞
内腔を有するタンパク質としてフェリチンを用い、以下の方法により、セレン化インジウム−フェリチン複合体（セレン化インジウムを内包したフェリチン）を作製した。
終濃度が、硫酸インジウム１ｍＭ、セレノ尿素０．５ｍＭ、アポフェリチン（金属化合物粒子を内包していないフェリチン）０．３ｇ／Ｌ、酢酸アンモニウム４０ｍＭ、アンモニア５０ｍＭであるとともに、１ＭのＨＣｌ水溶液によりｐＨ４．５となるように調製した反応液を、２５℃で２０時間放置した。その後、１５，０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離により、上清を回収することで得られたサンプルにつき、無染色のサンプルと、２．０％金チオグルコース液により負染色したサンプルを、それぞれ、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ、ＪＥＯＬ日本電子（株）製「ＪＥＭ−２２００ＦＳ」）により解析したところ、粒子径が均一なナノ粒子を複数個、確認した（図１及び図２を参照）。さらに、得られたナノ粒子の組成を、電子顕微鏡（ＪＥＯＬ日本電子（株）製「ＪＥＭ−３１００ＦＥＦ」）を用いた電子エネルギー損失分光法（ＥＥＬＳ）と、エネルギー分散型Ｘ線分析（ＥＤＳ）とにより分析した結果、いずれの分析方法によってもインジウムとセレンが検出され、セレン化インジウムを内包したフェリチンのナノ粒子（セレン化インジウム−フェリチン複合体のナノ粒子）が得られていることが確認された（図３及び図４を参照）。

＜合成例２：セレン化インジウム−フェリチン複合体の合成条件の検討＞
セレン化インジウム−フェリチン複合体の合成条件（反応液のｐＨ、反応液に含まれるアンモニアの濃度及び反応温度）の検討を行った。

（反応液のｐＨの検討）
セレン化インジウム−フェリチン複合体の合成条件を最適化するために、種々のｐＨの反応液を作製し検討した。具体的には、終濃度が、硫酸インジウム１ｍＭ、セレノ尿素０．５ｍＭ、アポフェリチン０．３ｇ／Ｌ、酢酸アンモニウム４０ｍＭ、アンモニア３４ｍＭであるとともに、１ＭのＨＣｌ水溶液によりｐＨが３．４から６．２となるように調製した反応液を、それぞれ２５℃で２０時間放置した。その後、１５，０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離により、上清を回収することで得られたサンプルを２．０％の金チオグルコース液により負染色し、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ、ＪＥＯＬ日本電子（株）製「ＪＥＭ−２２００ＦＳ」）を使用した解析するとともに、ＥＥＬＳ及びＥＤＳによる元素分析を行い、観察された全フェリチンのうち、セレン化インジウムを内包しているフェリチンの割合を計測しグラフに示した（図５を参照）。図５に示すグラフにおいて、横軸は反応液のｐＨを示し、縦軸は、全フェリチン中のセレン化インジウムを内包しているフェリチンの割合（以下、「セレン化インジウムを内包しているフェリチンの割合」ともいう）を示している。グラフの縦軸における、Ｎはセレン化インジウムを内包しているフェリチンの割合が０であることを示し、Ｌはセレン化インジウムを内包しているフェリチンの割合が０．４未満であることを示し、Ｍはセレン化インジウムを内包しているフェリチンの割合が０．４以上０．８未満であることを示し、Ｈはセレン化インジウムを内包しているフェリチンの割合が０．８以上であることを示す。

図５に示すように、反応液のｐＨを３．７から５．１としたものにおいて、セレン化インジウム−フェリチン複合体のナノ粒子の形成が確認された。特に、反応液のｐＨを４．３から４．７としたものでは、セレン化インジウムを内包しているフェリチンの割合が０．４以上、すなわち、全フェリチンのうち、４０％以上のフェリチンの内腔にセレン化インジウム粒子が生成されるので、セレン化インジウム−フェリチン複合体のナノ粒子の形成において好ましいということがわかった。

（アンモニア濃度の検討）
種々のアンモニア濃度の反応液を作製し検討した。具体的には、終濃度が、硫酸インジウム１ｍＭ、セレノ尿素０．５ｍＭ、アポフェリチン０．３ｇ／Ｌ、酢酸アンモニウム４０ｍＭであるとともに、アンモニアを終濃度が１０ｍＭ〜１６０ｍＭとなるように加え、１ＭのＨＣｌ水溶液によりｐＨ４．４に調製した反応液をそれぞれ２５℃で２０時間放置した。その後、１５，０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離により、上清を回収することで得られたサンプルを２．０％の金チオグルコース液により負染色し、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ、ＪＥＯＬ日本電子（株）製「ＪＥＭ−２２００ＦＳ」）を使用した解析するとともに、ＥＥＬＳ及びＥＤＳによる元素分析を行い、観察された全フェリチン中のセレン化インジウムを内包しているフェリチンの割合を計測しグラフに示した（図６を参照）。ここで、図６のグラフの横軸は、反応液中の総アンモニア濃度（緩衝剤として添加している酢酸アンモニウムと、アンモニアとの合計の濃度）を示し、縦軸はセレン化インジウムを内包しているフェリチンの割合を示している。図６に示すグラフの縦軸における、Ｎ、Ｌ、Ｍ、Ｈは、図５のグラフの縦軸におけるＮ、Ｌ、Ｍ、Ｈと同様である。

図６に示すように、総アンモニア濃度が５０ｍＭ〜２００ｍＭの反応液において、セレン化インジウム−フェリチン複合体のナノ粒子の形成が確認された。特に、総アンモニア濃度が６０ｍＭから１００ｍＭのものでは、全フェリチンのうち、４０％以上のフェリチンの内腔にセレン化インジウムが生成されるので、セレン化インジウム−フェリチン複合体のナノ粒子の形成において好ましいことがわかった。

（反応温度の検討）
反応液の温度条件を変えて反応温度の検討を行った。具体的には、終濃度が、硫酸インジウム１ｍＭ、セレノ尿素０．５ｍＭ、アポフェリチン０．３ｇ／Ｌ、酢酸アンモニウム４０ｍＭであるとともに、アンモニアを終濃度が３４ｍＭとなるように加え、１ＭのＨＣｌ水溶液によりｐＨ４．４に調製した反応液を４℃〜６０℃の温度条件でそれぞれ２０時間放置した。その後、１５，０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離により、上清を回収することで得られたサンプルを２．０％の金チオグルコース液により負染色し、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ、ＪＥＯＬ日本電子（株）製「ＪＥＭ−２２００ＦＳ」）を使用した解析するとともに、ＥＥＬＳ及びＥＤＳによる元素分析を行い、観察された全フェリチン中の、インジウム化合物を内包しているフェリチンの割合を計測しグラフに示した（図７を参照）。ここで、図７に示すグラフにおいて、横軸は反応温度を示し、縦軸は全フェリチン中のインジウム化合物を内包しているフェリチンの割合を示している。グラフの縦軸における、Ｎはインジウム化合物を内包しているフェリチンの割合が０であることを示し、Ｌはインジウム化合物を内包しているフェリチンの割合が０．４未満であることを示し、Ｍはインジウム化合物を内包しているフェリチンの割合が０．４以上０．８未満であることを示し、Ｈはインジウム化合物を内包しているフェリチンの割合が０．８以上であることを示す。

図７に示すように、反応温度４℃〜６０℃で、金属化合物を内包したフェリチンのナノ粒子の形成が確認されたが、元素分析により、反応温度を４０℃以上としたものでは、フェリチンに内包されている粒子は酸化インジウムであることが確認された。なお、反応温度が３５℃以下のものでは、フェリチンに内包されている粒子がセレン化インジウムであることが確認された。この結果より、セレン化インジウム−フェリチン複合体のナノ粒子の形成においては反応温度を４０℃よりも低くすることが好ましいということがわかった。
なお、図７のグラフにおいては、フェリチンの内腔に形成されているインジウム化合物がセレン化インジウムであると確認されたもの（つまり、セレン化インジウム−フェリチン複合体のナノ粒子が形成されているもの）については、グラフを黒く塗りつぶし、フェリチンの内腔に形成されているインジウム化合物が酸化インジウムであると確認されたもの（つまり、酸化インジウムを内包したフェリチンのナノ粒子が形成されているもの）についてはグラフに斜線を施した。

＜合成例３：セレン化銅−フェリチン複合体の合成＞
内腔を有するタンパク質としてフェリチンを用い、以下の方法により、セレン化銅−フェリチン複合体（セレン化銅を内包したフェリチン）を作製した。
終濃度が、酢酸銅１ｍＭ、セレノ尿素１ｍＭ、アポフェリチン０．３ｇ／Ｌ、酢酸アンモニウム４０ｍＭ、アンモニア５０ｍＭであるとともに、１ＭのＨＣｌ水溶液によりｐＨ４．７となるように調製した反応液を、２５℃で２０時間放置した。その後、１５，０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離により、上清を回収することで得られたサンプルにつき、無染色のサンプルと、２．０％金チオグルコース液により負染色したサンプルを、それぞれ、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ、ＪＥＯＬ日本電子（株）製「ＪＥＭ−２２００ＦＳ」）により解析したところ、粒子径が均一なナノ粒子を複数個、確認した（図８及び図９を参照）。さらに、得られたナノ粒子の組成を、電子顕微鏡（ＪＥＯＬ日本電子（株）製「ＪＥＭ−３１００ＦＥＦ」）を用いた電子エネルギー損失分光法（ＥＥＬＳ）と、エネルギー分散型Ｘ線分析（ＥＤＳ）とにより分析した結果、いずれの分析方法によっても銅とセレンが検出され、セレン化銅−フェリチン複合体のナノ粒子が得られていることが確認された（図１０及び図１１を参照）。

＜合成例４：セレン化銅−フェリチン複合体の合成条件の検討＞
セレン化銅−フェリチン複合体の合成条件（反応液のｐＨ、反応液に含まれるアンモニアの濃度及び反応温度）の検討を行った。

（反応液のｐＨの検討）
セレン化銅−タンパク質複合体の合成条件を最適化するために、種々のｐＨの反応液を作製し検討した。具体的には、終濃度が、酢酸銅１ｍＭ、セレノ尿素１ｍＭ、アポフェリチン０．３ｇ／Ｌ、酢酸アンモニウム４０ｍＭ、アンモニア５０ｍＭであるとともに、１ＭのＨＣｌ水溶液によりｐＨが３．５から６．８となるように調製した反応液を、それぞれ２５℃で２０時間放置した。その後、１５，０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離により、上清を回収することで得られたサンプルを２．０％の金チオグルコース液により負染色し、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ、ＪＥＯＬ日本電子（株）製「ＪＥＭ−２２００ＦＳ」）を使用した解析するとともに、ＥＥＬＳ及びＥＤＳによる元素分析を行い、観察された全フェリチン中の、セレン化銅を内包しているフェリチンの割合を計測しグラフに示した（図１２を参照）。図１２に示すグラフにおいて、横軸は反応液のｐＨを示し、縦軸は全フェリチン中のセレン化銅を内包しているフェリチンの割合（以下、「セレン化銅を内包しているフェリチンの割合」ともいう）を示している。具体的には、グラフの縦軸における、Ｎはセレン化銅を内包しているフェリチンの割合が０であることを示し、Ｌはセレン化銅を内包しているフェリチンの割合が０．４未満であることを示し、Ｍはセレン化銅を内包しているフェリチンの割合が０．４以上０．８未満であることを示し、Ｈはセレン化銅を内包しているフェリチンの割合が０．８以上であることを示す。

図１２に示すように、反応液のｐＨを３．５から６．８としたものにおいて、セレン化銅−フェリチン複合体のナノ粒子の形成が確認された。特に、反応液のｐＨを４．４から５．１としたものでは、セレン化銅を内包しているフェリチンの割合が０．４以上、すなわち、全フェリチンのうち、４０％以上のフェリチンの内腔にセレン化銅粒子が生成されるので、セレン化銅−フェリチン複合体のナノ粒子の形成において好ましいということがわかった。

（アンモニア濃度の検討）
種々のアンモニア濃度の反応液を作製し検討した。具体的には、終濃度が、酢酸銅１ｍＭ、セレノ尿素１ｍＭ、アポフェリチン０．３ｇ／Ｌ、酢酸アンモニウム４０ｍＭであるとともに、アンモニアを終濃度が０ｍＭ〜５０ｍＭとなるように加え、１ＭのＨＣｌ水溶液によりｐＨ４．４に調製した反応液をそれぞれ２５℃で２０時間放置した。その後、１５，０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離により、上清を回収することで得られたサンプルを２．０％の金チオグルコース液により負染色し、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ、ＪＥＯＬ日本電子（株）製「ＪＥＭ−２２００ＦＳ」）を使用した解析するとともに、ＥＥＬＳ及びＥＤＳによる元素分析を行い、観察された全フェリチン中のセレン化銅を内包しているフェリチンの割合を計測し、グラフに示した（図１３を参照）。ここで、図１３に示すグラフにおいて、横軸は反応液中の総アンモニアの濃度（緩衝剤として添加している酢酸アンモニウムと、アンモニアとの合計）を示し、縦軸は全フェリチン中のセレン化銅を内包しているフェリチンの割合を示している。グラフの縦軸における、Ｎ、Ｌ、Ｍ、Ｈは図１２のグラフの縦軸におけるＮ、Ｌ、Ｍ、Ｈと同様である。

図１３に示すように、すべての反応液においてセレン化銅−フェリチン複合体のナノ粒子の形成が確認された。特に、総アンモニア濃度が４０ｍＭから９０ｍＭのものでは、全フェリチンのうち、４０％以上のフェリチンの内腔にセレン化銅粒子が生成されるので、セレン化銅−フェリチン複合体のナノ粒子の形成において好ましいことがわかった。

（反応温度の検討）
反応液の温度条件を変えて反応温度の検討を行った。具体的には、終濃度が、酢酸銅１ｍＭ、セレノ尿素１ｍＭ、アポフェリチン０．３ｇ／Ｌ、酢酸アンモニウム４０ｍＭであるとともに、アンモニアを終濃度が３４ｍＭとなるように加え、１ＭのＨＣｌ水溶液によりｐＨ４．７に調製した反応液を４℃〜６０℃の温度条件でそれぞれ２０時間放置した。その後、１５，０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離により、上清を回収することで得られたサンプルを２．０％の金チオグルコース液により負染色し、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ、ＪＥＯＬ日本電子（株）製「ＪＥＭ−２２００ＦＳ」）を使用した解析するとともに、ＥＥＬＳ及びＥＤＳによる元素分析を行い、観察された全フェリチン中のセレン化銅を内包しているフェリチンの割合を計測しグラフに示した（図１４を参照）。ここで、図１４に示すグラフにおいて、横軸は反応温度を示し、縦軸は全フェリチン中のセレン化銅を内包しているフェリチンの割合を示している。グラフの縦軸における、Ｎ、Ｌ、Ｍ、Ｈは図１２のグラフの縦軸におけるＮ、Ｌ、Ｍ、Ｈと同様である。

図１４に示すように、反応温度４℃〜４０℃で、セレン化銅−フェリチン複合体のナノ粒子の形成が確認された。特に、反応温度が２５℃と４０℃のものでは、全フェリチンのうち、４０％以上のフェリチンの内腔にセレン化銅粒子が生成されるので、セレン化銅−フェリチン複合体のナノ粒子の形成において好ましいことがわかった。

（実施例１−１：銅−インジウム−セレンを含む化合物を内包するタンパク質複合体ナノ粒子の作製）
インジウム化合物を内包したフェリチンを前駆体として、銅−インジウム−セレンを含む化合物を内包したフェリチンのナノ粒子を作製した。

終濃度が、硫酸インジウム１ｍＭ、セレノ尿素２ｍＭ、アポフェリチン０．３ｇ／Ｌ、酢酸アンモニウム４０ｍＭ、アンモニア３４ｍＭであるとともに、１ＭのＨＣｌ水溶液によりｐＨ４．４となるように調製した反応液を、４０℃で２０時間放置した。その後、１５，０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離により、上清を回収することで、粒径が均一なフェリチンに内包されたインジウム化合物（インジウム化合物を内包したフェリチン）を含む水溶液を得た。

インジウム化合物を内包したフェリチンを含む水溶液をアミコンウルトラ（メルクミリポア社、５０Ｋ）にて限外濾過処理し、インジウム化合物を内包したフェリチンが懸濁された溶媒を水に置換した。置換処理後のインジウム化合物を内包したフェリチンを含む溶液に、終濃度が、酢酸銅３ｍＭ、セレノ尿素１ｍＭ、酢酸アンモニウム４０ｍＭ、アンモニア２０ｍＭであるとともに、１ＭのＨＣｌ水溶液によりｐＨ４．５となるように各成分を添加してなる反応液を、２５℃で２０時間放置した。その後、１５，０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離により、上清を回収しサンプルを得た。

得られたサンプルを２．０％の金チオグルコース液により負染色し透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ、ＪＥＯＬ日本電子（株）製「ＪＥＭ−２２００ＦＳ」）により解析したところ、９割以上のフェリチンの内腔にナノ粒子が形成されていることを確認することができた（図１５を参照）。さらに、フェリチンに内包されたナノ粒子の組成を、電子顕微鏡（ＪＥＯＬ日本電子（株）製「ＪＥＭ−３１００ＦＥＦ」）を用いた電子エネルギー損失分光法（ＥＥＬＳ）と、エネルギー分散型Ｘ線分析（ＥＤＳ）とにより分析した結果、銅、インジウム、セレンを同時に含む粒子であることが確認された（図１６および図１７を参照）。またＥＥＬＳ分析により、フェリチンに内包されたナノ粒子は酸素を含有しない粒子であることが確認された（図１６を参照）。この結果より、インジウム化合物を内包したフェリチンに、銅イオンとセレンイオンを添加することで、銅とインジウムとセレンとを含むナノ粒子を内包したフェリチンのナノ粒子が生成したことを確認することができた。

（実施例１−２〜１−５：銅−インジウム−セレンを含む化合物を内包するタンパク質の複合体ナノ粒子の作製）
インジウム化合物を内包したフェリチンを含む溶液に添加する酢酸銅、セレノ尿素、酢酸アンモニウム及びアンモニアの量を表１に記載の量とし、表１に記載の成分を含む反応液のｐＨを４．６とすること以外は、実施例１−１と同様にした場合にも、銅−インジウム−セレンを含む化合物を内包したフェリチンを得ることができた（実施例１−２〜１−５）。表１には実施例１−１のインジウム化合物を内包したフェリチンを含む溶液に添加する酢酸銅、セレノ尿素、酢酸アンモニウム及びアンモニアの量及びこれらを含む反応液のｐＨも併せて示した。

(実施例２−１：銅−インジウム−セレン内包タンパク質複合体の合成)
銅化合物を内包したフェリチンを前駆体として、銅−インジウム−セレンを含む化合物を内包したフェリチンのナノ粒子を作製した。

終濃度が、酢酸銅１ｍＭ、セレノ尿素１ｍＭ、アポフェリチン０．３ｇ／Ｌ、酢酸アンモニウム４０ｍＭ、アンモニア２０ｍＭであるとともに、１ＭのＨＣｌ水溶液によりｐＨ４．５となるように調製した反応液を、２５℃で一晩放置した。その後、１５，０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離により、上清を回収することで、粒径が均一なフェリチンに内包された銅化合物（銅化合物を内包したフェリチン）を含む水溶液を得た。

銅化合物を内包したフェリチンを含む水溶液をアミコンウルトラ（メルクミリポア社、５０Ｋ）にて限外濾過処理し、銅化合物を内包したフェリチンが懸濁された溶媒を水に置換した。置換処理後の銅化合物を内包したフェリチンを含む溶液に、終濃度が、硫酸インジウム１ｍＭ、セレノ尿素１ｍＭ、酢酸アンモニウム４０ｍＭ、アンモニア３４ｍＭであるとともに、１ＭのＨＣｌ水溶液によりｐＨ４．４となるように各成分を添加した反応液を、２５℃で一晩放置した。その後、１５，０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離により、上清を回収しサンプルを得た。サンプルを実施例１−１と同様に分析した結果、銅とインジウムとセレンとを含むナノ粒子を内包したフェリチンのナノ粒子が生成したことを確認することができた(図１８〜図２０を参照)。

（実施例２−２〜２−４：銅−インジウム−セレンを含む化合物を内包するタンパク質の複合体ナノ粒子の作製）
銅化合物を内包したフェリチンを含む溶液に添加する硫酸インジウム、セレノ尿素、酢酸アンモニウム及びアンモニアの量を表２に記載の量とすること以外は、実施例２−１と同様にした場合にも、銅−インジウム−セレンを含む化合物を内包したフェリチンを得ることができた（実施例２−２〜２−４）。表２には実施例２−１の銅化合物を内包したフェリチンを含む溶液に添加する硫酸インジウム、セレノ尿素、酢酸アンモニウム及びアンモニアの量及びこれらを含む反応液のｐＨも併せて示した。

（実施例３：銅−インジウム−セレン内包タンパク質複合体の物性分析）
（１）銅インジウムセレン内包タンパク質複合体の作製
終濃度が、酢酸銅１ｍＭ、セレノ尿素１ｍＭ、アポフェリチン０．３ｇ／Ｌ、酢酸アンモニウム４０ｍＭ、アンモニア２０ｍＭであるとともに、１ＭのＨＣｌ水溶液によりｐＨ４．６となるように調製した反応液を、２５℃で２０時間放置した。その後、１５，０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離により、上清を回収することで、粒径が均一なフェリチンに内包された銅化合物（銅化合物を内包したフェリチン）を含む水溶液を得た。

銅化合物を内包したフェリチンを含む水溶液をアミコンウルトラ（メルクミリポア社、５０Ｋ）にて限外濾過処理し、銅化合物を内包したフェリチンが懸濁された溶媒を水に置換した。置換処理後の銅化合物を内包したフェリチンを含む溶液に、終濃度が、硫酸インジウム１ｍＭ、セレノ尿素１ｍＭ、酢酸アンモニウム４０ｍＭ、アンモニア３４ｍＭであるとともに、１ＭのＨＣｌ水溶液によりｐＨ４．４となるように各成分を添加してなる反応液を、２５℃で２０時間放置した。その後、１５，０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離により、上清を回収し、銅−インジウム−セレンを含む化合物を内包したフェリチンが懸濁された溶媒を得た。
（２）ＸＲＤ分析
アミコンウルトラ（メルクミリポア社、５０Ｋ）にて限外濾過処理し、銅−インジウム−セレンを含む化合物を内包したフェリチンが懸濁された溶媒を水に置換した。置換処理後の銅−インジウム−セレンを含む化合物を内包したフェリチンを含む水溶液を室温で放置することで乾燥させ、Ｘ線回折装置（（株）リガク製「ＲＩＮＴ−ＴＴＲ ３／ＮＭ」）を用いてＸ線回折（ＸＲＤ）による結晶性の分析を行った。ＸＲＤ測定は、光源としてＣｕＫα線（Ｋα１とＫα２とが２:１で混ざったもの）を用い、ステップ幅０．０２度の条件で行った。その結果、αカルコパイライト型ＣｕＩｎＳｅ_２結晶に特有の回折光を検出することができ、フェリチン内部に形成された粒子はαカルコパイライト型のＣｕＩｎＳｅ_２であること、つまり、ＣｕＩｎＳｅ_２を内包したフェリチンが生成されていることが確認された（図２１を参照）。

（３）分光スペクトルの測定
銅化合物を内包したフェリチンを前駆体として作製したＣｕＩｎＳｅ_２を内包したフェリチン（（１）で作製したもの。以下サンプル１）及びインジウム化合物を内包したフェリチンを前駆体として作製したＣｕＩｎＳｅ_２を内包したフェリチン（実施例１−１。以下サンプル２）の分光スペクトルを、分光光度計（米国ベックマンコールター（株）製「ＤＵ−８００」）を用いて測定した。その結果、サンプル１では９００ｎｍ〜１０００ｎｍから光吸収をしており、そのバンドギャップエネルギーは１．２〜１．４ｅＶと推測された（図２２を参照）。一方、サンプル２ではより短い波長である６００ｎｍ付近まで光吸収している様子が観察され、そのバンドギャップエネルギーは２．０ｅＶ前後であると推測された。これらはバルクであるＣｕＩｎＳｅ_２のバンドエネルギー（１．０４ｅＶ）より大きかった。ＣｕＩｎＳｅ_２の粒子径を４ｎｍから５ｎｍ程度にナノ粒子化した場合、量子サイズ効果によりバンドギャップエネルギーは１．２〜１．４ｅＶに増加することが期待できる。このことから、銅化合物を前駆体としてフェリチン内部に形成されたＣｕＩｎＳｅ_２の結晶粒のサイズは４ｎｍから５ｎｍ程度である可能性が高いと考えられる。一方、ＣｕＩｎＳｅ_２の粒子径を２ｎｍから３ｎｍ程度にナノ粒子化した場合、量子サイズ効果によりバンドギャップエネルギーは１．６〜２．２ｅＶに増加することが期待でき、インジウム化合物を前駆体としてフェリチン内部に形成されたＣｕＩｎＳｅ_２の結晶粒のサイズは２ｎｍから３ｎｍ程度である可能性が高いと考えられる。

（４）蛍光スペクトルの測定
インジウム化合物を内包したフェリチンを前駆体として作製したＣｕＩｎＳｅ_２を内包したフェリチン（実施例１−１）とナノ粒子を内包していないフェリチン（アポフェリチン）の蛍光スペクトルを、蛍光分光光度計計（（株）堀場製作所製「Ｎａｎｏｌｏｇ−ＮＲ」）を用いて測定した。その結果、５５０ｎｍの光で励起されたＣｕＩｎＳｅ_２を内包したフェリチンでは６８０ｎｍをピークとした蛍光を発しており、そのバンドギャップエネルギーは１．８ｅＶと推測された（図２３を参照）。これはバルクであるＣｕＩｎＳｅ_２のバンドエネルギー（１．０４ｅＶ）より大きかった。ＣｕＩｎＳｅ_２の粒子径を２．４ｎｍから２．５ｎｍ程度にナノ粒子化した場合、量子サイズ効果によりバンドギャップエネルギーは１．８ｅＶ前後に増加することが期待できる。このことから、フェリチン内部に形成されたＣｕＩｎＳｅ_２の微結晶のサイズは２．４ｎｍから２．５ｎｍ程度である可能性が高いと考えられる。なお、図２４はアポフェリチンの蛍光スペクトルである。

（５）粒度分布の測定
（１）で作製した銅−インジウム−セレンを含む化合物を内包したフェリチンが懸濁された溶媒を用いて、ＣｕＩｎＳｅ_２を内包したフェリチンの粒度分布を測定した。１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）中に、フェリチンタンパク質の濃度が１ｍｇ／ｍｌとなるように懸濁した溶液サンプルについて、英国マルバーン製のゼータサイザーナノＺＳを用いて粒度分布を測定した。その結果、粒子径（直径）１５ｎｍを頂点としたピークの単一ピークが観察された（図２５を参照）。すなわち、本発明のＣｕＩｎＳｅ_２を内包したフェリチンは、フェリチン由来の粒径均一性と溶液分散性を維持しており、優れた機能を有するナノ粒子であることが確認された。

（１）で作製した銅−インジウム−セレンを含む化合物を内包したフェリチンが懸濁された溶媒を用いて、ＣｕＩｎＳｅ_２を内包したフェリチンの粒度分布を測定した。１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）中に、フェリチンタンパク質の濃度が０．３ｍｇ／ｍｌとなるように懸濁した溶液サンプルを無染色で透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ、ＪＥＯＬ日本電子（株）製「ＪＥＭ−２２００ＦＳ」）により解析し、画像処理ソフト（米国ＮＩＨ製「Ｉｍａｇｅ−Ｊ」）を用いて粒径を測定した。粒径の計測はＴＥＭ画像中の６４６個の粒子について、以下のように行った。まずＩｍａｇｅ−Ｊ中でＴＥＭ像を８ｂｉｔグレースケールに変更し、ＴＥＭ画像中の２０ｎｍの長さバーと同じ長さに線を引き、その長さを画像中の単位長さとした。次にＴＥＭ画像の明るさとコントラストを調整し、画像を二値化した。その後、粒子が見えにくい部分を四角く囲み削除し、楕円近似にて画像中の粒子の長軸と短軸の長さを計測し、長軸と短軸の平均値を粒子の直径としてヒストグラム化した。その結果、フェリチンに内包されたＣｕＩｎＳｅ_２の粒径は６．０±０．９ｎｍであることが分かった（図２６を参照）。

（実施例４：銅−インジウム−セレン内包タンパク質複合体の作製）
終濃度が、硫酸インジウム１ｍＭ、酢酸銅１ｍＭ、セレノ尿素２ｍＭ、アポフェリチン０．３ｇ／Ｌ、酢酸アンモニウム４０ｍＭ、アンモニア３４ｍＭ、ｐＨ４．４（１Ｍ ＨＣｌ水溶液にて調製）となる反応液を２５℃で１７時間放置した。その後、１５，０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離により、上清を回収することで、サンプルを得た。

得られたサンプルを２．０％の金チオグルコース液により負染色し透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ、ＪＥＯＬ日本電子（株）製「ＪＥＭ−２２００ＦＳ」）により解析したところ、９割以上のフェリチンの内腔にナノ粒子が形成されていることを確認することができた（図２７を参照）。さらに、フェリチンに内包されたナノ粒子の組成を、電子顕微鏡（ＪＥＯＬ日本電子（株）製「ＪＥＭ−３１００ＦＥＦ」）を用いた電子エネルギー損失分光法（ＥＥＬＳ）と、エネルギー分散型Ｘ線分析（ＥＤＳ）とにより分析した結果、少なくともナノ粒子の一部は、銅、インジウム、セレンを同時に含む粒子であることが確認された（図２８および図２９を参照）。この結果より、フェリチンに、インジウムイオン、銅イオン及びセレンイオンを添加することで、銅とインジウムとセレンとを含むナノ粒子を内包したフェリチンのナノ粒子が生成したことを確認することができた。

（実施例５：硫化銅インジウムを内包するＤｐｓタンパク質複合体の作製）
（１）硫化インジウム内包タンパク質複合体の作製
終濃度が、硫酸インジウム１ｍＭ、チオ酢酸２ｍＭ、Ｄｐｓ０．３ｇ／Ｌ、酢酸アンモニウム４０ｍＭ、アンモニア１１０ｍＭであるとともに、１ＭのＨＣｌ水溶液によりｐＨ３．８となるように調製した反応液を、２５℃で２０時間放置した。その後、１５，０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離により、上清を回収することで、粒径が均一なＤｐｓに内包された硫化インジウム（硫化インジウムを内包したＤｐｓ）を含む水溶液を得た。

上記反応液を遠心分離して上清を回収することで得られたサンプルにつき、２．０％金チオグルコース液により負染色し、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ、ＪＥＯＬ日本電子（株）製「ＪＥＭ−２２００ＦＳ」）により解析した結果、粒子径が均一なナノ粒子を複数個、確認した（図３０を参照）。さらに、得られたナノ粒子の組成を、電子顕微鏡（ＪＥＯＬ日本電子（株）製「ＪＥＭ−３１００ＦＥＦ」）を用いたエネルギー分散型Ｘ線分析（ＥＤＳ）により分析した結果、インジウムと硫黄が検出され、硫化インジウムを内包したＤｐｓのナノ粒子（硫化インジウム−Ｄｐｓ複合体のナノ粒子）が得られていることが確認された（図３１を参照）。

上記反応液に代えて、終濃度が、硫酸インジウム０．５〜１．５ｍＭ、チオ酢酸０．５〜２．０ｍＭ、Ｄｐｓ０．３ｇ／Ｌ、酢酸アンモニウム４０ｍＭ、アンモニア０〜１１０ｍＭであるとともに、１ＭのＨＣｌ水溶液によりｐＨ３．５〜４．５となるように調製した反応液を用いたものについても、同様に、硫化インジウムを内包したＤｐｓのナノ粒子が得られることを確認した。

（２）硫化銅インジウム内包タンパク質複合体の作製
（１）で作製した硫化インジウムを内包したＤｐｓを含む水溶液をアミコンウルトラ（メルクミリポア社、５０Ｋ）にて限外濾過処理し、硫化インジウムを内包したＤｐｓが懸濁された溶媒を水に置換した。置換処理後の硫化インジウムを内包したＤｐｓを含む溶液に、終濃度が、酢酸銅１ｍＭ、チオ酢酸０．５ｍＭ、酢酸アンモニウム４０ｍＭ、アンモニア３０ｍＭであるとともに、１ＭのＨＣｌ水溶液によりｐＨ４．１となるように各成分を添加してなる反応液を、２５℃で２０時間放置した。その後、１５，０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離により、上清を回収することで、硫化銅インジウムを内包したＤｐｓのナノ粒子（硫化銅インジウム−Ｄｐｓ複合体のナノ粒子）が得られた。

なお、上記反応液に代えて終濃度が、酢酸銅０．１〜１０ｍＭ、チオ酢酸０．５〜１．０ｍＭ、酢酸アンモニウム４０ｍＭ、アンモニア０〜５０ｍＭであるとともに、１ＭのＨＣｌ水溶液によりｐＨ４．０〜５．０となるように各成分を添加してなる反応液を用いた場合も同様に、硫化銅インジウムを内包したＤｐｓのナノ粒子（硫化銅インジウム−Ｄｐｓ複合体のナノ粒子）が得られた。

（実施例６：硫化銅インジウムを内包するＤｐｓタンパク質複合体の作製）
（１）硫化インジウム内包タンパク質複合体の作製
終濃度が、硫酸インジウム１ｍＭ、チオ酢酸２ｍＭ、Ｄｐｓ０．３ｇ／Ｌ、酢酸アンモニウム４０ｍＭ、アンモニア１１０ｍＭであるとともに、１ＭのＨＣｌ水溶液によりｐＨ３．８となるように調製した反応液を、２５℃で２０時間放置した。その後、１５，０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離により、上清を回収することで、粒径が均一なＤｐｓに内包された硫化インジウム（硫化インジウムを内包したＤｐｓ）を含む水溶液を得た。

（２）硫化銅インジウム内包タンパク質複合体の作製
（１）で作製した硫化インジウムを内包したＤｐｓを含む水溶液をアミコンウルトラ（メルクミリポア社、５０Ｋ）にて限外濾過処理し、硫化インジウムを内包したＤｐｓが懸濁された溶媒を水に置換した。置換処理後の硫化インジウムを内包したＤｐｓを含む溶液に、終濃度が、酢酸銅１ｍＭ、酢酸アンモニウム４０ｍＭ、アンモニア３０ｍＭであるとともに、１ＭのＨＣｌ水溶液によりｐＨ４．１となるように各成分を添加してなる反応液を、２５℃で１０分間放置した。その後、１５，０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離により、上清を回収することで、硫化銅インジウムを内包したＤｐｓのナノ粒子（硫化銅インジウム−Ｄｐｓ複合体のナノ粒子Ａ）が得られた。

なお、上記反応液に代えて終濃度が、酢酸銅０．１〜１０ｍＭ、酢酸アンモニウム４０ｍＭ、アンモニア０〜５０ｍＭであるとともに、特にｐＨが調整されていない反応液を用いた場合も同様に、硫化銅インジウムを内包したＤｐｓのナノ粒子（硫化銅インジウム−Ｄｐｓ複合体のナノ粒子）が得られた。当該反応液にさらにチオ酢酸を０．５〜１．０ｍＭ追加した場合でも、硫化銅インジウムを内包したＤｐｓのナノ粒子（硫化銅インジウム−Ｄｐｓ複合体のナノ粒子）が得られたが、チオ酢酸を用いなかった場合よりも収率が低かった。

（３）硫化銅インジウムを内包するＤｐｓタンパク質複合体のＸＲＤ分析
（２）で作製した硫化銅インジウム−Ｄｐｓ複合体のナノ粒子Ａを、アミコンウルトラ（メルクミリポア社、５０Ｋ）にて限外濾過処理し、硫化銅インジウムを含む化合物を内包したＤｐｓが懸濁された溶媒を水に置換した。置換処理後の硫化銅インジウムを含む化合物を内包したＤｐｓを含む水溶液０．１ｍｌを室温で２４時間から７２時間放置することで乾燥させた。乾燥後の硫化銅インジウム−内包Ｄｐｓ複合体を、さらに、窒素中で３０分間、４００℃で加熱して得られたサンプルを、Ｘ線回折装置（（株）リガク製「ＲＩＮＴ−ＴＴＲ ３／ＮＭ」）を用いて、Ｘ線回折（ＸＲＤ）による結晶性の分析を行った。ＸＲＤ測定は、光源としてＣｕＫα線（Ｋα１とＫα２とが２：１で混ざったもの）を用い、ステップ幅０．０２度の条件で行った。得られた結果を図３２に示した。図３２には、４００℃で加熱して得られたサンプルの分析結果とＣｕＩｎＳ_２の標品の分析結果を並べて示した。
分析の結果、４００℃で加熱されたサンプルではαカルコパイライト型ＣｕＩｎＳ_２結晶に特有の回折光を明確に検出することができ、Ｄｐｓ内部に形成された粒子は銅−インジウム−硫黄からなり、加熱によりαカルコパイライト型のＣｕＩｎＳ_２に変換できることが確認された（図３２を参照）。

（４）硫化銅インジウム内包タンパク質複合体のＸＰＳによる組成分析
（２）で作製した硫化銅インジウム−Ｄｐｓ複合体のナノ粒子Ａを含む水溶液をアミコンウルトラ（メルクミリポア社、５０Ｋ）にて限外濾過処理し、硫化銅インジウムを内包したＤｐｓ複合体が懸濁された溶媒を水に置換し、サンプル溶液を得た。１１５℃で１時間のＵＶオゾン処理により、基板表面に親水性のＳｉＯ_２膜を形成させた厚さ３００μｍ、1ｃｍ角のｐ型低抵抗シリコン基板に、サンプル溶液を滴下し自然乾燥させた。サンプル溶液の滴下量が、硫化銅インジウム−Ｄｐｓ複合体のナノ粒子の外殻のＤｐｓ量として５０μｇ分となるように基板に滴下した。乾燥後、基板表面の構成元素をＰＨＩ ５０００ ＶｅｒｓａＰｒｏｂｅ ＩＩ（アルバック・ファイ（株）製）を使ったＸ線光電子分光（ＸＰＳ）で分析し、結果を図３３及び図３４に示した。

その結果、タンパク質由来の炭素（図３３のＣ１ｓ）および窒素（図３３のＮ１ｓ）由来のシグナルを各々検出することができた。また、硫化銅インジウム由来のＣｕ（図３４のＣｕ２ｐ_３/２）とＩｎ（図３４のＩｎ３ｄ_５/２とＩｎ３ｄ_３/２）、Ｓ（図３４のＳ２ｐ_３/２とＳ２ｐ_１/２）由来のシグナルを各々検出することができた。この結果より、本条件で得られたＤｐｓ内部には、銅とインジウム、硫黄の各元素が含有されており、銅とインジウムと硫黄とを含むナノ粒子を内包したＤｐｓのナノ粒子が得られたことを確認することができた。

（実施例７：硫化銅インジウムを内包するフェリチンタンパク質複合体の作製）
（１）硫化インジウム内包タンパク質複合体の作製
内腔を有するタンパク質としてフェリチンを用い、以下の方法により、硫化インジウム−フェリチン複合体（硫化インジウムを内包したフェリチン）を作製した。
終濃度が、硫酸インジウム１ｍＭ、チオ酢酸２ｍＭ、アポフェリチン０．３ｇ／Ｌ、酢酸アンモニウム４０ｍＭ、アンモニア１１０ｍＭであるとともに、１ＭのＨＣｌ水溶液によりｐＨ４．３となるように調製した反応液を、２５℃で２０時間放置した。その後、１５，０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離により、上清を回収することで得られたサンプルＡを、２．０％金チオグルコース液により負染色して得られたサンプルを透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ、ＪＥＯＬ日本電子（株）製「ＪＥＭ−２２００ＦＳ」）により解析したところ、粒子径が均一な硫化インジウムナノ粒子を内包したフェリチンを複数個、確認した（図３５を参照。代表例を白矢印で示す）。

（２）硫化銅インジウム内包タンパク質複合体の作製
硫化インジウムを内包したフェリチン（サンプルＡ）を含む水溶液をアミコンウルトラ（メルクミリポア社、５０Ｋ）にて限外濾過処理し、硫化インジウムを内包したフェリチンが懸濁された溶媒を水に置換した。置換処理後の硫化インジウムを内包したフェリチンを含む溶液に、終濃度が、酢酸銅１ｍＭ、酢酸アンモニウム４０ｍＭ、アンモニア３０ｍＭであるとともに、１ＭのＨＣｌ水溶液によりｐＨ４．５となるように各成分を添加してなる反応液を、２５℃で１０分間放置した。その後、１５，０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離により、上清を回収しサンプルを得た。
得られたサンプルを２．０％の金チオグルコース液により負染色し透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ、ＪＥＯＬ日本電子（株）製「ＪＥＭ−２２００ＦＳ」）により解析したところ、９割以上のフェリチンの内腔にナノ粒子が形成されていることを確認することができた（図３６を参照。代表例を白矢印で示す）。

（３）硫化銅インジウムを内包するＤｐｓタンパク質複合体のＸＲＤ分析
（２）で得られたサンプルを、アミコンウルトラ（メルクミリポア社、５０Ｋ）にて限外濾過処理し、硫化銅インジウムを含む化合物を内包したフェリチンが懸濁された溶媒を水に置換した。置換処理後の硫化銅インジウムを含む化合物を内包したフェリチンを含む水溶液を室温で放置することで乾燥させた。さらに、窒素中で３０分間、４００℃で加熱して得られたサンプルと、４００℃で加熱する前のサンプルについてＸ線回折装置（（株）リガク製「ＲＩＮＴ−ＴＴＲ ３／ＮＭ」）を用いてＸ線回折（ＸＲＤ）による結晶性の分析を行った。ＸＲＤ測定は、光源としてＣｕＫα線（Ｋα１とＫα２とが２：１で混ざったもの）を用い、ステップ幅０．０２度の条件で行った。得られた結果を図３７に示した。図３７には、４００℃で加熱して得られたサンプルの分析結果、４００℃で加熱する前のサンプルの分析結果、及びＣｕＩｎＳ_２の標品の分析結果を並べて示した。
その結果、４００℃で加熱されたサンプルでは、αカルコパイライト型ＣｕＩｎＳ_２結晶に特有の回折光を明確に検出することができ、フェリチン内部に形成された粒子は銅−インジウム−硫黄からなり、加熱によりαカルコパイライト型のＣｕＩｎＳ_２に変換できることが確認された（図３７を参照）。

Claims (11)

1. 複合体ナノ粒子の製造方法であって、
   前記複合体ナノ粒子が、内腔を有するタンパク質と、前記内腔に内包され、少なくとも３つの元素から構成される化合物と、を備え、
   前記化合物を構成する元素が、第１１族及び第１３族から選ばれる２以上の金属元素、並びに、第１５族及び第１６族から選ばれる１以上の元素を含み、
   前記製造方法が、
   （Ａ）系中に、内腔を有するタンパク質、金属イオン、及び陰イオンを存在させて、金属イオンと陰イオンとが結合した化合物前駆体をタンパク質の内腔中に生成する工程と、
   （Ｂ）系中に、化合物前駆体を構成する金属イオンとは別の金属イオンをさらに存在させて、２種以上の金属イオンと陰イオンとが結合した化合物をタンパク質の内腔中に生成する工程と、を含む、複合体ナノ粒子の製造方法。
2. 前記化合物を構成する元素が、銅、インジウム、ガリウム及びアルミニウムから選ばれる２つ以上の金属元素を含む、請求項１に記載の複合体ナノ粒子の製造方法。
3. （Ａ）工程の系中に存在させる金属イオンが銅イオンであり、
   （Ｂ）工程の系中に存在させる、化合物前駆体を構成する金属イオンとは別の金属イオンがインジウムイオンである、
   請求項１又は２に記載の複合体ナノ粒子の製造方法。
4. （Ｂ）工程において、系を加熱する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の複合体ナノ粒子の製造方法。
5. 複合体ナノ粒子の製造方法であって、
   前記複合体ナノ粒子が、内腔を有するタンパク質と、前記内腔に内包され、少なくとも３つの元素から構成される化合物と、を備え、
   前記化合物を構成する元素が、第１１族及び第１３族から選ばれる２以上の金属元素、並びに、第１５族及び第１６族から選ばれる１以上の元素を含み、
   前記製造方法が、系中に、内腔を有するタンパク質、２種以上の金属イオン、及び陰イオンを存在させて、２種以上の金属イオンと陰イオンとが結合した化合物をタンパク質の内腔中に生成する、複合体ナノ粒子の製造方法。
6. 前記化合物を構成する元素が、銅、インジウム、ガリウム及びアルミニウムから選ばれる２つ以上の金属元素を含む、請求項５に記載の複合体ナノ粒子の製造方法。
7. 前記化合物が化合物半導体である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の複合体ナノ粒子の製造方法。
8. 前記化合物を構成する元素が、セレン及び／又は硫黄を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の複合体ナノ粒子の製造方法。
9. 前記化合物がセレン化銅インジウムまたは硫化銅インジウムである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の複合体ナノ粒子の製造方法。
10. 前記複合体ナノ粒子の平均粒子径が５ｎｍ〜３０ｎｍである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の複合体ナノ粒子の製造方法。
11. 内腔を有するタンパク質が、内腔を有する２４量体を形成し得るタンパク質又は内腔を有する１２量体を形成し得るタンパク質である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の複合体ナノ粒子の製造方法。

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