KR20240042570A - 안정화된 그룹 2 인플루엔자 헤마글루티닌 줄기 영역 삼량체 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

광범위 방어능 항인플루엔자 항체를 유도하는 백신. 상기 백신은, 표면 상에 그룹 2 인플루엔자 바이러스로부터의 HA 삼량체를 나타내는 나노입자를 포함한다. 상기 나노입자는 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질의 안정화된 줄기 영역에 연결된 단량체 서브유닛(예컨대, 페리틴)을 포함하는 융합 단백질이다. 상기 융합 단백질은 자기 조립하여 HA를 나타내는 나노입자를 형성한다. 융합 단백질, 및 상기 단백질을 코딩하는 핵산 분자, 및 본 발명의 나노입자를 사용하여 항인플루엔자 항체를 검출하는 검정법 또한 제공한다.

Description

안정화된 그룹 2 인플루엔자 헤마글루티닌 줄기 영역 삼량체 및 그의 용도{STABILIZED GROUP 2 INFLUENZA HEMAGGLUTININ STEM REGION TRIMERS AND USES THEREOF}
인플루엔자 바이러스에 대해 백신접종(vaccination)에 의해 유도된 방어 면역 반응은 바이러스의 숙주 세포 수용체와의 상호 작용을 담당하는 바이러스 표면의 당단백질인 바이러스 HA 단백질에 주로 지향된다. 바이러스 표면 상의 HA 단백질은 효소적으로 절단되어 아미노 말단 HA1 및 카복실 말단 HA2 폴리펩티드를 생성하는 HA 단백질 단량체의 삼량체이다. 구상 헤드는 배타적으로 HA1 폴리펩티드의 주요 부분으로만 구성되는 반면, HA 단백질을 바이러스 지질 외피에 고정시키는 줄기는 HA2 및 HA1 중 일부로 구성된다. HA 단백질의 구상 헤드는 두 도메인: 시알산 결합 부위를 포함하는 ~148 아미노산 잔기 도메인인 수용체 결합 도메인(RBD: receptor binding domain), 및 RBD 바로 아래에 있는 더 작은 ~75 아미노산 잔기 영역인 퇴화한 에스테라제 도메인을 포함한다. 구상 헤드는 면역우성 에피토프를 포함하는 수개의 항원성 부위를 포함한다. 예로는 Sa, Sb, Ca1, Ca2 및 Cb 항원성 부위를 포함한다(예를 들어, 문헌 [Caton, et al, 1982, Cell 31, 417-427] 참조). RBD-A 영역은 Sa 항원성 부위 및 Sb 항원성 부위의 일부를 포함한다.
인플루엔자에 대한 항체는 흔히 보존된 시알산 결합 부위를 둘러싼 HA의 구상 헤드 중의 가변 항원성 부위를 표적화하여 오직 항원적으로 밀접하게 관련된 바이러스만을 중화시킨다. HA 헤드의 가변성은 인플루엔자 바이러스의 일정한 항원 변이에 기인하고, 인플루엔자의 계절성 풍토병의 원인이 된다. 그에 반해, HA 줄기는 고도로 보존적이고, 항원 변이는 거의 일어나지 않는다. 불행하게도, 면역우성 헤드와 달리, 보존적인 HA 줄기는 면역원성은 높지 않다. 추가로, 바이러스 게놈의 유전자 세그먼트는 숙주 종에서 재편성(항원 대변이)될 수 있고, 이로써, 대유행병이 될 수 있는 항원성이 변경된 새로운 바이러스가 생성될 수 있다 (문헌 [Salomon, R. et al. Cell 136, 402-410 (2009)]). 지금까지 매년 인플루엔자 백신은 향후 순환하는 바이러스에 대해 예상되는 HA 및 뉴라미니다제(NA)를 반영하도록 업데이트되고 있다.
최근, 고도로 보존되는 HA 줄기를 인식하는, 인플루엔자 바이러스에 대해 광범위하게 중화하는, 전적으로 새로운 중화 항체 분류가 단리되었다 (문헌 [Corti, D. et al. J Clin Invest 120, 1663-1673 (2010)]; [Ekiert, D.C. et al. Science 324, 246-251 (2009)]; [Kashyap, A.K. et al. Proc Natl Acad Sci USA 105, 5986-5991 (2008)]; [Okuno, Y. et al. J Virol 67, 2552-2558 (1993)]; [Sui, J. et al. Nat Struct Mol Biol 16, 265-273 (2009)]; [Ekiert, D.C. et al. Science 333, 843-850 (2011)]; [Corti, D. et al. Science 333, 850-856 (2011)]). 균주 특이적 항체와는 달리, 상기 항체는 다중의 항원적으로 상이한 바이러스를 중화시킬 수 있으며, 이에 상기 항체를 유도하는 것이 차세대의 범용 백신 개발의 초점이 되어왔다(문헌 [Nabel, G.J. et al. Nat Med 16, 1389-1391 (2010)]). 그러나, 백신접종에 의해 상기 이종성 중화 프로파일을 갖는 이들 항체를 강력하게 이끌어 내는 것은 어렵다(문헌 [Steel, J. et al. MBio 1, e0018 (2010)]; [Wang, T.T. et al. PLoS Pathog 6, e1000796 (2010)]; [Wei, C.J. et al. Science 329, 1060-1064 (2010)]). 유전자 조작을 통한, (경쟁 에피토프를 함유하는) HA의 면역우성 헤드 영역의 제거 및 생성된 줄기 도메인의 안정화가 상기 광범위하게 중화하는 줄기 항체의 유도를 개선시킬 수 있는 잠재적인 한 방법이다.
인플루엔자에 대한 현행 백신 전략법은 화학적으로 불활성화된, 또는 살아있는 약화된 인플루엔자 바이러스를 사용한다. 상기 두 백신 모두 일반적으로 시간이 걸리는 과정과 제한된 생산 능력으로 인해 주요한 제조상 한계가 있는 배아로 된 알에서 생산된다. 현행 백신의 또 다른 더욱 중요한 한계는 그의 고도한 균주 특이적 효능이다. 이러한 어려움은 2009 H1N1 전염병의 출현 동안 명백하게 나타났고, 따라서 이들 한계를 극복할 수 있는 새로운 백신 플랫폼에 대한 필요성이 입증되었다. 바이러스 유사 입자는 상기 대안적인 접근법 중 하나를 대표하며, 현재 임상 시험에서 평가되고 있다(문헌 [Roldao, A. et al. Expert Rev Vaccines 9, 1149-1176 (2010)]; [Sheridan, C. Nat Biotechnol 27, 489-491 (2009)]). 배아로 된 알 대신에, 흔히 HA, NA 및 매트릭스 단백질 1(M1)을 포함하는 VLP는 포유동물 또는 곤충 세포 발현 시스템에서 대량 생산될 수 있다(문헌 [Haynes, J.R. Expert Rev Vaccines 8, 435-445 (2009)]). 이 접근법의 이점은 그의 미립자로 된, 다가 성질 및 감염성 비리온을 충실히 모방하는, 적절하게 폴딩된 삼량체 HA 스파이크의 확실한 디스플레이이다. 그에 반해, 그의 어셈블리의 성질에 의해, 외피보유 VLP는 이 플랫폼의 반복된 사용 후에 잠재적인 안전성, 면역원성 어려움을 나타낼 수 있는, 작지만 유한한 숙주 세포 구성요소를 함유한다(문헌 [Wu, C.Y. et al. PLoS One 5, e9784 (2010)]). 더욱이, VLP에 의해 유도된 면역은 현행 백신에 의해 유도된 면역과 본질적으로 동일하고, 따라서, 백신 유도된 방어 면역의 효력 및 폭, 둘 모두를 유의적으로 개선시키지는 못할 것이다. VLP 이외에도, 비록 방어 중화 항체 역가를 유도하는 능력이 제한적이기는 하지만, 재조합 HA 단백질 또한 인간에서 평가되었다(문헌 [Treanor, J.J. et al. Vaccine 19, 1732-1737 (2001)]; [Treanor, J.J. JAMA 297, 1577-1582 (2007)]). 이들 시험에 사용된 재조합 HA 단백질은 곤충 세포에서 생산되었으며, 천연 삼량체를 우선적으로 형성하지 못할 수 있다(문헌 [Stevens, J. Science 303, 1866-1870 (2004)]).
종래의 인플루엔자 백신에 대한 몇 가지 대안에도 불구하고, 지난 수십 년 내 생명공학이 진보함에 따라 생물학적 물질의 조작이 신규 백신 플랫폼 생성에 사용될 수 있었다. 거의 모든 살아 있는 유기체에서 발견되는 철 저장 단백질인 페리틴은 다수의 잠재적인 생화학적/생물의학적 목적을 위해 광범위하게 연구되고, 조작된 예이고((Iwahori, K.) 미국 특허 2009/0233377 (2009); [Meldrum, F.C. et al. Science 257, 522-523 (1992)]; (aitou, M. et al.) 미국 특허 2011/0038025 (2011); [Yamashita, I. Biochim Biophys Acta 1800, 846-857 (2010)]), 외인성 에피토프 펩티드를 나타내기 위한 잠재적인 백신 플랫폼을 포함한다 ((Carter, D.C. et al.) 미국 특허 2006/0251679 (2006); [Li, C.Q. et al. Industrial Biotechnol 2, 143-147 (2006)]). 백신 플랫폼으로서 그를 사용하는 것은 T 세포 비의존성 항체 반응을 유도할 뿐만 아니라, 1가 형태보다 강한 B 세포 반응을 유도하는 항원의 자기 조립 및 다가 제시 때문에 특히 흥미롭다(문헌 [Bachmann, M.F. et al. Annu Rev Immunol 15, 235-270 (1997)]; [Dintzis, H.M. et al. Proc Natl Acad Sci USA 73, 3671-3675 (1976)]). 추가로, 432 대칭을 갖는 팔면체 케이지로 조립되는 24개의 서브유닛으로 구성되는 페리틴의 분자 구성은 그 표면 상에 다량체 항원을 나타낼 수 있는 잠재성을 갖는다.
그룹 1 헤마글루티닌 단백질의 줄기 영역은 변형을 통해, 그의 입체구조가 전장의, 야생형(wt: wild-type) 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질의 융합 전 입체구조와 매우 유사한, 안정화된 HA 줄기 단백질을 형성할 수 있다는 것이 선행 연구를 통해 밝혀졌다. 추가로, 상기 변형된 안정화된 줄기(SS: stabilized stem) HA 단백질이 단량체 서브유닛 단백질, 예컨대, 페리틴에 연결되었을 때, 생성된 융합 단백질은, 그의 표면에서 SS-HA 단백질의 삼량체를 나타내는 나노입자를 형성하였다. 더욱이, 상기 나노입자는 면역 반응 그룹 1 인플루엔자 바이러스를 유도할 수 있으며, 이는 나노입자에 의해 제시된 SS-HA 단백질 삼량체가 wt 인플루엔자 HA 단백질의 것과 유사한 입체구조를 가졌다는 것을 나타내는 것이다. 상기 구성체는 국제 특허 출원 번호 PCT/US2015/032695(상기 특허의 내용은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에 개시되어 있다. 그러나, 상기 언급된 나노입자에 의해 유도된 항체는 그룹 2 인플루엔자 바이러스보다 그룹 1 인플루엔자 바이러스에 대하여 더욱 큰 방어성을 보였다.
따라서, 그룹 2 인플루엔자 바이러스에 대하여 강력한 방어를 제공하는 효과적인 인플루엔자 백신이 요구되고 있다. 추가로, 미래의 진화하는 계절성 및 유행성 인플루엔자 바이러스 균주를 비롯한, 인플루엔자 바이러스의 이종성 균주로부터 개체를 보호하는 인플루엔자 백신 또한 요구되고 있다. 본 발명은 가변 면역우성 헤드 영역이 결여되어 있고, 나노입자의 표면에 융합되어 있는 신규한 그룹 2 HA 안정화된 줄기(SS)로 구성된 신규한 나노입자 기반 백신을 제공하여, 쉽게 제조되고, 강력하며, 광범위한 이종아형 방어성을 보이는 항체를 유도하는 인플루엔자 백신을 생성함으로써 상기 요구를 충족시킨다.
따라서, 본 개시내용은 그룹 2 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 단백질을 포함하는 재조합 단백질로서, 여기서, 헤드 영역의 아미노산 서열이 인플루엔자 HA 단백질의 헤드 영역으로부터의 5개 미만의 인접한 아미노산을 포함하는 링커로 대체되어 있는 것인 재조합 단백질을 제공한다. 상기 재조합 단백질의 포유동물에게로의 투여 후, 상기 재조합 단백질은 포유동물에서 그룹 2 인플루엔자 HA 단백질에 대한 면역 반응을 유도한다.
재조합 단백질은 그룹 2 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 단백질의 줄기 영역으로부터의 제1 아미노산 서열, 및 그룹 2 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 단백질의 줄기 영역으로부터의 제2 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 여기서, 제1 및 제2 아미노산 서열은 링커 서열에 의해 공유 결합되어 있고, 여기서, 제1 아미노산 서열은 헤드 영역 서열의 아미노 말단 단부 상류의 아미노산 서열로부터의 적어도 20개의 인접한 아미노산 잔기를 포함하고, 여기서, 제2 아미노산 서열은 헤드 영역 서열의 카복실 말단 단부 하류의 아미노산 서열로부터의 적어도 20개의 인접한 아미노산 잔기를 포함한다. 상기 재조합 단백질 구성체에서, 제1 아미노산 서열은 헤드 영역의 아미노 말단 단부에 바로 인접해 있는 상류 쪽 폴리펩티드 서열로부터의 적어도 20개의 인접한 아미노산을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 제1 아미노산 서열은 서열 번호 27, 서열 번호 28 또는 서열 번호 29로부터의 적어도 20개의 인접한 아미노산을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 제2 아미노산 서열은 헤드 영역의 카복실 말단 단부에 바로 인접해 있는 하류 쪽 폴리펩티드 서열로부터의 적어도 20개의 인접한 아미노산을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 제1 아미노산 서열은 서열 번호 31, 서열 번호 32 또는 서열 번호 33으로부터의 적어도 20개의 인접한 아미노산을 포함할 수 있다.
재조합 단백질은 제1 시스테인 아미노산을 함유하도록 변형된, 헤드 영역 서열에 연결된 나선 C의 아미노 말단 단부(나선 C의 막 원위 단부), 및 제1 및 제2 시스테인이 디설파이드 결합을 형성하도록 제2 시스테인 아미노산을 포함하는 링커 서열을 포함할 수 있다.
재조합 단백질은, 재조합 HA 줄기 단백질의 3차원 구조가 천연 그룹 2 HA 단백질에서의 HA 줄기 영역의 3차원 구조에 가깝도록 변형된, 나선간 영역(즉, 나선 C의 N 말단 단부를 나선 A의 카복실 말단 단부(즉, 나선 A의 막 원위 단부)에 연결하는 아미노산 서열)을 포함할 수 있다. 재조합 단백질은 길이가 8개 미만의 아미노산 길이이고, 나선간 영역을 대체하는 아미노산 링커 서열을 포함할 수 있다.
재조합 단백질은 아미노산 부가에 의해 연장된 나선 A의 막 원위 단부를 포함할 수 있다.
재조합 단백질은 나선 A를 형성하는 아미노산 서열의 카복실 말단에 연결되고, 나선 A의 길이를 연장시키는 나선을 형성하는 제3 아미노산 링커를 포함할 수 있다. 나선 C의 원위 단부는 링커 펩티드에 의해 제3 링커의 카복실 단부에 연결될 수 있다. 링커 펩티드의 길이는 바람직하게 8개 미만의 아미노산 길이이다.
상기 재조합 단백질은 단백질의 안전성을 증가시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 상기 안정화 돌연변이는 바람직하게 나선 A 및 나선 C 중 적어도 하나를 형성하는 아미노산 서열에 위치한다.
상기 재조합 단백질은 페리틴(ferritin) 또는 루마진(lumazine) 신타제 유래의 단량체 서브유닛에 연결될 수 있다.
본 개시내용의 예시적인 재조합 단백질은 서열 번호 47-159로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한, 또는 적어도 85% 동일한, 또는 적어도 90% 동일한, 또는 적어도 95% 동일한, 또는 적어도 97% 동일한, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 개시내용의 예시적인 재조합 단백질은 서열 번호 47-159로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 개시내용은 또한 본 개시내용의 적어도 하나의 재조합 단백질을 포함하는 나노입자를 제공한다.
본 개시내용은 또한 상기 재조합 단백질과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 단백질을 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 상기 면역원성 조성물은 서열 번호 서열 번호 47-1598로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 포함할 수 있다. 상기 면역원성 조성물은 서열 번호 47-159로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성된 단백질을 포함할 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 또한 상기 면역원성 조성물, 및 애주번트를 포함하는 백신 조성물을 제공한다.
본 개시내용은 또한 인플루엔자 바이러스 감염의 병리적 효과의 예방 또는 감소를 필요로 하는 인간에게 면역적 유효 용량의 본 개시내용의 백신 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 인간에서 인플루엔자 바이러스 감염의 병리적 효과를 예방 또는 감소시키는 방법을 제공한다.
본 개시내용의 재조합 단백질을 코딩하는 핵산 또한 제공한다. 바람직하게는, 핵산은 DNA이다. 상기 핵산을 포함하는 벡터 또한 제공한다. 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포 또한 제공한다. 상기 숙주 세포는 박테리아 세포, 효모 세포, 또는 포유동물 세포일 수 있다. 상기 숙주 세포는 불활성화된 것일 수 있다.
본 개시내용은 또한 본 개시내용의 재조합 단백질을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 유사하게, 상기 조성물은 생리적으로 허용되는 담체와 함께 조합하여 본 개시내용의 재조합 단백질을 포함하는 백신일 수 있다.
본 개시내용은 또한 피험체에게 예방적 또는 치료적 유효량의 본 개시내용의 재조합 단백질을 투여하는 단계를 포함하는 백신접종 방법을 제공한다.
본 개시내용은 또한 인플루엔자 관련 질환의 치료를 필요로 하는 피험체에게 예방적 또는 치료적 유효량의 본 개시내용의 재조합 단백질을 투여하는 단계를 포함하는, 인플루엔자 관련 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 피험체는 인간이다.
도 1a-1c는 선행 기술을 요약한 것이다. 도 1a는 전장의 HA-페리틴 나노입자의 디자인을 도시한 리본 다이어그램이다. 도 1b는 HIV gp41 삼량체화 도메인에 의해 안정화된 HA 줄기-페리틴 나노입자의 디자인을 도시한 리본 다이어그램이다. 상기 두 디자인 모두 특허 출원 PCT/US12/56822(상기 특허는 본원에서 참조로 포함된다)에 상세하게 기술되어 있다. 도 1c는 PCT 특허 출원 번호 PCT/US15/32695(상기 특허는 본원에서 참조로 포함된다)에 개시된 그룹 1 HA 안정화된 줄기 나노입자의 디자인을 도시한 리본 다이어그램이다.
도 2는 자기 조립성 그룹 2 HA 줄기 나노입자의 생성을 도시한 것이다. 리본 다이어그램은 (좌측에서 우측으로) 그룹 2 HA 안정화된 줄기 나노입자의 디자인을 도시한 것이다. 한 HA 단량체의 헤드 영역은 짙은 회색으로 표시되어 있다. 상기 동일 단량체의 줄기 영역은 중간 회색으로 제시되어 있다. 나머지 다른 2개의 단량체는 옅은 회색으로 제시되어 있다.
도 3a 및 3b는 그룹 2 HA 안정화된 줄기 나노입자가 형성될 수 있도록 하는 H3N2 디자인 231 중의 돌연변이를 보여주는 것이다. 도 3a는 PDB ID 2YP2에 기반한 그룹 2 H3N2 안정화된 HA 줄기 삼량체의 모델을 도시한 리본 다이어그램이다. 나선 중의 돌연변이의 영역은 짙은 회색으로 제시되어 있다. 도 3b는 H3 디자인 #231의 서열(A/덴마크35/2005 H3N2의 HA 줄기에 기반, 진뱅크(GenBank) ABU92694)을 보여주는 것이다. 돌연변이화된 서열은 박스로 표시되어 있다. 참조를 위해, C 말단 SGG 링커는 굵은체로 표시되어 있고, C 말단 페리틴은 밑줄체로 표시되어 있고, N 연결된 글리칸을 제거하기 위한 Asn에서 Gln으로의 페리틴 돌연변이는 굵은체로 표시되어 있다.
도 4a-4d는 H3N2 디자인 231에서의 HA1 헤드를 대체하는 루프 중의 돌연변이를 보여주는 것이다. 도 4a는 PDB ID 2YP2에 기반한 그룹 2 H3N2 안정화된 HA 줄기 삼량체의 모델을 도시한 리본 다이어그램을 보여주는 것이다. HA1 헤드 영역을 대체하는 루프 중의 7개의 돌연변이, 상기 언급된 루프와 이황화물을 형성하는 나선 C 중의 추가의 시스테인이 표시되어 있다. 나선 영역 중의 모든 다른 돌연변이는 짙은 회색으로 제시되어 있다. 도 4b는(도 4a에서 헤드 영역을 대체하는 것으로 표시된) 돌연변이화된 루프를 도시한 것이고, 여기서, 측쇄는 스틱 모델로 표시되어 있다. 도 4c는 루프 서열의 변이체를 보여주는 것이다. 도 4d는 H3 디자인 #231의 서열을 보여주는 것이다. 도 4a-4c에 도시되어 있는, 헤드 및 나선 영역 중의 돌연변이는 박스로 표시되어 있다. 참조를 위해, C 말단 SGG 링커는 굵은체로 표시되어 있고, C 말단 페리틴은 밑줄체로 표시되어 있고, N 연결된 글리칸을 제거하기 위한 Asn에서 Gln으로의 페리틴 돌연변이는 굵은체로 표시되어 있다.
도 5a-5c는 H3N2, 디자인 231에서의 HA2 나선 A와 C를 연결하는 루프 중의 돌연변이를 보여주는 것이다. 도 5a는 PDB ID 2YP2에 기반한 그룹 2 H3N2 안정화된 HA 줄기 삼량체의 모델을 도시한 리본 다이어그램이다. HA2 나선 A와 C를 연결하는 4개의 잔기가 표시되어 있다. 나선 중의 돌연변이는 짙은 회색으로 제시되어 있다. 도 5b는 루프(도 5a에서 표시된 영역)의 클로즈 업을 보여주는 것이고, 여기서, 측쇄는 스틱 모델로 표시되어 있다. 도 5c는 H3 디자인 #231의 서열을 보여주는 것이다. 도 5a 및 5b에 도시되어 있는, 나선 중의 돌연변이, 및 짧은 링커를 구성하는 아미노산은 박스로 표시되어 있다. 참조를 위해, C 말단 SGG 링커는 굵은체로 표시되어 있고, C 말단 페리틴은 밑줄체로 표시되어 있고, N 연결된 글리칸을 제거하기 위한 Asn에서 Gln으로의 페리틴 돌연변이는 굵은체로 표시되어 있다.
도 6a-6c는 H3N2, 디자인 231에서의 나선 A의 C 말단 연장부 중의 돌연변이를 보여주는 것이다. 도 6a는 PDB ID 2YP2에 기반한 그룹 2 H3N2 안정화된 HA 줄기 삼량체의 모델을 도시한 리본 다이어그램이다. 나선 A의 5개 잔기 연장부가 제시되어 있다. 나선 중의 돌연변이는 짙은 회색으로 제시되어 있다. 도 6b는 (이 또한 도 6a에 제시된) 나선 연장부의 클로즈 업을 보여주는 것이고, 여기서, 측쇄는 스틱 모델로 표시되어 있다. 도 6c는 H3 디자인 #231의 서열을 보여주는 것이다. 나선 중의 돌연변이, 및 5개 잔기 연장부를 구성하는 산은 박스로 표시되어 있다. 참조를 위해, C 말단 SGG 링커는 굵은체로 표시되어 있고, C 말단 페리틴은 밑줄체로 표시되어 있고, N 연결된 글리칸을 제거하기 위한 Asn에서 Gln으로의 페리틴 돌연변이는 굵은체로 표시되어 있다.
도 7a 및 7b는 H3N2 디자인 231에서의 캐비티 충전 돌연변이를 보여주는 것이다. 도 7a는 PDB ID 2YP2에 기반한 그룹 2 H3N2 안정화된 HA 줄기 삼량체의 모델을 도시한 리본 다이어그램이다. 7개의 캐비티 충전 돌연변이가 짙은 회색으로 제시되어 있고, 여기서, 측쇄는 스틱 모델로 표시되어 있다. 도 7b는 H3 디자인 #231의 서열을 보여주는 것이다. 나선 및 헤드 영역에의 돌연변이는 박스로 표시되어 있다. 참조를 위해, C 말단 SGG 링커는 굵은체로 표시되어 있고, C 말단 페리틴은 밑줄체로 표시되어 있고, N 연결된 글리칸을 제거하기 위한 Asn에서 Gln으로의 페리틴 돌연변이는 굵은체로 표시되어 있다.
도 8a 및 8b는 H3 안정화된 줄기 페리틴 나노입자 231(H3-SS-np_231)의 발현 및 특징 규명을 보여주는 것이다. 도 8a는 예상된 용리 부피에서의 단일 피크를 보이는 H3-SS-np_231에 대한 겔 여과 용리 프로파일을 보여주는 것이다. 겔 여과 후 Expi293 세포로부터의 H3-SS-np_231에 대한 발현율은 7.7 mg/L였다. 도 8b는 중공구로부터 돌출하는 HA 줄기의 시각적 배열을 가지는 입자의 형성을 나타내는 H3-SS-np_231의 음성 염색 전자 현미경검사 2D 클래스 평균을 보여주는 것이다.
도 9a 및 9b는 H3-SS-np_231의 HA 줄기 항체 인식을 보여주는 것이다. 도 9a는 3개의 HA 줄기 항체에 의한 키네틱 ELISA H3-SS-np_231 인식 검정법으로부터의 EC50 값을 열거한 것이다. H1-SS-np의 인식에 대한 값 또한 대조군으로 제시되어 있다. 상기 두 모든 경우에서, 나노입자를 플레이트 상에 고정화시켰다. 도 9b는 H3-SS-np_231의 CT149 인식에 대한 생체층 간섭법(BLI: biolayer interferometry, Octet로부터 것) 결합 곡선(상단 패널) 및 HA 줄기 항체 CT149 및 CR9114에 대한 BLI 동력학적 상수(하단 패널)를 보여주는 것이다.
도 10a-10b는 H3-SS-np_231의 5개의 변이체에 대한 겔 여과 프로파일을 보여주는 것이다. H3-SS-np_231 변이체 249(도 10a), 256(도 10b), 258(도 10c), 262(도 10d) 및 264(도 10e)에 대한 겔 여과 슈퍼로스(Superose) 6 10/30 프로파일. 각 경우에서, 대략 14.5 ml의 부피에서 단일 피크가 용리되었다. 겔 여과 후 Expi293 세포로부터의 최종 수율은 6-8 mg/L (배양물)였다.
도 11a-11f는 H3-SS-np 나노입자 변이체의 전자 현미경검사를 보여주는 것이다. 중공구로부터 돌출하는 HA 줄기의 시각적 배열을 가지는 입자의 형성을 나타내는 H3-SS-np 변이체의 음성 염색 전자 현미경검사 2D 클래스 평균. H3-SS-np 231 입자에 대한 영상(좌측 상단 패널)은 양성 대조군으로서 제시되어 있다.
도 12a-12d는 H3-SS-np_231의 5개의 변이체에 대한 키네틱 ELISA 결과를 보여주는 것이다. 도 12a-12c는 H3-SS-np_231 변이체 249, 256, 258, 262 및 264의 FI6(도 12a), CT149(도 12b), 및 CR8020(도 12c) 인식에 대한 키네틱 ELISA 곡선을 보여주는 것이다. 도 12d는 도 12a-12c에 제시된 곡선으로부터의 EC50 값을 열거한 것이다.
도 13a 및 13b는 H3-SS-np 변이체 235-295에 대한 키네틱 ELISA 결과를 보여주는 것이다. 도 13a는 광범위하게 중화시키는 HA 줄기 항체 FI6, CT149 및 D25(음성 대조군)에 의한 디자인 235-265의 인식을 보여주는 ELISA 역가를 열거한 것이다. 도 13b는 D25 및 CT149에 의한 디자인 266-296의 인식을 보여주는 ELISA 역가를 열거한 것이다. 디자인 면역원을 발현하는 HEK293T 세포로부터의 상청액을 플레이팅하고, 상기 항체에 의해 검출하였다.
도 14는 H3-SS-np(#231) 및 5개의 변이체에 대한 역학적 주사 열량측정법(DSC: dynamic scanning calorimetry) 플롯을 보여주는 것이다. 열용량(Cp) 대 온도의 플롯은 각 단백질에 대한 용융 전이를 도시한 것이다. 각 디자인에 대한 최초 용융점(TM)이 기록되어 있다. 각각에 대한 디자인 번호는 괄호 안에 제시되어 있다. 본 다이어그램에서, Y축 상의 Cp 값은 임의 눈금으로 제시되어 있다.
도 15a & 15b는 H3-SS-np로 면역화된 마우스의 그룹 2 HA에 대한 면역 반응을 보여주는 것이다. 플레이팅된 A/홍콩/1/1968(H3N2) HA(도 15a) 및 A/안후이/1/2013(H7N9)(도 15b)에 대한, 6개의 상이한 버전의 SAS 애주번트가 첨가된 H3-SS-np로 3x 면역화된 BALB/c 마우스(n=10)로부터의 혈청의 ELISA 항체 종점 역가. 빈(empty) 페리틴 나노입자 단독으로 면역화된 마우스로부터의 혈청은 음성 대조군으로서의 역할을 한다. 기하 평균 역가는 수평선으로 제시되어 있다. 짙은 회색 음영 표시는 음성 대조군에 대한 평균 역가를 나타내고, 옅은 회색 음영 표시는 음성 대조군의 평균 역가의 최대 4배인 영역을 나타낸다. 양측 스튜던츠 t 검정을 사용하여 통계 분석을 수행하였다; *P < 0.05, **P < 0.01, ****P < 0.0001.
도 16a-16d는 H3-SS-np로 면역화된 마우스의 그룹 1 HA에 대한 면역 반응을 보여주는 것이다. 플레이팅된 A/뉴칼레도니아/20/1999(H1N1) HA(도 16a), A/캐나다/720/2005(H2N2)(도 16b), A/홍콩/1074/1999(H9N2)(도 16c) 및 A/베트남/1203/2004(H5N1)(도 16d)에 대한, 6개의 상이한 버전의 SAS 애주번트가 첨가된 H3-SS-np로 3x 면역화된 BALB/c 마우스(n=10)로부터의 혈청의 ELISA 항체 종점 역가. 엠프티 페리틴 나노입자 단독으로 면역화된 마우스로부터의 혈청은 음성 대조군으로서의 역할을 한다. 기하 평균 역가는 수평선으로 제시되어 있다. 짙은 회색 음영 표시는 음성 대조군에 대한 평균 역가를 나타내고, 옅은 회색 음영 표시는 음성 대조군의 평균 역가의 최대 4배인 영역을 나타낸다.
도 17은 아퀴펙스 아에올리쿠스(aquifex aeolicus) 루마진 신타제(LS: lumazine synthase) 60-mer 정20면체 나노입자의 N 말단에 융합된 H3-SS #231에 대한 서열을 보여주는 것이다. H3-SS-np_231에 대한 돌연변이는 박스로 표시되어 있다. H3-SS #231을 LS에 연결하는 6개 잔기 링커 및 LS 중의 N 연결된 글리칸을 결실시키는 단일 LS 돌연변이(N102D)는 굵은체로 표시되어 있다. C 말단 LS는 밑줄체로 표시되어 있다.
도 18a-18f는 H3-LS-np의 6개의 변이체에 대한 겔 여과 프로파일이다. a-f H3-SS-LS-np 변이체 01(도 18a), 02(도 18b), 03(도 18c), 04(도 18d), 06(도 18e) 및 07(도 18f)에 대한 겔 여과 슈퍼로스 6 10/30 프로파일. H3-SS-LS-04를 제외한 각 경우에서, 단일 피크가 용리되었다. 겔 여과 후 Expi293 세포로부터의 최종 수율은 1-2 mg/L (배양물)였다.
도 19a-19b는 H3-LS-np의 4개의 변이체에 대한 ELISA 결과를 보여주는 것이다. 도 19a 및 19b는 H3-SS-LS-np 변이체 01, 02, 03 및 04의 HA 줄기 항체 CT149(도 19a) 및 CR8020(도 19b) 인식에 대한 ELISA 곡선을 보여주는 것이다. 곡선으로부터의 EC50 값은 각 플롯 아래 제시되어 있다.
도 20은 3개의 H3-SS-LS 변이체에 대한 역학적 주사 열량측정법(DSC) 플롯이다. 열용량(Cp) 대 온도의 플롯은 각 단백질에 대한 용융 전이를 도시한 것이다. 각 디자인에 대한 최초 용융점(TM)이 기록되어 있고, 연관된 곡선과 매칭되도록 색상으로 코딩되어 있다. 각각에 대한 디자인 번호는 괄호 안에 제시되어 있다. 본 다이어그램에서, Y축 상의 Cp 값은 임의 눈금으로 제시되어 있다.
도 21a-21d는 H3-SS-LS-np로 면역화된 마우스의 다양한 HA에 대한 면역 반응을 보여주는 것이다. 플레이팅된 A/뉴칼레도니아/20/1999(H1N1) HA(도 21a), A/베트남/1203/2004(H5N1)(도 21b), A/홍콩/1/1968(H3N2)(도 21c) 및 A/안후이/1/2013(H7N9)(도 21d)에 대한, 4개의 상이한 버전의 SAS 애주번트가 첨가된 H3-SS-LS-np로 3x 면역화된 BALB/c 마우스(n=5)로부터의 혈청의 ELISA 항체 종점 역가. 엠프티 페리틴 나노입자 단독 및 H3-SS-np(#231)로 면역화된 마우스로부터의 혈청은 음성 대조군으로서의 역할을 한다. 기하 평균 역가는 수평선으로 제시되어 있다.
도 22a 및 22b는 H3N2 및 H7N9에 대한 H3-SS-LS-np로 면역화된 마우스의 중화 혈청 반응을 보여주는 것이다. 4개의 상이한 버전의 SAS 애주번트가 첨가된 H3-SS-LS-np로 3x 면역화된 BALB/c 마우스(n=5)로부터의 혈청의 슈도바이러스 중화 역가. 도 22a는 A/안후이/1/2013(H7N9)의 중화를 보여주는 것이다. 도 22b는 A/위스콘신/67/2005(H3N2)의 중화를 보여주는 것이다. 엠프티 페리틴 나노입자, H1-SS-np 및 H3-SS-np(#231)로 면역화된 마우스로부터의 혈청은 음성 대조군으로서의 역할을 한다. 기하 평균 역가는 수평선으로 제시되어 있다. 수평 점선은 기준선 역가 50을 나타낸다.
도 23은 25개의 돌연변이의 서열 위치가 그룹 2 H7 HA 안정화된 줄기 나노입자의 형성을 가능하게 한다는 것을 보여주는 것이다. H7-SS-np_16에 대한 서열(A/안후이/1/2013(H7N9) HA에 기반, 진뱅크 수탁 YP_009118475.1) 이 제시되어 있고, 여기서, H3 #231 돌연변이는 박스로 표시되어 있다. 새로운 H7 돌연변이는 별표로 표시되어 있다(H3N2 HA에 매칭되도록 돌연변이화된 2개의 잔기). 참조를 위해, C 말단 SGG 링커는 굵은체로 표시되어 있고, C 말단 페리틴은 밑줄체로 표시되어 있고, N 연결된 글리칸을 제거하기 위한 Asn에서 Gln으로의 페리틴 돌연변이는 굵은체로 표시되어 있다.
도 24a-24f는 H7-SS-np 변이체의 정제를 보여주는 것이다. GNA 렉틴 친화성 크로마토그래피 이후의 H7-SS-np 변이체 16(도 24a), 18(도 24b), 20(도 24c), 21(도 24d), 23(도 24e) 및 26(도 24f)에 대한 겔 여과 슈퍼로스 6 10/30 프로파일. 겔 여과 후 Expi293 세포로부터의 최종 수율은 5-10 mg/L (배양물)였다.
도 25는 H7-SS-np의 전자 현미경검사를 보여주는 것이다. 중공구로부터 돌출하는 HA 줄기의 시각적 배열을 가지는 입자의 형성을 나타내는 H7-SS-np 변이체의 음성 염색 전자 현미경검사 2D 클래스 평균. H1-SS-np 입자에 대한 영상(좌측 상단 패널)은 양성 대조군으로서 제시되어 있다.
도 26a-26d는 H7-SS-np의 변이체에 대한 키네틱 ELISA 결과를 보여주는 것이다. 도 26a-26c는 H7-SS-np 변이체 16, 18, 20, 21, 23, 25, 26 및 H1-SS-np 양성 대조군의 FI6(도 26a), CT149(도 26B) 및 CR8020(도 26c) 인식에 대한 키네틱 ELISA 곡선을 보여주는 것이다. 도 26d는 도 26a-26c에 제시된 곡선으로부터의 EC50 값을 열거한 것이다. ND, 비측정.
도 27은 H7-SS-np의 HA 줄기 항체 인식을 보여주는 것이다. 6개의 H7-SS-np 변이체(도 27a: H7-SS-16; 도 27b: H7-SS-18; 도 27c: H7-SS-21; 도 27d: H7-SS-23; 도 27e: H7-SS-25; 도 27f: H7-SS-26)의 CT149 인식에 대한 생체층 간섭법 결합 곡선이 제시되어 있고, 여기서, 동력학적 상수는 각 곡선 세트 우측에 제시되어 열거되어 있다. 나노입자를 아민 커플링에 의해 센서 팁에 고정화시키고, 다양한 농도의 항체 Fab에서 인큐베이션시켰다.
도 28은 7개의 H7-SS-np 변이체에 대한 역학적 주사 열량측정법(DSC) 플롯이다. 열용량(Cp) 대 온도의 플롯은 각 단백질에 대한 용융 전이를 도시한 것이다. 각 디자인에 대한 최초 용융점(TM)이 기록되어 있고, 연관된 곡선과 매칭되도록 색상으로 코딩되어 있다. 각각에 대한 H7-SS-np 디자인 번호는 괄호 안에 제시되어 있다. 본 다이어그램에서, Y축 상의 Cp 값은 임의 눈금으로 제시되어 있다.
도 29a-29d는 H7-SS-np로 면역화된 마우스의 다양한 HA에 대한 면역 반응을 보여주는 것이다. 플레이팅된 A/뉴칼레도니아/20/1999(H1N1) HA(도 29a), A/베트남/1203/2004(H5N1)(도 29b), A/홍콩/1/1968(H3N2)(도 29c) 및 A/안후이/1/2013(H7N9)(도 29d)에 대한, 6개의 상이한 버전의 SAS 애주번트가 첨가된 H7-SS-np로 3x 면역화된 BALB/c 마우스(n=5)로부터의 혈청의 ELISA 항체 종점 역가. 엠프티 페리틴 나노입자, H1-SS-np 및 H3-SS-np(#231)로 면역화된 마우스로부터의 혈청은 대조군으로서의 역할을 한다. 기하 평균 역가는 수평선으로 제시되어 있다. 수평 점선은 기준선 역가 50을 나타낸다.
도 30a 및 30b는 H3N2 및 H7N9에 대한 H7-SS-np로 면역화된 마우스의 중화 혈청 반응을 보여주는 것이다. 6개의 상이한 버전의 SAS 애주번트가 첨가된 H3-SS-LS-np로 3x 면역화된 BALB/c 마우스(n=5)로부터의 혈청의 슈도바이러스 중화 역가. 도 30a는 A/안후이/1/2013(H7N9)에 대한 중화를 보여주는 것이다. 도 30b는 A/위스콘신/67/2005(H3N2)의 중화를 보여주는 것이다. 엠프티 페리틴 나노입자, H1-SS-np 및 H3-SS-np(#231)로 면역화된 마우스로부터의 혈청은 대조군으로서의 역할을 한다. 기하 평균 역가는 수평선으로 제시되어 있다. 수평 점선은 기준선 역가 50을 나타낸다.
도 31은 인플루엔자 아형 10 HA(H10) 단백질의 서열에 기반한, 본 발명의 단백질 구성체의 4개의 상이한 예의 서열을 보여주는 것이다. 인플루엔자 HA 서열에 대하여 이루어진 돌연변이는 박스로 표시되어 있다. 참조를 위해, C 말단 SGG 링커는 굵은체로 표시되어 있다. C 말단 페리틴 서열은 밑줄체로 표시되어 있다.
도 32a-32e는 H10ssF 변이체 1(도 32a), 2(도 32b) 3(도 32c), 4(도 32d) 및 5(도 32e)에 대한 겔 여과 슈퍼덱스(Superdex) 200 10/30 프로파일을 보여주는 것이다. 각 경우에서, 대략 12.5의 부피에서 단일 피크가 용리되었다. 겔 여과 후 Expi293 세포로부터의 최종 수율은 6-8 mg/L (배양물)였다.
도 33. H10ssF 나노입자 변이체의 전자 현미경검사. 중공구로부터 돌출하는 HA 줄기의 시각적 배열을 가지는 입자의 형성을 나타내는 H10ssF 변이체의 음성 염색 전자 현미경검사 2D 클래스 평균.
도 34a-34d는 H10ssF 변이체 2-5에 대한 키네틱 ELISA 결과를 보여주는 것이다. 도 a-c는 ELISA 곡선을 보여주는 것이다. 도 d는 상기 곡선으로부터 계산된 IC50 값을 보여주는 것이다. 디자인 면역원을 발현하는 HEK293T 세포로부터의 상청액을 플레이팅하고, 상기 항체에 의해 검출하였다.
도 35a & 35b는 H10ssF로 면역화된 마우스의 그룹 2 HA에 대한 면역 반응을 보여주는 것이다. 고정화된 A/홍콩/1/1968(H3N2) HA(도 35b) 및 A/안후이/1/2013(H7N9)(도 35b)에 대한, 5개의 상이한 버전의 S5AS 애주번트가 첨가된 H10ssF(2 ug/마우스)로 3x 면역화된 BALB/c 마우스(n=10)로부터의 혈청의 ELISA 항체 종점 역가. 엠프티 페리틴 나노입자 단독, H7N9 AH13 1가 불활성화된 백신(MIV: Monovalent inactivated vaccine) 또는 H7ssF26로 면역화된 마우스로부터의 혈청에 대한 반응은 대조군으로서의 역할을 한다. 기하 평균 역가는 수평선으로 제시되어 있다. 하단의 점선은 기준선 역가 50을 나타내고, 상단의 점선은 기록된 최고값을 나타낸다.
도 36a-36d는 치사 H3N2 챌린지에 대한 H10ssF로 면역화된 마우스의 반응을 보여주는 것이다. 도 36a-c는 엠프티 나노입자(도 36a), H10ssF_4(도 36b), 또는 H10ssF_5(도 36c)로 면역화된 후, 이어서, 치사 용량의 A/필리핀/1982(H3N2) 인플루엔자로 챌린지된 BALB/c 마우스(n=10)에 대한 체중 손실 곡선을 보여주는 것이다. 도 36d는 a에서의 것과 동일한 마우스에 대한 생존 곡선을 보여주는 것이다. 페리틴 나노입자 단독(엠프티 np)으로 면역화된 마우스가 음성 대조군으로서의 역할을 한다.
도 37a-37g는 치사 H7N9 챌린지에 대한 H10ssF로 면역화된 마우스의 반응을 보여주는 것이다. 도 37a는 치사 용량의 A/상하이/2/2013 유사(H7N9) 인플루엔자로 챌린지된 H10ssF로 면역화된 BALB/c 마우스(n=10)에 대한 생존 곡선을 보여주는 것이다. 페리틴 나노입자 단독(엠프티 np)으로 면역화된 마우스가 음성 대조군으로서의 역할을 한다. 도 37b는 도 37a에서의 것과 동일한 마우스에 대한 챌린지 후 6일째의 체중 감소를 보여주는 것이다. 도 37c-g는 도 37a & 37b에서의 것과 동일한 마우스에 대한 챌린지 후 12일 동안에 걸친 체중 감소를 보여주는 것이다.
도 38은 인플루엔자 아형 3 HA(H3) 단백질의 서열에 기반한, 본 발명의 단백질 구성체의 4개의 상이한 예의 서열을 보여주는 것이다. 인플루엔자 HA 서열에 대하여 이루어진 돌연변이는 박스로 표시되어 있다. 참조를 위해, C 말단 SGG 링커는 굵은체로 표시되어 있고, C 말단 페리틴 서열은 밑줄체로 표시되어 있다. 또한, N 연결된 글리칸을 제거하는 Asn에서 Gln으로의 페리틴 돌연변이는 박스 및 굵은체로 표시되어 있다.
도 39는 인플루엔자 아형 7 HA(H7) 단백질의 서열에 기반한, 본 발명의 단백질 구성체의 4개의 상이한 예의 서열을 보여주는 것이다. 인플루엔자 HA 서열에 대하여 이루어진 돌연변이는 박스로 표시되어 있다. 참조를 위해, C 말단 SGG 링커는 굵은체로 표시되어 있고, C 말단 페리틴 서열은 밑줄체로 표시되어 있다. 또한, N 연결된 글리칸을 제거하는 Asn에서 Gln으로의 페리틴 돌연변이는 박스 및 굵은체로 표시되어 있다.
도 40a-40c는 생식세포계열 역전된 16.a.26 B 세포 수용체(BCR: B cell receptor)를 발현하는 B 세포를 활성화시킬 수 있는 본 발명의 다양한 단백질 구성체의 능력을 보여주는 것이다. 그래프는 항IgM 양성 대조군(및 H1 음성 대조군과 사용하여 활성화시키지 않음)(도 40a), H3-ss-np 단백질 구성체(도 40b), H7-ss-np 단백질 구성체(도 40c), 및 H10ssF 단백질 구성체(도 40d)와 B 세포의 접촉 결과로 발생되는 (B 세포 활성화를 나타내는) 칼슘 유입을 보여주는 것이다.
도 41은 도 40a-c에 도시된 B 세포 활성화 검정법에서의 활성을 나타낸 단백질 구성체의 HA 부분의 서열을 보여주는 것이다. 인플루엔자 HA 서열에 대하여 이루어진 돌연변이는 박스로 표시되어 있다.
본 발명은 인플루엔자 바이러스에 대한 신규한 백신에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 광범위한 인플루엔자 바이러스로부터의 HA 단백질의 줄기 영역에 대한 면역 반응을 유도하는 신규한 그룹 2 인플루엔자 HA 단백질 기반 백신에 관한 것이다. 이는 또한 그룹 2 인플루엔자 HA 단백질로부터의 줄기 영역의 융합 전 입체구조의 면역원성 부분을 그 표면 상에 나타내는 자기 조립성 나노입자에 관한 것이다. 상기 나노입자는 개체를 인플루엔자 바이러스에 대해 백신접종하는 데 유용하다. 따라서, 본 발명은 또한 상기 나노입자를 생산하기 위한 단백질 구성체 및 상기 단백질을 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 본 발명의 나노입자를 제조하는 방법, 및 상기 나노입자를 사용하여 개체를 백신접종하는 방법에 관한 것이다.
본 발명을 추가로 기술하기에 앞서, 본 발명은 기술된 특정 실시양태에 한정되지 않으며, 이에 당연히 본 발명은 달라질 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 본원에서 사용된 용어는 단지 특정 실시양태를 기술하기 위한 것이며, 본 발명의 범주는 오직 청구범위에 의해서만 제한되는 바, 상기 용어는 제한하는 것으로 의도되지 않는다는 것 또한 이해하여야 한다.
본원 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바, "하나"("a," "an") 및 "그"라는 단수 형태는 문맥상 달리 명시되지 않는 한, 복수의 지시 대상을 포함한다는 것에 주의하여야 한다. 예를 들어, 하나의 핵산 분자는 하나 이상의 핵산 분자들을 지칭한다. 따라서, "하나"("a," "an"), "하나 이상의" 및 "적어도 하나의"라는 용어는 상호교환적으로 사용될 수 있다. 유사하게, "포함하는(comprising)," "포함하는(including)" 및 "가지는"이라는 용어는 상호교환적으로 사용될 수 있다. 청구항은 임의의 임의적 요소를 배제하는 것으로 초안 작성될 수 있다는 것에도 추가로 주의한다. 따라서, 이러한 진술은 청구항 요소의 열거와 관련하여 "단독으로," "오직" 등과 같은 배타적 용어의 사용에 대한, 또는 "부정적인" 제한의 사용에 대한 선행 기준으로서의 역할을 하는 것으로 의도된다.
편의상, 본 발명의 단백질 구성체, 및 그의 일부를 지칭하는 데 특정 약어가 사용될 수 있다. 예를 들어, HA는 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질, 또는 그의 일부를 지칭할 수 있다. HA-SS는 인플루엔자 HA 단백질로부터의 안정화된 줄기 영역, 또는 상기 줄기 영역의 일부를 지칭한다. 전형적으로, 상기 명칭의 HA 부분은 헤마글루티닌 단백질의 아형을 지칭할 것이다. 예를 들어, 아형 3 헤마글루티닌으로부터의 안정화된 줄기 영역은 H3-SS로 지칭될 수 있다. 인플루엔자 HA 단백질 막횡단 도메인에 연결된 HA-SS(예컨대, H3-SS)를 포함하는 단백질 구성체는 HA-SS-TM(예컨대, H3-SS-TM)으로 지칭될 수 있다. 페리틴 단량체 서브유닛에 연결된 HA-SS를 포함하는 단백질 구성체는 HA-SS-np로 지칭될 수 있다. 또한, 상기 명칭 다음에는 구체적인 변경을 함유하는 특정 구성체를 명시하는 번호가 기재될 수 있다(예컨대, H3-SS-np_231(서열 번호 47)). 상기 구성체는 또한 HAssF(예컨대, H3ssF_231)로 지칭될 수 있다는 점에도 주의하여야 한다. 본 발명의 특정 측면에서, HA-SS는 다른 단량체 서브유닛, 예컨대, 예를 들어, 루마진 신타제에 연결된다. 상기 구성체는 명칭 HA-SS-LS(예컨대, H3-SS_LS-01(서열 번호 83)) 또는 HAssL(예컨대, H3ssLS-01(서열 번호 83))로 지칭될 수 있다.
상기 이외에도, 달리 구체적으로 정의되지 않는 한, 본원에 개실된 다양한 실시양태에 공통된 하기 용어 및 어구는 하기 기술되는 바와 같이 정의된다.
본원에서 사용되는 바, 단백질 구성체는, 생성된 변형된 단백질이 자연상에서는 발견되지 않는 서열을 포함하도록 단백질의 아미노산 서열이 변형된 것인, 인공적으로 제조된 단백질이다. 단백질 구성체는 2개 이상의 아미노산 서열이 자연상에서는 발견되지 않는 방식으로 공유 결합된 단백질을 포함한다. 연결된 아미노산 서열은 관련되거나, 또는 비관련된 것일 수 있다. 본원에서 사용되는 바, 폴리펩티드 서열은 그의 아미노산 서열이 일반적으로는 그의 자연 환경(들)에서 (예컨대, 세포 내에서) 공유 결합을 통해 함께 연결된 것으로 발견되지 않는다면, 이는 비관련된 것이다. 예를 들어, 페리틴 단량체 서브유닛의 아미노산 서열, 및 그룹 2 인플루엔자 HA 단백질의 아미노산 서열은 일반적으로 공유 결합을 통해 함께 연결된 것으로 발견되지 않는다. 따라서, 상기 서열은 비관련된 것으로 간주된다.
단백질 구성체는 또한 관련된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 인플루엔자 HA 단백질의 구조는 헤드 영역 아미노산 서열 양쪽 단부 모두에서 줄기 영역 아미노산 서열이 측면에 위치하는 것이다. 유전적 수단을 통해, 줄기 영역 서열이 측면에 위치하는 헤드 영역의 부분은 유지시키면서, 헤드 영역의 중간부로부터 아미노산 잔기를 제거함으로써 변형된 버전의 HA 단백질을 생성할 수 있다. 최종 분자 중의 서열의 순서는 동일하게 유지될 수 있지만, 아미노산 사이의 공간적 관계는 천연 단백질과 상이할 것이다. 따라서, 상기 분자는 단백질 구성체로 간주될 것이다. 본 발명에 따라, 단백질 구성체는 또한 융합 단백질로서 지칭될 수 있다.
단백질 구성체에서 아미노산 서열은 서로 직접 연결될 수 있거나, 또는 링커를 사용하여 연결될 수 있다. 링커, 링커 서열, 링커 펩티드 등은 원하는 특징(예컨대, 구조, 에피토프, 면역원성, 활성 등)을 가지는 두 단백질을 연결하는 데 사용되는 짧은 (예컨대, 2-20개) 아미노산 서열이다. 링커 서열은 전형적으로 그 자체의 활성은 없고, 보통은 단백질 구성체의 다른 부분을 연결하여 그가 원하는 입체구조를 띨 수 있도록 하는 데 사용된다. 비록 다른 아미노산 잔기의 사용이 배제되는 것은 아니지만, 링커 서열은 전형적으로 작은 아미노산 잔기 및/또는 그의 런(run), 예컨대, 예를 들어, 세린, 알라닌 및 글리신으로부터 제조된다. 예를 들어, 링커 서열에서 예컨대, 시스테인 잔기와 같이, 공유 결합을 형성할 수 있는 아미노산을 포함하는 것인 바람직할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 면역원성이라는 용어는 특이적 단백질에 대한, 또는 특이적 단백질과 고도의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 특이적 단백질, 또는 그의 특이적 영역의 능력을 지칭한다. 본 발명에 따라, 고도의 동일성을 가지는 두 단백질은 적어도 80% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 87% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 가진다. 두 아미노산 또는 핵산 서열 사이의 동일성(%)을 측저아는 방법은 당업계에 공지되어 있다.
본원에서 사용되는 바, 본 발명의 백신, 또는 나노입자에 대한 면역 반응은 피험체에서의 백신에 존재하는 그룹 2 HA 단백질에 대한 체액성 및/또는 세포성 면역 반응의 발생이다. 본 발명의 목적을 위해, "체액성 면역 반응"은 분비성 (IgA) 또는 IgG 분자를 포함하는 항체 분자에 의해 매개되는 면역 반응을 지칭하는 반면, "세포성 면역 반응"은 T 림프구 및/또는 다른 백혈구에 의해 매개되는 것이다. 세포성 면역의 한 중요한 측면은 세포용해 T 세포("CTL": cytolytic T-cell)에 의한 항원 특이적 반응을 포함한다. CTL은 주조직 적합성 복합체(MHC: major histocompatibility complex)에 의해 코딩된 단백질과 회합되어 제시되고, 세포의 표면 상에 발현되는 펩티드 항원에 대해 특이성을 갖는다. CTL은 세포내 미생물의 파괴 또는 상기 미생물로 감염된 세포의 용해 유도 및 촉진을 돕는다. 세포성 면역의 또 다른 측면은 헬퍼 T 세포에 의한 항원 특이적 반응을 포함한다. 헬퍼 T 세포는 그 표면 상에 MHC 분자와 회합된 펩티드 항원을 나타내는 세포 대비 비특이적 효과기 세포의 기능을 자극하고, 그의 활성을 주력하는 데 도움을 주는 작용을 한다. 세포성 면역 반응은 또한 CD4+ 및 CD8+T 세포로부터 유래된 것을 비롯한, 활성화된 T 세포 및/또는 다른 백혈구에 의해 생산된 사이토카인, 케모카인 및 다른 상기와 같은 분자의 생산을 지칭한다.
따라서, 면역학적 반응은 CTL, 및/또는 헬퍼 T 세포의 생산 또는 활성화를 자극하는 것일 수 있다. 케모카인 및/또는 사이토카인의 생산 또한 자극될 수 있다. 백신은 또한 항체 매개 면역 반응을 유도할 있다. 그러므로, 면역학적 반응은 하기 효과: B 세포에 의한 항체(예컨대, IgA 또는 IgG)의 생산; 및/또는 억제인자, 세포독성, 또는 헬퍼 T 세포, 및/또는 백신에 존재하는 그룹 2 HA 단백질에 특이적인 T 세포의 활성화인 효과 중 하나 이상의 것을 포함할 수 있다. 상기 반응은 면역화된 개체에 보호를 제공하기 위해 감염성을 중화시키고/거나(예컨대, 항체 의존성 방어), 항체 보체 또는 항체 의존성 세포 세포독성(ADCC: antibody dependent cell cytotoxicity)을 매개하는 역할을 할 수 있다. 상기 반응은 당업계에 널리 공지된, 표준 면역검정법 및 중화 검정법을 사용하여 측정될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 항원성(antigenic), 항원성(antigenicity)이라는 용어 등은 단백질이 항체 또는 항체들로 이루어진 군에 의해 결합이 이루어진다는 것을 지칭한다. 유사하게, 단백질의 항원부는 항체 또는 항체들로 이루어진 군에 의해 인식되는 임의의 부분이다. 본 발명에 따라, 항체에 의한 단백질의 인식이란, 항체가 단백질에 선택적으로 결합한다는 것을 의미한다. 본원에서 사용되는 바, 선택적으로 결합한다, 선택적 결합이라는 어구 등은 샘플 또는 검정법에서의 HA와 비관련된 단백질, 또는 비단백질 구성요소에의 결합과 대조적으로, HA 단백질에 우선적으로 결합할 수 있는 항체의 능력을 지칭한다. HA에 우선적으로 결합하는 항체는, HA에는 결합하지만, 샘플 또는 검정법에 존재할 수 있는 다른 분자 또는 구성요소에는 유의적으로 결합하지 않는 것이다. 유의적인 결합이란, 샘플 중의 HA 단백질, 또는 항인플루엔자를 검출 및/또는 그의 수준을 측정할 수 있는 검정법의 능력을 방해할 수 있을 정도로 충분히 큰 친화도 또는 결합력으로 결합하는 항HA 항체의 비HA 분자에의 결합인 것으로 간주된다. 샘플 또는 검정법에 존재할 수 있는 다른 분자 및 화합물의 예로는 비HA 단백질, 예컨대, 알부민, 지질 및 탄수화물을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에 따라, 비HA 단백질은 본원에 개시된 인플루엔자 HA 단백질의 서열과 60% 미만의 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 가지는 단백질이다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항체들은 광범위한 이종아형 방어를 제공한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항체들은 중화 항체 또는 항체들이다.
본원에서 사용되는 바, 중화 항체는 인플루엔자 바이러스가 1회의 복제를 완료하지 못하게 막는 항체이다. 본원에서 정의되는 바, 1회의 복제는 바이러스의 숙주 세포에의 부착으로 시작하여 숙주 세포로부터 새로 형성된 바이러스의 발아로 끝나는 바이러스의 생활 주기를 지칭한다. 이 생활 주기는 세포에 부착하는 단계, 세포에 진입하는 단계, HA 단백질의 절단 및 재배열 단계, 엔도솜 막과 바이러스 막의 융합 단계, 세포질 내로의 바이러스 리보핵단백질의 방출 단계, 새로운 바이러스 입자의 형성 단계 및 숙주 세포막으로부터 바이러스 입자의 발아 단계를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에 따라, 중화 항체는 하나 이상의 상기 단계를 억제시키는 것이다.
본원에서 사용되는 바, 광범위하게 중화시키는 중화 항체는 1개 초과의 타입, 아형, 및/또는 균주의 인플루엔자 바이러스를 중화시키는 항체이다. 예를 들어, 타입 A 인플루엔자 바이러스로부터의 HA 단백질에 대해 유도된 광범위하게 중화시키는 중화 항체는 타입 B 또는 타입 C 바이러스를 중화시킬 수 있다. 추가 예로서, 그룹 2 인플루엔자 바이러스로부터의 HA 단백질에 대해 유도된 광범위하게 중화시키는 중화 항체는 그룹 1 바이러스를 중화시킬 수 있다. 추가 예로서, 한 아형 또는 균주의 바이러스로부터의 HA 단백질에 대해 유도된 광범위하게 중화시키는 중화 항체는 또 다른 아형 또는 균주의 바이러스를 중화시킬 수 있다. 예를 들어, H3 인플루엔자 바이러스로부터의 HA 단백질에 대해 유도된 광범위하게 중화시키는 중화 항체는 H1, H2, H4, H5, H6, H7, H8, H8, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, H17 또는 H18로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아형으로부터의 바이러스를 중화시킬 수 있다.
본 발명에 따라, 인플루엔자 바이러스를 분류하는 데 사용된 모든 명명법은 당업자에 의해 보편적으로 사용되는 것이다. 따라서, 인플루엔자 바이러스의 타입, 또는 그룹은 인플루엔자 타입 A, 인플루엔자 타입 B 또는 인플루엔자 타입 C를 지칭한다. 특정 타입으로 바이러스를 지정하는 것은 각각의 M1(매트릭스) 단백질 또는 NP(핵단백질)에서의 서열 차이에 관한 것임을 당업자는 이해한다. 타입 A 인플루엔자 바이러스는 그룹 1 및 그룹 2로 추가로 분류된다. 이들 그룹은 그의 HA 단백질의 서열에 기반한 바이러스 분류를 지칭하는 것인 아형으로 추가로 분류된다. 현재 보편적으로 인식되는 아형의 예로는 H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H8, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, H17 또는 H18이 있다. 그룹 1 인플루엔자 아형은 H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13, H16, H17 및 H18이다. 그룹 2 인플루엔자 아형은 H3, H4, H7, H10, H14, 및 H15이다. 마지막으로, 균주라는 용어는 그의 게놈에 작은 유전적 변이를 갖는다는 점에서 서로 상이한, 아형 내의 바이러스를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질, 또는 HA 단백질은 본 발명의 단백질 구성체 및 나노입자를 제조하는 데 유용하거나, 또는 면역 반응을 유도할 수 있는, 전장의 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질 또는 그의 임의의 일부를 지칭한다. 바람직한 HA 단백질은 삼량체를 형성할 수 있는 것이다. 전장의 인플루엔자 HA 단백질의 에피토프란, 동종 인플루엔자 균주, 즉, HA의 유래 기점이 되는 균주에 대해 항체 반응을 유도할 수 있는 상기 단백질의 일부분을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 상기 에피토프는 또한 이종 인플루엔자 균주, 즉, 면역원의 HA의 것과 동일하지 않은 HA를 가지는 균주에 대해 항체 반응을 유도할 수 있다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 광범위한 이종아형 방어 반응을 유도한다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 중화 항체를 유도한다.
본원에서 사용되는 바, 변이체란, 그의 서열이 참조 서열과 유사하지만, 동일하지는 않은 단백질, 또는 핵산 분자로서, 여기서, 변이체 단백질(또는 변이체 핵산 분자에 의해 코딩된 단백질)의 활성은 유의적으로 변경되지 않은 것을 지칭한다. 이러한 서열 변이는 자연적으로 발생된 변이일 수 있거나, 또는 당업자에게 공지된 유전적 공학 기술의 사용을 통해 조작될 수 있다. 상기 기술의 예는 문헌 [Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T et al., in Molecular Cloning--A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, pp. 9.31-9.57)], 또는 [Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6](상기 두 문헌 모두 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에서 살펴볼 수 있다.
변이체에 관하여, 아미노산 서열, 또는 핵산 서열에서의 임의의 유형의 변경은 생성된 변이체 단백질이 인플루엔자 바이러스에 대한 중화 또는 비중화 항체를 유도할 수 있는 능력을 보유하는 한, 허용가능하다. 상기 변이의 예로는 결실, 삽입, 치환 및 그의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 단백질에 관하여, 하나 이상의(예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의) 아미노산은 종종, 단백질의 활성에는 유의적으로 영향을 미치지 않으면서, 상기 단백질의 아미노 및/또는 카복시 말단 단부로부터 제거될 수 있다는 것이 당업자에 의해 잘 이해되고 있다. 유사하게, 하나 이상의(예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의) 아미노산은 종종, 단백질의 활성에는 유의적으로 영향을 미치지 않으면서, 상기 단백질 내로 삽입될 수 있다. 삽입이 이루어진 변이체에서, 삽입된 아미노산은 삽입이 이루어진 것 뒤에 아미노산 잔기를 참조 표시함으로써 나타낼 수 있다. 예를 들어, 아미노산 잔기 402 뒤의 4개의 아미노산 잔기의 삽입은 402a-402d로 표시될 수 있다. 더욱이, 상기 삽입된 아미노산 중 하나가 추후에 또 다른 아미노산으로 치환되는 경우, 상기 변이는 문자 위치로 참조 표시함으로써 나타낼 수 있다. 예를 들어, (삽입체의 추가 위치에서) 삽입된 글리신의 트레오닌으로의 치환은 S402dT로 표시될 수 있다.
언급한 바와 같이, 본 발명의 변이체 단백질은 본원에 개시된 인플루엔자 HA 단백질 대비 아미노산 치환을 함유할 수 있다. 단백질의 활성이 유의적으로 영향을 받지 않는 한, 임의의 아미노산 치환은 허용가능하다. 이와 관련하여, 아미노산은 그의 물리적 특성에 기초하여 군으로 분류될 수 있다는 것이 당업계에서 이해되고 있다. 상기 군의 예로는 하전된 아미노산, 비하전된 아미노산, 극성 비하전된 아미노산, 및 소수성 아미노산을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 치환을 함유하는 바람직한 변이체는 아미노산이 동일 군으로부터의 아미노산으로 치환된 것이다. 상기 치환은 보존적 치환으로 지칭된다.
자연적으로 발생된 잔기는 공통 측쇄 특성에 기초하여 하기 부류들로 분류될 수 있다:
1) 소수성: Met, Ala, Val, Leu, Ile;
2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr;
3) 산성: Asp, Glu;
4) 염기성: Asn, Gln, His, Lys, Arg;
5) 쇄 배향에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro; 및
6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
예를 들어, 비보존적 치환은 또 다른 부류로부터 구성원 대신 이들 부류 중 한 부류의 구성원으로 교환하는 것을 포함할 수 있다.
아미노산을 변이시키는 데 있어서, 아미노산의 소수친수성 지수가 고려될 수 있다. 각 아미노산은 그의 소수성 및 전하 특징에 기초하여 소수친수성 지수가 배정된다. 소수친수성 지수는 이소류신(+4.5); 발린(+4.2); 류신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스틴(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글리신(-0.4); 트레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 티로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 리신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5)이다. 단백질에 상호작용성의 생물학적 기능을 부여하는 데 있어 소수친수성 아미노산 지수의 중요성은 당업계에서 일반적으로 이해되고 있다(문헌 [Kyte et al., 1982, J. Mol. Biol. 157:105-31]). 특정 아미노산은 소수친수성 지수 또는 점수가 유사한 다른 아미노산으로 치환될 수 있고, 이는 여전히 유사한 생물학적 활성을 보유한다는 것이 공지되어 있다. 소수친수성 지수에 기초하여 변이시키는 데 있어, 소수친수성 지수가 ±2 이내인 아미노산의 치환이 바람직하고, ±1 이내인 것이 특히 바람직하고, ±0.5 이내인 것이 더욱더 특히 바람직하다.
유사 아미노산의 치환은 친수성에 기초하여 효과적으로 이루어질 수 있고, 특히, 그를 통해 생성된 생물학적으로 기능적으로 등가인 단백질 또는 펩티드가 본 경우에서와 같이 면역학적 발명에서의 사용을 위해 의도된다는 것 또한 당업계에서 이해되고 있다. 그의 인접 아미노산의 친수성에 의해 지배되는 바와 같이, 단백질의 가장 큰 국부 평균 친수성은 그의 면역원성 및 항원성, 즉, 단백질의 생물학적 특성과 상관관계가 있다. 하기 친수성 값이 이들 아미노산 잔기에 배정되었다: 아르기닌(+3.0); 리신(+3.0); 아스파르테이트(+3.0±1); 글루타메이트(+3.0±1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글리신(0); 트레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5±1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 류신(-1.8); 이소류신(-1.8); 티로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 및 트립토판(-3.4). 유사한 친수성 값에 기초하여 변이시키는 데 있어, 친수성 값이 ±2 이내인 아미노산의 치환이 바람직하고, ±1 이내인 것이 특히 바람직하고, ±0.5 이내인 것이 더욱더 특히 바람직하다. 또한, 친수성에 기초하여 1차 아미노산 서열로부터 에피토프를 확인할 수도 있다.
원하는 아미노산 치환(보존적이든 또는 비보존적이든)은 상기 치환이 요구되는 시점에 당업자에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 아미노산 치환은 본원에 기술된 HA 단백질의 중요한 잔기를 확인하기 위해, 또는 HA 단백질의 면역원성, 가용성 또는 안정성을 증가 또는 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 예시적인 아미노산 치환은 하기 표 1에 제시되어 있다.
본원에서 사용되는 바, "단백질 활성에 유의적으로 영향을 미친다"라는 어구는 단백질의 활성을 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40% 또는 적어도 50%만큼 감소시킨다는 것을 지칭한다. 본 발명과 관련하여, 상기 활성은 예를 들어, 인플루엔자 바이러스에 대한 방어 항체를 유도할 수 있는 단백질의 능력으로서 측정될 수 있다. 상기 활성은 인플루엔자 바이러스에 대한 상기 항체의 역가, 인플루엔자 감염으로부터 방어할 수 있는 상기 항체의 능력을 측정함으로써, 또는 유도된 항체에 의해 중화되는 타입, 아형 또는 균주의 개수를 측정함에 의해 측정될 수 있다. 항체 역가를 측정하는 방법, 방어 검정법을 수행하는 방법, 및 바이러스 중화 검정법을 수행하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 상기 기술된 활성 이외에도, 측정될 수 있는 다른 활성으로는 적혈구를 응집시킬 수 있는 능력, 및 세포에 대한 단백질의 결합 친화도를 포함한다. 상기 활성을 측정하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다.
개체, 피험체, 및 환자라는 용어는 당업계에 잘 알려져 있으며, 이는 본원에서 인플루엔자 감염에 감수성인 임의의 인간 또는 다른 동물을 지칭하는 것으로 상호교환적으로 사용된다. 예로는 비인간 영장류, 예컨대, 침팬지 및 다른 유인원 및 원숭이 종을 비롯한 인간 및 다른 영장류; 농장 동물, 예컨대, 소, 양, 돼지, 물개, 염소 및 말; 가정용 포유동물, 예컨대, 개 및 고양이; 설치류, 예컨대, 마우스, 래트 및 기니아 피그를 비롯한, 실험실 동물; 가정용 조류, 야생 조류 및 엽조, 예컨대, 닭, 칠면조 및 다른 꿩류 새, 오리, 거위 등을 비롯한 조류를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 개체, 피험체, 및 환자라는 용어는 그 자체로, 특정 연령, 성별, 인종 등을 나타내지 않는다. 따라서, 남성이든 여성이든 임의의 연령의 개체가 본 개시내용에 의해 포함되는 것으로 의도되며, 이는 노인, 성인, 소아, 아기, 영아 및 유아를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 유사하게, 본 발명의 방법은 예를 들어, 코카서스 인종(백인), 아프리카계 미국인(흑인), 아메리카 원주민, 하와이 원주민, 히스패닉계, 라틴계, 아시아계 및 유럽인을 비롯한, 임의의 인종에 적용될 수 있다. 감염된 피험체는 그의 신체 내에 인플루엔자 바이러스를 보유하는 것으로 알려진 피험체이다.
본원에서 사용되는 바, 백신접종받은 피험체는 인플루엔자 바이러스에 대한 방어 효과를 제공하도록 의도되는 백신을 투여받은 피험체이다.
본원에서 사용되는 바, 노출된, 노출이라는 용어 등은 피험체가 인플루엔자 바이러스로 감염된 것으로 공지된 한 개인 또는 동물과 접촉하였다는 것을 나타낸다.
본원에서 논의된 공개문헌은 본 출원의 출원일 이전의 그의 개시를 위해서만 제공된다. 본원의 어느 것도 본 발명이 선행 발명에 의해 상기 공개문헌에 앞서는 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 추가로, 제공된 공개문헌의 일자는 실제 공개일과 다를 수 있으며, 이는 독립적으로 확인되어야 할 필요가 있을 수도 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 당업계의 숙련가가 보편적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 가진다. 본원에 기술된 것과 유사하거나, 또는 등가인 임의의 방법 및 물질 또한 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질이 이제 기술된다. 본원에서 언급된 모든 공개문헌은 본 공개문헌이 인용되는 것과 관련된 방법 및/또는 물질을 개시하고 기술하기 위해 본원에서 참조로 포함된다.
명확하게 하기 위해, 별개의 실시양태의 문맥으로 기술된 본 발명의 특정 특징은 또한 단일 실시양태로 조합하여 제공될 수 있다는 것을 알 것이다. 반대로, 간략하게 하기 위해, 단일 실시양태의 문맥으로 기술된 본 발명의 다양한 특징은 또한 개별적으로 또는 임의의 적합한 하위 조합으로 제공될 수 있다. 실시양태의 모든 조합은 구체적으로 본 발명에 포함되며, 이는 마치 각각의 모든 조합이 개별적으로 및 명백하게 개시된 것처럼 본원에 개시된다. 추가로, 모든 하위 조합 또한 구체적으로 본 발명에 포함되며, 이는 마치 각각의 모든 하위 조합이 개별적으로 및 명백하게 개시된 것처럼 본원에 개시된다.
본 발명의 한 실시양태는, 그룹 2 인플루엔자 HA 단백질의 헤드 영역이 인플루엔자 HA 단백질의 헤드 영역으로부터의 5개 미만의 인접한 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열로 대체된 것인, 그룹 2 인플루엔자 HA 단백질을 포함하는 단백질 구성체이다. 본원에서 사용되는 바, 그룹 2 HA 단백질은 본 발명의 단백질 구성체 및 나노입자를 제조하는 데 유용한 그룹 2 인플루엔자 바이러스로부터의 전장의 인플루엔자 HA 단백질, 또는 그의 임의의 한 부분/부분들 및/또는 변이체들을 지칭한다. 따라서, 본 발명은 그룹 2 인플루엔자 HA 단백질의 줄기 영역에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 분자에 주목한다. 일부 실시양태에서, HA 단백질 구성체의 서열은 단백질의 줄기 영역을 면역계에 제시될 수 있는 형태로 안정화시키기 위해 추가로 변경된 (즉, 돌연변이화된) 것이다. 본 발명을 실시하는 데 유용한 그룹 2 인플루엔자 HA 단백질, 및 그로부터 제조된 단백질 구성체가 하기 표 2에 제시되어 있다.
상기 열거된 인플루엔자 바이러스, 및 그로부터의 서열이 예시적인 임의의 다른 그룹 2 인플루엔자 바이러스이고, 서열 및 그로부터의 단백질이 본 발명을 실시하는 데 사용될 수 있다.
바이러스 표면 상의 삼량체 HA 단백질은 구상 헤드 영역, 및 HA 단백질을 바이러스 지질 외피에 고정시키는 줄기, 또는 스톡(stalk) 영역을 포함한다. 인플루엔자 HA의 헤드 영역은 배타적으로 HA1 폴리펩티드의 주요 부분으로부터만 형성되는 반면, 스톡 영역은 HA1 및 HA2의 세그먼트로부터 제조된다. 본 발명에 따라, 헤드 영역은 인플루엔자 A 바이러스(A/덴마크/35/2005(H3N2))의 전장의 HA 단백질(서열 번호 4)의 대략 아미노산 60-329에 상응하는 그룹 2 인플루엔자 HA 단백질의 아미노산으로 구성된다. 유사하게, 본원에서 사용되는 바, 줄기 영역은 인플루엔자 A 바이러스(A/덴마크/35/2005(H3N2))의 전장의 HA 단백질(서열 번호 4)의 아미노산 1-59 및 330--519에 상응하는 그룹 2 인플루엔자 HA 단백질의 아미노산으로부터 형성된다. 본원에서 사용되는 바, 헤드 및 줄기 영역과 관련하여, 상기 용어는 거의 상기 언급된 서열은 본 발명의 성질에는 영향을 미치지 않으면서, 수개의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의) 아미노산만큼 그 길이가 달라질 수 있다는 것을 의미한다. 따라서, 예를 들어, 헤드 영역은 아미노산 64-329, 아미노산 60-326 또는 아미노산 62-327로 구성될 수 있다. 일반적으로, 헤드 및 줄기 영역은 상기 언급된 위치로부터 10개 초과의 아미노산만큼 달라지지는 않을 것이다. 본 발명의 특정 측면에서, 헤드 영역은 인플루엔자 A 바이러스(A/덴마크/35/2005(H3N2))(서열 번호 4)의 Cys68 및 Cys321에 상응하는 아미노산 잔기를 포함하여, 그 사이의 아미노산 서열로 구성된다. HA 단백질과 관련하여, 상이한 인플루엔자 바이러스로부터의 HA 단백질은 단백질 중의 서열 차이(삽입, 결실)에 기인하여 길이가 상이할 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 따라서, 상응하는 영역에 대한 참조는 비교되는 영역과 서열, 구조 및/또는 기능이 동일하거나, 또는 거의 동일한(예컨대, 적어도 90% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 98% 동일한 또는 적어도 99% 동일한) 또 다른 단백질의 영역을 지칭한다. 예를 들어, HA 단백질의 줄기 영역과 관련하여, 또 다른 HA 단백질 중의 상응하는 영역은 잔기 개수는 동일하지 않을 수 있지만, 거의 동일한 서열을 가지고, 동일한 기능을 수행할 것이다. 예로서, 상기 언급된 실시양태에서, 인플루엔자 바이러스 A 바이러스(A/덴마크/35/2005(H3N2))(서열 번호 4)로부터의 HA 단백질의 헤드 영역은 아미노산 60에서 시작된다. A/뉴칼레도니아/20/1999(H1)에서 헤드 영역의 시작점의 상응하는 아미노산은 아미노산 C60이다. 바이러스 사이의 서열 비교를 더욱 잘 명확하게 수행할 수 있도록 하기 위해, 아미노산 서열을 참조 서열과 관련시키는 넘버링 체계가 당업자에 의해 사용된다. 따라서, 상이한 인플루엔자 균주로부터의 HA 단백질 중의 상응한 아미노산 잔기는 단백질의 n 말단 아미노산으로부터의 그의 거리와 관련하여 동일한 잔기 개수를 갖지 않을 수도 있다. 예를 들어, H3 넘버링 체계를 사용할 경우, A/뉴칼레도니아/20/1999(1999 NC, H1)에서 잔기 100에 대한 참조는 이것이 N 말단 아미노산으로부터의 100번째 잔기임을 의미하는 것이 아니다. 대신, A/뉴칼레도니아/20/1999(1999 NC, H1)의 잔기 100은 인플루엔자 H3N2 균주의 잔기 100과 나란히 정렬된다. 상기 넘버링 체계의 사용은 당업자에 의해 이해된다. 아미노산의 위치를 확인하는 데 H3 넘버링 체계가 사용될 수 있지만, 달리 언급되지 않는 한, HA 단백질 중의 아미노산 잔기의 위치는 본원에 개시된 서열로부터의 상응하는 아미노산의 일부분에 대한 일반적 참조에 의해 확인될 것이다.
본 발명자들은 또한 인플루엔자 바이러스 HA 단백질의 특정 서열을 비관련 단백질을 조합함으로써, 및 그로부터 제조되는, HA 단백질을 면역계에 제시할 수 있는 나노입자에 의해, HA 단백질의 표적화된 영역에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다는 것도 발견하게 되었다. 따라서, 본 발명의 한 실시양태는 단량체 서브유닛 단백질의 적어도 일부에 연결된 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질을 포함하는 단백질 구성체로서, 여기서, 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질의 헤드 영역은 인플루엔자 HA 단백질의 헤드 영역으로부터의 5개 미만의 인접한 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열로 대체되어 있고, 여기서, 단백질 구성체는 나노입자를 형성할 수 있는 것인, 단백질 구성체이다.
그룹 2 인플루엔자 HA 단백질의 적어도 일부를 단량체 서브유닛에 연결시킴으로써, 본 발명의 단백질 구성체는 그 표면 상에서 그룹 2 인플루엔자 HA 단백질의 삼량체를 발현하는 나노입자로 조립될 수 있다. 상기 삼량체는 융합 전 형태이고, 단량체 서브유닛에의 연결, 및 나노입자 상의 발현이 융합 전 단백질을 그의 삼량체 형태로 안정화시킨다. 이러한 이유에서, HA 단백질은 더욱 천연 상태인 형태로 제시되며, 이는 줄기 폴리펩티드의 특정 표면은 노출되지 않고, 이로써, 줄기 폴리펩티드가 바람직하지 못한 항체 반응을 유도할 수 있는 위험은 감소된다는 것을 의미한다.
특정 측면에서, 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질의 적어도 일부는 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질의 줄기 영역으로부터의 적어도 하나의 면역원성 부분을 포함하고, 여기서, 단백질 구성체는 인플루엔자 바이러스에 대한 방어 항체를 유도한다. 특정 측면에서, 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질의 적어도 일부는 인플루엔자 H3 바이러스 HA 단백질, 인플루엔자 H4 바이러스 HA 단백질, H7 인플루엔자 바이러스 HA 단백질, H10 인플루엔자 바이러스 HA 단백질 HA 단백질, H14 인플루엔자 바이러스 HA 단백질, 및 H15 인플루엔자 바이러스 HA 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 HA 단백질의 줄기 영역으로부터의 적어도 하나의 면역원성 부분을 포함한다.
특정 측면에서, 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질의 적어도 일부는 서열 번호 4-서열 번호 26으로 구성된 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 80%, 적어도 85% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 97% 동일한, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단백질의 HA 부분으로부터의 적어도 하나의 면역원성 부분을 포함한다. 특정 측면에서, 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질의 적어도 일부는 서열 번호 4-서열 번호 26으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질의 HA 부분으로부터의 적어도 하나의 면역원성 부분을 포함한다. 특정 측면에서, 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질의 적어도 일부는 서열 번호 47-서열 번호 159로 구성된 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 80% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 97% 동일한, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단백질의 HA 부분으로부터의 적어도 하나의 면역원성 부분을 포함한다. 특정 측면에서, 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질의 적어도 일부는 서열 번호 47-서열 번호 159로 구성된 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 80% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 97% 동일한, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단백질의 HA 부분으로부터의 적어도 하나의 면역원성 부분을 포함한다. 특정 측면에서, 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질의 적어도 일부는 서열 번호 47-서열 번호 159로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질의 HA 부분으로부터의 적어도 하나의 면역원성 부분을 포함한다. 특정 측면에서, 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질의 적어도 일부는 서열 번호 47-서열 번호 159로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질의 HA 부분으로부터의 적어도 하나의 면역원성 부분을 포함한다. 한 실시양태에서, 그룹 2 인플루엔자 HA 단백질의 면역원성 부분을 포함하는 단백질 구성체는 인플루엔자 바이러스에 대하여 광범위한 방어성을 띠는 방어 항체의 생산을 유도한다.
단백질의 면역원성 부분은, 면역계에 의해 인식되고, 이로써, 면역 반응을 유도하는 아미노산 잔기로 이루어진 클러스터인 에피토프를 포함할 수 있다. 상기 에피토프는 인접한 아미노산 잔기(즉, 단백질에서 서로 인접해 있는 아미노산 잔기)로 구성될 수 있거나, 또는 이는 비인접한 아미노산 잔기(즉, 단백질에서 서로 인접해 있지 않은 아미노산 잔기)이지만, 최종적으로 폴딩된 단백질에서는 공간상 매우 근접하게 위치하는 것인 아미노산 잔기로 구성될 수 있다. 에피토프는 면역계에 의해 인식되도록 하기 위해서는 최소 6개의 아미노산 잔기가 필요하다는 것이 당업자에 의해 잘 이해되고 있다. 따라서, 특정 측면에서, 그룹 2 인플루엔자 HA 단백질로부터의 면역원성 부분은 적어도 하나의 에피토프를 포함한다. 한 실시양태에서, 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질의 적어도 일부는 그룹 2 인플루엔자 HA 단백질의 줄기 영역으로부터의 적어도 6개의 아미노산, 적어도 10개의 아미노산, 적어도 25개의 아미노산, 적어도 50개의 아미노산, 적어도 75개의 아미노산, 또는 적어도 100개의 아미노산을 포함한다. 특정 측면에서, 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질의 적어도 일부는 인플루엔자 H3 바이러스 HA 단백질, 인플루엔자 H4 바이러스 HA 단백질, H7 인플루엔자 바이러스 HA 단백질, H10 인플루엔자 바이러스 HA 단백질 HA 단백질, H14 인플루엔자 바이러스 HA 단백질, 및 H15 인플루엔자 바이러스 HA 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 그룹 2 인플루엔자 HA 단백질의 줄기 영역으로부터의 적어도 6개의 아미노산, 적어도 10개의 아미노산, 적어도 25개의 아미노산, 적어도 50개의 아미노산, 적어도 75개의 아미노산 또는 적어도 100개의 아미노산을 포함한다. 특정 측면에서, 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질의 적어도 일부는 표 2에 열거된 것으로부터 선택되는 인플루엔자 바이러스로부터의 HA 단백질과 적어도 80% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 97% 동일한, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 가지는 그룹 2 인플루엔자 HA 단백질의 줄기 영역으로부터의 적어도 6개의 아미노산, 적어도 10개의 아미노산, 적어도 25개의 아미노산, 적어도 50개의 아미노산, 적어도 75개의 아미노산 또는 적어도 100개의 아미노산을 포함한다. 특정 측면에서, 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질의 적어도 일부는 표 2에 열거된 것으로부터 선택되는 인플루엔자 바이러스로부터의 그룹 2 인플루엔자 HA 단백질의 줄기 영역으로부터의 적어도 6개의 아미노산, 적어도 10개의 아미노산, 적어도 25개의 아미노산, 적어도 50개의 아미노산, 적어도 75개의 아미노산 또는 적어도 100개의 아미노산, 및 그의 변이체를 포함한다. 특정 측면에서, 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질의 적어도 일부는 서열 번호 4-서열 번호 26으로 구성된 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 80%, 적어도 85% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 97% 동일한, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 그룹 2 인플루엔자 HA 단백질의 줄기 영역으로부터의 적어도 6개의 아미노산, 적어도 10개의 아미노산, 적어도 25개의 아미노산, 적어도 50개의 아미노산, 적어도 75개의 아미노산 또는 적어도 100개의 아미노산을 포함한다. 특정 측면에서, 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질의 적어도 일부는 서열 번호 4-서열 번호 26으로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 그룹 2 인플루엔자 HA 단백질의 줄기 영역으로부터의 적어도 6개의 아미노산, 적어도 10개의 아미노산, 적어도 25개의 아미노산, 적어도 50개의 아미노산, 적어도 75개의 아미노산 또는 적어도 100개의 아미노산을 포함한다. 특정 측면에서, 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질의 적어도 일부는 서열 번호 47-서열 번호 159로 구성된 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 80%, 적어도 85% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 97% 동일한, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 단백질의 HA 부분으로부터의 적어도 6개의 아미노산, 적어도 10개의 아미노산, 적어도 25개의 아미노산, 적어도 50개의 아미노산, 적어도 75개의 아미노산 또는 적어도 100개의 아미노산을 포함한다. 특정 측면에서, 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질의 적어도 일부는 서열 번호 47-서열 번호 159로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 단백질의 HA 부분으로부터의 적어도 6개의 아미노산, 적어도 10개의 아미노산, 적어도 25개의 아미노산, 적어도 50개의 아미노산, 적어도 75개의 아미노산 또는 적어도 100개의 아미노산을 포함한다.
본 발명의 특정 측면에서, 아미노산은 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질의 줄기 영역으로부터의 인접한 아미노산이다. 특정 측면에서, 아미노산 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질의 줄기 영역으로부터의 적어도 6개의 아미노산, 적어도 10개의 아미노산, 적어도 25개의 아미노산, 적어도 50개의 아미노산, 적어도 75개의 아미노산 또는 적어도 100개의 아미노산을 포함하는 본 발명의 단백질 구성체는 인플루엔자 바이러스에 대하여 광범위한 방어성을 띠는 방어 항체의 생산을 유도한다. 본 발명의 특정 측면에서, 단백질 구성체는 서열 번호 4-서열 번호 26으로 구성된 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 80% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 97% 동일한, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질의 줄기 영역으로부터의 적어도 6개의 아미노산, 적어도 10개의 아미노산, 적어도 25개의 아미노산, 적어도 50개의 아미노산, 적어도 75개의 아미노산 또는 적어도 100개의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 특정 측면에서, 단백질 구성체는 서열 번호 4-서열 번호 26으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질의 줄기 영역으로부터의 적어도 6개의 아미노산, 적어도 10개의 아미노산, 적어도 25개의 아미노산, 적어도 50개의 아미노산, 적어도 75개의 아미노산 또는 적어도 100개의 아미노산을 포함한다. 특정 측면에서, 아미노산은 비인접한 아미노산이지만, 이는 최종 단백질 중에서 공간상 매우 근접하게 위치한다.
본 출원은 수개의 예시적인 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질로부터의 줄기 영역 서열의 사용을 예시하지만, 본 발명은 또한 개시된 그룹 2 인플루엔자 HA 서열의 변이를 포함하는 단백질로부터의 줄기 영역을 사용하여 실시될 수도 있다. 따라서, 본 발명의 특정 측면에서, 그룹 2 인플루엔자 HA 단백질은 표 2에 열거된 그룹 2 바이러스로부터 선택되는 바이러스로부터의 것, 및 그의 변이체이다. 특정 측면에서, 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질은 서열 번호 4-서열 번호 26으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질의 줄기 영역과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 94%, 적어도 96%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 측면에서, 그룹 2 인플루엔자 HA 단백질은 서열 번호 4-서열 번호 26으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 특정 측면에서, 단백질 구성체 중의 HA 단백질의 헤드 영역 서열은 링커 서열로 대체된다. 줄기 영역 서열이 원하는 입체구조를 취할 수 있는 한, 임의의 링커 서열이 사용될 수 있다. 링커 서열을 제조하는 데 임의의 아미노산이 사용될 수 있지만, 본 발명의 특정 측면에서, 아미노산에는 크거나, 하전된 측쇄는 결여되어 있다. 사용하기에 바람직한 아미노산으로는 시스테인, 세린, 글리신, 알라닌, 발린 및 프롤린을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 한 실시양태에서, 링커는 세린, 글리신, 시스테인, 발린, 프롤린 및/또는 페닐알라닌 잔기로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산으로부터 제조된다. 특정 실시양태에서, 또 다른 아미노산과 공유 결합, 예컨대, 디설파이드 결합을 형성할 수 있는 측쇄를 가지는 아미노산 잔기를 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 상기 아미노산의 한 예는 시스테인이다. 링커 서열의 길이는 다양할 수 있지만, 바람직한 실시양태는 줄기 서열이 원하는 구조를 형성할 수 있도록 하기 위해서는 가능한 가장 짧은 서열을 사용한다. 특정 측면에서, 링커 서열의 길이는 12개 미만의 아미노산 길이이다. 한 실시양태에서, 링커 서열의 길이는 10개 미만의 아미노산 길이이다. 한 실시양태에서, 링커 서열의 길이는 5개 미만의 아미노산 길이이다. 바람직한 실시양태에서, 링커 서열에는 HA 단백질의 헤드 영역으로부터의 인접한 아미노산 서열이 결여되어 있다. 특정 측면에서, 링커 서열은 HA 단백질의 헤드 영역으로부터의 5개 미만의 인접한 아미노산을 포함한다. 특정 측면에서, 헤드 영역 서열은 서열 번호 34, 서열 번호 35를 포함하는 아미노산 서열, 또는 그의 변이체로 대체된다.
본 발명자들은 또한 본 발명의 단백질 구성체 및 나노입자의 안정성은 개시된 단백질 구성체의 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질을 추가로 변경시킴으로써 개선될 수 있다는 것도 발견하게 되었다. 예를 들어, 본 발명자들은 나선 A의 길이가 본 발명의 단백질 구성체의 성능을 개선시킨다는 것을 발견하게 되었다. 따라서, 한 실시양태는 나선 A가 아미노산 부가에 의해 연장된 본 발명의 단백질 구성체이다. 한 실시양태는, 단백질 구성체가 단량체 서브유닛의 적어도 일부에 연결된 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질을 포함하고, 여기서, 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질의 헤드 영역은 인플루엔자 HA 단백질의 헤드 영역으로부터의 5개 미만의 인접한 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열로 대체되고, 여기서, 나선 A의 카복시 말단 단부(즉, 나선 C의 아미노 단부에 연결되는 부분)는 아미노산 잔기의 부가에 의해 연장된 것인, 본 발명의 단백질 구성체이다. 본 목표는 나선을 연장시키는 것이기 때문에, 나선 A의 카복시 말단 단부에 부가되는 아미노산의 서열은 바람직하게는 나선을 형성하여야 한다는 것을 이해하여야 한다. 본 발명의 특정 측면에서, 나선 A의 길이는 서열 번호 36 또는 37을 포함하는 아미노산 서열, 또는 그의 나선 형성 변이체를 나선 A의 카복실 단부에 부가함으로써 연장된다. 본 발명의 특정 측면에서, 나선 A의 길이는 X1LMX2Q를 포함하거나, 또는 그로 구성된 서열, 또는 그의 나선 형성 변이체를 나선 A의 카복실 단부에 부가함으로써 연장되고, 여기서, 위치 X1 및 X2의 아미노산은 산성 아미노산이다. X1 및 X2는 그러할 필요는 없지만, 동일한 아미노산 잔기일 수 있다는 점에 주의하여야 한다. 특정 측면에서, 상기 링커의 1번째 및 4번째 위치의 잔기는 글루타민, 글루탐산, 아스파라긴, 아스파르트산, 글리신, 및 프롤린으로 구성된 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 나선 A는 서열 번호 36 또는 37로 구성된 아미노산 서열, 또는 그의 나선 형성 변이체를 나선 A의 카복실 단부에 부가함으로써 연장된다. 본 발명의 특정 측면에서, 나선 A의 길이는 ALMAQ 또는 ELMEQ를 포함하는 서열을 나선 A의 카복실 단부에 부가함으로써 연장된다. 본 발명의 특정 측면에서, 나선 A의 길이는 ALMAQ 또는 ELMEQ로 구성된 서열, 또는 그의 나선 형성 변이체를 나선 A의 카복실 단부에 부가함으로써 연장된다.
나선 A의 연장 이외에도, 본 발명자들은 나선 A의 카복실 단부를 나선 C의 아미노 단부에 연결하는 아미노산 서열(본원에서 나선간 영역 또는 나선간 루프로 지칭됨, 그의 한 예는 서열 번호 38로 제시된다)의 변형이 본 발명의 단백질 구성체 및 나노입자의 안정성 및 성능을 개선시킨다는 것을 발견하게 되었다. 더욱 특히, 본 발명자들은 나선간 영역의 길이를 단축시키는 것이 본 발명의 단백질 구성체 및 나노입자의 안정성 및 성능을 개선시킨다는 것을 발견하게 되었다. 따라서, 본 발명의 특정 측면에서, 본 발명의 단백질 구성체에서 나선 A의 카복실 단부를 나선 C의 아미노 단부에 연결하는 아미노산 서열은 본 발명의 단백질 구성체의 안정성을 개선시키기 위해 변형된다. 본 발명의 단백질 구성체의 안정성을 개선시킨다는 것은 본 발명의 단백질 구성체의 3차원 구조, 및 특히, 본 발명의 단백질 구성체의 줄기 영역을 안정화시켜 상기 단백질 구성체가 거의 천연 그룹 2 인플루엔자 HA 단백질의 줄기 영역의 3차원 구조에 가까운 구조를 띠게 하고, 그룹 2 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 유도할 수 있도록 한다는 것을 의미함을 이해하여야 한다. 따라서, 본 발명의 특정 측면에서, 본 발명의 단백질 구성체의 나선간 영역은 단축된다. 상기 단축은 현존 나선간 영역으로부터 아미노산을 제거함으로써, 또는 나선간 영역의 아미노산을 링커 서열로 대체함으로써 달성될 수 있다. 특정 측면에서, 본 발명의 단백질 구성체의 나선간 영역은 6개 미만의 아미노산으로 단축된다. 특정 측면에서, 나선간 영역의 아미노산은 링커 서열로 대체된다. 본 발명의 특정 측면에서, 인플루엔자 바이러스 A(덴마크/35/2005(H3N2)) HA 단백질(서열 번호 4)의 나선간 영역에 상응하는 나선간 영역의 아미노산은 링커 서열로 대체된다. 본 발명의 특정 측면에서, 인플루엔자 바이러스 A(덴마크/35/2005(H3N2)) HA 단백질(서열 번호 4)의 아미노산 402-437에 상응하는 나선간 영역의 아미노산은 링커 서열로 대체된다. 본 발명의 특정 측면에서, 서열 번호 4의 아미노산 402-437에 상응하는 나선간 영역은 링커 서열로 대체된다. 본 발명의 특정 측면에서, 서열 번호 38로 제시되는, 인플루엔자 바이러스 A(덴마크/35/2005(H3N2)) HA 단백질(서열 번호 4)의 영역에 상응하는 나선간 영역은 링커 서열로 대체된다. 본 발명의 특정 측면에서, 서열 번호 38과 적어도 90%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질의 나선간 영역은 링커 서열로 대체된다. 한 실시양태에서, 서열 번호 38을 포함하는 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질의 영역은 링커 서열로 대체된다. 본 발명의 특정 측면에서, 서열 번호 38로 구성된 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질의 영역은 링커 서열로 대체된다. 본 발명의 특정 측면에서, 나선간 영역은 GGPD(서열 번호 39)를 포함하는 링커 서열로 대체된다. 본 발명의 특정 측면에서, 서열 번호 4의 아미노산 402-437에 상응하는 나선간 영역은 GGPD로 구성된 펩티드의 물리적, 공간적, 및/또는 화학적 특성을 가지는 링커 서열로 대체된다. 본 발명의 특정 측면에서, 서열 번호 4의 아미노산 402-437에 상응하는 나선간 영역은 나선을 형성하는 성향을 가지는 링커 서열로 대체된다. 본 발명의 특정 측면에서, 서열 번호 4의 아미노산 402-437에 상응하는 나선간 영역은 GGPD(서열 번호 39)를 포함하는 링커 서열, 또는 그의 보존적 변이체로 대체된다. 본 발명의 특정 측면에서, 나선간 영역은 GGPD로 구성된 링커 서열로 대체된다.
앞서 기술된 바와 같이, 본 발명의 단백질 구성체는 본원에 기술된 돌연변이 및 서열 변경 중 하나, 수개, 또는 그들 모두를 함유할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 상기 기술된 바와 같이 나선 A가 연장된 단백질 구성체는 또한 상기 기술된 바와 같이, 단축되거나, 또는 링커 서열로 대체된 나선간 영역을 가질 수 있다. 따라서, 본 발명의 한 측면은 단량체 서브유닛 단백질의 적어도 일부에 연결된 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질을 포함하는 단백질 구성체로서, 여기서, 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질의 헤드 영역은 인플루엔자 HA 단백질의 헤드 영역으로부터의 5개 미만의 인접한 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열로 대체되고, 여기서, 나선간 영역은 단축되거나, 또는 링커 서열로 대체되고, 여기서, 단백질 구성체는 나노입자를 형성할 수 있는 것인, 단백질 구성체이다. HA 단백질 헤드 영역을 대체하는 방법, 및 나선간 영역을 단축시키거나, 또는 그를 대체하는 방법은 본원에 개시되어 있다. 나선 A의 카복실 단부가 아미노산의 부가에 의해 연장되어 있는 실시양태에서, 나선간 영역은 나선 C의 아미노 말단 단부를 나선 A의 연장 서열의 카복실 말단 단부와 연결하는 링커로 대체될 수 있다는 것을 이해하여야 한다.
본 발명자들은 본 발명의 단백질 구성체의 안정성은 그룹 2 인플루엔자 바이러스 줄기 영역의 서열에서의 부위 특이적 돌연변이화에 의해 개선될 수 있다는 것을 추가로 발견하게 되었다. 특히, 이온 결합, 염 다리를 형성하거나, 또는 소수성 패킹을 증가시키는 돌연변이 등은 본 발명의 단백질 구성체 및 나노입자의 안정성을 강화시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 특정 측면에서, 본 발명의 단백질 구성체는 이온 상호작용, 또는 염 다리를 형성하거나, 강화시키거나, 또는 소수성 패킹을 증가시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 비록 치환 돌연변이가 바람직하기는 하지만, 본 발명의 단백질 구성체의 안정성을 증가시키는 원하는 효과를 가지는 임의 유형의 돌연변이화가 진행될 수 있다. 본 발명의 특정 측면에서, 돌연변이는 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질에서 K396, L397, L400, S438, N440, E448, T452 및 N461로 구성된 군으로부터 선택되는 서열 번호 4 중의 위치에 상응하는 아미노산 위치에서 이루어진다. 한 실시양태에서, 인플루엔자 바이러스 A(덴마크/35/2005(H3N2) HA 단백질(서열 번호 4) 중 K396에 상응하는 아미노산은 메티오닌, 류신, 이소류신, 알라닌 및 발린으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 변이된다. 본 발명의 특정 측면에서, 인플루엔자 바이러스 A(덴마크/35/2005(H3N2) HA 단백질(서열 번호 4) 중 K396에 상응하는 아미노산은 메티오닌 또는 류신으로 변이된다. 한 실시양태에서, 인플루엔자 바이러스 A(덴마크/35/2005(H3N2) HA 단백질(서열 번호 4) 중 L397에 상응하는 아미노산은 메티오닌, 류신, 이소류신, 알라닌 및 발린으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 변이된다. 본 발명의 특정 측면에서, 인플루엔자 바이러스 A(덴마크/35/2005(H3N2) HA 단백질(서열 번호 4) 중 L397에 상응하는 아미노산은 발린으로 변이된다. 본 발명의 특정 측면에서, 인플루엔자 바이러스 A(덴마크/35/2005(H3N2) HA 단백질(서열 번호 4) 중 L400에 상응하는 아미노산은 메티오닌, 류신, 이소류신, 알라닌 및 발린으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 변이된다. 본 발명의 특정 측면에서, 인플루엔자 바이러스 A(덴마크/35/2005(H3N2) HA 단백질(서열 번호 4) 중 L400에 상응하는 아미노산은 발린으로 변이된다. 본 발명의 특정 측면에서, 인플루엔자 바이러스 A(덴마크/35/2005(H3N2) HA 단백질(서열 번호 4) 중 S438에 상응하는 아미노산은 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 및 시스테인으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 변이된다. 본 발명의 특정 측면에서, 인플루엔자 바이러스 A(덴마크/35/2005(H3N2) HA 단백질(서열 번호 4) 중 S438에 상응하는 아미노산은 시스테인으로 변이된다. 본 발명의 특정 측면에서, 인플루엔자 바이러스 A(덴마크/35/2005(H3N2) HA 단백질(서열 번호 4) 중 N440에 상응하는 아미노산은 메티오닌, 류신, 이소류신, 알라닌 및 발린으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 변이된다. 본 발명의 특정 측면에서, 인플루엔자 바이러스 A(덴마크/35/2005(H3N2) HA 단백질(서열 번호 4) 중 N440에 상응하는 아미노산은 류신으로 변이된다. 본 발명의 특정 측면에서, 인플루엔자 바이러스 A(덴마크/35/2005(H3N2) HA 단백질(서열 번호 4) 중 E448에 상응하는 아미노산은 메티오닌, 류신, 이소류신, 알라닌 및 발린으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 변이된다. 본 발명의 특정 측면에서, 인플루엔자 바이러스 A(덴마크/35/2005(H3N2) HA 단백질(서열 번호 4) 중 E448에 상응하는 아미노산은 류신으로 변이된다. 본 발명의 특정 측면에서, 인플루엔자 바이러스 A(덴마크/35/2005(H3N2) HA 단백질(서열 번호 4) 중 T452에 상응하는 아미노산은 메티오닌, 류신, 이소류신, 알라닌 및 발린으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 변이된다. 본 발명의 특정 측면에서, 인플루엔자 바이러스 A(덴마크/35/2005(H3N2) HA 단백질(서열 번호 4) 중 T452에 상응하는 아미노산은 발린으로 변이된다. 본 발명의 특정 측면에서, 인플루엔자 바이러스 A(덴마크/35/2005(H3N2) HA 단백질(서열 번호 4) 중 N461에 상응하는 아미노산은 히스티딘, 리신, 글루탐산, 아스파르트산, 및 아르기닌으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 변이된다. 본 발명의 특정 측면에서, 인플루엔자 바이러스 A(덴마크/35/2005(H3N2) HA 단백질(서열 번호 4) 중 N461에 상응하는 아미노산은 히스티딘, 리신, 및 아르기닌으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 변이된다. 본 발명의 특정 측면에서, 인플루엔자 바이러스 A(덴마크/35/2005(H3N2) HA 단백질(서열 번호 4) 중 N461에 상응하는 아미노산은 아르기닌으로 변이된다.
본 발명의 단백질 구성체를 안정화시킬 수 있는 추가의 돌연변이로는 G39, T46, N54, T58, L331, N338, 및 Q392로 구성된 군으로부터 선택되는 서열 번호 4 중의 위치에 상응하는 아미노산 위치에서의 돌연변이를 포함한다. 상기 위치에서의 돌연변이는 삽입된 아미노산이 본원에서 제안된 것과 특성이 유사한 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 특정 측면에서, 인플루엔자 바이러스 A(덴마크/35/2005(H3N2) HA 단백질(서열 번호 4) 중 G39에 상응하는 아미노산은 시스테인, 세린, 트레오닌, 프롤린, 아스파라긴, 및 글루타민으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 변이된다. 본 발명의 특정 측면에서, 인플루엔자 바이러스 A(덴마크/35/2005(H3N2) HA 단백질(서열 번호 4) 중 G39에 상응하는 아미노산은 시스테인으로 변이된다.
본 발명의 특정 측면에서, 인플루엔자 바이러스 A(덴마크/35/2005(H3N2) HA 단백질(서열 번호 4) 중 T46에 상응하는 아미노산은 시스테인, 세린, 트레오닌, 프롤린, 아스파라긴, 및 글루타민으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 변이된다. 본 발명의 특정 측면에서, 인플루엔자 바이러스 A(덴마크/35/2005(H3N2) HA 단백질(서열 번호 4) 중 T46에 상응하는 아미노산은 시스테인으로 변이된다.
본 발명의 특정 측면에서, 인플루엔자 바이러스 A(덴마크/35/2005(H3N2) HA 단백질(서열 번호 4) 중 N54에 상응하는 아미노산은 히스티딘, 아르기닌 및 리신으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 변이된다. 본 발명의 특정 측면에서, 인플루엔자 바이러스 A(덴마크/35/2005(H3N2) HA 단백질(서열 번호 4) 중 N54에 상응하는 아미노산은 히스티딘으로 변이된다.
본 발명의 특정 측면에서, 인플루엔자 바이러스 A(덴마크/35/2005(H3N2) HA 단백질(서열 번호 4) 중 T58에 상응하는 아미노산은 메티오닌, 류신, 이소류신, 알라닌 및 발린으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 변이된다. 본 발명의 특정 측면에서, 인플루엔자 바이러스 A(덴마크/35/2005(H3N2) HA 단백질(서열 번호 4) 중 T58에 상응하는 아미노산은 류신으로 변이된다.
본 발명의 특정 측면에서, 인플루엔자 바이러스 A(덴마크/35/2005(H3N2) HA 단백질(서열 번호 4) 중 L331에 상응하는 아미노산은 히스티딘, 아르기닌 및 리신으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 변이된다. 본 발명의 특정 측면에서, 인플루엔자 바이러스 A(덴마크/35/2005(H3N2) HA 단백질(서열 번호 4) 중 L331에 상응하는 아미노산은 리신으로 변이된다.
본 발명의 특정 측면에서, 인플루엔자 바이러스 A(덴마크/35/2005(H3N2) HA 단백질(서열 번호 4) 중 N338에 상응하는 아미노산은 시스테인, 세린, 프롤린, 아스파라긴, 글루타민, 및 트레오닌으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 변이된다. 본 발명의 특정 측면에서, 인플루엔자 바이러스 A(덴마크/35/2005(H3N2) HA 단백질(서열 번호 4) 중 N338에 상응하는 아미노산은 시스테인으로 변이된다.
본 발명의 특정 측면에서, 인플루엔자 바이러스 A(덴마크/35/2005(H3N2) HA 단백질(서열 번호 4) 중 Q392에 상응하는 아미노산은 시스테인, 세린, 프롤린, 아스파라긴, 글루타민, 및 트레오닌으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 변이된다. 본 발명의 특정 측면에서, 인플루엔자 바이러스 A(덴마크/35/2005(H3N2) HA 단백질(서열 번호 4) 중 Q392에 상응하는 아미노산은 시스테인으로 변이된다.
상기 내용 이외에도, 본 발명자들은 글리칸 연결 부위를 부가하는 돌연변이가 유익할 수 있다는 것을 발견하게 되었다. 따라서, 본 발명의 특정 측면에서, 단백질 구성체는 Q49N/E51T(그룹 1 글리칸을 부가하는 돌연변이), E56N/V59T(헤드 링커 및 인접 잔기 중의 돌연변이), V59N/P61T(헤드 링커 중의 돌연변이), G62N/G64T(헤드 링커 중의 돌연변이), V329N/L331T(헤드 링커 및 인접 잔기 중의 돌연변이), L331N/L333T, D437N/Y439T(나선간 링커 및 인접 잔기 중의 돌연변이), Q432N/G434T(삽입된 G)(나선간 링커 및 인접 잔기 중의 돌연변이), Q372N/S374T, 및 A492N/I494T로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이, 또는 하나 이상의 돌연변이 쌍을 포함한다.
추가로, 본 발명의 특정 측면에서, 인플루엔자 바이러스 A(덴마크/35/2005(H3N2) HA 단백질(서열 번호 4) 중의 아미노산 339-357에 상응하는 루프는 글리신 링커로 대체될 수 있다.
앞서 기술된 바와 같이, 본 발명의 단백질 구성체는 본원에 기술된 돌연변이 및 서열 변경 중 하나, 수개, 또는 그들 모두를 함유할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 상기 기술된 바와 같이 나선 A가 연장된 단백질 구성체는 또한 상기 기술된 바와 같이, 단축되거나, 또는 링커 서열로 대체된 나선간 영역을 가질 수 있고, 이는 또한 본원에 기술된 부위 특이적 돌연변이 중 하나 이상의 것을 함유할 수 있다. 따라서, 따라서, 본 발명의 한 측면은 단량체 서브유닛 단백질의 적어도 일부에 연결된 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질을 포함하는 단백질 구성체로서, 여기서, 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질의 헤드 영역은 인플루엔자 HA 단백질의 헤드 영역으로부터의 5개 미만의 인접한 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열로 대체되고, 여기서, 나선간 영역은 단축되거나, 또는 링커 서열로 대체되고, 여기서, 단백질 구성체의 HA 부분은 K396, L397, L400, S438, N440, E448, T452, N461, G39, T46, N54, T58, L331, N338, 및 D437로 구성된 군으로부터 선택되는 서열 번호 4 중의 위치에 상응하는 위치에 하나 이상의 부위 특이적 돌연변이를 포함하고, 여기서, 단백질 구성체는 나노입자를 형성할 수 있는 것인, 단백질 구성체이다. 상기 구성체는 또한 Q49N/E51T, E56N/V59T(헤드 링커 및 인접 잔기 중의 돌연변이), V59N/P61T(헤드 링커 중의 돌연변이), G62N/G64T(헤드 링커 중의 돌연변이), V329N/L331T(헤드 링커 및 인접 잔기 중의 돌연변이), L331N/L333T, D437N/Y439T(나선간 링커 및 인접 잔기 중의 돌연변이), Q432N/G434T(삽입된 G)(나선간 링커 및 인접 잔기 중의 돌연변이), Q372N/S374T, 및 A492N/I494T로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이, 또는 하나 이상의 돌연변이 쌍을 포함할 수 있다. HA 단백질 헤드 영역을 대체하는 방법, 나선 A를 연장시키는 방법, 나선간 영역을 단축 또는 대체시키는 방법, 및 적합한 부위 특이적 돌연변이 방법은 본원에 개시되어 있다. 나선 A의 카복실 단부가 아미노산의 부가에 의해 연장되어 있는 실시양태에서, 나선간 영역은 나선 C의 아미노 말단 단부를 나선 A의 연장 서열의 카복실 말단 단부와 연결하는 링커로 대체될 수 있다는 것을 이해하여야 한다.
지금까지는 나노입자 백신 제조에 유용한, 본 발명의 단백질 구성체의 구체적인 측면을 기술하였다. 본 발명을 명백하게 하는 것을 돕기 위해, 본 발명자들은 이제 대안으로 및 더욱 상세하게 다양한 측면을 기술할 것이다. 하기 기술된 본 발명의 임의의 측면 또한 본원에서 이미 기술된 단백질 구성체의 실시양태 및 측면에도 적용된다는 것을 이해하여야 한다.
본 발명의 단백질 구성체는 그룹 3 인플루엔자 HA 단백질의 다양한 부분을 함께 연결하고, 그에 대한 서열을 변경시키는 재조합 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 재조합 기술은 또한 적절한 링커 및 단량체 서브유닛을 부가하는 데에도 사용될 수 있다. 이러한 방식으로, 단백질 구성체를 제조하는 데 필요한 특정 서열을 포함하는 단백질 구성체, 및 그 결과로, 본 발명의 나노입자 백신이 제조될 수 있다. 따라서, 본 발명의 한 실시양태는 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질의 줄기 영역으로부터의 제1 아미노산 서열 및 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질의 줄기 영역으로부터의 제2 아미노산 서열을 포함하고, 제1 및 제2 아미노산 서열은 링커 서열에 의해 공유 결합되고,
여기서, 제1 아미노산 서열은 헤드 영역 서열의 아미노 말단 단부 상류의 아미노산 서열로부터의 적어도 20개의 인접한 아미노산 잔기를 포함하고;
여기서, 제2 아미노산 서열은 헤드 영역 서열의 카복실 말단 단부 하류의 아미노산 서열로부터의 적어도 20개의 인접한 아미노산 잔기를 포함하고;
여기서, 제1 또는 제2 아미노산 서열은, 단백질 구성체가 나노입자를 형성할 수 있도록 단량체 서브유닛 도메인의 적어도 일부에 연결된 것인, 단백질 구성체(이는 또한 본원에서 융합 단백질로도 지칭된다)이다.
본 발명의 특정 측면에서, 제1 아미노산 서열은 인플루엔자 H3 바이러스 HA 단백질, 인플루엔자 H4 바이러스 HA 단백질, H7 인플루엔자 바이러스 HA 단백질, H10 인플루엔자 바이러스 HA 단백질 HA 단백질, H14 인플루엔자 바이러스 HA 단백질, 및 H15 인플루엔자 바이러스 HA 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 바이러스로부터의 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질의 줄기 영역으로부터의 것이다. 본 발명의 특정 측면에서, 제1 아미노산 서열은 표 2에 열거된 그룹 2 바이러스로부터의 HA 단백질의 줄기 영역으로부터의 것이다. 본 발명의 특정 측면에서, 제1 아미노산 서열은 그룹 2 인플루엔자 HA 단백질의 줄기 영역으로부터의 것이고, 여기서, HA 단백질은 서열 번호 4-서열 번호 26 및 서열 번호 47-서열 번호 159로 구성된 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 97% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 특정 측면에서, 제1 아미노산 서열은 그룹 2 인플루엔자 HA 단백질의 줄기 영역으로부터의 것이고, 여기서, HA 단백질은 서열 번호 4-서열 번호 26 및 서열 번호 47-서열 번호 159로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다.
본 발명의 특정 측면에서, 제2 아미노산 서열은 인플루엔자 H3 바이러스, 인플루엔자 H4 바이러스, H7 인플루엔자 바이러스, H10 인플루엔자 바이러스, H14 인플루엔자 바이러스, 및 H15 인플루엔자 바이러스로 구성된 군으로부터 선택되는 바이러스로부터의 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질의 줄기 영역으로부터의 것이다. 본 발명의 특정 측면에서, 제2 아미노산 서열은 표 2에 열거된 그룹 2 바이러스로부터의 HA 단백질의 줄기 영역으로부터의 것이다. 본 발명의 특정 측면에서, 제2 아미노산 서열은 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질의 줄기 영역으로부터의 것이고, 여기서, HA 단백질은 서열 번호 4-서열 번호 26 및 서열 번호 47-서열 번호 159로 구성된 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 97% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 특정 측면에서, 제2 아미노산 서열은 서열 번호 4-서열 번호 26 및 서열 번호 47-서열 번호 159로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질의 줄기 영역으로부터의 것이다.
상기 언급된 바와 같이, 제1 아미노산 서열은 헤드 영역 서열의 아미노 말단 단부 상류의 아미노산 서열로부터의 적어도 20개의 인접한 아미노산 잔기를 포함한다. 본 발명에 따라, 상류라는 용어는 헤드 영역의 제1 아미노산 잔기의 아미노 말단 단부에 연결된 아미노산 서열 전체를 지칭한다. 바람직한 상류 서열은 헤드 영역 서열에 바로 인접해 있는 것이다. 본 발명의 특정 측면에서, 헤드 영역의 아미노 말단 단부는 인플루엔자 A(덴마크/35/2005(H3N2)) HA 단백질(서열 번호 4)의 HA 단백질의 Q60에 상응하는 아미노산 잔기에 위치한다. 본 발명의 특정 측면에서, 제1 아미노산 서열은 서열 번호 4에 의해 제시되는 인플루엔자 A(덴마크/35/2005(H3N2))의 HA 단백질의 아미노산 잔기 1-59에 상응하는 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질의 영역으로부터의 적어도 20개의 인접한 아미노산 잔기를 포함한다. 본 발명의 특정 측면에서, 제1 아미노산 서열은 서열 번호 27, 서열 번호 28 및 서열 번호 29로 구성된 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 97% 동일한 서열로부터의 적어도 20개의 인접한 아미노산 잔기를 포함한다. 본 발명의 특정 측면에서, 제1 아미노산 서열은 서열 번호 27, 서열 번호 28 및 서열 번호 29로 구성된 군으로부터 선택되는 서열로부터의 적어도 20개의 인접한 아미노산 잔기를 포함한다.
본 발명의 특정 측면에서, 제1 아미노산 서열은 인플루엔자 A(덴마크/35/2005(H3N2)) HA 단백질(서열 번호 4)의 아미노산 잔기 1-59에 상응하는 HA 단백질의 아미노산 영역으로부터의 적어도 40개의 인접한 아미노산 잔기를 포함한다. 본 발명의 특정 측면에서, 제1 아미노산 서열은 서열 번호 27 또는 서열 번호 28과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 97% 동일한 서열로부터의 적어도 40개의 인접한 아미노산 잔기를 포함한다. 본 발명의 특정 측면에서, 제1 아미노산 서열은 서열 번호 27 또는 서열 번호 28로부터의 적어도 40개의 인접한 아미노산 잔기를 포함한다.
본 발명의 특정 측면에서, 제1 아미노산 서열은 서열 번호 27과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 97% 동일한 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 제1 아미노산 서열은 서열 번호 27을 포함한다.
상기 언급된 바와 같이, 제2 아미노산 서열은 헤드 영역 서열의 카복실 말단 단부 하류의 아미노산 서열로부터의 적어도 20개의 인접한 아미노산 잔기를 포함한다. 본 발명에 따라, 하류라는 용어는 헤드 영역의 카복실 말단 아미노산 잔기에 연결된 아미노산 서열 전체를 지칭한다. 바람직한 상류 서열은 헤드 영역 서열에 바로 인접해 있는 것이다. 본 발명의 특정 측면에서, 헤드 영역의 카복실 말단 단부는 서열 번호 4에 의해 제시되는 인플루엔자 A(덴마크/35/2005(H3N2)) HA 단백질의 HA 단백질의 T329에 상응하는 아미노산 위치에 위치한다. 따라서, 본 발명의 특정 측면에서, 제2 아미노산 서열은 인플루엔자 A(덴마크/35/2005)(H3N2) HA 단백질의 아미노산 잔기 330-519에 상응하는 그룹 2 인플루엔자 HA 단백질의 영역으로부터의 적어도 20개의 인접한 아미노산을 포함한다. 본 발명의 특정 측면에서, 제2 아미노산 서열은 인플루엔자 A(덴마크/35/2005(H3N2))(서열 번호 4)의 아미노산 잔기 330-519를 포함하는 그룹 2 인플루엔자 HA 단백질의 영역으로부터의 적어도 20개의 인접한 아미노산을 포함한다. 한 실시양태에서, 제2 아미노산 서열은 서열 번호 30, 서열 번호 31, 서열 번호 32 및 서열 번호 33으로 구성된 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 97% 동일한 서열로부터의 적어도 20개의 인접한 아미노산 잔기를 포함한다. 한 실시양태에서, 제2 아미노산 서열은 서열 번호 30, 서열 번호 31, 서열 번호 32 및 서열 번호 33으로 구성된 군으로부터 선택되는 서열로부터의 적어도 20개의 인접한 아미노산 잔기를 포함한다.
본 발명의 특정 측면에서, 제2 아미노산 서열은 인플루엔자 A(덴마크/35/2005)(H3N2) HA 단백질의 아미노산 잔기 330-519에 상응하는 그룹 2 인플루엔자 HA 단백질의 영역으로부터의 적어도 40개의 인접한 아미노산을 포함한다. 본 발명의 특정 측면에서, 제2 아미노산 서열은 인플루엔자 A(덴마크/35/2005(H3N2))(서열 번호 4)의 아미노산 잔기 330-519를 포함하는 그룹 2 인플루엔자 HA 단백질의 영역으로부터의 적어도 40개의 인접한 아미노산을 포함한다. 본 발명의 특정 측면에서, 제2 아미노산 서열은 서열 번호 30, 서열 번호 31, 및 서열 번호 32로 구성된 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 97% 동일한 서열로부터의 적어도 40개의 인접한 아미노산 잔기를 포함한다. 본 발명의 특정 측면에서, 제2 아미노산 서열은 서열 번호 30, 서열 번호 31, 및 서열 번호 32로 구성된 군으로부터 선택되는 서열로부터의 적어도 20개의 인접한 아미노산 잔기를 포함한다.
본 발명의 특정 측면에서, 제2 아미노산 서열은 서열 번호 36과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 97% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 제2 아미노산 서열은 서열 번호 36을 포함한다.
본 발명의 특정 측면에서, 제2 아미노산 서열은 인플루엔자 A(덴마크/35/2005)(H3N2) HA 단백질의 아미노산 잔기 330-519에 상응하는 그룹 2 인플루엔자 HA 단백질의 영역으로부터의 적어도 60, 적어도 72, 적어도 75, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 175, 또는 적어도 190개의 인접한 아미노산을 포함한다. 본 발명의 특정 측면에서, 제2 아미노산 서열은 인플루엔자 A(덴마크/35/2005(H3N2))(서열 번호 4)의 아미노산 잔기 330-519를 포함하는 그룹 2 인플루엔자 HA 단백질의 영역으로부터의 적어도 60, 적어도 72, 적어도 75, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 175, 또는 적어도 190개의 인접한 아미노산을 포함한다. 본 발명의 특정 측면에서, 제2 아미노산 서열은 서열 번호 30과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 97% 동일한 서열로부터의 적어도 40, 적어도 60, 적어도 72, 적어도 75, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 175, 또는 적어도 190개의 인접한 아미노산 잔기를 포함한다. 한 실시양태에서, 제2 아미노산 서열은 서열 번호 30으로부터의 적어도 40, 적어도 60, 적어도 72, 적어도 75, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 175, 또는 적어도 190개의 인접한 아미노산 잔기를 포함한다.
상기 언급된 바와 같이, 단백질 구성체의 제1 및 제2 아미노산 서열은 링커 서열에 의해 연결될 수 있다. 링커 서열이 HA 단백질의 헤드 영역으로부터의 5개 미만의 인접한 아미노산 잔기를 가지는 한, 그리고, 제1 및 제2 아미노산이 원하는 입체구조를 형성할 수 있는 한, 임의의 링커 서열이 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 링커 서열은 길이가 10개 미만의 아미노산, 7개 미만의 아미노산, 또는 5개 미만의 아미노산 길이이다. 한 실시양태에서, 링커 서열은 글리신 및 세린을 포함한다. 한 실시양태에서, 링커 서열은 제1 아미노산 서열의 카복실 말단 단부를 제2 아미노산 서열의 아미노 말단 단부에 연결시킨다. 본 발명의 특정 측면에서, 링커 서열은 제2 아미노산 서열의 카복실 말단 단부를 제1 아미노산 서열의 아미노 말단 단부에 연결시킨다. 본 발명의 특정 측면에서, 링커 서열은 서열 번호 34 또는 서열 번호 35로 구성된 펩티드와 화학적 및 공간적 특성이 유사하다. 본 발명의 특정 측면에서, 링커는 서열 번호 34 또는 서열 번호 35, 또는 그의 보존적 변이체를 포함한다. 한 실시양태에서, 링커는 서열 번호 34 또는 서열 번호 35를 포함한다. 본 발명의 특정 측면에서, 링커는 서열 번호 34 또는 서열 번호 35로 구성된다.
본 발명의 특정 측면에서, 제2 아미노산 서열은 인플루엔자 A(덴마크/35/2005(H3N2)) HA 단백질(서열 번호 4)의 아미노산 330-519에 상응하는, 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질로부터의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서, HA 단백질(서열 번호 4)의 나선간 영역에 상응하는 영역은 링커 펩티드로 대체된다. 본 발명의 특정 측면에서, 인플루엔자 A(덴마크/35/2005(H3N2)) HA 단백질(서열 번호 4)의 나선간 영역은 본질적으로 서열 번호 4의 아미노산 402-437로 구성된다. 따라서, 본 발명의 특정 측면에서, 제2 아미노산 서열은 인플루엔자 A(덴마크/35/2005(H3N2)) HA 단백질(서열 번호 4)의 아미노산 330-519에 상응하는, 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질로부터의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서, 서열 번호 4의 아미노산 402-437에 상응하는 영역은 링커 펩티드로 대체된다. 본 발명의 특정 측면에서, 제2 아미노산 서열은 서열 번호 30과 적어도 80% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 97% 동일한 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 여기서, 나선간 영역(즉, 서열 번호 4의 아미노산 402-437)에 상응하는 영역은 링커 펩티드로 대체된다. 본 발명의 특정 측면에서, 제2 아미노산 서열은 서열 번호 30을 포함하고, 여기서, 나선간 영역(즉, 서열 번호 4의 아미노산 402-437)에 상응하는 영역은 링커 펩티드로 대체된다. 본 발명의 특정 측면에서, 제2 아미노산 서열은 서열 번호 30을 포함하고, 여기서, 서열 번호 30의 아미노산 73-108은 링커 펩티드로 대체된다. 단백질 구성체가 원하는 입체구조를 형성할 수 있는 한, 제2 아미노산 서열에서 링커 펩티드로서 임의의 링커 서열이 사용될 수 있다. 본 발명의 특정 측면에서, 링커 펩티드는 길이가 10개 미만의 아미노산, 7개 미만의 아미노산, 또는 5개 미만의 아미노산 길이이다. 한 실시양태에서, 링커 펩티드는 길이가 4개의 아미노산 길이이다. 본 발명의 특정 측면에서, 링커 서열은 글리신, 세린, 프롤린 및 아스파르트산으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 특정 측면에서, 링커 펩티드는 서열 번호 39로 구성된 펩티드와 유사한 화학적 및 공간적 특성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 특정 측면에서, 링커 펩티드는 서열 번호 39, 또는 그의 보존적 변이체를 포함한다. 본 발명의 특정 측면에서, 링커 펩티드는 서열 번호 38을 포함한다. 본 발명의 특정 측면에서, 링커 펩티드는 서열 번호 39로 구성된다.
본 발명의 특정 측면에서, 제2 아미노산 서열은 서열 번호 40, 서열 번호 41, 서열 번호 42 및 서열 번호 43으로 구성된 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 80% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 97% 동일한 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 본 발명의 특정 측면에서, 제2 아미노산 서열은 서열 번호 40, 서열 번호 41, 서열 번호 42, 및 서열 번호 43으로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다.
본 발명의 한 실시양태는 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질의 줄기 영역으로부터의 제1 아미노산 서열, 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질의 줄기 영역으로부터의 제2 아미노산 서열, 및 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질의 줄기 영역으로부터의 제3 아미노산 서열을 포함하는 단백질 구성체(이는 또한 본원에서 융합 단백질로 지칭된다)로서;
여기서, 제1 아미노산 서열은 인플루엔자 A 바이러스 HA 단백질의 헤드 영역 서열의 아미노 말단 단부 상류의 아미노산 서열, 또는 인플루엔자 A 바이러스 HA 단백질의 헤드 영역 서열의 아미노 말단 단부 상류의 아미노산 서열로부터의 적어도 40개의 인접한 아미노산과 적어도 85% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 97% 동일한, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열로부터의 적어도 20개의 인접한 아미노산 잔기를 포함하고;
여기서, 제2 아미노산 서열은 헤드 영역 서열의 카복실 말단 단부를 인플루엔자 A 바이러스 HA 단백질의 나선간 영역에 연결시키는 아미노산 서열, 또는 헤드 영역 서열의 카복실 말단 단부를 인플루엔자 A 바이러스 HA 단백질의 나선간 영역에 연결시키는 아미노산 서열로부터의 적어도 40개의 인접한 아미노산과 적어도 85% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 97% 동일한, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열로부터의 적어도 20개의 인접한 아미노산 잔기를 포함하고;
여기서, 제3 아미노산 서열은 나선간 영역의 카복실 말단 단부를 인플루엔자 A 바이러스 HA 단백질의 막횡단 도메인(TM)에 연결시키는 아미노산 서열, 또는 나선간 영역의 카복실 말단 단부를 인플루엔자 A 바이러스 HA 단백질의 막횡단 도메인에 연결시키는 아미노산 서열로부터의 적어도 40개의 인접한 아미노산과 적어도 85% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 97% 동일한, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열로부터의 적어도 20개의 인접한 아미노산 잔기를 포함하고;
여기서, 제1 및 제2 아미노산 서열은 링커 서열에 의해 연결되고; 여기서, 제2 및 제3 아미노산 서열은 링커 서열에 의해 연결되고;
여기서, 제1 또는 제3 아미노산 서열은, 단백질 구성체가 나노입자를 형성할 수 있도록 단량체 서브유닛 도메인의 적어도 일부에 연결된 것인, 단백질 구성체이다.
본 발명의 특정 측면에서, 제1 아미노산 서열은 그룹 2 인플루엔자 HA 단백질로부터의 것이다. 한 실시양태에서, 제1 아미노산 서열은 인플루엔자 H3 바이러스 HA 단백질, 인플루엔자 H4 바이러스 HA 단백질, H7 인플루엔자 바이러스 HA 단백질, H10 인플루엔자 바이러스 HA 단백질 HA 단백질, H14 인플루엔자 바이러스 HA 단백질, 및 H15 인플루엔자 바이러스 HA 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 바이러스로부터의 그룹 2 인플루엔자 HA 단백질로부터의 것이다. 본 발명의 특정 측면에서, 제1 아미노산 서열은 표 2에 열거된 그룹 2 바이러스로부터의 그룹 2 인플루엔자 HA 단백질로부터의 것이다. 본 발명의 특정 측면에서, 제1 아미노산 서열은 서열 번호 4-서열 번호 26 및 서열 번호 47-159로 구성된 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 97% 동일한 아미노산 서열을 가지는 그룹 2 인플루엔자 HA 단백질의 줄기 영역으로부터의 것이다. 본 발명의 특정 측면에서, 제1 아미노산 서열은 서열 번호 4-서열 번호 26 및 서열 번호 47-159로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 그룹 2 인플루엔자 HA 단백질의 줄기 영역으로부터의 것이다.
본 발명의 특정 측면에서, 제1 아미노산 서열은 인플루엔자 A(덴마크/35/2005(H3N2))의 HA 단백질의 아미노산 잔기 1-59에 상응하는 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질의 영역으로부터의 적어도 20개의 인접한 아미노산 잔기를 포함한다. 본 발명의 특정 측면에서, 제1 아미노산 서열은 서열 번호 27, 서열 번호 28 및 서열 번호 29로 구성된 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 97% 동일한 서열로부터의 적어도 20개의 인접한 아미노산 잔기를 포함한다. 본 발명의 특정 측면에서, 제1 아미노산 서열은 서열 번호 27, 서열 번호 28 및 서열 번호 29로 구성된 군으로부터 선택되는 서열로부터의 적어도 20개의 인접한 아미노산 잔기를 포함한다.
본 발명의 특정 측면에서, 제1 아미노산 서열은 인플루엔자 A(덴마크/35/2005(H3N2))의 아미노산 잔기 1-59에 상응하는 HA 단백질의 아미노산 영역으로부터의 적어도 40개의 인접한 아미노산 잔기를 포함한다. 본 발명의 특정 측면에서, 제1 아미노산 서열은 서열 번호 27 및 서열 번호 28과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 97% 동일한 서열로부터의 적어도 40개의 인접한 아미노산 잔기를 포함한다. 본 발명의 특정 측면에서, 제1 아미노산 서열은 서열 번호 27 및 서열 번호 28로부터의 적어도 40개의 인접한 아미노산 잔기를 포함한다.
본 발명의 특정 측면에서, 제1 아미노산 서열은 인플루엔자 A(덴마크/35/2005(H3N2)) HA 단백질(서열 번호 4)의 아미노산 잔기 1-59에 상응하는 서열을 포함한다. 본 발명의 특정 측면에서, 제1 아미노산 서열은 서열 번호 27과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 97% 동일한 서열을 포함한다. 본 발명의 특정 측면에서, 제1 아미노산 서열은 서열 번호 27을 포함한다. 본 발명의 특정 측면에서, 제1 아미노산 서열은 서열 번호 27로 구성된다.
본 발명의 특정 측면에서, 제2 아미노산 서열은 그룹 2 인플루엔자 HA 단백질로부터의 것이다. 본 발명의 특정 측면에서, 제2 아미노산 서열은 인플루엔자 H3 바이러스 HA 단백질, 인플루엔자 H4 바이러스 HA 단백질, H7 인플루엔자 바이러스 HA 단백질, H10 인플루엔자 바이러스 HA 단백질 HA 단백질, H14 인플루엔자 바이러스 HA 단백질, 및 H15 인플루엔자 바이러스 HA 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 바이러스로부터의 그룹 2 인플루엔자 HA 단백질로부터의 것이다. 본 발명의 특정 측면에서, 제2 아미노산 서열은 표 2에 열거된 그룹 2 바이러스로부터의 그룹 2 인플루엔자 HA 단백질로부터의 것이다. 본 발명의 특정 측면에서, 제2 아미노산 서열은 서열 번호 4-서열 번호 26 및 서열 번호 47-159로 구성된 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 97% 동일한 아미노산 서열을 가지는 그룹 2 인플루엔자 HA 단백질의 줄기 영역으로부터의 것이다. 본 발명의 특정 측면에서, 제2 아미노산 서열은 서열 번호 4-서열 번호 26 및 서열 번호 47-159로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 그룹 2 인플루엔자 HA 단백질의 줄기 영역으로부터의 것이다.
본 발명의 특정 측면에서, 제2 아미노산 서열은 인플루엔자 A(덴마크/35/2005(H3N2))(서열 번호 4)의 아미노산 잔기 330-401에 상응하는 그룹 2 인플루엔자 HA 단백질의 영역으로부터의 적어도 20개의 인접한 아미노산을 포함한다. 본 발명의 특정 측면에서, 제2 아미노산 서열은 서열 번호 30, 서열 번호 31, 서열 번호 32 및 서열 번호 33으로 구성된 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 97% 동일한 서열로부터의 적어도 20개의 인접한 아미노산 잔기를 포함한다. 본 발명의 특정 측면에서, 제2 아미노산 서열은 서열 번호 30, 서열 번호 31, 서열 번호 32 및 서열 번호 33으로 구성된 군으로부터 선택되는 서열로부터의 적어도 20개의 인접한 아미노산 잔기를 포함한다. 본 발명의 특정 측면에서, 제2 아미노산 서열은 서열 번호 30, 서열 번호 31, 및 서열 번호 32로 구성된 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 97% 동일한 서열로부터의 적어도 40개의 인접한 아미노산 잔기를 포함한다. 본 발명의 특정 측면에서, 제2 아미노산 서열은 서열 번호 30, 서열 번호 31, 및 서열 번호 32로 구성된 군으로부터 선택되는 서열로부터의 적어도 40개의 인접한 아미노산 잔기를 포함한다.
본 발명의 특정 측면에서, 제2 아미노산 서열은 서열 번호 31과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 97% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 특정 측면에서, 제2 아미노산 서열은 서열 번호 31을 포함한다.
본 발명의 특정 측면에서, 제2 아미노산 서열은 HA 단백질의 헤드 영역 서열의 카복실 말단 단부의 하류쪽으로 바로 옆에 위치하는, 그룹 2 인플루엔자 HA 단백질의 아미노산 서열로부터의 적어도 60, 또는 적어도 72개의 인접한 아미노산을 포함한다. 본 발명의 특정 측면에서, 제2 아미노산 서열은 인플루엔자 A(덴마크/35/2005(H3N2)) HA 단백질(서열 번호 4)의 아미노산 잔기 330-401에 상응하는, 그룹 2 인플루엔자 HA 단백질의 아미노산 서열로부터의 적어도 60, 또는 적어도 72개의 인접한 아미노산을 포함한다.
제1 및 제2 아미노산 서열은 링커 서열에 의해 연결된다. 본 발명의 특정 측면에서, 링커 서열은 길이가 10개 미만의 아미노산, 7개 미만의 아미노산, 또는 5개 미만의 아미노산 길이이다. 본 발명의 특정 측면에서, 링커 서열은 글리신 및 세린을 포함한다. 본 발명의 특정 측면에서, 링커 서열은 제1 아미노산 서열의 카복실 말단 단부를 제2 아미노산 서열의 아미노 말단 단부에 연결시킨다. 본 발명의 특정 측면에서, 링커 서열은 제2 아미노산 서열의 카복실 말단 단부를 제1 아미노산 서열의 아미노 말단 단부에 연결시킨다. 본 발명의 특정 측면에서, 링커 서열은 서열 번호 34 또는 서열 번호 35로 구성된 펩티드와 화학적 및 공간적 특성이 유사하다. 본 발명의 특정 측면에서, 링커는 서열 번호 34 또는 서열 번호 35, 또는 그의 보존적 변이체를 포함한다. 한 실시양태에서, 링커는 서열 번호 34 또는 서열 번호 35를 포함한다. 본 발명의 특정 측면에서, 링커는 서열 번호 34 또는 서열 번호 35로 구성된다.
본 발명의 특정 측면에서, 제3 아미노산 서열은 그룹 2 인플루엔자 HA 단백질로부터의 것이다. 본 발명의 특정 측면에서, 제3 아미노산 서열은 인플루엔자 H3 바이러스 HA 단백질, 인플루엔자 H4 바이러스 HA 단백질, H7 인플루엔자 바이러스 HA 단백질, H10 인플루엔자 바이러스 HA 단백질 HA 단백질, H14 인플루엔자 바이러스 HA 단백질, 및 H15 인플루엔자 바이러스 HA 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 바이러스로부터의 그룹 2 인플루엔자 HA 단백질로부터의 것이다. 본 발명의 특정 측면에서, 제3 아미노산 서열은 표 2에 열거된 그룹 2 바이러스로부터의 그룹 2 인플루엔자 HA 단백질로부터의 것이다. 본 발명의 특정 측면에서, 제3 아미노산 서열은 서열 번호 4-서열 번호 26 및 서열 번호 47-159로 구성된 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 97% 동일한 아미노산 서열을 가지는 그룹 2 인플루엔자 HA 단백질의 줄기 영역으로부터의 것이다. 본 발명의 특정 측면에서, 제3 아미노산 서열은 서열 번호 4-서열 번호 26, 및 서열 번호 47-159로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 그룹 2 인플루엔자 HA 단백질의 줄기 영역으로부터의 것이다.
본 발명의 특정 측면에서, 제3 아미노산 서열은 인플루엔자 A(덴마크/35/2005(H3N2)) HA 단백질(서열 번호 4)의 아미노산 잔기 438-519에 상응하는 그룹 2 인플루엔자 HA 단백질의 영역으로부터의 적어도 20개의 인접한 아미노산을 포함한다. 본 발명의 특정 측면에서, 제2 아미노산 서열은 서열 번호 44, 서열 번호 45 및 서열 번호 46으로 구성된 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 97% 동일한 서열로부터의 적어도 20개의 인접한 아미노산 잔기를 포함한다. 본 발명의 특정 측면에서, 제3 아미노산 서열은 서열 번호 44, 서열 번호 45 및 서열 번호 46으로 구성된 군으로부터 선택되는 서열로부터의 적어도 20개의 인접한 아미노산 잔기를 포함한다. 본 발명의 특정 측면에서, 제3 아미노산 서열은 서열 번호 44, 서열 번호 45 및 서열 번호 46으로 구성된 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 97% 동일한 서열로부터의 적어도 40개의 인접한 아미노산 잔기를 포함한다. 본 발명의 특정 측면에서, 제3 아미노산 서열은 서열 번호 44, 서열 번호 45, 및 서열 번호 46으로 구성된 군으로부터 선택되는 서열로부터의 적어도 40개의 인접한 아미노산 잔기를 포함한다.
본 발명의 특정 측면에서, 제3 아미노산 서열은 서열 번호 44, 서열 번호 45 및 서열 번호 46으로 구성된 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 85%, 적어도 90% 적어도 95% 또는 적어도 97% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 특정 측면에서, 제3 아미노산 서열은 서열 번호 44, 서열 번호 45, 및 서열 번호 46으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 특정 측면에서, 제3 아미노산 서열은 그룹 2 인플루엔자 A(덴마크/35/2005(H3N2)) HA 단백질의 나선간 영역 서열의 카복실 말단 단부의 하류쪽으로 바로 옆에 위치하는, 그룹 2 인플루엔자 HA 단백질의 아미노산 서열로부터의 적어도 60, 또는 적어도 75개의 인접한 아미노산을 포함한다. 본 발명의 특정 측면에서, 제2 아미노산 서열은 인플루엔자 A(덴마크/35/2005(H3N2)) HA 단백질(서열 번호 4)의 아미노산 잔기 438-519에 상응하는, 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질의 아미노산 영역으로부터의 적어도 60, 또는 적어도 75개의 인접한 아미노산을 포함한다.
단백질 구성체가 원하는 입체구조를 형성할 수 있는 한, 링커 펩티드는 임의의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 특정 측면에서, 링커 펩티드는 길이가 10개 미만의 아미노산, 7개 미만의 아미노산, 또는 5개 미만의 아미노산 길이이다. 본 발명의 특정 측면에서, 링커 펩티드는 길이가 4개의 아미노산 길이이다. 본 발명의 특정 측면에서, 링커 서열은 글리신, 세린, 프롤린 및 아스파르트산 으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산을 포함한다. 본 발명의 특정 측면에서, 링커 펩티드는 서열 번호 39를 포함한다. 본 발명의 특정 측면에서, 링커 펩티드는 서열 번호 39로 구성된다.
논의된 바와 같이, 본 발명의 단백질 구성체 중의 다양한 위치에 대해 이루어진 돌연변이가 단백질 구성체 및/또는 상기 구성체를 포함하는 나노입자의 3차원 구조를 안정화시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 특정 측면에서, 제1 아미노산 서열은 G39, T46, 및 T58로 구성된 군으로부터 선택되는 서열 번호 4 중의 위치에 상응하는 아미노산 위치에 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 본 발명의 특정 측면에서, 제1 아미노산 서열은 G39C, T46C, 및 N54H, T58L로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다(인플루엔자 A(덴마크/35/2005)(H3N2)) HA 단백질의 서열에 기반한 넘버링).
본 발명의 특정 측면에서, 제2 아미노산 서열은 L331, N338, Q392, K396, L397 및 L400로 구성된 군으로부터 선택되는 서열 번호 4 중의 위치에 상응하는 아미노산 위치에 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 본 발명의 특정 측면에서, 제1 아미노산 서열은 L331K, N338C, Q392C, 및 L400V로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다(인플루엔자 A(덴마크/35/2005)(H3N2)) HA 단백질의 서열에 기반한 넘버링).
본 발명의 특정 측면에서, 제3 아미노산 서열은 S438, N440, E448, T452, 및 N461로 구성된 군으로부터 선택되는 서열 번호 4 중의 위치에 상응하는 아미노산 위치에 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 본 발명의 특정 측면에서, 제1 아미노산 서열은 S438C, N440L, E448L, T452V, 및 N461R 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다(인플루엔자 A(덴마크/35/2005)(H3N2)) HA 단백질의 서열에 기반한 넘버링).
상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 단백질 구성체는 단백질 구성체가 나노입자를 형성할 수 있도록 단량체 서브유닛 단백질의 적어도 일부에 연결될 수 있다. 본 발명의 특정 측면에서, 단량체 서브유닛 단백질의 적어도 일부는 제3 아미노산 서열에 연결된다. 바람직한 실시양태에서, 단량체 서브유닛 단백질의 적어도 일부는 제3 아미노산 서열의 카복실 단부에 연결된다. 본 발명의 특정 측면에서, 일부분은 단량체 서브유닛으로부터의 적어도 50, 적어도 100 또는 적어도 150개의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 특정 측면에서, 단량체 서브유닛은 페리틴이다. 본 발명의 특정 측면에서, 단량체 서브유닛은 루마진 신타제이다. 본 발명의 특정 측면에서, 일부분은 서열 번호 1, 서열 번호 2 또는 서열 번호 3으로부터의 적어도 50, 적어도 100 또는 적어도 150개의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 특정 측면에서, 단량체 서브유닛은 서열 번호 1, 서열 번호 2 또는 서열 번호 3과 적어도 85% 동일한, 적어도 90% 동일한 또는 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 본 발명의 특정 측면에서, 단량체 서브유닛은 서열 번호 1, 서열 번호 2 및 서열 번호 3으로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다.
본원에 개시된 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질에 대하여 이루어진 변형이 별개의 실시양태로서 기술되었지만, 상기의 모든 변형이 단일 단백질 구성체에 함유될 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 예를 들어, 제1 아미노산 서열이 링커에 의해 제2 아미노산 서열에 연결되고, 여기서, 제2 아미노산 서열은 그룹 2 인플루엔자 HA 단백질의 헤드 영역의 카복실 말단 단부 하류의 영역으로부터의 아미노산 서열을 포함하지만, 여기서, 그룹 2 인플루엔자 A(덴마크/35/2005)(H3N2)) HA 단백질의 아미노산 402-437에 상응하는 나선간 영역은 링커 펩티드에 의해 대체되고, 여기서, 폴딩된 단백질 중의 상기 아미노산 잔기들 사이의 상호작용의 강도를 증가시키기 위해 그룹 2 인플루엔자 A(덴마크/35/2005)(H3N2)) HA 단백질의 L331, N338, K396, L397, L400, S438, N440, E448, T452, 및 N461로 구성된 군으로부터 선택되는 위치에 상응하는 위치에서 제2 아미노산 서열 내로 하나 이상의 돌연변이가 도입된 단백질 구성체가 제조될 수 있다.
지금까지 기술된 단백질 구성체는 하나 이상의 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 일으킬 수 있는 나노입자를 제조하는 데 사용될 수 있지만, 일부 실시양태에서, 본 발명의 단백질의 아미노산 서열 내로의 추가의 돌연변이를 조작하는 것이 유용할 수 있다. 예를 들어, 단백질의 유익한 특성(예컨대, 가용성, 반감기, 면역 감시로부터의 단백질 일부분의 차폐)을 제공하기 위해, 단량체 서브유닛 단백질, 삼량체화 도메인, 또는 링커 서열 중의 부위, 예컨대, 효소 인식 부위 또는 글리코실화 부위를 변경시키는 것이 유용할 것이다. 이와 관련하여, 페리틴의 단량체 서브유닛은 천연적으로 글리코실화되지 않은 것으로 공지되어 있다. 그러나, 포유동물 또는 효모 세포에서 분비된 단백질로서 발현된다면, 이는 글리코실화된 것일 수 있다. 따라서, 본 발명의 특정 측면에서, 단량체 페리틴 서브유닛으로부터의 아미노산 서열 중 잠재적 N 연결된 글리코실화 부위는, 돌연변이화된 페리틴 서브유닛 서열이 돌연변이화된 부위에서 더 이상 글리코실화되지 않도록 돌연변이화된다. 돌연변이화된 단량체 페리틴 서브유닛의 상기와 같은 한 서열은 서열 번호 2에 의해 제시된다. 유용한 돌연변이에 관한 추가 설명은 국제 출원 번호 PCT/US2015/032695에 개시되어 있다.
일부 경우에서, 단백질 구성체 중의 특정 아미노산 서열에 대한 면역 반응 발생을 차단시키는 것이 바람직할 수 있다. 이는 차단되는 부위에 도달할 수 있는 면역계의 능력을 글리칸이 입체적으로 방해하도록 차단하고자 하는 부위 가까운 위치에 글리코실화 부위를 부가함으로써 수행될 수 있다. 따라서, 본 발명의 특정 측면에서, 단백질 구성체의 서열은 하나 이상의 글리코실화 부위를 포함하도록 변경된 것이다. 상기 부위의 예로는 Asn-X-Ser, Asn-X-Thr 및 Asn-X-Cys를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 경우에서, 글리코실화 부위는 링커 서열 내로 도입될 수 있다. 글리코실화 부위가 도입되는 부위로서 유용한 부위의 추가 예로는 그룹 2 인플루엔자 HA 단백질에서 인플루엔자 A 뉴칼레도니아/20/1999(H1)의 HA 단백질의 아미노산 45-47, 또는 아미노산 370-372에 상응하는 위치를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 글리코실화 부위를 도입하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다.
본 발명의 단백질 및 단백질 구성체는 본 발명의 핵산 분자에 의해 코딩된다. 추가로, 이는 본 발명의 핵산 구성체에 의해 발현된다. 본원에서 사용되는 바, 핵산 구성체는 재조합 발현 벡터, 즉, 핵산 구성체가 예를 들어, 피험체 또는 기관, 조직 또는 세포에 투여될 때, 핵산 분자가 단백질의 발현에 영향을 미칠 수 있도록 단백질을 코딩하는 핵산 분자에 연결된 벡터이다. 벡터는 또한 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 유기체, 조직, 또는 세포 배양물과 같은 환경 내 세포로의 핵산 분자의 수송을 가능하게 한다. 본 개시내용의 핵산 구성체는 인간 개입에 의해 제조된다. 핵산 구성체는 DNA, RNA 또는 그의 변이체일 수 있다. 벡터는 DNA 플라스미드, 바이러스 벡터, 또는 다른 벡터일 수 있다. 본 발명의 특정 측면에서, 벡터는 사이토메갈로바이러스(CMV), 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 헤르페스 바이러스, 백시니아 바이러스, 폴리오바이러스, 신드비스 바이러스, 또는 임의의 다른 DNA 또는 RNA 바이러스 벡터일 수 있다. 본 발명의 특정 측면에서, 벡터는 슈도타입형 렌티바이러스 또는 레트로바이러스 벡터일 수 있다. 본 발명의 특정 측면에서, 벡터는 DNA 플라스미드일 수 있다. 본 발명의 특정 측면에서, 벡터는 핵산 분자 전달 및 발현을 가능하게 하는 바이러스 구성요소 및 플라스미드 구성요소를 포함하는 DNA 플라스미드일 수 있다. 본 개시내용의 핵산 구성체를 구성하는 방법은 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, Sambrook et al. 2001 Cold Spring Harbor Laboratory Press, and Current Protocols in Molecular Biology], [Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1994]를 참조한다. 본 발명의 특정 측면에서, 벡터는 DNA 플라스미드, 예컨대, CMV/R 플라스미드 예컨대, CMV/R 또는 CMV/R 8KB(이는 또한 본원에서 CMV/R 8kb로 지칭된다)이다. CMV/R 및 CMV/R 8 kb의 예가 본원에서 제공된다. CMV/R은 또한 2006년 8월 22일 간행된 US 7,094,598 B2에도 기술되어 있다.
본원에서 사용되는 바, 핵산 분자는 본 발명의 단백질 구성체를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 핵산 분자는 재조합에 의해, 합성에 의해, 또는 재조합 및 합성 방법의 조합에 의해 제조될 수 있다. 본 개시내용의 핵산 분자는 야생형 핵산 서열, 또는 예를 들어, 인간 번역 시스템에 의해 더욱 잘 인식되는 코돈을 포함시키기 위해 코돈 변형된 핵산 서열을 가질 수 있다. 본 발명의 특정 측면에서, 핵산 분자는 상이한 아미노산을 코딩하는 코돈을 도입하거나, 또는 제거하기 위해, 예컨대, N 연결된 글리코실화 부위를 코딩하는 코돈을 도입하기 위해 유전적으로 조작될 수 있다. 특히 일단 핵산 서열이 공지되고 나면, 본 개시내용의 핵산 분자를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 핵산 구성체는 한 핵산 분자, 또는 1개 초과의 핵산 분자를 포함할 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 핵산 분자는 한 단백질, 또는 1개 초과의 단백질을 코딩할 수 있다는 것 또한 이해하여야 한다.
본 발명의 특정 측면에서, 본 발명의 핵산 분자는 본 발명의 단백질 구성체를 코딩한다. 본 발명의 특정 측면에서, 핵산 분자는 표 2에 열거된 단백질 구성체와 적어도 80% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 99% 동일한 단백질을 코딩한다. 본 발명의 특정 측면에서, 핵산 분자는 서열 번호 47-159로 구성된 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 80% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코딩한다.
본 발명의 단백질 구성체를 제조하기 위한 발현 시스템 또한 본 발명에 포함된다. 본 발명의 특정 측면에서, 본 발명의 핵산 분자는 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 본원에서 사용되는 바, 작동가능하게 연결된이라는 것은 연결된 프로모터가 활성화되었을 때, 연결된 핵산 분자에 의해 코딩되는 단백질이 발현될 수 있다는 것을 의미한다. 본 발명을 실시하는 데 유용한 프로모터는 당업자에게 공지되어 있다. 본 발명의 한 실시양태는 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 재조합 세포이다. 본 발명의 한 실시양태는 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 재조합 바이러스이다.
상기 명시된 바와 같이, 본 발명의 단백질 구성체의 재조합적 제조는 본 분야에 현재 공지되어 있는 임의의 적합한 종래의 재조합 기술을 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자의 제조는 E. 콜라이(E. coli)에서 적합한 단량체 서브유닛 단백질, 예컨대, 헬리코박터 파일로리(helicobacter pylori) 페리틴 단량체 서브유닛을 코딩하는 핵산 분자를 사용하고, 상기 핵산 분자를 본원에 개시된 적합한 인플루엔자 단백질을 코딩하는 핵산 분자에 융합시킴으로써 수행될 수 있다. 이어서, 구성체를 단백질 발현 세포 내로 형질전환시키고, 적합한 크기로 성장시키고, 유도시켜 융합 단백질을 제조할 수 있다.
기술된 바와 같이, 본 발명의 단백질 구성체가 단량체 서브유닛 단백질을 포함하기 때문에, 상기 단백질 구성체는 자기 조립이 가능하다. 본 발명에 따라, 상기 자기 조립으로부터 생성되는 초거대분자는 HA 발현 단량체 서브유닛 기반 나노입자로 지칭된다. 쉽게 논의할 수 있도록 하기 위해, HA 발현 단량체 서브유닛 기반 나노입자는 한 나노입자(np) 또는 그 나노입자(np)로 간단하게 지칭될 것이다. 본 발명의 나노입자는 그의 제조 기점이 되는 단량체 단백질의 나노입자와 유사한 구조적 특징을 가진다. 예를 들어, 페리틴과 관련하여, 페리틴 기반 나노입자는 24개의 서브유닛을 함유하고, 432 대칭을 갖는다. 본 발명의 나노입자의 경우, 서브유닛은 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질에 연결된 단량체 서브유닛(예컨대, 페리틴, 루마진 신타제 등)를 포함하는 단백질 구성체이다. 상기 나노입자는 그 표면 상에 HA 삼량체로서 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질의 적어도 일부를 나타낸다. 상기 구성에서, HA 삼량체는 면역계에 접근가능하고, 이로써, 면역 반응을 유도할 수 있다. 따라서, 본 발명의 한 실시양태는 본원에 개시 또는 기술된 임의의 단백질 구성체를 포함하는 나노입자이다. 본 발명의 한 실시양태는 본 발명의 단백질 구성체를 포함하는 나노입자로서, 여기서, 단백질 구성체는 단량체 서브유닛 단백질에 연결된 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질의 줄기 영역으로부터의 아미노산을 포함하는 것인 나노입자이다. 본 발명의 특정 측면에서, 나노입자는 그 표면 상에 HA 삼량체로서 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질을 나타낸다. 본 발명의 특정 측면에서, 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질은 인플루엔자 바이러스에 대한 방어 항체를 유도할 수 있다.
본 발명의 한 실시양태는 본 발명의 단백질 구성체를 포함하는 나노입자이다. 본 발명의 특정 측면에서, 단백질 구성체는, 그룹 2 인플루엔자 HA 단백질의 헤드 영역은 인플루엔자 HA 단백질의 헤드 영역으로부터의 5개 미만의 인접한 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열로 대체된 것인 그룹 2 인플루엔자 HA 단백질을 포함한다. 본 발명의 특정 측면에서, 단백질 구성체의 HA 단백질은 또한 나선 A의 길이를 연장시킴으로써 변경된 것이다. 본 발명의 특정 측면에서, 단백질 구성체의 HA 단백질은 또한 나선간 영역을 단축시킴으로써, 또는 나선간 영역을 링커 서열로 대체함으로써 변경된 것이다. 본 발명의 특정 측면에서, 단백질 구성체의 HA 단백질은 또한 삼량체 구조를 안정화시키기 위해 특이적 위치를 돌연변이화시킴으로써 변경된 것이다. 적합한 위치의 예로는 L331, N338, K396, L397, L400, S438, N440, E448, T452, N461, G39, T46, N54 및 T58로 구성된 군으로부터 선택되는 서열 번호 4 중의 위치에 상응하는 위치를 포함하나, 이에 제한되지 않고, 여기서, 단백질 구성체는 나노입자를 형성할 수 있다. HA 단백질 헤드 영역을 대체하는 방법, 나선 A를 연장시키는 방법, 나선간 영역을 단축시키거나, 또는 그를 대체하는 방법, 및 적합한 부위 특이적 돌연변이 방법은 본원에 개시되어 있다. 본 발명의 특정 측면에서, 나노입자는, 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질의 줄기 영역으로부터의 제1 아미노산 서열, 및 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질의 줄기 영역으로부터의 제2 아미노산 서열을 포함하고, 제1 및 제2 아미노산 서열은 링커 서열에 의해 공유 결합되어 있고,
여기서, 제1 아미노산 서열은 헤드 영역 서열의 아미노 말단 단부 상류의 아미노산 서열로부터의 적어도 20개의 인접한 아미노산 잔기를 포함하고;
여기서, 제2 아미노산 서열은 헤드 영역 서열의 카복실 말단 단부 하류의 아미노산 서열로부터의 적어도 20개의 인접한 아미노산 잔기를 포함하고;
여기서, 제1 또는 제2 아미노산 서열은, 단백질 구성체가 나노입자를 형성할 수 있도록 단량체 서브유닛 도메인의 적어도 일부에 연결된 것인 단백질 구성체를 포함한다.
본 발명의 특정 측면에서, 제1 아미노산 서열은 인플루엔자 H3 바이러스 HA 단백질, 인플루엔자 H4 바이러스 HA 단백질, H7 인플루엔자 바이러스 HA 단백질, H10 인플루엔자 바이러스 HA 단백질 HA 단백질, H14 인플루엔자 바이러스 HA 단백질, 및 H15 인플루엔자 바이러스 HA 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 바이러스로부터의 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질의 줄기 영역으로부터의 것이다. 본 발명의 특정 측면에서, 제1 아미노산 서열은 표 2에 열거된 그룹 2 바이러스로부터의 HA 단백질의 줄기 영역으로부터의 것이다. 본 발명의 특정 측면에서, 제1 아미노산 서열은 서열 번호 4-서열 번호 26 및 서열 번호 47-서열 번호 159로 구성된 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 97% 동일한 아미노산 서열을 가지는 그룹 2 인플루엔자 HA 단백질의 줄기 영역으로부터의 것이다. 본 발명의 특정 측면에서, 제1 아미노산 서열은 서열 번호 4-서열 번호 26 및 서열 번호 47-서열 번호 159로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 그룹 2 인플루엔자 HA 단백질의 줄기 영역으로부터의 것이다.
본 발명의 특정 측면에서, 제2 아미노산 서열은 인플루엔자 H3 바이러스, 인플루엔자 H4 바이러스, H7 인플루엔자 바이러스, H10 인플루엔자 바이러스, H14 인플루엔자 바이러스, 및 H15 인플루엔자 바이러스 구성된 군으로부터 선택되는 바이러스로부터의 그룹 2 인플루엔자 HA 단백질의 줄기 영역으로부터의 것이다. 본 발명의 특정 측면에서, 제2 아미노산 서열은 표 2에 열거된 그룹 2 바이러스로부터의 HA 단백질의 줄기 영역으로부터의 것이다. 본 발명의 특정 측면에서, 제2 아미노산 서열은 서열 번호 4-서열 번호 26 및 서열 번호 47-서열 번호 159로 구성된 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 97% 동일한 아미노산 서열을 가지는 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질의 줄기 영역으로부터의 것이다. 본 발명의 특정 측면에서, 제2 아미노산 서열은 서열 번호 4-서열 번호 26 및 서열 번호 47-서열 번호 159로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질의 줄기 영역으로부터의 것이다.
상기 언급된 바와 같이, 제1 아미노산 서열은 헤드 영역 서열의 아미노 말단 단부 상류의 아미노산 서열로부터의 적어도 20개의 인접한 아미노산 잔기를 포함한다. 본 발명에 따라, 상류라는 용어는 헤드 영역의 제1 아미노산 잔기의 아미노 말단 단부에 연결된 아미노산 서열 전체를 지칭한다. 바람직한 상류 서열은 헤드 영역 서열에 바로 인접해 있는 것이다. 본 발명의 특정 측면에서, 헤드 영역의 아미노 말단 단부는 인플루엔자 A(덴마크/35/2005(H3N2)) HA 단백질(서열 번호 4)의 HA 단백질의 Q60에 상응하는 아미노산 잔기에 위치한다. 본 발명의 특정 측면에서, 제1 아미노산 서열은 서열 번호 4에 의해 제시되는 인플루엔자 A(덴마크/35/2005(H3N2))의 HA 단백질의 아미노산 잔기 1-59에 상응하는 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질의 영역으로부터의 적어도 20개의 인접한 아미노산 잔기를 포함한다. 본 발명의 특정 측면에서, 제1 아미노산 서열은 서열 번호 27, 서열 번호 28 및 서열 번호 29로 구성된 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 97% 동일한 서열로부터의 적어도 20개의 인접한 아미노산 잔기를 포함한다. 본 발명의 특정 측면에서, 제1 아미노산 서열은 서열 번호 27, 서열 번호 28 및 서열 번호 29로 구성된 군으로부터 선택되는 서열로부터의 적어도 20개의 인접한 아미노산 잔기를 포함한다.
본 발명의 특정 측면에서, 제1 아미노산 서열은 인플루엔자 A(덴마크/35/2005(H3N2)) HA 단백질(서열 번호 4)의 아미노산 잔기 1-59에 상응하는 HA 단백질의 아미노산 영역으로부터의 적어도 40개의 인접한 아미노산 잔기를 포함한다. 본 발명의 특정 측면에서, 제1 아미노산 서열은 서열 번호 27 또는 서열 번호 28과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 97% 동일한 서열로부터의 적어도 40개의 인접한 아미노산 잔기를 포함한다. 본 발명의 특정 측면에서, 제1 아미노산 서열은 서열 번호 27 또는 서열 번호 28로부터의 적어도 40개의 인접한 아미노산 잔기를 포함한다.
본 발명의 특정 측면에서, 제1 아미노산 서열은 서열 번호 27과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 97% 동일한 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 제1 아미노산 서열은 서열 번호 27을 포함한다.
상기 언급된 바와 같이, 제2 아미노산 서열은 헤드 영역 서열의 카복실 말단 단부 하류의 아미노산 서열로부터의 적어도 20개의 인접한 아미노산 잔기를 포함한다. 본 발명에 따라, 하류라는 용어는 헤드 영역의 카복실 말단 아미노산 잔기에 연결된 아미노산 서열 전체를 지칭한다. 바람직한 상류 서열은 헤드 영역 서열에 바로 인접해 있는 것이다. 본 발명의 특정 측면에서, 헤드 영역의 카복실 말단 단부는 서열 번호 4에 의해 제시되는 인플루엔자 A(덴마크/35/2005(H3N2)) HA 단백질의 HA 단백질의 T329에 상응하는 아미노산 위치에 위치한다. 따라서, 본 발명의 특정 측면에서, 제2 아미노산 서열은 인플루엔자 A(덴마크/35/2005)(H3N2) HA 단백질의 아미노산 잔기 330-519에 상응하는 그룹 2 인플루엔자 HA 단백질의 영역으로부터의 적어도 20개의 인접한 아미노산을 포함한다. 본 발명의 특정 측면에서, 제2 아미노산 서열은 인플루엔자 A(덴마크/35/2005(H3N2))(서열 번호 4)의 아미노산 잔기 330-519를 포함하는 그룹 2 인플루엔자 HA 단백질의 영역으로부터의 적어도 20개의 인접한 아미노산을 포함한다. 본 발명의 특정 측면에서, 제2 아미노산 서열은 서열 번호 30, 서열 번호 31, 서열 번호 32 및 서열 번호 33으로 구성된 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 97% 동일한 서열로부터의 적어도 20개의 인접한 아미노산 잔기를 포함한다. 본 발명의 특정 측면에서, 제2 아미노산 서열은 서열 번호 30, 서열 번호 31, 서열 번호 32 및 서열 번호 33으로 구성된 군으로부터 선택되는 서열로부터의 적어도 20개의 인접한 아미노산 잔기를 포함한다.
본 발명의 특정 측면에서, 제2 아미노산 서열은 인플루엔자 A(덴마크/35/2005)(H3N2) HA 단백질의 아미노산 잔기 330-519에 상응하는 그룹 2 인플루엔자 HA 단백질의 영역으로부터의 적어도 40개의 인접한 아미노산을 포함한다. 본 발명의 특정 측면에서, 제2 아미노산 서열은 인플루엔자 A(덴마크/35/2005(H3N2))(서열 번호 4)의 아미노산 잔기 330-519를 포함하는 그룹 2 인플루엔자 HA 단백질의 영역으로부터의 적어도 40개의 인접한 아미노산을 포함한다. 본 발명의 특정 측면에서, 제2 아미노산 서열은 서열 번호 30, 서열 번호 31, 및 서열 번호 32로 구성된 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 97% 동일한 서열로부터의 적어도 40개의 인접한 아미노산 잔기를 포함한다. 본 발명의 특정 측면에서, 제2 아미노산 서열은 서열 번호 30, 서열 번호 31, 및 서열 번호 32로 구성된 군으로부터 선택되는 서열로부터의 적어도 20개의 인접한 아미노산 잔기를 포함한다.
본 발명의 특정 측면에서, 제2 아미노산 서열은 서열 번호 37과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 97% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 특정 측면에서, 제2 아미노산 서열은 서열 번호 37을 포함한다.
본 발명의 특정 측면에서, 제2 아미노산 서열은 인플루엔자 A(덴마크/35/2005)(H3N2) HA 단백질의 아미노산 잔기 330-519에 상응하는 그룹 2 인플루엔자 HA 단백질의 영역으로부터의 적어도 60, 적어도 72, 적어도 75, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 175, 또는 적어도 190개의 인접한 아미노산을 포함한다. 본 발명의 특정 측면에서, 제2 아미노산 서열은 인플루엔자 A(덴마크/35/2005(H3N2))(서열 번호 4)의 아미노산 잔기 330-519를 포함하는 그룹 2 인플루엔자 HA 단백질의 영역으로부터의 적어도 60, 적어도 72, 적어도 75, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 175, 또는 적어도 190개의 인접한 아미노산을 포함한다. 본 발명의 특정 측면에서, 제2 아미노산 서열은 서열 번호 30과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 97% 동일한 서열로부터의 적어도 40, 적어도 60, 적어도 72, 적어도 75, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 175, 또는 적어도 190개의 인접한 아미노산 잔기를 포함한다. 본 발명의 특정 측면에서, 제2 아미노산 서열은 서열 번호 30으로부터의 적어도 40, 적어도 60, 적어도 72, 적어도 75, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 175, 또는 적어도 190개의 인접한 아미노산 잔기를 포함한다.
본 발명의 특정 측면에서, 나노입자는 표 2에 열거된 단백질 구성체 서열과 적어도 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 97% 또는 적어도 약 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단백질 구성체를 포함하고, 여기서, 나노입자는 항인플루엔자 항체에 선택적으로 결합할 수 있다. 본 발명의 특정 측면에서, 나노입자는 서열 번호 47-159로 구성된 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 97% 또는 적어도 약 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단백질 구성체를 포함하고, 여기서, 나노입자는 항인플루엔자 항체에 선택적으로 결합할 수 있다. 본 발명의 특정 측면에서, 나노입자는 서열 번호 47-159로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질 구성체를 포함한다.
본 발명의 나노입자는 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 유도하는 데 사용될 수 있다. 한 유형의 면역 반응은 B 세포 반응으로, 이는 면역 반응을 유도한 항원에 대한 항체를 생산한다. 따라서, 본 발명의 특정 측면에서, 나노입자는 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스 및 인플루엔자 C 바이러스로 구성된 군으로부터 선택되는 바이러스로부터의 인플루엔자 A HA 단백질의 줄기 영역에 결합하는 항체를 유도한다. 본 발명의 한 실시양태는 H1 인플루엔자 바이러스 HA 단백질, H2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질, 인플루엔자 H3 바이러스 HA 단백질, 인플루엔자 H4 바이러스 HA 단백질, 인플루엔자 H5 바이러스 HA 단백질, 인플루엔자 H6 바이러스 HA 단백질, H7 인플루엔자 바이러스 HA 단백질, H8 인플루엔자 바이러스 HA 단백질, H9 인플루엔자 바이러스 HA 단백질, H10 인플루엔자 바이러스 HA 단백질 HA 단백질, H11 인플루엔자 바이러스 HA 단백질, H12 인플루엔자 바이러스 HA 단백질, H13 인플루엔자 바이러스 HA 단백질, H14 인플루엔자 바이러스 HA 단백질, H15 인플루엔자 바이러스 HA 단백질, H16 인플루엔자 바이러스 HA 단백질, H17 인플루엔자 바이러스 HA 단백질, 및 H18 인플루엔자 바이러스 HA 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 인플루엔자 HA 단백질의 줄기 영역에 결합하는 항체를 유도하는 나노입자이다. 본 발명의 한 실시양태는 표 2에 열거된 바이러스로부터의 인플루엔자 HA 단백질의 줄기 영역에 결합하는 항체를 유도하는 나노입자이다.
면역 반응을 유도하고, 그 결과로 항체를 생산하게 된 항원에 모든 항체가 결합할 수 있지만, 바람직한 항체는 인플루엔자 바이러스에 대하여 광범위한 이종아형 방어를 제공하는 것이다. 따라서, 본 발명의 한 실시양태는 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스 및 인플루엔자 C 바이러스로 구성된 군으로부터 선택되는 바이러스로부터의 인플루엔자 HA 단백질의 줄기 영역에 결합하는 방어 항체를 유도하는 나노입자이다. 본 발명의 한 실시양태는 H1 인플루엔자 바이러스 HA 단백질, H2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질, 인플루엔자 H3 바이러스 HA 단백질, 인플루엔자 H4 바이러스 HA 단백질, 인플루엔자 H5 바이러스 HA 단백질, 인플루엔자 H6 바이러스 HA 단백질, H7 인플루엔자 바이러스 HA 단백질, H8 인플루엔자 바이러스 HA 단백질, H9 인플루엔자 바이러스 HA 단백질, H10 인플루엔자 바이러스 HA 단백질 HA 단백질, H11 인플루엔자 바이러스 HA 단백질, H12 인플루엔자 바이러스 HA 단백질, H13 인플루엔자 바이러스 HA 단백질, H14 인플루엔자 바이러스 HA 단백질, H15 인플루엔자 바이러스 HA 단백질, H16 인플루엔자 바이러스 HA 단백질, H17 인플루엔자 바이러스 HA 단백질, 및 H18 인플루엔자 바이러스 HA 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 인플루엔자 HA 단백질의 줄기 영역에 결합하는 방어 항체를 유도하는 나노입자이다. 본 발명의 한 실시양태는 표 2에 열거된 바이러스로부터의 인플루엔자 HA 단백질의 줄기 영역에 결합하는 항체를 유도하는 나노입자이다. 본 발명의 한 실시양태는 서열 번호 4-26으로 구성된 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 결합하는 항체를 유도하는 나노입자이다. 본 발명의 한 실시양태는 서열 번호 4-26으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 결합하는 항체를 유도하는 나노입자이다.
본 발명의 단백질에 의해 유도된 방어 항체는 바이러스의 생활 주기에서의 임의 단계에 영향을 미침으로써 바이러스 감염으로부터 방어할 수 있다. 예를 들어, 방어 항체는 인플루엔자 바이러스가 세포에 부착하는 것, 세포에 진입하는 것, 세포질 내로의 바이러스 리보핵단백질의 방출, 감염된 세포에서의 새로운 바이러스 입자의 형성 및 감염된 숙주 세포막으로부터의 새로운 바이러스 입자의 발아를 하지 못하게 막을 수 있다. 본 발명의 특정 측면에서, 본 발명의 단백질에 의해 유도된 방어 항체는 인플루엔자 바이러스가 숙주 세포에 진입하지 못하게 막는다. 본 발명의 특정 측면에서, 본 발명의 단백질에 의해 유도된 방어 항체는 바이러스 막이 엔도솜 막과 융합되지 못하게 막는다. 본 발명의 특정 측면에서, 본 발명의 단백질에 의해 유도된 방어 항체는 리보핵단백질이 숙주 세포의 세포질 내로 방출되지 못하게 막는다. 본 발명의 특정 측면에서, 본 발명의 단백질에 의해 유도된 방어 항체는 새로운 바이러스가 감염된 숙주 세포에서 어셈블리하지 못하게 막는다. 본 발명의 특정 측면에서, 본 발명의 단백질에 의해 유도된 방어 항체는 새로 형성된 바이러스가 감염된 숙주 세포로부터 방출되지 못하게 막는다.
인플루엔자 바이러스의 줄기 영역의 아미노산 서열은 고도로 보존적이기 때문에, 본 발명의 나노입자에 의해 유도된 방어 항체는 광범위한 방어성을 띨 수 있다. 즉, 본 발명의 나노입자에 의해 유도된 방어 항체는 1개 초과의 타입, 아형, 및/또는 균주의 인플루엔자 바이러스로부터 방어할 수 있다. 따라서, 본 발명의 한 실시양태는 인플루엔자 HA 단백질의 줄기 영역에 결합하는 광범위하게 방어하는 방어 항체를 유도하는 나노입자이다. 한 실시양태는 인플루엔자 타입 A 바이러스, 인플루엔자 타입 B 바이러스 및 인플루엔자 타입 C 바이러스로 구성된 군으로부터 선택되는 1개 초과의 인플루엔자 바이러스 타입으로부터의 HA 단백질의 줄기 영역에 결합하는 항체를 유도하는 나노입자이다. 한 실시양태는 H1 인플루엔자 바이러스, H2 인플루엔자 바이러스, 인플루엔자 H3 바이러스, 인플루엔자 H4 바이러스, 인플루엔자 H5 바이러스, 인플루엔자 H6 바이러스, H7 인플루엔자 바이러스, H8 인플루엔자 바이러스, H9 인플루엔자 바이러스, H10 인플루엔자 바이러스, H11 인플루엔자 바이러스, H12 인플루엔자 바이러스, H13 인플루엔자 바이러스, H14 인플루엔자 바이러스, H15 인플루엔자 바이러스, H16 인플루엔자 바이러스, H17 인플루엔자 바이러스, 및 H18 인플루엔자 바이러스로 구성된 군으로부터 선택되는 1개 초과의 인플루엔자 바이러스 아형으로부터의 HA 단백질의 줄기 영역에 결합하는 항체를 유도하는 나노입자이다. 한 실시양태는 1개 초과의 인플루엔자 바이러스 균주로부터의 HA 단백질의 줄기 영역에 결합하는 항체를 유도하는 나노입자이다. 본 발명의 한 실시양태는 서열 번호 4-서열 번호 26으로 구성된 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 1개 초과의 단백질에 결합하는 항체를 유도하는 나노입자이다. 본 발명의 한 실시양태는 서열 번호 4-26으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 1개 초과의 단백질에 결합하는 항체를 유도하는 나노입자이다.
상기 언급된 바와 같이, HA 서열은 단량체 서브유닛 단백질의 일부분에 연결된다. 본원에서 사용되는 바, 단량체 서브유닛 단백질이란, 단량체 서브유닛 단백질이 나노입자로 자기 조립하도록 다른 단량체 서브유닛 단백질에 결합할 수 있는 한 단백질 단량체를 지칭한다. 단백질 구성체가 그 표면 상에 HA 단백질을 나타내는 다량체 구조를 형성할 수 있는 한, 본 발명의 단백질 구성체를 제조하는 데 임의의 단량체 서브유닛 단백질이 사용될 수 있다. 본 발명의 특정 측면에서, 단량체 서브유닛은 페리틴이다.
페리틴은 주로 광물화된 코어로 또는 코어로부터 수화된 철 이온 및 양성자의 수송을 통해 다핵 Fe(III)2O3 형성 속도 및 위치를 제어하는 작용을 하는, 모든 동물, 박테리아 및 식물에서 발견되는 구상 단백질이다. 구상 형태의 페리틴은, 분자량이 대략 17-20 kDa인 폴리펩티드인 단량체 서브유닛 단백질(이는 또한 단량체 페리틴 서브유닛으로도 지칭된다)로 구성된다. 상기의 한 단량체 페리틴 서브유닛의 서열의 예가 서열 번호 1에 의해 제시된다. 각각의 단량체 페리틴 서브유닛은, 다섯 번째로 더 짧은 나선(c 말단 나선)이 4개의 나선 다발로 이루어진 장축에 거의 수직으로 놓여 있는, 4개의 역평행 나선 모티프를 포함하는 나선 다발의 토폴로지를 가진다. 관습에 따라, 나선은 N 말단으로부터 각각 A, B, C, 및 D & E로 표지된다. N 말단 서열은 3 폴드 축에서 나노입자에 인접해 있고, 표면으로 연장되는 반면, E 나선은 4 폴드 축에서 입자 코어로 연장하는 C 말단과 함께 패킹된다. 상기 패킹의 결과로 나노입자 표면에 2개의 포어가 생성된다. 이들 포어 중 하나 또는 그 둘 모두, 수화된 철이 나노입자 안팎으로 확산되는 지점을 나타낸다는 것이 예상된다. 생성 후, 이들 단량체 페리틴 서브유닛 단백질은 구상 페리틴 단백질로 자기 조립된다. 따라서, 구상 형태의 페리틴은 24개의 단량체, 페리틴 서브유닛 단백질을 포함하고, 432 대칭을 갖는 캡시드 유사 구조를 갖는다.
본 발명에 따라, 본 발명의 단량체 페리틴 서브유닛은 단량체 페리틴 서브유닛의 구상 형태의 단백질로의 자기 조립을 유도할 수 있는 페리틴 단백질의 전장의, 단일 폴리펩티드, 또는 그의 임의의 일부이다. 상기 단백질의 예로는 서열 번호 1 및 서열 번호 2를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 단량체 페리틴 서브유닛이, 그 표면 상에 HA를 나타내는 나노입자로 자기 조립을 할 수 있는 한, 임의의 공지된 페리틴 단백질의 단량체 페리틴 서브유닛으로부터의 아미노산 서열이 본 발명의 단백질 구성체를 제조하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 특정 측면에서, 단량체 서브유닛은 박테리아 페리틴 단백질, 식물 페리틴 단백질, 조류 페리틴 단백질, 곤충 페리틴 단백질, 진균 페리틴 단백질 및 포유동물 페리틴 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 페리틴 단백질로부터의 것이다. 본 발명의 특정 측면에서, 페리틴 단백질은 헬리코박터 파일로리로부터의 것이다.
본 발명의 단백질 구성체는 페리틴 단백질의 단량체 서브유닛 폴리펩티드의 전장의 서열을 포함할 필요는 없다. 단량체 페리틴 서브유닛 단백질의 일부분이 단량체 페리틴 서브유닛의 구상 형태의 단백질로의 자기 조립을 유도하는 아미노산 서열을 포함하는 한, 상기 일부분, 또는 영역이 사용될 수 있다. 상기 영역 중 한 예는 헬리코박터 파일로리 페리틴 단백질의 아미노산 5 내지 167 사이에 위치한다. 더욱 구체적인 영역은 문헌 [Zhang, Y. Self-Assembly in the Ferritin Nano-Cage Protein Super Family. 2011, Int. J. Mol. Sci., 12, 5406-5421](상기 문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에 기술되어 있다.
본 발명의 특정 측면에서, 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질은 페리틴으로부터의 적어도 50, 적어도 100 또는 적어도 150개의 아미노산에 연결되고, 여기서, 단백질 구성체는 나노입자를 형성할 수 있다. 본 발명의 특정 측면에서, 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질은 서열 번호 1 또는 서열 번호 2로부터의 적어도 50, 적어도 100 적어도 50, 적어도 100 또는 적어도 150개의 아미노산에 연결되고, 여기서, 단백질 구성체는 나노입자를 형성할 수 있다. 본 발명의 특정 측면에서, 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질은 페리틴의 서열과 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 연결되고, 여기서, 단백질 구성체는 나노입자를 형성할 수 있다. 본 발명의 특정 측면에서, 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질은 서열 번호 1 또는 서열 번호 2와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 연결되고, 여기서, 단백질 구성체는 나노입자를 형성할 수 있다.
본 발명의 특정 측면에서, 단량체 서브유닛은 루마진 신타제이다. 본 발명의 특정 측면에서, 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질은 루마진 신타제로부터의 적어도 50, 적어도 100 또는 적어도 150개의 아미노산에 연결되고, 여기서, 단백질 구성체는 나노입자를 형성할 수 있다. 따라서, 본 발명의 특정 측면에서, 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질은 루마진 신타제와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 동일한 단백질에 연결되고, 여기서, 단백질 구성체는 나노입자를 형성할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 본 발명의 나노입자란, 본 발명의 단백질 구성체(융합 단백질)의 자기 조립에 의해 형성된 3차원 입자를 지칭한다. 본 발명의 나노입자는 비록 다른 형상이 배제되는 것은 아니지만, 형상은 일반적으로 회전타원체형이고, 직경은 일반적으로 약 20 nm 내지 약 100 nm이다. 본 발명의 나노입자는 그의 형성 기점이 되는 단백질 구성체 이외의 다른 분자, 예컨대, 단백질, 지질, 탄수화물 등을 포함할 수 있지만, 그러할 필요는 없다.
본 발명의 나노입자는 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 유도할 수 있기 때문에, 이는 인플루엔자 바이러스에 의한 감염으로부터 개체를 방어하는 백신으로서 유용하다. 따라서, 본 발명의 한 실시양태는 본 발명의 나노입자를 포함하는 백신이다. 본 발명의 백신은 또한 다른 구성요소, 예컨대, 애주번트, 완충제 등을 함유할 수 있다. 비록 임의의 애주번트가 사용될 수는 있지만, 바람직한 실시양태는 화학적 애주번트, 예컨대, 인산알루미늄, 벤즈알코늄 클로라이드, 우베니멕스, 및 QS21; 유전적 애주번트, 예컨대, IL-2 유전자 또는 그의 단편, 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF: granulocyte macrophage colony-stimulating factor) 유전자 또는 그의 단편, IL-18 유전자 또는 그의 단편, 케모카인(C-C 모티프) 리간드 21(CCL21) 유전자 또는 그의 단편, IL-6 유전자 또는 그의 단편, CpG, LPS, TLR 작용제, 및 다른 면역 자극 유전자; 단백질 애주번트, 예컨대, IL-2 또는 그의 단편, 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF) 또는 그의 단편, IL-18 또는 그의 단편, 케모카인(C-C 모티프) 리간드 21 (CCL21) 또는 그의 단편, IL-6 또는 그의 단편, CpG, LPS, TLR 작용제 및 다른 면역 자극 사이토카인 또는 그의 단편; 지질 애주번트, 예컨대, 양이온성 리포솜, N3(양이온성 지질), 모노포스포릴 지질 A(MPL1); 콜레라 독소, 장독소, Fms 유사 티로신 키나제-3 리간드(Flt-3L), 부피바카인, 마카인, 및 레바미솔을 포함하는 다른 애주번트를 함유할 수 있다.
본 발명의 한 실시양태는 1개 초과의 인플루엔자 HA 단백질을 포함하는 나노입자 백신이다. 상기 백신은 단일 나노입자 상에, 또는 적어도 2개는 고유 인플루엔자 HA 단백질을 가지는 것인 나노입자의 혼합물로서, 상이한 인플루엔자 HA 단백질의 조합을 포함할 수 있다. 다가 백신은 원하는 범위의 바이러스 균주로부터 방어하는 데 필요한 면역 반응을 일으키는 데 필요한 만큼 다수의 인플루엔자 HA 단백질을 포함할 수 있다. 본 발명의 특정 측면에서, 백신은 적어도 2개의 상이한 인플루엔자 균주로부터의 HA 단백질을 포함한다(2가). 본 발명의 특정 측면에서, 백신은 적어도 3개의 상이한 인플루엔자 균주로부터의 HA 단백질을 포함한다(3가). 본 발명의 특정 측면에서, 백신은 적어도 4개의 상이한 인플루엔자 균주로부터의 HA 단백질을 포함한다(4가). 본 발명의 특정 측면에서, 백신은 적어도 5개의 상이한 인플루엔자 균주로부터의 HA 단백질을 포함한다(5가). 본 발명의 특정 측면에서, 백신은 적어도 6개의 상이한 인플루엔자 균주로부터의 HA 단백질을 포함한다(6가). 다양한 실시양태에서, 백신은 각각의 7, 8, 9, 또는 10개의 상이한 인플루엔자 균주로부터의 HA 단백질을 포함한다. 상기 조합의 예로는 인플루엔자 그룹 1 HA 단백질, 인플루엔자 그룹 2 HA 단백질, 및 인플루엔자 B HA 단백질을 포함하는 나노입자 백신이 있다. 본 발명의 특정 측면에서, 인플루엔자 HA 단백질은 H1 HA, H3 HA, 및 B HA이다. 다가 백신의 또 다른 예로는 4개의 상이한 인플루엔자 바이러스로부터의 HA 단백질을 포함하는 나노입자 백신이 있다. 본 발명의 특정 측면에서, 다가 백신은 표 2에 연결된 하나 이상의 HA 단백질과 적어도 80% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 97% 동일한 또는 적어도 99% 동일한 하나 이상의 HA 단백질을 포함한다. 본 발명의 특정 측면에서, 다가 백신은 표 2에 연결된 하나 이상의 HA 단백질을 포함한다.
본 발명의 한 실시양태는 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응이 개체에서 일어나도록 개체에게 나노입자를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서, 나노입자는 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질에 연결된 단량체 서브유닛 단백질을 포함하고, 여기서, 나노입자는 그 표면 상에 인플루엔자 HA를 나타내는 것인, 인플루엔자 바이러스에 대해 개체를 백신접종하기 위한 방법이다. 본 발명의 특정 측면에서, 나노입자는 1가 나노입자이다. 본 발명의 특정 측면에서, 나노입자는 다가 나노입자이다. 본 발명의 또 다른 실시양태는
a) 단량체 서브유닛을 포함하는 나노입자를 수득하는 단계로서, 여기서, 단량체 서브유닛은 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질에 연결되어 있고, 여기서, 나노입자는 표면 상에 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질를 나타내는 것인 단계; 및
b) 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응이 일어나도록 개체에게 나노입자를 투여하는 단계를 포함하는, 인플루엔자 바이러스 감염에 대해 개체를 백신접종하기 위한 방법이다.
본 발명의 한 실시양태는 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응이 개체에서 일어나도록 개체에게 실시양태의 백신을 투여하는 단계를 포함하고, 여기서, 백신은 인플루엔자 HA 단백질에 연결된 단량체 서브유닛을 포함하는 적어도 하나의 나노입자를 포함하고, 여기서, 나노입자는 표면 상에 인플루엔자 HA를 나타내는 것인, 인플루엔자 바이러스에 대해 개체를 백신접종하기 위한 방법이다. 본 발명의 특정 측면에서, 백신은 1가 백신이다. 본 발명의 특정 측면에서, 백신은 다가 백신이다. 본 발명의 한 실시양태는
a) 본 발명의 단백질 구성체를 포함하는 적어도 하나의 나노입자를 포함하는 백신을 수득하는 단계로서, 여기서, 단백질 구성체는 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질에 연결된 단량체 서브유닛 단백질을 포함하고, 여기서, 나노입자는 그의 표면 상에 인플루엔자 HA를 나타내는 것인 단계; 및
b) 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응이 일어나도록 개체에게 백신을 투여하는 단계를 포함하는, 인플루엔자 바이러스 감염에 대해 개체를 백신접종하기 위한 방법이다.
본 발명의 특정 측면에서, 나노입자는 1가 나노입자이다. 본 발명의 특정 측면에서, 나노입자는 다가 나노입자이다.
본 발명의 특정 측면에서, 나노입자는 팔면체 대칭을 가진다. 본 발명의 특정 측면에서, 인플루엔자 HA 단백질은 인플루엔자 바이러스에 대한 항체를 유도할 수 있다. 본 발명의 특정 측면에서, 인플루엔자 HA 단백질은 인플루엔자 바이러스에 대하여 광범위하게 작용하는 항체를 유도할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 유도된 항체는 방어 항체이다. 바람직한 실시양태에서, 유도된 항체는 광범위한 이종아형 방어 항체이다.
본 발명의 백신은 프라이밍/부스팅 프로토콜을 사용하여 개체를 백신접종하는 데 사용될 수 있다. 상기 프로토콜은 미국 특허 공개 번호 20110177122(상기 특허는 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에 기술되어 있다. 상기 프로토콜에서, 제1 백신 조성물이은 개체에게 투여될 수 있고(프라이밍), 이어서, 일정 기간 후에 제2 백신 조성물이 개체에 투여될 수 있다(부스팅). 부스팅 조성물의 투여는 일반적으로 프라이밍 조성물의 투여 후 몇 주 또는 몇 개월, 바람직하게는, 약 2-3주 또는 4주, 또는 8주, 또는 16주, 또는 20주, 또는 24주, 또는 28주, 또는 32주 경과 후에 이루어진다. 본 발명의 특정 측면에서, 부스팅 조성물은 프라이밍 조성물의 투여 후 약 1주, 또는 2주, 또는 3주, 또는 4주, 또는 5주, 또는 6주, 또는 7주, 또는 8주, 또는 9주, 또는 16주, 또는 20주, 또는 24주, 또는 28주, 또는 32주 경과 후에 투여하기 위한 것으로 제제화된다.
제1 및 제2 백신 조성물은 동일한 조성물일 수 있지만, 그러할 필요는 없다. 따라서, 본 발명의 본 발명의 특정 측면에서, 백신을 투여하는 단계는 제1 백신 조성물을 투여하는 단계, 및 이어서, 추후에 제2 백신 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 특정 측면에서, 제1 백신 조성물은 본 발명의 나노입자를 포함한다. 본 발명의 특정 측면에서, 제1 백신 조성물은 본 발명의 나노입자를 포함한다.
본 발명의 특정 측면에서, 백신접종받는 개체는 인플루엔자 바이러스에 노출된 개체이다. 본원에서 사용되는 바, 노출된, 노출이라는 용어 등은 피험체가 인플루엔자 바이러스로 감염된 것으로 공지된 한 개인 또는 동물과 접촉하였다는 것을 나타낸다. 본 발명의 백신은 당업자에게 널리 공지된 기술을 사용하여 투여될 수 있다. 제제화 및 투여 기술은 예를 들어, 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Sciences", 18th ed., 1990, Mack Publishing Co., Easton, PA]에서 살펴볼 수 있다. 백신은 전통적 주사기, 바늘 없는 주사 장치, 또는 미세투사물 충격 유전자 총을 포함하나, 이에 제한되지 않는 수단에 의해 투여될 수 있다. 적합한 투여 경로로는 단지 몇 개만 예로 들면, 비경구 전달, 예컨대, 근육내, 진피내, 피하, 수질내 주사 뿐만 아니라, 척추강내, 직접적인 심실내, 정맥내, 복강내, 비내, 또는 안구내 주사를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 주사를 위해, 본 발명의 한 실시양태의 화합물은 수용액, 바람직하게는 생리적으로 양립가능한 완충제, 예컨대 행크스 용액, 링거액, 또는 생리적 염수 완충제에서 제제화될 수 있다.
본 발명의 특정 측면에서, 본 발명의 백신, 또는 나노입자는 이종성 인플루엔자 바이러스에 의한 감염으로부터 개체를 방어하는 데 사용될 수 있다. 즉, 한 인플루엔자 바이러스 균주로부터의 HA 단백질을 사용하여 제조된 백신은 상이한 인플루엔자 균주에 의한 감염으로부터 개체를 방어할 수 있다. 예를 들어, 인플루엔자 A/덴마크/35/2005)(H3N2)로부터의 HA 단백질을 사용하여 제조된 백신은 표 2에 열거된 인플루엔자 바이러스에 의한 감염으로부터 개체를 방어하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 특정 측면에서, 본 발명의 백신, 또는 나노입자는 항원적으로 분기성을 띠는 인플루엔자 바이러스에 의한 감염으로부터 개체를 방어하는 데 사용될 수 있다. 항원적으로 분기성이라는 것은 시간이 경과함에 따라 돌연변이화하여, 면역계에 제시되는 아미노산을 변이시키는 인플루엔자 바이러스 균주의 성향을 지칭한다. 시간 경과에 따른 상기 돌연변이는 또한 항원 변이로도 지칭된다. 따라서, 예를 들어, 인플루엔자 바이러스의 인플루엔자 A/덴마크/35/2005)(H3N2) 균주로부터의 HA 단백질을 사용하여 제조된 백신은 조기의 항원적으로 분기성을 띠는, 인플루엔자의 덴마크 균주에 의한, 및 미래의 진화하는 (또는 분기하는) 인플루엔자 균주에 의한 감염으로부터 개체를 방어할 수 있다.
본 발명의 나노입자는 무손상 HA와 항원적으로 유사한 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질을 나타내기 때문에, 이는 인플루엔자 바이러스에 대한 항체(항인플루엔자 항체)를 검출하는 검정법에서 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 한 실시양태는 본 발명의 나노입자를 사용하여 항인플루엔자 바이러스 항체를 검출하는 방법이다. 본 발명의 검출 방법은 일반적으로
a. 항인플루엔자 항체의 존재에 대하여 검사되는 샘플 중 일부를 본 발명의 나노입자와 접촉시키는 단계; 및
b. 나노입자/항체 복합체의 존재를 검출하는 단계로서,
여기서, 나노입자/항체 복합체의 존재가 샘플이 항인플루엔자 항체를 함유한다는 것을 나타내는 것인 단계에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 본 발명의 특정 측면에서, 샘플은 항인플루엔자 바이러스 항체의 존재에 대해 검사하고자 하는 개체로부터 수득되거나, 또는 수집된다. 개체는 항인플루엔자 항체를 가지고 있거나, 또는 인플루엔자 바이러스에 노출된 것으로 의심을 받거나, 또는 그렇지 않은 개체일 수 있다. 샘플은 항인플루엔자 바이러스 항체의 존재에 대해 검사하는 데 사용될 수 있는 개체로부터 수득된 임의의 시료이다. 바람직한 샘플은 항인플루엔자 바이러스 항체의 존재를 검출하는 데 사용될 수 있는 체액이다. 본 방법을 실시하는 데 사용될 수 있는 체액의 예로는 혈액, 혈장, 혈청, 누액 및 타액을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 당업자는 개시된 방법을 실시하는 데 적절한 샘플을 쉽게 확인할 수 있다.
혈액, 또는 혈액 유래 체액, 예컨대, 혈장, 혈청 등이 샘플로서 특히 적합하다. 상기 샘플은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 개체로부터 수집 및 제조될 수 있다. 샘플은 검정 이전에 냉장 또는 냉동될 수 있다.
나노입자가 항인플루엔자 바이러스 항체에 결합하는 바, 개시된 방법을 실시하는 데 본 발명의 임의의 나노입자가 사용될 수 있다. 유용한 나노입자, 및 그의 제조 방법은 본원에 상세하게 기술되어 있다. 바람직한 실시양태에서, 나노입자는, 나노입자가 표면 상에 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질 에피토프의 삼량체를 포함하도록 그룹 2 인플루엔자 바이러스 HA 단백질로부터의 적어도 하나의 에피토프에 연결된 (그에 융합된) 단량체 서브유닛 단백질로부터의 적어도 25, 적어도 50, 적어도 75, 적어도 100, 또는 적어도 150개의 인접한 아미노산을 포함하고, 여기서, 단백질 구성체는 나노입자로 자기 조립할 수 있는 것인 단백질 구성체를 포함한다.
본원에서 사용되는 바, 접촉시키는 단계라는 용어는 예를 들어, 항인플루엔자 항체의 존재에 대해 검사되는 샘플 및 본 발명의 나노입자를 조합하거나, 혼합하여, 나노입자가 샘플 중에 항체가 존재한다면, 그에 물리적으로 접촉할 수 있도록 하는, 상기 샘플을 본 발명의 나노입자로 도입하는 것을 지칭한다. 항인플루엔자 바이러스 항체가 샘플 중에 존재할 경우, 이때 항체/나노입자 복합체가 형성된다. 상기 복합체 형성은 검출될 수 있는 안정한 복합체를 형성하기 위해 나노입자 중의 단백질 구성체의 HA 부분에 선택적으로 결합할 수 있는 항인플루엔자 바이러스 항체의 능력을 나타낸다. 샘플 중 항인플루엔자 바이러스 항체의 나노입자에의 결합은 복합체 형성에 적합한 조건하에서 달성된다. 상기 조건 (예컨대, 적절한 농도, 완충제, 온도, 반응 시간) 뿐만 아니라, 상기 조건을 최적화시키는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 결합은 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Labs Press, 1989)] 및 [Harlow et al., Antibodies, a Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Labs Press, 1988)](상기 두 문헌 모두 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에 기술되어 있는 것과 같은, 응집 검정법, 침전 검정법, 효소 면역검정법(예컨대, ELISA), 면역침전 검정법, 면역블롯 검정법 및 다른 면역검정법을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 당업계에서 표준이 되는 다양한 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 상기 참고문헌은 또한 복합체 형성 조건의 예도 제공한다.
본원에서 사용되는 바, HA에 선택적으로 결합한다, HA에 선택적으로 결합하는이라는 용어 등은 샘플 또는 검정법에서의 HA와 비관련된 단백질, 또는 비단백질 구성요소에의 결합과 대조적으로, HA 단백질에 우선적으로 결합할 수 있는 항체의 능력을 지칭한다. HA에 선택적으로 결합하는 항체는, HA에는 결합하지만, 샘플 또는 검정법에 존재할 수 있는 다른 분자 또는 구성요소에는 유의적으로 결합하지 않는 것이다. 유의적인 결합은 샘플 중의 항인플루엔자 항체를 검출 및/또는 그의 수준을 측정할 수 있는 검정법의 능력을 방해할 수 있을 정도로 충분히 큰 친화도 또는 결합력으로 결합하는 항HA 항체의 비HA 분자에의 결합인 것으로 간주된다. 샘플 또는 검정법에 존재할 수 있는 다른 분자 및 화합물의 예로는 비HA 단백질, 예컨대, 알부민, 지질 및 탄수화물을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 특정 측면에서, 본원에서 항체/나노입자 복합체로도 지칭되는 항인플루엔자 바이러스 항체/나노입자 복합체는 용액 중에서 형성될 수 있다. 본 발명의 특정 측면에서, 항체/나노입자 복합체는, 나노입자가 기재 상에 고정화된 (예컨대, 그 위에 코팅되어 있는) 상태에서 형성될 수 있다. 고정화 기술은 당업자에게 공지되어 있다. 적합한 기재 물질로는 플라스틱, 유리, 겔, 셀룰로이드, 섬유, 종이, 및 입자성 물질을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 기재 물질의 예로는 라텍스, 폴리스티렌, 나일론, 니트로셀룰로스, 아가로스, 면, PVDF(폴리-비닐리덴-플루오라이드: poly-vinylidene-fluoride), 및 자기 수지를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 기재 물질의 적합한 형상으로는 웰(예컨대, 마이크로타이터 디쉬 웰), 마이크로타이터 플레이트, 딥스틱, 스트립, 비드, 측방 유동 장치, 막, 필터, 튜브, 디쉬, 셀룰로이드형 매트릭스, 자기 입자, 및 다른 미립자를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 특히 바람직한 기재로는 예를 들어, ELISA 플레이트, 딥스틱, 면역도트 스트립, 방사면역검정법 플레이트, 아가로스 비드, 플라스틱 비드, 라텍스 비드, 면사, 플라스틱 칩, 면역블롯 막, 면역블롯 종이 및 유동 통과 막을 포함한다. 본 발명의 특정 측면에서, 기재, 예컨대, 미립자는 검출가능한 마커를 포함할 수 있다. 기재 물질의 예에 관한 설명에 대해서는 예를 들어, 문헌 [Kemeny, D.M. (1991) A Practical Guide to ELISA, Pergamon Press, Elmsford, NY pp 33-44], 및 [Price, C. and Newman, D. eds. Principles and Practice of Immunoassay, 2nd edition (1997) Stockton Press, NY, NY](상기 두 문헌 모두 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)를 참조한다.
본 발명에 따라, 항인플루엔자 바이러스 항체/나노입자 복합체는 일단 형성되고 나면, 검출된다. 검출은 정성적, 정량적, 또는 반정량적 검출일 수 있다. 본원에서 사용되는 바, 복합체 형성을 검출하는 단계, 복합체를 검출하는 단계라는 어구 등은 나노입자와 복합체를 형성한 항인플루엔자 바이러스 항체의 존재를 확인하는 것을 지칭한다. 복합체가 형성되었다면, 형성된 복합체의 양은 정량화될 수 있지만, 그러할 필요는 없다. 추정 항인플루엔자 바이러스 항체와 나노입자 사이의 복합체 형성, 또는 선택적 결합은, 예가 본원에 개시되어 있는, 당업계에서 표준이 되는 다양한 방법을 사용하여 측정(즉, 검출, 측정)될 수 있다(예를 들어, 문헌 [Sambrook et al. 상기 문헌 참조] 참조). 복합체는 하기 검정법들: 혈구응집 억제 검정법, 방사상 확산 검정법, 효소 결합 면역검정법, 경쟁적 효소 결합 면역검정법, 방사면역검정법, 형광 면역검정법, 화학발광성 검정법, 측방 유동 검정법, 유동 통과 검정법, 미립자 기반 검정법(예컨대, 미립자, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 자기 입자 또는 플라스틱 중합체, 예컨대, 라텍스 또는 폴리스티렌 비드를 사용하는 것), 면역침전 검정법, 바이오코어J(BioCoreJ) 검정법(예컨대, 콜로이드 금을 사용하는 것), 면역도트 검정법(예컨대, CMG Immunodot System: 스위스 프리부르 소재), 및 면역블롯 검정법(예컨대, 웨스턴 블롯), 인광 검정법, 유동 통과 검정법, 크로마토그래피 검정법, PAGe 기반 검정법, 표면 플라즈몬 공명 검정법, 분광광도 검정법, 및 전자 감지 검정법 중 하나 이상의 것을 사용하는 것을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 다양한 방법으로 검출될 수 있다. 상기 검정법은 당업자에게 널리 공지되어 있다.
검정법은 그의 사용 방법에 의존하여 사용됨으로써 정성적 또는 정량적 결과를 제공할 수 있다. 일부 검정법, 예컨대, 응집, 미립자 분리, 및 침전 검정법은 검출가능한 마커 필요없이 시각적으로 (예컨대, 육안으로 또는 기계, 예컨대, 밀도계 또는 분광광도계에 의해) 관찰될 수 있다.
다른 검정법에서, 나노입자에의, 또는 나노입자에 선택적으로 결합하는 시약에의 검출가능한 마커의 접합(즉, 부착)은 복합체 형성을 검출하는 데 도움을 준다. 검출가능한 마커는 항인플루엔자 바이러스 항체에 결합할 수 있는 나노입자의 능력을 방해하지 않는 부위에서 나노입자에, 또는 나노입자 결합 시약에 접합될 수 있다. 접합 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 검출가능한 마커의 예로는 방사성 표지, 형광성 표지, 화학발광성 표지, 발색성 표지, 효소 표지, 인광성 표지, 전자 표지; 금속 졸 표지, 유색 비드, 물리적 표지, 또는 리간드를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 리간드란, 또 다른 분자에 선택적으로 결합하는 분자를 지칭한다. 바람직한 검출가능한 마커로는 플루오레세인, 방사성 동위 원소, 포스파타제(예컨대, 알칼리성 포스파타제), 비오틴, 아비딘, 퍼옥시다제(예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다제), 베타-갈락토시다제, 및 비오틴 관련 화합물 또는 아비딘 관련 화합물(예컨대, 스트렙트아비딘 또는 ImmunoPure7 NeutrAvidin)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 특정 측면에서, 항체/나노입자 복합체는 샘플을, 특이적 화합물, 예컨대, 검출가능한 마커에 접합된, 항인플루엔자 항체, 페리틴에, 또는 항체/나노입자 복합체에 결합하는 항체를 접촉시킴으로써 검출될 수 있다. 검출가능한 마커는 특이적 화합물이 검출되는 복합체에 결합할 수 있는 능력을 차단하지 않도록 하는 방식으로 상기 화합물에 접합될 수 있다. 바람직한 검출가능한 마커로는 플루오레세인, 방사성 동위 원소, 포스파타제(예컨대, 알칼리성 포스파타제), 비오틴, 아비딘, 퍼옥시다제(예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다제), 베타-갈락토시다제, 및 비오틴 관련 화합물 또는 아비딘 관련 화합물(예컨대, 스트렙트아비딘 또는 ImmunoPure7 NeutrAvidin)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
또 다른 실시양태에서, 복합체는 복합체를 지표 분자와 접촉시킴으로써 검출된다. 적합한 지표 분자는 항인플루엔자 바이러스 항체/나노입자 복합체, 항인플루엔자 바이러스 항체, 또는 나노입자에 결합할 수 있는 분자를 포함한다. 따라서, 지표 분자는 항인플루엔자 바이러스 항체, 예컨대, 면역글로불린을 인식하는 항체에 결합하는 시약을 포함할 수 있다. 항체인, 바람직한 지표 분자로는 예를 들어, 항인플루엔자 바이러스 항체가 생산된 개체 종으로부터의 항체와 반응성을 띠는 항체를 포함한다. 지표 분자 그 자체가 본 발명의 검출가능한 마커에 부착될 수 있다. 예를 들어, 항체는 비오틴, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제 또는 플루오레세인에 접합될 수 있다.
본 발명은 지표 분자의 존재를 검출할 수 있는 2차 분자 또는 다른 결합 분자의 하나 이상의 층 및/또는 타입을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 지표 분자에 선택적으로 결합하는 태그가 부착되지 않은(즉, 검출가능한 마커에 접합되지 않은) 2차 항체는 2차 항체에 선택적으로 결합하는 태그부착된 (즉, 검출가능한 마커에 접합된) 3차 항체에 결합될 수 있다. 적합한 2차 항체, 3차 항체 및 다른 2차 또는 3차 분자는 당업자에 의해 쉽게 선택될 수 있다. 바람직한 3차 분자 또한 2차 분자의 특징에 기초하여 당업자에 의해 선택될 수 있다. 후속 층에 대해 동일한 전략법이 적용될 수 있다.
바람직하게는, 지표 분자는 검출가능한 마커에 접합된다. 필요할 경우, 발색 시약이 첨가되고, 기재는 분석을 위해 검출 장치에 제출된다. 일부 프로토콜에서, 과량의 시약을 제거하기 위해 1회의 또는 2회의 복합체 형성 단계 모두, 그 이후에 세척 단계가 추가된다. 상기 단계가 사용될 경우, 이는 과량의 시약은 제거되지만, 복합체는 유지되도록 하는, 당업자에게 공지된 조건을 포함한다.
본 발명의 검정법은 혈액 샘플을 비롯한, 샘플 중 항인플루엔자 바이러스 항체를 검출할 수 있기 때문에, 상기 검정법은 항인플루엔자 항체를 가지는 개체를 확인하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 한 실시양태는
a. 항인플루엔자 항체에 대해 검사되는 개체로부터의 샘플을 본 발명의 나노입자와 접촉시키는 단계; 및
b. 접촉된 샘플을 나노입자/항체 복합체의 존재에 대해 분석하는 단계로서,
여기서, 나노입자/항체 복합체의 존재는 개체가 항인플루엔자 항체를 가진다는 것을 나타내는 것인 단계를 포함하는, 항인플루엔자 바이러스 항체를 가지는 개체를 확인하는 방법이다.
개시된 방법을 수행하는 데 개시된 검정 포맷 중 임의의 것이 사용될 수 있다. 유용한 검정 포맷의 예로는 방사상 확산 검정법, 효소 결합 면역검정법, 경쟁적 효소 결합 면역검정법, 방사면역검정법, 형광 면역검정법, 화학발광성 검정법, 측방 유동 검정법, 유동 통과 검정법, 미립자 기반 검정법(예컨대, 미립자, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 자기 입자 또는 플라스틱 중합체, 예컨대, 라텍스 또는 폴리스티렌 비드를 사용하는 것), 면역침전 검정법, 바이오코어J 검정법(예컨대, 콜로이드 금을 사용하는 것), 면역도트 검정법(예컨대, CMG Immunodot System: 스위스 프리부르 소재), 및 면역블롯 검정법(예컨대, 웨스턴 블롯), 인광 검정법, 유동 통과 검정법, 크로마토그래피 검정법, PAGe 기반 검정법, 표면 플라즈몬 공명 검정법, 생체층 간섭법 검정법, 분광광도 검정법, 및 전자 감지 검정법을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
샘플 중에서 어떤 항인플루엔자 항체도 검출되지 않는다면, 상기 결과는 개체가 항인플루엔자 바이러스 항체를 가지지 않는다는 것을 나타내는 것이다. 검사되는 개체는 인플루엔자 바이러스에 대한 항체를 가지는 것으로 의심되거나, 또는 의심되지 않는 개체일 수 있다. 개시된 방법은 또한 개체가 하나 이상의 특정 타입, 그룹, 서브그룹 또는 균주의 인플루엔자 바이러스에 노출되었는지 여부를 측정하는 데에도 사용될 수 있다. 측정을 위해, 샘플을 (예컨대, 약 1년 초과, 약 2년 초과, 약 3년 초과, 약 4년 초과, 약 5년 초과 등의) 지난 과거 어느 시점에 하나 이상의 특정 타입, 그룹, 서브그룹 또는 균주의 인플루엔자 바이러스에 대한 항체에 대하여 음성 반응을 보인 개체로부터 수득한다. 이어서, 본 발명의 나노입자 기반 검정법을 사용하여 하나 이상의 타입, 그룹, 서브그룹 또는 균주의 인플루엔자 바이러스에 대한 항인플루엔자 바이러스 항체의 존재에 대해 검사한다. 검정 결과, 상기 항체가 존재하는 것으로 나타났다면, 이때 개체는 개체가 항인플루엔자 항체에 대하여 음성인 것으로 확인된 검사 이후의 어느 시점에 하나 이상의 타입, 그룹, 서브그룹 또는 균주의 인플루엔자 바이러스에 노출된 것으로 확인된다. 따라서, 본 발명의 한 실시양태는
a. 항인플루엔자 항체에 대해 검사되는 개체로부터의 샘플의 적어도 일부를 본 발명의 나노입자와 접촉시키는 단계;
b. 접촉된 샘플을 항체/나노입자 복합체의 존재 또는 수준에 대하여 분석하는 단계로서, 여기서, 항체/나노입자 복합체의 존재 또는 수준이 최근 항인플루엔자 항체의 존재 또는 수준을 나타내는 것인 단계;
c. 최근 항인플루엔자 항체 수준을 과거 항인플루엔자 항체 수준과 비교하는 단계로서;
여기서, 최근 항인플루엔자 항체 수준이 과거 항인플루엔자 항체 수준에 비하여 증가하였다면, 이는 개체가 과거 항인플루엔자 항체 수준 측정 이후에 인플루엔자 바이러스에 노출된 바 있음을 시사하는 것인 단계를 포함하는, 인플루엔자 바이러스에 노출된 개체를 확인하는 방법이다.
본 발명의 방법은 또한 백신에 대한 개체의 반응을 측정하는 데 유용하다. 따라서, 한 실시양태는
a. 개체에게 인플루엔자 바이러스용 백신을 투여하는 단계;
b. 개체로부터의 샘플의 적어도 일부를 본 발명의 나노입자와 접촉시키는 단계;
c. 접촉된 샘플을 항체/나노입자 복합체의 존재 또는 수준에 대하여 분석하는 단계로서, 여기서, 항체/나노입자 복합체의 존재 또는 수준이 최근 항인플루엔자 항체의 존재 또는 수준을 나타내고,
여기서, 샘플 중의 항체 수준이 개체에서의 백신접종 이전의 항체 수준에 비하여 증가하였다면, 이는 백신이 개체에서 면역 반응을 유도하였다는 것을 나타내는 것인 단계를 포함하는, 인플루엔자 백신에 대한 개체의 반응을 측정하는 방법이다.
나노입자가 투여된 백신에 의해 유도되는 항인플루엔자 항체에 결합할 수 있는 HA 단백질을 포함하는 한, 개체에게 투여되는 인플루엔자 백신은 본 발명의 백신을 포함할 수는 있지만, 그러할 필요는 없다. 인플루엔자 백신을 투여하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다.
개체로부터 수득된 샘플 분석은 개시된 검정 포맷들 중 임의의 것을 사용하여 수행될 수 있다. 본 발명의 특정 측면에서, 샘플 분석은 방사상 확산 검정법, 효소 결합 면역검정법, 경쟁적 효소 결합 면역검정법, 방사면역검정법, 형광 면역검정법, 화학발광성 검정법, 측방 유동 검정법, 유동 통과 검정법, 미립자 기반 검정법(예컨대, 미립자, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 자기 입자 또는 플라스틱 중합체, 예컨대, 라텍스 또는 폴리스티렌 비드를 사용하는 것), 면역침전 검정법, 바이오코어J 검정법(예컨대, 콜로이드 금을 사용하는 것), 면역도트 검정법(예컨대, CMG Immunodot System: 스위스 프리부르 소재), 및 면역블롯 검정법(예컨대, 웨스턴 블롯), 인광 검정법, 유동 통과 검정법, 크로마토그래피 검정법, PAGE 기반 검정법, 표면 플라즈몬 공명 검정법, 생체층 간섭법 검정법, 분광광도 검정법 및 전자 감지 검정법으로 구성된 군으로부터 선택되는 검정 포맷을 사용하여 수행된다.
본 발명의 특정 측면에서, 본 방법은 백신을 투여하기 전 개체에 존재하는 항인플루엔자 항체의 수준을 측정하는 단계를 포함한다. 그러나, 사전 의무 기록 정보가 이용가능하다면, 상기 기록으로부터 개체에 존재하는 항인플루엔자 항체 수준을 측정하는 것도 가능하다.
개시된 방법을 수행하여야 할 필요는 없지만, 백신을 투여하는 단계와 개체에서 항인플루엔자 항체의 수준을 측정하는 단계 사이에 일정 기간을 기다리는 것이 바람직할 수 있다. 본 발명의 특정 측면에서, 개체에 존재하는 항인플루엔자 항체의 수준을 측정하는 단계는 백신 투여 후 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 6일, 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 3주, 적어도 4주, 적어도 2개월, 적어도 3개월 또는 적어도 6개월이 경과한 후에 수행된다.
본 발명은 또한 항인플루엔자 항체를 검출하는 데 적합한 키트를 포함한다. 적합한 검출 수단으로는 본 발명의 나노입자를 사용하는, 본원에 개시된 기술을 포함한다. 키트는 또한 검출가능한 마커, 예컨대, 나노입자에 선택적으로 결합하는 항체, 또는 다른 지표 분자를 포함할 수 있다. 키트는 또한 연관된 구성요소, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 완충제, 라벨, 용기, 인서트, 튜빙, 바이알, 시린지 등을 함유할 수 있다.
실시예
본 실시예는, 본원에 개시된 파라미터 및 방법을 사용하여 디자인된, 5종의 그룹 2 HA 나노입자의 H10 변이체의 특성 및 활성을 특징 규명하는 것이다. 변이체는 모두 인간 A/장시/IPB13/2013(H10N8) 균주에 기반한 것이었다. H10 변이체를 코딩하는 핵산 분자를 Expi293 세포 내로 도입하고, 코딩된 변이체 단백질의 발현에 적합한 조건하에서 세포를 배양하였다. 렉틴 친화성 크로마토그래피, 이어서, 크기 배제 크로마토그래피(SEC: size exclusion chromatography)를 이용하여 세포 배양물 상청액으로부터 발현된 나노입자를 정제하였다. 정제된 나노입자에 대한 크로마토그램은 도 32a-32e에 도시되어 있다.
정제된 나노입자를 음성 염색 전자 현미경검사에 의해 분석하였고, 그 결과, 주기적인 배열로 바깥쪽으로 돌출되어 있는 HA 줄기를 포함하는 개별 나노입자가 형성되어 있는 것으로 나타났다. 각 변이체에 대한 대표적인 전자 현미경 사진은 도 33에 도시되어 있다.
H10ssF 변이체의 항원성을 ELISA 포맷으로 HA 줄기 항체 FI6, CT149 및 CR8020에의 친화도를 측정함으로써 평가하였다. 상기 평가의 결과는 도 34a-34d에 도시되어 있다.
이어서, 나노입자를 마우스에서 다양한 인플루엔자 균주에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 그의 능력에 대해 테스트하였다. BALB/c 마우스(n=10)를 SAS 애주번트를 사용하여 2 ㎍의, 변이체 나노입자들 중 하나로 면역화하였다. 주기적인 간격으로 2회 넘게 면역화를 반복하였다. 마지막 면역화 후 2주 경과하였을 때, 혈청을 수집하고, H3N2 및 H7N9로부터의 HA 단백질을 인식할 수 있는 그의 능력에 대해 (ELISA에 의해) 테스트하였다. 도 35a & 35b에 도시되어 있는 결과를 통해, 혈청은 H3N2 및 H7N9 HA 단백질, 둘 모두에 대하여 교차 반응성을 보였다는 것이 입증된다.
이어서, 면역화된 마우스를 치사 용량의 H3N2(A/필리핀/1982) 또는 H7N9(A/상하이/2/2013 유사)로 챌린지하고, 체중 감소 및 생존에 대해 모니터링하였다. 도 36a-36d 및 도 37a-37g에 도시된 결과를 통해, 변이체 나노입자에 의한 면역화가 유의적인 체중 감소 없이 두 챌린지 균주 모두에 대해 방어하였다는 것이 나타났다. 상기 결과는 H10ssF 면역원이 H3N2 및 H7N9 균주에 대하여 이종아형 방어를 제공할 수 있다는 것을 입증한다.
VH1-18 v-유전자를 사용하는, 인간의, 광범위 중화능 줄기 단일클론 항체(mAb) 16.a.26은 그룹 1 및 그룹 2 인플루엔자 바이러스, 둘 모두를 강력하게 중화시킬 수 있는 것으로 나타났다. 따라서, H3N2, H7N9 및 H10N8 아형을 비롯한, 여러 종의 HA-SS-np 변이체를, 생식세포계열 역전된 버전의 mAb 16.a.26을 발현하는 B 세포를 활성화시킬 수 있는 그의 능력에 대해 평가하였다. 본 검정법에서, B 세포의 활성화는 Ca++ 유입으로 보여진다. 도 40에 도시된 본 평가의 결과는 변이체 나노입자 H3ssF_256, H7ssF_26 및 H10ssF_04가 각각 IgM 양성 대조군에 의해 관찰되는 것과 유사한 정도로 높은 수준의 활성화를 일으켰다는 것을 보여준다. 도 41에 도시된 바와 같이, 3개의 상기 디자인들 모두 동일한 나선 A C 말단 연장부(ELMEQ)를 공유하며, 이는 상기의 특정 모티프가 인플루엔자 HA 단백질에 대한 16.a.26 bNAb 반응을 유도하는 데 유용하다는 것을 시사하는 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Boyington, Jeffrey C. Graham, Barney S. Mascola, John R. Yassine, Hadi M. Corbett, Kizzmekia S. Moin, Syed M. Wang, Lingshu Kanekiyo, Masaru <120> STABILIZED GROUP 2 INFLUENZA HEMAGGLUTININ STEM REGION TRIMERS AND USES THEREOF <130> 6137NIAID-64-PCT <140> not yet assigned <141> 2017-09-01 <150> 62/383,267 <151> 2016-09-02 <160> 159 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 168 <212> PRT <213> Helicobacter pylori <400> 1 Met Leu Ser Asp Ile Ile Lys Leu Leu Asn Glu Gln Val Asn Lys Glu 1 5 10 15 Met Gln Ser Ser Asn Leu Tyr Met Ser Met Ser Ser Trp Cys Tyr Thr 20 25 30 His Ser Leu Asp Gly Ala Gly Leu Phe Leu Phe Asp His Ala Ala Glu 35 40 45 Glu Tyr Glu His Ala Lys Lys Leu Ile Ile Phe Leu Asn Glu Asn Asn 50 55 60 Val Pro Val Gln Leu Thr Ser Ile Ser Ala Pro Glu His Lys Phe Glu 65 70 75 80 Gly Leu Thr Gln Ile Phe Gln Lys Ala Tyr Glu His Glu Gln His Ile 85 90 95 Ser Glu Ser Ile Asn Asn Ile Val Asp His Ala Ile Lys Ser Lys Asp 100 105 110 His Ala Thr Phe Asn Phe Leu Gln Trp Tyr Val Ala Glu Gln His Glu 115 120 125 Glu Glu Val Leu Phe Lys Asp Ile Leu Asp Lys Ile Glu Leu Ile Gly 130 135 140 Asn Glu Asn His 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Gly Ala Ile Ala 65 70 75 80 Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Leu Ile Asp Gly Trp Tyr Gly 85 90 95 Phe Arg His Gln Asn Ala Gln Gly Glu Gly Thr Ala Ala Asp Tyr Lys 100 105 110 Ser Thr Gln Ser Ala Ile Asp Gln Ile Thr Gly Met Val Asn Arg Val 115 120 125 Ile Glu Leu Met Glu Gln Gly Gly Pro Asp Cys Tyr Leu Ala Glu Leu 130 135 140 Leu Val Ala Met Leu Asn Gln His Val Ile Asp Leu Ala Asp Ser Glu 145 150 155 160 Met Asp Lys Leu Tyr Glu Arg Val Lys Arg Gln Leu Arg Glu Asn Ala 165 170 175 Glu Glu Asp Gly Thr Gly Cys Phe Glu Ile Phe His Lys Cys Asp Asp 180 185 190 Asp Cys Met Ala Ser Ile Arg Asn Asn Thr Tyr Asp His Ser Lys Tyr 195 200 205 Arg Glu Glu Ala Met Gln Asn Arg Ile Gln Ile Asp Ala Gly Pro Pro 210 215 220 Pro Gly Gly Met Gln Ile Tyr Glu Gly Lys Leu Thr Ala Glu Gly Leu 225 230 235 240 Arg Phe Gly Ile Val Ala Ser Arg Phe Asn His Ala Leu Val Asp Arg 245 250 255 Leu Val Glu Gly Ala Ile Asp Cys Ile Val Arg His Gly Gly Arg Glu 260 265 270 Glu Asp Ile Thr Leu Val Arg Val Pro Gly Ser Trp Glu Ile Pro Val 275 280 285 Ala Ala Gly Glu Leu Ala Arg Lys Glu Asp Ile Asp Ala Val Ile Ala 290 295 300 Ile Gly Val Leu Ile Arg Gly Ala Thr Pro His Phe Asp Tyr Ile Ala 305 310 315 320 Ser Glu Val Ser Lys Gly Leu Ala Asp Leu Ser Leu Glu Leu Arg Lys 325 330 335 Pro Ile Thr Phe Gly Val Ile Thr Ala Asp Thr Leu Glu Gln Ala Ile 340 345 350 Glu Arg Ala Gly Thr Lys His Gly Asn Lys Gly Trp Glu Ala Ala Leu 355 360 365 Ser Ala Ile Glu Met Ala Asn Leu Phe Lys Ser Leu Arg 370 375 380 <210> 155 <211> 381 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 155 Met Asn Thr Gln Ile Leu Val Phe Ala Leu Ile Ala Ile Ile Pro Thr 1 5 10 15 Asn Ala Asp Lys Ile Cys Leu Gly His His Ala Val Ser Asn Gly Thr 20 25 30 Lys Val Asn Thr Leu Thr Glu Arg Gly Val Glu Val Val Asn Ala Thr 35 40 45 Glu Leu Val Phe Pro Cys Gly Val Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met Lys 50 55 60 Asn Val Pro Glu Ile Pro Lys Gly Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala 65 70 75 80 Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Leu Ile Asp Gly Trp Tyr Gly 85 90 95 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Gly Val Leu Ile Arg Gly Ala Thr Pro His Phe Asp Tyr Ile Ala 305 310 315 320 Ser Glu Val Ser Lys Gly Leu Ala Asp Leu Ser Leu Glu Leu Arg Lys 325 330 335 Pro Ile Thr Phe Gly Val Ile Thr Ala Asp Thr Leu Glu Gln Ala Ile 340 345 350 Glu Arg Ala Gly Thr Lys His Gly Asn Lys Gly Trp Glu Ala Ala Leu 355 360 365 Ser Ala Ile Glu Met Ala Asn Leu Phe Lys Ser Leu Arg 370 375 380 <210> 156 <211> 382 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 156 Met Asn Thr Gln Ile Leu Val Phe Ala Leu Ile Ala Ile Ile Pro Thr 1 5 10 15 Asn Ala Asp Lys Ile Cys Leu Gly His His Ala Val Ser Asn Gly Thr 20 25 30 Lys Val Asn Thr Leu Thr Glu Arg Gly Val Glu Val Val Asn Ala Thr 35 40 45 Glu Leu Val Phe Pro Gly Cys Gly Val Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met 50 55 60 Lys Asn Val Pro Glu Ile Pro Lys Gly Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile 65 70 75 80 Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Leu Ile Asp Gly Trp Tyr 85 90 95 Gly Phe Arg His Gln Asn Ala Gln Gly Glu Gly Thr Ala Ala Asp Tyr 100 105 110 Lys Ser Thr Gln Ser Ala Ile Asp Gln Ile Thr Gly Met Val Asn Arg 115 120 125 Val Ile Glu Leu Met Glu Gln Gly Pro Pro Asp Cys Tyr Leu Ala Glu 130 135 140 Leu Leu Val Ala Met Leu Asn Gln His Val Ile Asp Leu Ala Asp Ser 145 150 155 160 Glu Met Asp Lys Leu Tyr Glu Arg Val Lys Arg Gln Leu Arg Glu Asn 165 170 175 Ala Glu Glu Asp Gly Thr Gly Cys Phe Glu Ile Phe His Lys Cys Asp 180 185 190 Asp Asp Cys Met Ala Ser Ile Arg Asn Asn Thr Tyr Asp His Ser Lys 195 200 205 Tyr Arg Glu Glu Ala Met Gln Asn Arg Ile Gln Ile Asp Ala Gly Pro 210 215 220 Pro Pro Gly Gly Met Gln Ile Tyr Glu Gly Lys Leu Thr Ala Glu Gly 225 230 235 240 Leu Arg Phe Gly Ile Val Ala Ser Arg Phe Asn His Ala Leu Val Asp 245 250 255 Arg Leu Val Glu Gly Ala Ile Asp Cys Ile Val Arg His Gly Gly Arg 260 265 270 Glu Glu Asp Ile Thr Leu Val Arg Val Pro Gly Ser Trp Glu Ile Pro 275 280 285 Val Ala Ala Gly Glu Leu Ala Arg Lys Glu Asp Ile Asp Ala Val Ile 290 295 300 Ala Ile Gly Val Leu Ile Arg Gly Ala Thr Pro His Phe Asp Tyr Ile 305 310 315 320 Ala Ser Glu Val Ser Lys Gly Leu Ala Asp Leu Ser Leu Glu Leu Arg 325 330 335 Lys Pro Ile Thr Phe Gly Val Ile Thr Ala Asp Thr Leu Glu Gln Ala 340 345 350 Ile Glu Arg Ala Gly Thr Lys His Gly Asn Lys Gly Trp Glu Ala Ala 355 360 365 Leu Ser Ala Ile Glu Met Ala Asn Leu Phe Lys Ser Leu Arg 370 375 380 <210> 157 <211> 381 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 157 Met Asn Thr Gln Ile Leu Val Phe Ala Leu Ile Ala Ile Ile Pro Thr 1 5 10 15 Asn Ala Asp Lys Ile Cys Leu Gly His His Ala Val Ser Asn Gly Thr 20 25 30 Lys Val Asn Thr Leu Thr Glu Arg Gly Val Glu Val Val Asn Ala Thr 35 40 45 Glu Leu Val Phe Pro Cys Gly Val Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met Lys 50 55 60 Asn Val Pro Glu Ile Pro Lys Gly Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala 65 70 75 80 Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Leu Ile Asp Gly Trp Tyr Gly 85 90 95 Phe Arg His Gln Asn Ala Gln Gly Glu Gly Thr Ala Ala Asp Tyr Lys 100 105 110 Ser Thr Gln Ser Ala Ile Asp Gln Ile Thr Gly Met Val Asn Arg Val 115 120 125 Ile Glu Leu Met Glu Gln Gly Pro Pro Asp Cys Tyr Leu Ala Glu Leu 130 135 140 Leu Val Ala Met Leu Asn Gln His Val Ile Asp Leu Ala Asp Ser Glu 145 150 155 160 Met Asp Lys Leu Tyr Glu Arg Val Lys Arg Gln Leu Arg Glu Asn Ala 165 170 175 Glu Glu Asp Gly Thr Gly Cys Phe Glu Ile Phe His Lys Cys Asp Asp 180 185 190 Asp Cys Met Ala Ser Ile Arg Asn Asn Thr Tyr Asp His Ser Lys Tyr 195 200 205 Arg Glu Glu Ala Met Gln Asn Arg Ile Gln Ile Asp Ala Gly Pro Pro 210 215 220 Pro Gly Gly Met Gln Ile Tyr Glu Gly Lys Leu Thr Ala Glu Gly Leu 225 230 235 240 Arg Phe Gly Ile Val Ala Ser Arg Phe Asn His Ala Leu Val Asp Arg 245 250 255 Leu Val Glu Gly Ala Ile Asp Cys Ile Val Arg His Gly Gly Arg Glu 260 265 270 Glu Asp Ile Thr Leu Val Arg Val Pro Gly Ser Trp Glu Ile Pro Val 275 280 285 Ala Ala Gly Glu Leu Ala Arg Lys Glu Asp Ile Asp Ala Val Ile Ala 290 295 300 Ile Gly Val Leu Ile Arg Gly Ala Thr Pro His Phe Asp Tyr Ile Ala 305 310 315 320 Ser Glu Val Ser Lys Gly Leu Ala Asp Leu Ser Leu Glu Leu Arg Lys 325 330 335 Pro Ile Thr Phe Gly Val Ile Thr Ala Asp Thr Leu Glu Gln Ala Ile 340 345 350 Glu Arg Ala Gly Thr Lys His Gly Asn Lys Gly Trp Glu Ala Ala Leu 355 360 365 Ser Ala Ile Glu Met Ala Asn Leu Phe Lys Ser Leu Arg 370 375 380 <210> 158 <211> 396 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 158 Met Lys Thr Ile Ile Ala Leu Ser Tyr Ile Phe Cys Leu Ala Leu Ala 1 5 10 15 Gln Asp Leu Pro Gly Asn Asp Asn Ser Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly 20 25 30 His His Ala Val Pro Asn Gly Thr Leu Val Lys Thr Ile Thr Asp Asp 35 40 45 Gln Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Phe Pro Gly Cys Gly 50 55 60 Val Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met Arg Asn Val Pro Glu Lys Gln Thr 65 70 75 80 Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu 85 90 95 Gly Met Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Phe Arg His Gln Asn Ser Glu Gly 100 105 110 Thr Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asp Gln 115 120 125 Ile Asn Gly Met Val Asn Arg Val Ile Glu Leu Met Glu Gln Gly Gly 130 135 140 Pro Asp Cys Tyr Leu Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Leu Asn Gln His 145 150 155 160 Val Ile Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met Arg Lys Leu Phe Glu Lys Thr 165 170 175 Arg Arg Gln Leu Arg Glu Asn Ala Glu Asp Met Gly Asn Gly Cys Phe 180 185 190 Lys Ile Tyr His Lys Cys Asp Asn Ala Cys Ile Glu Ser Ile Arg Asn 195 200 205 Gly Thr Tyr Asp His Asp Val Tyr Arg Asp Glu Ala Leu Asn Asn Arg 210 215 220 Phe Gln Ile Lys Ser Gly Gly Asp Ile Ile Lys Leu Leu Asn Glu Gln 225 230 235 240 Val Asn Lys Glu Met Gln Ser Ser Asn Leu Tyr Met Ser Met Ser Ser 245 250 255 Trp Cys Tyr Thr His Ser Leu Asp Gly Ala Gly Leu Phe Leu Phe Asp 260 265 270 His Ala Ala Glu Glu Tyr Glu His Ala Lys Lys Leu Ile Ile Phe Leu 275 280 285 Asn Glu Asn Asn Val Pro Val Gln Leu Thr Ser Ile Ser Ala Pro Glu 290 295 300 His Lys Phe Glu Gly Leu Thr Gln Ile Phe Gln Lys Ala Tyr Glu His 305 310 315 320 Glu Gln His Ile Ser Glu Ser Ile Asn Asn Ile Val Asp His Ala Ile 325 330 335 Lys Ser Lys Asp His Ala Thr Phe Asn Phe Leu Gln Trp Tyr Val Ala 340 345 350 Glu Gln His Glu Glu Glu Val Leu Phe Lys Asp Ile Leu Asp Lys Ile 355 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Thr Asp Ser Glu Met Arg Lys Leu Phe Glu Lys Thr 165 170 175 Arg Arg Gln Leu Arg Glu Asn Ala Glu Asp Met Gly Asn Gly Cys Phe 180 185 190 Lys Ile Tyr His Lys Cys Asp Asn Ala Cys Ile Glu Ser Ile Arg Asn 195 200 205 Gly Thr Tyr Asp His Asp Val Tyr Arg Asp Glu Ala Leu Asn Asn Arg 210 215 220 Phe Gln Ile Lys Ser Gly Gly Asp Ile Ile Lys Leu Leu Asn Glu Gln 225 230 235 240 Val Asn Lys Glu Met Gln Ser Ser Asn Leu Tyr Met Ser Met Ser Ser 245 250 255 Trp Cys Tyr Thr His Ser Leu Asp Gly Ala Gly Leu Phe Leu Phe Asp 260 265 270 His Ala Ala Glu Glu Tyr Glu His Ala Lys Lys Leu Ile Ile Phe Leu 275 280 285 Asn Glu Asn Asn Val Pro Val Gln Leu Thr Ser Ile Ser Ala Pro Glu 290 295 300 His Lys Phe Glu Gly Leu Thr Gln Ile Phe Gln Lys Ala Tyr Glu His 305 310 315 320 Glu Gln His Ile Ser Glu Ser Ile Asn Asn Ile Val Asp His Ala Ile 325 330 335 Lys Ser Lys Asp His Ala Thr Phe Asn Phe Leu Gln Trp Tyr Val Ala 340 345 350 Glu Gln His Glu Glu Glu Val Leu Phe Lys Asp Ile Leu Asp Lys Ile 355 360 365 Glu Leu Ile Gly Asn Glu Asn His Gly Leu Tyr Leu Ala Asp Gln Tyr 370 375 380 Val Lys Gly Ile Ala Lys Ser Arg Lys Ser Gly Ser 385 390 395

Claims (18)

  1. 그룹 2 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 단백질을 포함하는 재조합 단백질로서, 헤드 영역의 아미노산 서열이 인플루엔자 HA 단백질의 헤드 영역으로부터의 5개 미만의 인접한 아미노산을 포함하는 링커로 대체되어 있고, 상기 단백질을 포유동물에 투여하는 것이, 포유동물에서 그룹 2 인플루엔자 HA 단백질에 대한 면역 반응을 유도하는 것인 재조합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 재조합 단백질이 그룹 2 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 단백질의 줄기 영역으로부터의 제1 아미노산 서열, 및 그룹 2 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 단백질의 줄기 영역으로부터의 제2 아미노산 서열을 포함하고,
    상기 제1 및 제2 아미노산 서열은 링커 서열에 의해 공유 결합되어 있고,
    상기 제1 아미노산 서열은 헤드 영역 서열의 아미노 말단 단부 상류의 아미노산 서열로부터의 적어도 20개의 인접한 아미노산 잔기를 포함하고,
    상기 제2 아미노산 서열은 헤드 영역 서열의 카복실 말단 단부 하류의 아미노산 서열로부터의 적어도 20개의 인접한 아미노산 잔기를 포함하는 것인 재조합 단백질.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 재조합 단백질이 단량체 서브유닛에 연결되어 있는 것인 재조합 단백질.
  4. 제3항에 있어서, 단량체 서브유닛 단백질이 페리틴 또는 루마진 신타제 유래의 것인 재조합 단백질.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 재조합 단백질을 포함하는 나노입자로서, 표면 상에 인플루엔자 HA 단백질의 삼량체를 나타내는 나노입자.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 재조합 단백질과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 포함하는 면역원성 조성물.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 재조합 단백질, 또는 제5항의 나노입자, 및 애주번트를 포함하는 백신 조성물.
  8. 인플루엔자 바이러스 감염의 병리적 효과의 예방 또는 감소를 필요로 하는 인간에게 면역적 유효 용량의 제7항의 백신 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 인간의 인플루엔자 바이러스 감염의 병리적 효과를 예방 또는 감소시키는 방법.
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 재조합 단백질을 코딩하는 핵산.
  10. 제9항에 있어서, DNA인 핵산.
  11. 제10항의 핵산을 포함하는 벡터.
  12. 제11항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  13. 제12항에 있어서, 박테리아 세포, 효모 세포, 또는 포유동물 세포인 숙주 세포.
  14. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 재조합 단백질을 포함하는 약학 조성물.
  15. 피험체에게 예방적 또는 치료적 유효량의, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 재조합 단백질, 제5항의 나노입자, 제6항의 면역원성 조성물, 제7항의 백신 조성물, 제9항의 핵산 분자, 또는 제11항의 벡터를 투여하는 단계를 포함하는, 백신접종 방법.
  16. 인플루엔자 관련 질환의 치료를 필요로 하는 피험체에게 예방적 또는 치료적 유효량의, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 재조합 단백질, 제5항의 나노입자, 제6항의 면역원성 조성물, 제7항의 백신 조성물, 제9항의 핵산 분자, 또는 제11항의 벡터를 투여하는 단계를 포함하는, 인플루엔자 관련 질환을 치료하는 방법.
  17. 생리적으로 허용되는 담체와 함께 조합하여 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 재조합 단백질을 포함하는 백신.
  18. a. 항인플루엔자 항체의 존재에 대하여 검사되는 샘플의 적어도 일부를 제5항의 나노입자와 접촉시키는 단계; 및
    b. 나노입자/항인플루엔자 항체 복합체의 존재를 검출하는 단계로서,
    나노입자/항체 복합체의 검출은, 샘플이 항인플루엔자 항체를 함유한다는 것을 나타내는 것인 단계를 포함하는, 항인플루엔자 항체를 검출하는 방법.
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