FR3050448A1 - Nanoparticules a base d'encapsuline. - Google Patents
Nanoparticules a base d'encapsuline. Download PDFInfo
- Publication number
- FR3050448A1 FR3050448A1 FR1670187A FR1670187A FR3050448A1 FR 3050448 A1 FR3050448 A1 FR 3050448A1 FR 1670187 A FR1670187 A FR 1670187A FR 1670187 A FR1670187 A FR 1670187A FR 3050448 A1 FR3050448 A1 FR 3050448A1
- Authority
- FR
- France
- Prior art keywords
- sequence
- encapsulin
- acid sequence
- amino acid
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 title claims abstract description 109
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims abstract description 179
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 137
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 130
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 101
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims abstract description 33
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims abstract description 33
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 29
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 206
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 42
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 39
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 33
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 27
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 24
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 19
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 17
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 13
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 13
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 9
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 claims description 8
- 238000012433 multimodal chromatography Methods 0.000 claims description 6
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 claims description 6
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 claims description 5
- 238000005498 polishing Methods 0.000 claims description 5
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 claims description 5
- 230000002051 biphasic effect Effects 0.000 claims description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 121
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 87
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 87
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 50
- 241000204666 Thermotoga maritima Species 0.000 description 22
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 22
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 21
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 19
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 15
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 13
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 12
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 12
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 10
- 241000205156 Pyrococcus furiosus Species 0.000 description 9
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 9
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 9
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 9
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 9
- 102100040051 Aprataxin and PNK-like factor Human genes 0.000 description 8
- 101710082494 DNA protection during starvation protein Proteins 0.000 description 8
- 101000890463 Homo sapiens Aprataxin and PNK-like factor Proteins 0.000 description 8
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 8
- 241000187561 Rhodococcus erythropolis Species 0.000 description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 7
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 7
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 7
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 6
- 108010074122 Ferredoxins Proteins 0.000 description 6
- 101710120381 Hemerythrin-like protein Proteins 0.000 description 6
- 108700020962 Peroxidase Proteins 0.000 description 6
- -1 acids amines Chemical class 0.000 description 6
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 6
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 6
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 6
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 6
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 6
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 241000863422 Myxococcus xanthus Species 0.000 description 5
- 241000915491 Rhodococcus jostii Species 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 5
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 5
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 5
- 244000177578 Bacterium linens Species 0.000 description 4
- 240000000220 Panda oleosa Species 0.000 description 4
- 235000016496 Panda oleosa Nutrition 0.000 description 4
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 4
- 101001039853 Sonchus yellow net virus Matrix protein Proteins 0.000 description 4
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 4
- VYLDEYYOISNGST-UHFFFAOYSA-N bissulfosuccinimidyl suberate Chemical compound O=C1C(S(=O)(=O)O)CC(=O)N1OC(=O)CCCCCCC(=O)ON1C(=O)C(S(O)(=O)=O)CC1=O VYLDEYYOISNGST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 4
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 4
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 4
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 4
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 4
- 238000004627 transmission electron microscopy Methods 0.000 description 4
- IDOQDZANRZQBTP-UHFFFAOYSA-N 2-[2-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol Chemical compound CC(C)(C)CC(C)(C)C1=CC=CC=C1OCCO IDOQDZANRZQBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 3
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 3
- 229920004929 Triton X-114 Polymers 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 3
- 238000002169 hydrotherapy Methods 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 3
- 102100022524 Alpha-1-antichymotrypsin Human genes 0.000 description 2
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 2
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 101000678026 Homo sapiens Alpha-1-antichymotrypsin Proteins 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 2
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 2
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 description 2
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 241000723873 Tobacco mosaic virus Species 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- 230000033581 fucosylation Effects 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 125000003473 lipid group Chemical group 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 1
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 108010062877 Bacteriocins Proteins 0.000 description 1
- 235000012539 Bacterium linens Nutrition 0.000 description 1
- 102220504602 Beta-ureidopropionase_P157Q_mutation Human genes 0.000 description 1
- 101100283604 Caenorhabditis elegans pigk-1 gene Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 108030002463 Dye decolorizing peroxidases Proteins 0.000 description 1
- 102000008857 Ferritin Human genes 0.000 description 1
- 108050000784 Ferritin Proteins 0.000 description 1
- 238000008416 Ferritin Methods 0.000 description 1
- 102220566687 GDNF family receptor alpha-1_F64L_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220566469 GDNF family receptor alpha-1_S65T_mutation Human genes 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010069767 H1N1 influenza Diseases 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229920002274 Nalgene Polymers 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 108700006385 OmpF Proteins 0.000 description 1
- 101710203389 Outer membrane porin F Proteins 0.000 description 1
- 101710160104 Outer membrane protein F Proteins 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- 239000004695 Polyether sulfone Substances 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 1
- 102100029812 Protein S100-A12 Human genes 0.000 description 1
- 101710110949 Protein S100-A12 Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241001459443 Rhodococcus jostii RHA1 Species 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000242677 Schistosoma japonicum Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N Uranyl acetate Chemical compound O.O.O=[U]=O.CC(O)=O.CC(O)=O COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000012382 advanced drug delivery Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N alumane Chemical class [AlH3] AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012223 aqueous fraction Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- 238000000429 assembly Methods 0.000 description 1
- 230000000712 assembly Effects 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000010310 bacterial transformation Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 102220401990 c.421A>T Human genes 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- 239000001752 chlorophylls and chlorophyllins Substances 0.000 description 1
- 229960001231 choline Drugs 0.000 description 1
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 235000021189 garnishes Nutrition 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 1
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 1
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000001728 nano-filtration Methods 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920006393 polyether sulfone Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 102220286690 rs1554306525 Human genes 0.000 description 1
- 102200162319 rs34949635 Human genes 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000002047 solid lipid nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 201000010740 swine influenza Diseases 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 239000000277 virosome Substances 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/0208—Specific bacteria not otherwise provided for
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
- A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
- A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
- A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
- A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
- A61K9/5169—Proteins, e.g. albumin, gelatin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6031—Proteins
- A61K2039/6068—Other bacterial proteins, e.g. OMP
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/735—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a domain for self-assembly, e.g. a viral coat protein (includes phage display)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Virology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
La présente invention a pour objet une nanoparticule comprenant un assemblage de monomères d'encapsuline, selon laquelle un peptide a été inséré dans la séquence d'acides aminés d'au moins un desdits monomères d'encapsuline, le site d'insertion du peptide étant situé dans un site externe du domaine A du monomère d'encapsuline, et comprenant en outre une protéine interne.
Description
[DOMAINE TECHNIQUE]
La présente invention concerne le domaine technique de l'encapsulation, et en particulier l'encapsulation de protéines. Plus précisément, la présente invention a pour objet des nanoparticules à base de monomères d'encapsuline spécifiques ayant une grande capacité à encapsuler des protéines, les moyens pour produire ces nanoparticules, ainsi que leur utilisation dans des compositions immunogènes.
[ETAT DE LA TECHNIQUE]
Le domaine de l'encapsulation connaît un essor important depuis plusieurs années. L'encapsulation consiste à enfermer une substance dans une « capsule », pour l'isoler du milieu extérieur et/ou la transporter jusqu'à l'endroit désiré où elle sera libérée pour agir. Cette technologie est notamment mise à profit pour encapsuler des protéines, qui peuvent être sensibles à certains facteurs environnementaux et se dégrader (par exemple, sous l'action d'enzymes ou dans certaines conditions de pH), et préserver ainsi leur activité biologique et/ou prolonger leur effet thérapeutique. Elle peut être aussi mise en oeuvre pour différer ou prolonger le relargage des protéines à travers la capsule. Dans le domaine vaccinal, elle est également mise à profit pour délivrer la protéine vaccinale aux cellules du système immunitaire (Bungener L. et coll. Vaccine (2002); 20: 2287-2295).
Plusieurs techniques ont été décrites dans la littérature pour l'encapsulation de protéines, conduisant à des systèmes de type microparticules ou nanoparticules, par exemple à base de polymères (Amidi M et Coll. Advanced Drug Delivery Reviews (2010); 62 :59-82), des systèmes à base de lipides, tels que des émulsions, des nanoparticules lipidiques solides ou des liposomes (Martins S et Coll., Int J Nanomedicine (2007) ; 2(4) : 595-607), ou encore des systèmes de type virosomes (Bungener L. et coll. Vaccine (2002); 20: 2287-2295) ou utilisant des Virus-Like-Particles (Patterson DP et Coll, ACS Chem Biol ( 2014) ; 9(2) : 359-365). Récemment, Sutter et Coll, ont décrit une famille de protéines bactériennes, les encapsulines, ayant la capacité de s'auto-assembler pour former un nano-compartiment (ou nanoparticule) contenant des protéines enzymatiques particulières appartenant à la famille des DyP (dye-decolorizing peroxydase) ou des Flp (ferritin-like protein) (Sutter M et Coll., Nat Struct Mol Biol (2008) ; 15(9) : 939-947). Cette structure pourrait servir de micro-réacteur à l'intérieur de la bactérie, dans lequel des réactions enzymatiques se produisent dans un espace confiné. Le nano- compartiment a une taille généralement comprise entre 10 et 40 nm, en fonction de la taille et du nombre de monomères d'encapsuline qui se sont auto-assemblés. Par exemple, les encapsulines provenant de Thermotoga maritima (ou de Rhodococcus jostii RHA1) s'assemblent pour former des nanoparticules ayant une taille d'environ 24 nm et composées de 60 monomères d'encapsuline. A partir d'une banque de données, Sutter a analysé les séquences des protéines enzymatiques appartenant à la famille des DyP et montré que celles qui sont présentes à l'intérieur des nano-compartiments d'encapsuline étaient codées par des gènes qui se trouvent sur le même opéron que celui qui code pour l'encapsuline. Par ailleurs, en alignant les séquences de leurs extrémités C-terminales, Sutter a également montré qu'il existait une séquence conservée d'acides aminés. Cette séquence conservée d'acides aminés est également retrouvée sur l'extension C-terminale d'autres protéines enzymatiques qui sont encapsulées dans les nanocompartiments d'encapsuline telles que celles qui appartiennent à la famille des Flp.
Très récemment, Tamura et Coll dans Biotechnology and Bioengineering (2015) ; 1: 13-20 ont montré que l'on pouvait encapsuler des protéines hétérologues, telles que l'eGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) ou la luciférase, dans des nanoparticules d'encapsuline provenant de Rhodococcus erythropolis N771. Ces protéines hétérologues ont été modifiées par addition à leur extrémité C-terminale, d'une séquence correspondant aux 37 derniers acides aminés C-terminaux de la peroxydase DypB provenant de R. erythropolis N771. Toutefois, le rendement d'encapsulation était relativement faible, puisque tout au plus une molécule d'eGFP ou de luciférase était encapsulée par nanoparticule.
[PROBLEME TECHNIQUE]
Aussi, le but de l'invention est de proposer des nanoparticules à base d'encapsuline, dans lesquelles une plus grande quantité de protéines peuvent être encapsulées.
[RESUME DE L'INVENTION] A cet effet, la présente invention a pour objet une nanoparticule comprenant un assemblage de monomères d'encapsuline, selon laquelle un peptide a été inséré dans la séquence d'acides aminés d'au moins un desdits monomères d'encapsuline, le site d'insertion du peptide étant situé dans un site externe du domaine A du monomère d'encapsuline, et comprenant en outre une protéine interne.
Selon un mode de réalisation de l'invention, le peptide a été inséré dans la séquence d'acides aminés de tous les monomères d'encapsuline.
Dans un autre mode de réalisation, le site externe du domaine A est constitué par la séquence d'acides aminés constitutive du premier feuillet β du domaine A et de la séquence d'acides aminés constitutive de la première structure dépliée contiguë à la séquence d'acides aminés du premier feuillet β.
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, la séquence d'acides aminés du monomère d'encapsuline est la séquence SEQ ID NO : 1 ou une séquence dérivée dont le degré d'identité est d'au moins 90%.
Selon encore un autre mode de réalisation particulier de l'invention, la séquence d'acides aminés du monomère d'encapsuline est la séquence SEQ ID NO : 7 ou une séquence dérivée dont le degré d'identité est d'au moins 90%.
Selon un autre mode de réalisation particulier de l'invention, le peptide a été inséré entre deux acides aminés consécutifs de la séquence Κ^Ι^ΕμοΟμιΟ^μβ, lorsque la séquence du monomère d'encapsuline est la séquence SEQ ID NO : 7, ou entre deux acides aminés consécutifs de la séquence correspondante lorsque la séquence du monomère d'encapsuline est une séquence dérivée de la séquence SEQ ID NO : 7, après alignement des deux séquences monomériques.
Dans un autre mode de réalisation de l'invention le nombre total d'acides aminés du peptide inséré est compris entre 4 et 55 (bornes incluses).
Selon un autre mode de réalisation particulier de l'invention, le peptide inséré comprend la séquence EVETPIRNE (SEQ ID NO : 9).
Selon un autre mode de réalisation très particulier de l'invention, la séquence d'acides aminés du monomère d'encapsuline après insertion du peptide est la séquence ID NO : 30.
Selon un mode de réalisation de l'invention, l'extrémité C- terminale ou N-terminale, respectivement, de la séquence d'acides aminés de la protéine interne se termine ou commence, respectivement, par un enchaînement d'acides aminés du type l-M-T, dans lequel : a. I désigne une séquence d'acides aminés dont le nombre total d'acides aminés est compris entre entre 0 et 30 (bornes incluses), de façon préférée entre 0 et 25 (bornes incluses) et de façon encore plus préférée entre 0 et 20 (bornes incluses) ; b. M est la séquence XiGSLX5X6GX8LXio (SEQ ID NO : 36), dans laquelle Xi est D ou K, X5 est T, G ou N, X6 est I, V ou L, X8 est S ou I et Xi0 est K ou Y, la séquence XiAPX4DGSLX9Xi0GSLKG (SEQ ID NO : 37), dans laquelle Xi et X4 désignent chacun un acide aminé non déterminé, X9 est T, G ou N, et X10 est I ou V, ou la séquence GGDLGIRK (SEQ ID NO : 38) et, c. T désigne une séquence d'acides aminés dont le nombre total d'acides aminés est compris entre 0 et 15 (bornes incluses), de façon préférée entre 0 et 10 (bornes incluses) et de façon encore plus préférée entre 0 et 5 (bornes incluses).
Selon un mode de réalisation de l'invention, la protéine interne est une protéine de fusion selon laquelle l'extrémité C-terminale ou N-terminale d'une protéine d'intérêt a été fusionnée à l'enchaînement d'acides aminés du type l-M-T.
La présente invention a également pour objet un vecteur bicistronique comprenant une première séquence d'acide nucléique codant pour un monomère d'encapsuline dans lequel un peptide a été inséré dans un site externe du domaine A du monomère, en particulier dans celui constitué par la séquence d'acides aminés constitutive du premier feuillet β du domaine A et de la séquence d'acides aminés constitutive de la première structure dépliée contiguë à la séquence d'acides aminés du premier feuillet β, et une deuxième séquence d'acide nucléique codant pour une protéine dont l'extrémité C-terminale ou N-terminale, respectivement, se termine ou commence, respectivement, par un enchaînement d'acides aminés du type l-M-T, dans lequel I désigne une séquence d'acides aminés dont le nombre total d'acides aminés est compris entre 0 et 30 (bornes incluses) de façon préférée entre 0 et 25 (bornes incluses) et de façon encore plus préférée entre 0 et 20 (bornes incluses), M est la séquence SEQ ID NO : 36, SEQ ID NO : 37 ou SEQ ID NO : 38, et T désigne une séquence d'acides aminés dont le nombre total d'acides aminés est compris entre 0 et 15 (bornes incluses), de façon préférée entre 0 et 10 (bornes incluses) et de façon encore plus préférée entre 0 et 5 (bornes incluses).
Un autre objet de l'invention est une cellule hôte comprenant un vecteur bicistronique tel que décrit précédemment.
Un autre objet de l'invention est une cellule hôte comprenant un premier vecteur qui comprend une séquence d'acide nucléique codant pour un monomère d'encapsuline dans lequel un peptide a été inséré dans un site externe du domaine A du monomère, en particulier dans celui constitué de la séquence d'acides aminés constitutive du premier feuillet β du domaine A et de la séquence d'acides aminés constitutive de la première structure dépliée contiguë à la séquence d'acides aminés du premier feuillet β, et un deuxième vecteur qui comprend une séquence d'acide nucléique codant pour une protéine dont l'extrémité C-terminale ou N-terminale, respectivement, se termine ou commence, respectivement, par un enchaînement d'acides aminés du type l-M-T, dans lequel I désigne une séquence d'acides aminés dont le nombre total d'acides aminés est compris entre 0 et 30 (bornes incluses), de façon préférée entre 0 et 25 (bornes incluses) et de façon encore plus préférée entre 0 et 20 (bornes incluses), M est la séquence SEQ ID NO : 36, SEQ ID NO : 37 ou SEQ ID NO : 38, et T désigne une séquence d'acides aminés dont le nombre total d'acides aminés est compris entre 0 et 15 (bornes incluses), de façon préférée entre 0 et 10 (bornes incluses) et de façon encore plus préférée entre 0 et 5 (bornes incluses). L'invention a aussi pour objet un procédé de production de nanoparticules comprenant un assemblage de monomères d'encapsuline, telles que définies dans les différents modes de réalisation précédents, selon lequel: a. On cultive des cellules hôtes telles que décrites précédemment dans des conditions favorisant l'expression des monomères d'encapsuline et de la protéine interne ; et b. On récupère les nanoparticules contenant la protéine interne résultant de l'auto-assemblage des monomères d'encapsuline. L'invention a encore pour objet un procédé de purification de nanoparticules comprenant un assemblage de monomères d'encapsuline selon lequel : a. On clarifie un broyât de cellules contenant des nanoparticules comprenant un assemblage de monomères d'encapsuline; b. On soumet la solution clarifiée contenant les nanoparticules à une ou plusieurs étape(s) de chromatographie de type multi-modale ; c. On récupère l'éluat contenant les assemblages de monomères d'encapsuline de diamètre supérieur ou égal à 10 nm ; d. On élimine en une ou plusieurs fois les contaminants hydrophobes contenus dans l'éluat au moyen d'une solution biphasique; e. On récupère la phase aqueuse que l'on soumet à une ou plusieurs étape(s) de polissage, et f. On récupère la solution purifiée contenant les nanoparticules comprenant un assemblage de monomères d'encapsuline. L'invention a également pour objet une composition immunogène comprenant des nanoparticules telles que définies dans leurs différents modes de réalisation précédents. L'invention a aussi pour objet une composition immunogène comprenant des nanoparticules qui comprennent un assemblage de monomères d'encapsuline, selon lesquelles un peptide a été inséré dans la séquence d'acides aminés d'au moins un desdits monomères d'encapsuline, le site d'insertion du peptide étant situé dans un site externe du domaine A du monomère d'encapsuline constitué de la séquence d'acides aminés constitutive du premier feuillet β du domaine A et de la séquence d'acides aminés constitutive de la première structure dépliée contiguë à la séquence d'acides aminés du premier feuillet β.
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, le peptide inséré comprend la séquence EVETPIRNE (SEQID NO : 9).
Selon ce mode de réalisation particulier de l'invention, la réponse immune est dirigée contre le virus grippal.
Un autre objet de l'invention est un monomère d'encapsuline dans lequel a été inséré, dans sa séquence d'acides aminés, un peptide comprenant la séquence EVETPIRNE (SEQID NO : 9).
Selon un mode de réalisation, le peptide a été inséré dans un site externe du domaine A du monomère, en particulier dans celui constitué de la séquence d'acides aminés constitutive du premier feuillet β du domaine A et de la séquence d'acides aminés constitutive de la première structure dépliée contiguë à la séquence d'acides aminés du premier feuillet β. L'invention a également pour objet une séquence d'acide nucléique codant pour un monomère d'encapsuline tel que décrit précédemment.
Selon un mode de réalisation, la séquence d'acide nucléique codant pour un monomère d'encapsuline est la séquence SEQ ID NO : 43 ou une séquence dérivée ayant un degré d'identité d'au moins 80 % avec la séquence SEQ ID NO : 43.
Enfin, l'invention a pour objet un vecteur comprenant une séquence d'acide nucléique telle que décrite précédemment.
La présente invention sera mieux comprise à la lecture de la description qui suit.
[DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION]
Les inventeurs ont montré de façon surprenante qu'une nanoparticule comprenant un assemblage de monomères d'encapsuline, selon laquelle un peptide a été inséré dans un site externe du domaine A d'au moins un desdits monomères d'encapsuline, est capable d'encapsuler une plus grande quantité de protéines qu'une nanoparticule ayant les mêmes caractéristiques excepté qu'aucun peptide n'a été inséré dans la séquence d'acides aminés des monomères d'encapsuline, comme illustré dans l'Exemple 2. En outre, selon la nature du peptide inséré et de la protéine interne, ces nanoparticules peuvent être immunogènes et induire de façon surprenante une réponse humorale contre le peptide inséré et/ou contre la protéine qui a été encapsulée, mais pas contre l'encapsuline.
La nanoparticule selon l'invention peut également être utilisée pour conserver et/ou stabiliser la protéine interne, notamment lorsque celle-ci se trouve dans un milieu défavorable, tel qu'une température trop élevée et/ou un pH incompatibles avec le maintien de l'intégrité de la protéine, ou lorsque le milieu contient des enzymes ou des agents qui altèrent ou dégradent rapidement la protéine. Dans le cadre d'une utilisation à des fins thérapeutiques ou préventives, l'encapsulation d'une protéine dans la nanoparticule selon l'invention peut aussi être avantageuse pour diminuer sa toxicité, ou prolonger sa demi-vie en retardant son relargage.
Dans la présente demande, les termes « un », « une », « le », « la » doivent être interprétés de façon large en désignant indifféremment le singulier ou le pluriel (« des », « les »...), sauf s'il est clairement indiqué dans le texte que le terme « un », « une », « le » ou « la » doit être compris dans un sens excluant le pluriel. En particulier, ce terme désigne uniquement le singulier lorsqu'il est précédé ou suivi d'une mention excluant le pluriel, telle que « seul » ou « seulement ».
Par « nanoparticule », on entend une particule de matière, dont au moins une des dimensions se situe à l'échelle nanométrique (c'est-à-dire, inférieure à 200 nm environ). De préférence, ses trois dimensions sont à l'échelle nanométrique.
Dans le cas de la présente invention, la nanoparticule ou le nano-compartiment est formé suite à l'auto-assemblage de monomères d'encapsuline tels que décrits dans l'invention. La nanoparticule peut contenir jusqu'à 60, 120, 180 ou 240 monomères d'encapsuline, en fonction de l'origine du monomère. Classiquement, la nanoparticule a une forme icosaédrique, dont le diamètre externe est typiquement compris entre 10 et 40 nm, plus particulièrement entre 20 et 40 nm. Les techniques permettant de mesurer la taille de ce type de particules (représentée par exemple par son diamètre externe ou interne) sont bien connues de l'homme du métier. On peut citer, par exemple, la microscopie électronique à transmission (MET) ou encore la diffusion dynamique de la lumière (Dynamic Light Scattering ou DLS). La MET permet de déterminer le diamètre interne et/ou externe des nanoparticules. La DLS, basée sur le principe de la diffusion de Rayleigh, permet de mesurer le rayon hydrodynamique d'une particule (c'est-à-dire le rayon d'une sphère théorique qui aurait le même coefficient de diffusion que la particule considérée).
Par « monomère d'encapsuline », on entend une protéine appartenant à la famille des encapsulines, qui sont des protéines bactériennes et qui possèdent 3 domaines structuraux : le domaine périphérique P (domaine P), le domaine axial A (domaine A) et la boucle allongée E (boucle E). Hormis les encapsulines de Thermotoga maritima (T. maritima), Pyrococcus furiosus (P. furiosus), Brevibacterium linens (B. iinens), Rhodococcus jostii (R. jostii), Rhodococcus erythropolis (R. erythropolis) et Myxococcus xanthus (M. xanthus) déjà décrites, Radford dans « Prédiction and Characterization of Phage Capsid-like Nanocompartments in Prokaryotes », Rapport de thèse (2015), Faculté de Médecine, Université de Toronto, a identifié 590 encapsulines provenant de nombreuses espèces bactériennes. Outre leurs propriétés d'auto-assemblage, les monomères d'encapsuline au sens de la présente invention, possèdent en commun une très forte homologie structurale, que l'on peut définir au moyen du RMSD (Root Mean Sguare Déviation), en particulier au niveau des domaines P et A. D'autre part, le domaine P contient une cavité interne dans laquelle se trouvent des acides aminés ayant la capacité de se lier au moyen de liaisons non covalentes, via des interactions ioniques et/ou hydrophobes à l'extrémité C-terminale d'au moins une des protéines appartenant à la famille des iron-dependent peroxidases (notamment les Dyp), des ferritin-like protéines (Flp), des ferredoxins, des Dps-bacterioferritin-like protéines, des hemerythrin-like protéines, ou des rubrerythrin-like protéines.
Le RMSD permet de comparer la ressemblance structurale de deux monomères d'encapsuline. Pour chacun des N atomes comparés, l'atome i de coordonnées (x,, y,, z,) du premier monomère est mis en correspondance avec l'atome i' de coordonnées (xr, y,-, zr) du second monomère, et le RMSD est obtenu par la formule suivante :
L'homme du métier peut identifier un logiciel pertinent permettant de réaliser cette mise en correspondance, et de calculer le RMSD. A titre d'exemple, on cite les logiciels Multiprot, SuperPose, jFATCAT, Dalilite, C-alphamatch, Pymol.
Tout monomère d'encapsuline ayant : 1) la capacité de s'auto-assembler, 2) un RMSD au niveau des domaines P et A inférieur à 5 Â par rapport aux domaines correspondants P et A d'au moins un des monomères des encapsulines de référence choisies parmi les encapsulines de T. maritima, P. furiosus, B. linens, R. jostii, R. erythropolis, et M. xanthus, telles que définies par leurs séquences respectives SEQID NO : 1, SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, telles que mentionnées ci-dessous, en particulier un RMSD au niveau des domaines P et A inférieur à 5 Â par rapport aux domaines correspondants P et A du monomère d'encapsuline de T. maritima (SEQ ID NO : 1), en utilisant le logiciel jFATCAT, et 3) dont le domaine P possède une cavité interne capable de se lier au moyen de liaisons non covalentes via des interactions ioniques et/ou hydrophobes à l'extrémité C-terminale d'au moins une des protéines appartenant à la famille des iron-dependent peroxidases (notamment les Dyp), des ferritin-like protéines (Flp), des ferredoxins, des Dps-bacterioferritin-like protéines, des hemerythrin-like protéines, ou des rubrerythrin-like protéines ; convient à l'objet de l'invention. MVNMEFLKRSFAPLTEKQWQEIDNRAREIFKTQLYGRKFVDVEGPYGWEYAAHPLGEVEVLSDENEVVKWGL RKSLPLIELRATFTLDLWELDNLERGKPNVDLSSLEETVRKVAEFEDEVIFRGCEKSGVKGLLSFEERKIECGSTPKD LLEAIVRALSIFSKDGIEGPYTLVINTDRWINFLKEEAGHYPLEKRVEECLRGGKMTTPRIEDALWSERGGDFKLIL GQDLSIGYEDREKDAVRLFITETFTFQVVNPEALILLKF (SEQ ID NO : 1) MLSINPTLINRDKPYTKEELMEILRLAIIAELDAINLYEQMARYSEDENVRKILLDVAREEKAHVGEFMALLLNLDP EQVTELKGGFEEVKELTGIEAHINDNKKEESNVEYFEKLRSALLDGVNKGRSLLKHLPVTRIEGQSFRVDIIKFEDG VRVVKQEYKPIPLLKKKFYVGIRELNDGTYDVSIATKAGELLVKDEESLVIREILSTEGIKKMKLSSWDNPEEALNDL MNALQEASNASAGPFGLIINPKRYAKLLKIYEKSGKMLVEVLKEIFRGGIIVTLNIDENKVIIFANTPAVLDVWGQ DVTLQELGPEGDDVAFLVSEAIGIRIKNPEAIVVLE (SEQ ID NO : 2)
MNNLYRELAPIPGPAWAEIEEEARRTFKRNIAGRRIVDVAGPTGFETSAVTTGHIRDVQSETSGLQVKQRIVQEY
IELRTPFTVTRQAIDDVARGSGDSDWQPVKDAATTIAMAEDRAILHGLDAAGIGGIVPGSSNAAVAIPDAVEDF ADAVAQALSVLRTVGVDGPYSLLLSSAEYTKVSESTDHGYPIREHLSRQLGAGEIIWAPALEGALLVSTRGGDYEL HLGQDLSIGYYSHDSETVELYLQETFGFLALTDESSVPLSL (SEQ ID NO : 3) MSDSSNLHRNLAPVTEVAWQQIGEEAARTFKRHVAGRRVVDVAGPFGYSYSAHNLGRVTPIKTSDSRIRAQQR QVNPLVELRFPFTLSRAEVDDVARGSLDSDWQPVKDAAKAVAFAEDQSIFQGFDEAGIRGLGPSSDNPVLSLPE DPLLIPDAVASALSALRLAGVEGPYSVVLDADAYTAVSETRDEGHPVFHHLRDLVAGDIIWAPAISGGYVLSTRG GDNQLTLGTDLSIGYDSHTATDVTLYLEETFTFASLTAEAAWLAR (SEQ ID NO : 4) MTNLHRDLAPISAAAWAEIEEEASRTFKRHVAGRRWDVEGPSGDDLAAIPLGHQVPINPLADGVIAHARQSQ PVIELRVPFTVSRQAIDDVERGAKDSDWQPVKDAAKQIAFAEDRAIFEGYPAASITGVRASGSNPELKLPIDAKD YPEAISQAITSLRLAGVNGPYSLLLNADAFTAINETSDHGYPIREHLRRVLDGEIIWAPAIDGAFLLSTRGGDYELHL GQDLSIGYLSHDANSVELYFQESMTFLMYTSEAVVSLA (SEQ ID NO : 5) MPLEPHFMPDFLGHAENPLREEEWARLNETVIQVARRSLVGRRILDIYGPLGAGVQTVPYDEFQGVSPGAVDI VGEQETAMVFTDARKFKTIPIIYKDFLLHWRDIEAARTHNMPLDVSAAAGAAALCAQQEDELIFYGDARLGYEG LMTANGRLTVPLGDWTSPGGGFQAIVEATRKLNEQGHFGPYAVVLSPRLYSQLHRIYEKTGVLEIETIRQLASDG VYQSNRLRGESGVVVSTGRENMDLAVSMDMVAAYLGASRMNHPFRVLEALLLRIKHPDAICTLEGAGATERR (SEQ ID NO : 6)
En particulier, les acides aminés de la cavité interne du domaine P qui sont impliqués dans ces interactions sont conservés ou les modifications éventuelles sont limitées à des substitutions conservatives, selon lesquelles les acides aminés sont remplacés par des acides aminés du même sous-groupe.
Les monomères d'encapsuline de T. maritima (SEQ ID NO : 1), P.furiosus (SEQ ID NO : 2), B. linens (SEQ ID NO : 3), R. jostii (SEQ ID NO : 4), R. erythropolis (SEQ ID NO : 5), et M. xanthus (SEQ ID NO : 6) conviennent particulièrement à l'objet de l'invention.
En outre, un peptide a été inséré dans la séquence d'acides aminés d'au moins un des monomères d'encapsuline qui forment le nano-compartiment selon l'invention. Le nanocompartiment peut donc être constitué d'un ensemble de monomères d'encapsuline identiques entre eux et au moins un monomère d'encapsuline différent, se distinguant par l'insertion de la séquence d'acides aminés du peptide. Le nano-compartiment peut également être constitué d'un mélange de deux ensembles de monomères ; un premier ensemble constitué de monomères d'encapsuline tous identiques entre eux et un deuxième ensemble constitué de monomères d'encapsuline, également tous identiques entre eux, mais se distinguant des monomères du premier ensemble par l'insertion de la séquence d'acides aminés du peptide. De manière préférée, la nanoparticule selon l'invention comprend un assemblage de monomères d'encapsuline tous identiques entre eux, selon laquelle la séquence d'acides aminés d'un peptide a été inséré dans la séquence d'acides aminés de tous les monomères d'encapsuline.
De plus, le peptide est inséré dans un site externe du monomère d'encapsuline, notamment dans un site externe du domaine A du monomère d'encapsuline que l'on localise en alignant la séquence du monomère d'encapsuline avec la séquence d'un monomère d'encapsuline de référence dont la structure cristallisée est connue, comme celle du monomère d'encapsuline de T. maritima. Cet alignement peut se faire structurellement si la structure de l'encapsuline cible est connue, comme celle de P. furiosus, ou simplement par alignement des séquences protéiques lorsque la structure de l'encapsuline cible n'est pas connue, comme celle de R. erythropolis. A titre d'exemple, on cite le logiciel Pymol (Schrodinger) pour l'alignement structurel et l'application Clustal Oméga (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) pour l'alignement des séquences protéiques. Structurellement, le domaine A du monomère d'encapsuline comprend des hélices a et des feuillets β, ces structures étant reliées entre elles par des séquences d'acides aminés qui n'ont pas de structure secondaire caractéristique (structures dépliées). On a identifié que la séquence d'acides aminés constitutive du premier feuillet β du domaine A et la séquence d'acides aminés constitutive de la première structure dépliée qui se situe entre ce premier feuillet β et la première hélice a du domaine A, représentent un site externe du domaine A et sont particulièrement appropriées pour insérer le peptide selon l'invention, comme indiqué sur la figure 1, où ont été représentées à titre indicatif les structures tridimensionnelles des monomères d'encapsuline de T. Maritima et de P. furiosus. On peut par exemple insérer le peptide entre deux acides aminés consécutifs de la séquence Κ2ι6 Μ2ι7 Κ2ι8 ί2ω S220 S22i, qui correspond à la séquence d'acides aminés du premier feuillet β et de la première structure dépliée du domaine A du monomère d'encapsuline de P. furiosus.
En particulier, le monomère d'encapsuline peut provenir d'une bactérie thermophile ou extrêmophile, telle que T. maritima. La séquence d'acides aminés du monomère à partir de laquelle on insère la séquence peptidique selon l'invention peut correspondre à la séquence de l'encapsuline de T. Maritima (SEQID NO : 1), ou à une séquence d'acides aminés dérivée de celle-ci.
Par « séquence d'acides aminés dérivée d'une séquence d'acides aminés de référence d'un monomère d'encapsuline », on entend une séquence d'acides aminés contenant des variations par rapport à la séquence de référence, mais celles-ci ne doivent pas modifier significativement la structure tridimensionnelle du monomère d'encapsuline, de sorte que le RMSD au niveau des domaines P et A est inférieur à 5 Â par rapport aux domaines correspondants P et A d'au moins un des monomères choisis parmi ceux de l'ensemble constitué par les monomères d'encapsuline de T. maritima (SEQ ID NO : 1), P. furiosus (SEQ ID NO : 2), B. linens (SEQ ID NO : 3), R. jostii (SEQ ID NO : 4), R. erythropolis (SEQ ID NO : 5), et M. xanthus (SEQ ID NO : 6) en utilisant le logiciel jFATCAT, et ne doivent pas altérer sa fonctionnalité, à savoir sa capacité à s'auto-assembler et à se lier au moyen de liaisons non covalentes, c'est-à-dire au moyen d'interactions ioniques et/ou hydrophobes, à l'extrémité C-terminale d'au moins une des protéines appartenant à la famille des iron-dependent peroxidases (notamment les Dyp), des ferritin-like protéines (Flp), des ferredoxins, des Dps-bacterioferritin-like protéines, des hemerythrin-like protéines, ou des rubrerythrin-like protéines.
Ces variations de séquence peuvent être des variations se produisant naturellement, ou être introduites par des techniques de génie génétique, connues de l'homme du métier (telles que celles décrites dans Sambrook J et Coll, Molecular Cloning—A Laboratory Manual, 2ème Edition, Cold Spring Flarbor Laboratory Press, 1989, p. 9.31-9.57, ou dans Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6). Les variations incluent une ou des délétion(s), une ou des substitution(s), ou une insertion d'un acide aminé, par exemple après la méthionine N-terminale de la séquence d'acides aminés de référence, ainsi que des combinaisons de ces variations. Comme exemples de séquences d'acides aminés dérivées des séquences SEQ ID NO : 2 à 6, on peut citer des séquences dans lesquelles une glycine est insérée en deuxième position des séquences SEQ ID NO : 2 à 6, juste après la méthionine N-terminale. Généralement, le pourcentage d'identité entre une séquence d'acides aminés de référence et une séquence d'acide aminés dérivée de cette séquence est d'au moins 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%.
Dans le cadre de la présente invention, lorsqu'une première séquence d'acides aminés est identique à X% à une seconde séquence d'acides aminés, cela signifie que ce X% représente le nombre d'acides aminés de la première séquence qui sont identiques aux acides aminés correspondants de la seconde séquence, après alignement optimal des deux séquences, par rapport à la longueur totale de la seconde séquence d'acides aminés. Les deux séquences sont alignées de façon optimale lorsque la valeur de X% est maximale. L'alignement des séquences et la détermination du pourcentage d'identité peuvent être faits manuellement ou de façon automatique en utilisant l'algorithme de Needleman et Wunsch (Needleman et Wunsch (1970), J. Mol. Biol. 48 :443-453), en utilisant comme paramètres, la matrice de comparaison Blossum 62 de
Henikoff (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89 : 10915-10919, une pénalité de 8 lorsqu'il y a un trou, et une pénalité de 2 lorsqu'il y a une différence de longueur entre les deux séquences.
Lorsqu'un acide aminé est substitué par un autre acide aminé, on le remplace de préférence par un acide aminé du même groupe ou du même sous-groupe, comme indiqué dans le tableau ci-dessous (substitutions dites « conservatives »).
Tableau 1. Classification des acides aminés en fonction de leur groupe et de leur sous-groupe
Pour le choix des substitutions, il est également possible d'utiliser par exemple l'index d'hydropathie des acides aminés, qui prend en compte leurs propriétés d'hydrophobicité. Ces index sont les suivants (du plus hydrophobe au plus hydrophile) : isoleucine (+4.5); valine (+4.2); leucine (+3.8); phénylalanine (+2.8); cystéine (+2.5); méthionine (+1.9); alanine (+1.8); glycine (-0.4); thréonine (-0.7); sérine (-0.8); tryptophane (-0.9); tyrosine (-1.3); proline (-1.6); histidine (-3.2); glutamate (-3.5); glutamine (-3.5); aspartate (-3.5); asparagine (-3.5); lysine (-3.9); et arginine (-4.5). L'importance de ces index hydropathiques par rapport à l'activité d'une protéine est connue de l'homme du métier (Kyte et Coll., J. Mol. Biol. (1982) ; 157:105-31). De préférence, on choisira une substitution d'un acide aminé par un autre acide aminé d'index d'hydropathie proche (écart entre les index d'hydropathie inférieur à 2, de préférence inférieur à 1, et de manière encore plus préférée inférieur à 0.5).
Comme exemples de séquences dérivées de la SEQ ID NO : 1, on cite des séquences d'acides aminés identiques à la séquence SEQ ID NO : 1, mais dans lesquelles les extrémités N-terminales comportent des délétions de 1 à 3 acides aminés, puisque ces 3 premiers acides aminés ne sont pas impliqués dans l'interaction avec la protéine interne. D'autre part, ces séquences dérivées conservent bien leur capacité à s'auto-assembler et les RMSD des domaines P et A sont inférieurs à 5 Â par rapport aux domaines P et A de la SEQ ID NO : 1 de T. maritima, en utilisant le logiciel jFATCAT.
En particulier, la séquence d'acides aminés du monomère à partir de laquelle a été inséré un peptide selon l'invention est une séquence dérivée de la séquence SEQ ID NO : 1 dans laquelle les 3 premiers acides aminés de l'extrémité N-terminale ont été délétés, et qui comprend la substitution C200S. Ainsi, selon un aspect particulier de l'invention, la séquence d'acides aminés du monomère d'encapsuline à partir de laquelle on insère un peptide selon l'invention est la séquence : MEFLKRSFAPLTEKQWQEIDNRAREIFKTQLYGRKFVDVEGPYGWEYAAHPLGEVEVLSDENEVVKWGLRKSL PLIELRATFTLDLWELDNLERGKPNVDLSSLEETVRKVAEFEDEVIFRGCEKSGVKGLLSFEERKIECGSTPKDLLEAI VRALSIFSKDGIEGPYTLVINTDRWINFLKEEAGHYPLEKRVEESLRGGKIITTPRIEDALWSERGGDFKULGQDLS IGYEDREKDAVRLFITETFTFQVVNPEALILLKF (SEQ ID NO : 7), ou une séquence dérivée ayant une identité de séquence d'au moins 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% par rapport à la séquence SEQ ID NO : 7.
Lorsque la séquence d'acides aminés du monomère d'encapsuline correspond à la séquence de T. maritima (SEQ ID NO : 1) ou à une séquence dérivée, l'insertion du peptide a lieu de préférence entre deux acides aminés consécutifs de la séquence Ki411142 Ei43 Ci44 Gi45 Si46, ou, dans le cas d'une séquence dérivée, entre deux acides aminés consécutifs de la séquence correspondante après alignement des deux séquences monomériques. Selon un mode de réalisation encore plus particulier, l'insertion du peptide a lieu entre les acides aminés K141 et l142, ou, dans le cas d'une séquence dérivée, entre les acides aminés de la séquence correspondante après alignement des deux séquences monomériques. Lorsque la séquence d'acides aminés est la séquence SEQ ID NO : 7 ou une séquence dérivée, l'insertion du peptide a lieu de préférence entre deux acides aminés consécutifs de la séquence K1381139 E140 C141G142 S143 ou, dans le cas d'une séquence dérivée, entre deux acides aminés consécutifs de la séquence correspondante après alignement des deux séquences monomériques. Selon un mode de réalisation particulier, l'insertion du peptide a lieu entre les acides aminés Ki38 et li39, ou, dans le cas d'une séquence dérivée, entre les acides aminés de la séquence correspondante après alignement des deux séquences monomériques.
Typiquement, le nombre total d'acides aminés de la séquence du peptide inséré, incluant éventuellement un ou plusieurs bras de liaison, est compris entre 4 et 55 (bornes incluses), en particulier entre 9 et 55 (bornes incluses), plus particulièrement entre 13 et 55 (bornes incluses), ou entre 4 et 28 (bornes incluses), en particulier entre 9 et 28 (bornes incluses), plus particulièrement entre 13 et 28 (bornes incluses), ou entre 4 et 13 (bornes incluses), en particulier entre 9 et 13 (bornes incluses). Ainsi, le nombre total d'acides aminés insérés peut donc être notamment de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, ou de 55.
Le peptide inséré peut éventuellement contenir une ou plusieurs chaînes saccharidiques ou lipidiques. L'insertion du peptide, se faisant typiquement au moyen de liaisons peptidiques, entraîne donc un allongement de la séquence du monomère d'encapsuline du nombre d'acides aminés contenus dans la séquence dudit peptide, cet allongement étant de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 ou 55 acides aminés.
Dans un souci de clarté, tout monomère d'encapsuline qui, après insertion du peptide selon l'invention, aurait une séquence d'acides aminés qui serait identique à une quelconque séquence d'encapsuline déjà décrite, en particulier à l'une des séquences SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 6 serait purement fortuite et devrait être exclu de l'objet de l'invention.
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, la séquence du peptide inséré comprend ou consiste en la séquence EVETPX6RX8X9 (SEQ ID NO : 8), où X6 est I ou T, X8 est N, S, T ou R, et X9 est E ou G. Plus particulièrement, la séquence du peptide inséré peut comprendre ou consister en une séquence choisie dans l'ensemble des séquences suivantes : EVETPIRNE (SEQ ID NO : 9), EVETPIRNG (SEQ ID NO : 10), EVETPIRSE (SEQ ID NO : 11), EVETPIRSG (SEQ ID NO : 12), EVETPIRTE (SEQ ID NO : 13), EVETPIRTG (SEQ ID NO : 14), EVETPIRRE (SEQ ID NO : 15), EVETPIRRG (SEQ ID NO : 16), EVETPTRNE (SEQ ID NO : 17), EVETPTRNG (SEQ ID NO : 18), EVETPTRSE (SEQ ID NO : 19), EVETPTRSG (SEQ ID NO : 20), EVETPTRTE (SEQ ID NO : 21), EVETPTRTG (SEQ ID NO : 22), EVETPTRRE (SEQ ID NO : 23), EVETPTRRG (SEQ ID NO : 24). Selon un mode de réalisation très particulier de l'invention, la séquence d'acides aminés insérée comprend ou consiste en la séquence EVETPIRNE (SEQ ID NO : 9). On peut également insérer une séquence comprenant ou consistant en la séquence des 24 acides aminés N-terminaux de la protéine M2 provenant d'un virus grippal de type H1N1, telle que MSLLTEVETPIRNEWGCRCNGSSD (SEQ ID NO : 25) ou une séquence répétée de celle-ci, avec éventuellement un bras de liaison entre les deux séquences, comme par exemple la séquence MSLLTEVETPIRNEWGCRCNGSSDGGGMSLLTEVETPIRNEWGCRCNGSSD (SEQ ID NO :26 ) qui comporte le motif GGG entre les deux séquences répétées de MSLLTEVETPIRNEWGCRCNGSSD (SEQ ID NO : 25).
La séquence du peptide inséré peut comporter en outre un bras de liaison (linker) en N-terminal et/ou C-terminal. Les bras de liaison sont des séquences de quelques acides aminés, bien connues de l'homme du métier, et choisies en fonction du degré de flexibilité recherché. On peut par exemple citer les bras de liaison de type Gly, Gly/Ser, ou encore Gly/Ala (Reddy Chichili VP et Coll., Protein Sci. (2013) ; 22(2) : 153-167). Les bras de liaison situés en N-terminal et C-terminal peuvent être identiques ou différents entre eux. Selon un mode de réalisation particulier, les bras de liaison situés en N-terminal et en C-terminal consistent en la séquence GG. Dans ce cas, la séquence du peptide inséré est par exemple la séquence GGEVETPIRNEGG (SEQ ID NO : 27), la séquence GGMSLLTEVETPIRNEWGCRCNGSSDGG (SEQ ID NO : 28) ou la séquence GGMSLLTEVETPIRNEWGCRCNGSSDGGGMSLLTEVETPIRNEWGCRCNGSSDGG (SEQ ID NO : 29).
Selon un aspect particulier, la séquence du monomère d'encapsuline après insertion de la séquence SEQ ID NO : 27 est la séquence : MEFLKRSFAPLTEKQWQEIDNRAREIFKTQLYGRKFVDVEGPYGWEYAAHPLGEVEVLSDENEWKWGLRKSL PLIELRATFTLDLWELDNLERGKPNVDLSSLEETVRKVAEFEDEVIFRGCEKSGVKGLLSFEERKGGEVETPIRNEG GIECGSTPKDLLEAIVRALSIFSKDGIEGPYTLVINTDRWINFLKEEAGHYPLEKRVEESLRGGKMTTPRIEDALWSE RGGDFKLILGQDLSIGYEDREKDAVRLFITETFTFQVVNPEALILLKF (SEQ ID NO : 30).
Selon un autre aspect particulier, la séquence du monomère d'encapsuline après insertion de la séquence SEQ ID NO : 28 est la séquence : MEFLKRSFAPLTEKQWQEIDNRAREIFKTQLYGRKFVDVEGPYGWEYAAHPLGEVEVLSDENEVVKWGLRKSL PLIELRATFTLDLWELDNLERGKPNVDLSSLEETVRKVAEFEDEVIFRGCEKSGVKGLLSFEERKGGMSLLTEVETP IRNEWGCRCNGSSDGGIECGSTPKDLLEAIVRALSIFSKDGIEGPYTLVINTDRWINFLKEEAGHYPLEKRVEESLR GGKNTTPRIEDALVVSERGGDFKLILGQDLSIGYEDREKDAVRLFITETFTFQWNPEALILLKF (SEQ ID NO : 31).
Selon encore un autre aspect particulier, la séquence du monomère d'encapsuline après insertion de la séquence SEQ ID NO : 29 est la séquence :
MEFLKRSFAPLTEKQWQEIDNRAREIFKTQLYGRKFVDVEGPYGWEYAAHPLGEVEVLSDENEVVKWGLRKSL
PLIELRATFTLDLWELDNLERGKPNVDLSSLEETVRKVAEFEDEVIFRGCEKSGVKGLLSFEERKGGMSLLTEVETP
IRNEWGCRCNGSSDGGGMSLLTEVETPIRNEWGCRCNGSSDGGIECGSTPKDLLEAIVRALSIFSKDGIEGPYTL VINTDRWINFLKEEAGHYPLEKRVEESLRGGKIITTPRIEDALVVSERGGDFKLILGQDLSIGYEDREKDAVRLFITE TFTFQWNPEAULLKF (SEQ ID NO : 32).
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la séquence du peptide inséré comprend ou consiste en la séquence DAEFRHDSG (SEQ ID NO : 33 ). Selon un mode de réalisation particulier, cette séquence comprend en N-ter et en C-ter deux bras de liaisons GG, si bien que la séquence du peptide inséré est la séquence GGDAEFRHDSGGG (SEQ ID NO : 34).
Selon un autre aspect particulier, la séquence du monomère d'encapsuline après insertion de la séquence SED ID NO : 34 est la séquence : MEFLKRSFAPLTEKQWQEIDNRAREIFKTQLYGRKFVDVEGPYGWEYAAHPLGEVEVLSDENEVVKWGLRKSL PLIELRATFTLDLWELDNLERGKPNVDLSSLEETVRKVAEFEDEVIFRGCEKSGVKGLLSFEERKGGDAEFRHDSG GGIECGSTPKDLLEAIVRALSIFSKDGIEGPYTLVINTDRWINFLKEEAGHYPLEKRVEESLRGGKMTTPRIEDALW SERGGDFKLILGQDLSIGYEDREKDAVRLFITETFTFQVVNPEALILLKF (SEQ ID NO : 35).
La nanoparticule selon l'invention comprend également une protéine interne, c'est-à-dire une protéine qui se trouve sur la face interne de la surface de la nanoparticule ou à l'intérieur du nano-compartiment, sans être liée à sa surface au moyen d'une liaison covalente. Dans le cas de la présente invention, le terme de « protéine interne » englobe à la fois un oligopeptide, un peptide, un polypeptide ou une protéine, pouvant contenir éventuellement une ou plusieurs chaînes saccharidiques ou lipidiques. Cette protéine interne peut être sous forme monomérique ou multimérique. Toute protéine capable de se lier par son extrémité N ou C-terminale, au moyen de liaisons non covalentes, c'est-à-dire au moyen d'interactions ioniques et/ou hydrophobes, à la cavité interne du domaine P d'un monomère d'encapsuline, est considérée comme une protéine interne, au sens de la présente invention, puisqu'elle se trouve à l'intérieur de la nanoparticule. L'extrémité N ou C-terminale de la protéine interne doit contenir un nombre suffisant d'acides aminés capables d'interagir au moyen d'interactions ioniques et/ou hydrophobes, avec les acides aminés de la cavité interne du domaine P du monomère d'encapsuline. Sutter et Coll puis Radford ont montré en effet qu'une vingtaine d'acides aminés de la cavité interne du domaine P interagissent avec les acides aminés de l'extrémité C-terminale d'une protéine appartenant à l'une des familles suivantes : iron-dependent peroxidases (comprenant les Dyp), ferritin-like protéines (Flp), ferredoxins, Dps-bacterioferritin-like protéines, hemerythrin-like protéines, rubrerythrin-like protéines. Spatialement, cette vingtaine d'acides aminés se trouvent à 5 Â ou moins de l'extrémité C-terminale de la protéine interne et sont bien conservés indépendamment de l'origine du monomère d'encapsuline. De façon corollaire, il a été montré que les séquences des acides aminés qui se situent au niveau des extrémités C- terminales des protéines appartenant aux familles ci-dessus étaient également bien conservées. Radford a identifié un motif de 10 acides aminés (XiGSLX5X6GX8LXi0, SEQID NO : 36, dans laquelle Xi est D ou K, X5 est T, G ou N, X6 est I, V ou L, X8 est S ou I et Χω est K ou Y) dans le domaine C-terminal de ces protéines, comme étant étroitement impliqués dans les interactions avec la vingtaine d'acides aminés conservés de la cavité interne du domaine P du monomère d'encapsuline (tel qu'explicité dans la Figure 2.16 du Rapport de thèse de Radford, 2015), à partir duquel a été défini un motif consensus de 15 acides aminés ayant pour séquence : XiAPX4DGSLX9Xi0GSLKG (SEQ ID NO : 37) (Xi et X4 désignent chacun un acide aminé non déterminé, X9 est T, G ou N, et Xi0 est I ou V) retrouvé dans la majorité des séquences d'acides aminés C-terminales des protéines appartenant à l'une des familles suivantes : iron-dependent peroxidases (comprenant les Dyp), ferritin-like protéines (Flp), ferredoxins, Dps-bacterioferritin-like protéines, hemerythrin-like protéines, rubrerythrin-like protéines, interagissant avec les monomères d'encapsuline. D'autre part, Sutter et Coll ont identifié un motif minimal GGDLGIRK (SEQ ID NO : 38) se trouvant dans la séquence d'acides aminés de l'extrémité C-terminale d'une protéine appartenant à la famille des ferritin-like protéines (Flp), qui interagit avec les acides aminés de la cavité interne du domaine P du monomère d'encapsuline provenant de T. maritima.
Selon un mode de réalisation préféré, la séquence d'acides aminés de la partie C-terminale ou N-terminale, respectivement, de la protéine interne se termine ou commence, respectivement, par un enchaînement d'acides aminés du type l-M-T, dans lequel : I désigne une séquence d'acides aminés dont le nombre total d'acides aminés est compris entre 0 et 30 (bornes incluses), de façon préférée entre 0 et 25 (bornes incluses) et de façon encore plus préférée entre 0 et 20 (bornes incluses), M est la séquence XiGSLX5X6GX8LXi0 (SEQ ID NO : 36), dans laquelle X4 est D ou K, X5 est T, G ou N, X6 est I, V ou L, X8 est S ou I et Χω est K ou Y, la séquence XiAPX4DGSLX9Xi0GSLKG (SEQ ID NO : 37), dans laquelle Xi et X4 désignent chacun un acide aminé non déterminé, X9 est T, G ou N, et X10 est I ou V, ou la séquence GGDLGIRK (SEQ ID NO : 38), et T désigne une séquence d'acides aminés de terminaison dont le nombre total d'acides aminés est compris entre 0 et 15 (bornes incluses), de façon préférée entre 0 et 10 (bornes incluses et de façon encore plus préférée entre 0 et 5 (bornes incluses).
Hormis les protéines appartenant à l'une des familles suivantes : iron-dependent peroxidases (comprenant les Dyp), ferritin-like protéines (Flp), ferredoxins, Dps-bacterioferritin-like protéines, hemerythrin-like protéines, rubrerythrin-like protéines, qui peuvent naturellement se terminer par un enchaînement du type l-M-T au niveau de leur extrémité C-terminale, l'enchaînement du type l-M-T est généralement fusionné à l'extrémité C-terminale ou N-terminale d'une protéine d'intérêt. Selon la structure de la protéine d'intérêt et selon que l'enchaînement l-M-T est fusionné respectivement à l'extrémité C-terminale ou N-terminale de la protéine d'intérêt, la séquence I ou la séquence T, respectivement, peut avantageusement commencer ou se terminer, respectivement, par une séquence d'acides aminés exerçant un rôle de bras de liaison, pour faciliter l'insertion de la protéine dans la cavité interne du domaine P du monomère d'encapsuline. Généralement, le nombre total d'acides aminés de l'enchaînement l-M-T n'excède pas 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, ou 60 acides aminés.
Les acides aminés en positions 1 et 4 de la séquence SEQ ID NO : 37 n'ayant pas de rôle déterminant, ils peuvent être n'importe quel acide aminé choisi parmi les 20 acides aminés naturels ou même être un acide aminé modifié. Le choix des acides aminés en position 1 et 4 peut servir éventuellement à ajuster plus finement les interactions de la séquence SEQ ID NO : 37 avec les acides aminés de la cavité interne du domaine P du monomère d'encapsuline.
Lorsque le monomère d'encapsuline servant à l'insertion de la séquence peptidique selon l'invention provient de T. Maritima, notamment lorsque sa séquence d'acides aminés est la séquence SEQ ID NO : 1 ou la SEQ ID NO : 7 ou une séquence dérivée, notamment lorsque le degré d'identité de la séquence dérivée vis-à-vis de la séquence ID NO : 1 ou SEQ ID NO : 7 est d'au moins 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, la partie C-terminale ou N-terminale, respectivement, de la protéine interne se termine ou commence, respectivement, par un enchaînement d'acides aminés du type l-M-T, dans lequel I désigne une séquence d'acides aminés dont le nombre total d'acides aminés est compris entre 0 à 30 (bornes incluses), de façon préférée entre 0 et 25 (bornes incluses) et de façon encore plus préférée entre 0 et 20 (bornes incluses), M est la séquence GGDLGIRK (SEQ ID NO : 38), la séquence XiGSLXsXgGXgLXio (SEQ ID NO : 36), dans laquelle X1 est D ou K, X5 est T, G ou N, X6 est I, V ou L, X8 est S ou I et X10 est K ou Y, ou la séquence XiAPX4DGSLX9Xi0GSLKG (SEQ ID NO : 37), dans laquelle Xi et X4 désignent chacun un acide aminé non déterminé, X9 est T, G ou N, et Xi0 est I ou V, et T désigne une séquence d'acides aminés de terminaison dans laquelle le nombre total d'acides aminés est compris entre 0 et 15 (bornes incluses), de façon préférée entre 0 et 10 (bornes incluses) et de façon encore plus préférée entre 0 et 5 (bornes incluses). De façon préférée, lorsque M est la séquence GGDLGIRK (SEQ ID NO : 38), I est la séquence GGSENT, ou, de façon encore plus préférée, la séquence IEEETSGGSENT, de sorte que l'enchaînement l-M est la séquence GGSENTGGDLGIRK (SEQ ID NO : 39) ou la séquence IEEETSGGSENTGGDLGIRK (SEQ ID NO: 40). Dans une variante, l'enchaînement l-M-T est la séquence GGSENTGGDLGIRKL (SEQ ID NO : 41), ou, de façon encore plus préférée, la séquence IEEETSGGSENTGGDLGIRKL (SEQ ID NO : 42).
Typiquement, la protéine interne selon l'invention est une protéine de fusion (c'est-à-dire une protéine artificielle) obtenue par recombinaison génétique, selon laquelle l'extrémité C-terminale ou N-terminale d'une protéine d'intérêt a été fusionnée à l'enchaînement l-M-T. La protéine de fusion se présente donc sous la forme NH2-l-M-T-Pr-COOH ou NH2-Pr-l-M-T-COOH dans laquelle Pr désigne la protéine d'intérêt. A titre d'exemple, la protéine d'intérêt est une enzyme, telle que la Glutathion S-transférase (GST), plus particulièrement la Glutathion S-transférase de Schistosoma japonicum, ou une protéine fluorescente, telle que l'eGFP. L'invention concerne également un vecteur bicistronique comprenant une première séquence d'acide nucléique codant pour un monomère d'encapsuline, dans lequel un peptide a été inséré dans un site externe du domaine A du monomère d'encapsuline, en particulier dans celui constitué de la séquence d'acides aminés constitutive du premier feuillet β du domaine A et de la séquence d'acides aminés constitutive de la première structure dépliée contiguë à la séquence d'acides aminés du premier feuillet β, et une deuxième séquence d'acide nucléique codant pour une protéine dont l'extrémité C-terminale ou N-terminale, respectivement, se termine ou commence, respectivement, par un enchaînement du type l-M-T, dans lequel I désigne une séquence d'acides aminés dont le nombre total d'acides aminés est compris entre 0 et 30 (bornes incluses), de façon préférée entre 0 et 25 (bornes incluses) et de façon encore plus préférée entre 0 et 20 (bornes incluses), M est la séquence SEQ ID NO : 36, SEQ ID NO : 37 ou SEQ ID NO : 38, et T désigne une séquence d'acides aminés dont le nombre total d'acides aminés est compris entre 0 et 15 (bornes incluses), de façon préférée entre 0 et 10 (bornes incluses) et de façon encore plus préférée entre 0 et 5 (bornes incluses).
Ce vecteur bicistronique est préférentiellement un vecteur d'expression. Le vecteur peut être, par exemple, un plasmide, un phage, un virus, un baculovirus, un cosmide, un phagemide, un transposon, un chromosome artificiel bactérien ou un chromosome artificiel de levure.
Classiquement, le vecteur est un plasmide. Il contient les éléments nécessaires qui permettent la transcription et/ou la traduction des acides nucléiques d'intérêt en protéines. Il inclut au minimum un promoteur inductible ou constitutif approprié à la cellule hôte, un système de sélection (antibiotique, complémentation..), une séquence SD/kozac, un ou plusieurs sites de fixation des ribosomes, une séquence d'arrêt de la transcription, un codon stop et un codon initiateur. Classiquement, outre les séquences d'acide nucléique d'intérêt, on retrouve dans le plasmide une ou plusieurs origines de réplication (ori), un ou plusieurs promoteurs, un ou plusieurs sites de liaison aux ribosomes (RBS), un ou plusieurs codons « start », un ou plusieurs codons « stop », une ou plusieurs séquences de terminaison, un ou plusieurs marqueurs de sélection, tels que des gènes de résistance à un antibiotique, et/ou un ou plusieurs sites de restriction. Des exemples de plasmides pouvant être utilisés pour insérer les séquences d'acide nucléique d'intérêt, incluent les plasmides pKK (Clontech), pUC, pET (Novagen), pRSET, pREP (Invitrogen), pMAL(New England Biolabs), pVAXl (Life Technology).
Les séquences d'acides nucléiques codant respectivement pour la protéine monomérique d'encapsuline, dans laquelle un peptide a été inséré, et pour la protéine interne, peuvent être sous le contrôle d'un seul et même promoteur.
Plus spécifiquement, le vecteur d'expression bicistronique selon l'invention peut être un plasmide comprenant : un promoteur opérationnel approprié à la cellule hôte, un premier site de fixation aux ribosomes (RBS), un codon d'initiation, une première séquence d'acide nucléique codant pour une séquence d'acides aminés d'un monomère d'encapsuline, telle que la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 ou 7, ou codant pour une séquence d'acides aminés dérivée de cette séquence, dans laquelle a été inséré un peptide, ainsi qu'un codon stop, un deuxième site de fixation aux ribosomes, un deuxième codon d'initiation, une deuxième séquence d'acide nucléique codant pour une seconde protéine (protéine interne) dont l'extrémité C-terminale ou N-terminale, respectivement, se termine ou commence, respectivement, par un enchaînement d'acides aminés de type l-M-T, et un codon stop.
Ce vecteur d'expression bicistronique, après introduction dans une cellule hôte, permet l'expression simultanée dans une même cellule, des protéines monomériques d'encapsuline selon l'invention et de la protéine interne, ce qui facilite l'encapsulation de la protéine interne dans la nanoparticule.
Le vecteur d'expression peut être également un vecteur polycistronique. Selon une première alternative, il comprend une première séquence d'acide nucléique codant pour une protéine monomérique d'encapsuline selon l'invention et deux séquences d'acides nucléiques ou plus, codant pour des protéines internes différentes que l'on souhaite encapsuler, dans lesquelles les extrémités C-terminales ou N-terminales, respectivement, se terminent ou commencent, respectivement, par un enchaînement d'acides aminés du type l-M-T, tel que décrit précédemment. Selon une deuxième alternative, le vecteur polycistronique comprend une première séquence d'acide nucléique codant pour une première protéine monomérique d'encapsuline, une deuxième séquence d'acide nucléique codant pour une seconde protéine monomérique d'encapsuline se distinguant de la première protéine en ce qu'un peptide a été inséré dans un site externe du domaine A du monomère d'encapsuline, en particulier dans celui constitué de la séquence d'acides aminés constitutive du premier feuillet β du domaine A et de la séquence d'acides aminés constitutive de la première structure dépliée contiguë à la séquence d'acides aminés du premier feuillet β, et une ou plusieurs séquences codant pour une ou plusieurs protéines internes que l'on souhaite encapsuler, les extrémités C-terminales ou N-terminales, respectivement, de ces protéines se terminant ou commençant, respectivement, par un enchaînement d'acides aminés du type l-M-T. Ce type de vecteur permet d'obtenir des nanoparticules dont la surface est constituée d'un mélange de deux ensembles de monomères ; un premier ensemble constitué de monomères d'encapsuline tous identiques entre eux et un deuxième ensemble constitué de monomères d'encapsuline, également tous identiques entre eux, mais se distinguant des monomères du premier ensemble par l'insertion dans leurs séquences d'acides aminés de la séquence peptidique additionnelle au niveau du domaine A des monomères d'encapsuline. Ces nanoparticules contiennent en outre une ou plusieurs protéines internes. L'invention a également pour objet une cellule hôte comprenant un vecteur bicistronique ou polycistronique tels que décrits précédemment. L'invention a encore pour objet une cellule hôte comprenant deux ou plusieurs vecteurs d'expression, permettant de produire les nanoparticules de l'invention. A titre d'exemple, on peut citer une cellule hôte contenant deux vecteurs, le premier vecteur comprenant une séquence d'acide nucléique codant pour un monomère d'encapsuline dans lequel un peptide a été inséré dans un site externe du domaine A du monomère d'encapsuline, en particulier dans celui constitué de la séquence d'acides aminés constitutive du premier feuillet β du domaine A et de la séquence d'acides aminés constitutive de la première structure dépliée contiguë à la séquence d'acides aminés du premier feuillet β, et le deuxième vecteur comprenant une séquence d'acide nucléique codant pour une protéine dont l'extrémité C-terminale ou N-terminale, respectivement, se termine ou commence, respectivement, par un enchaînement d'acides aminés du type l-M-T, dans lequel I désigne une séquence d'acides aminés dont le nombre est compris entre 0 et 30 (bornes incluses), de façon préférée entre 0 et 25 (bornes incluses) et de façon encore plus préférée entre 0 et 20 (bornes incluses), M est la séquence SEQ ID NO : 36, SEQ ID NO : 37 ou SEQ ID NO : 38, et T désigne une séquence d'acides aminés dont le nombre est compris entre 0 et 15 (bornes incluses), de façon préférée entre 0 et 10 (bornes incluses) et de façon encore plus préférée entre 0 et 5 (bornes incluses).
La cellule hôte peut être une cellule procaryote ou une cellule eucaryote. Parmi les cellules procaryotes convenant à l'invention, on cite les eubactéries, telles que les bactéries Gram+ ou Gram-, les agrobacterium, et les archéobactéries. Parmi les bactéries Gram-, on cite comme hôtes de choix les souches BL21(DE3), JM109, FB850, Shuffle, Lemo21, rosetta, K12 et origami d'E. coli. Parmi les bactéries Gram+, on cite comme hôte de choix la souche RIK 1285 de Bacillus subtilis. Parmi les cellules eucaryotes, on cite comme exemples des cellules de mammifères telles que les cellules d'une lignée CHO, des cellules d'insectes (par exemple, les cellules de la lignée Sf9), des cellules de levures provenant de Saccharomyces cerevisiae ou Pichia pastoris ainsi que toute autre cellule eucaryote unicellulaire, et des cellules de plantes.
La nature du vecteur d'expression est choisie en fonction du type de cellule hôte. Les méthodes utilisées pour introduire un ou plusieurs vecteur(s) d'expression selon l'invention dans des cellules hôtes sont bien connues de l'homme de métier. Lorsque le vecteur est par exemple un plasmide, un cosmide, un chromosome artificiel de bactérie ou de levure, on peut par exemple utiliser les méthodes d'électroporation, de transfection chimique ou de choc thermique. Lorsque le vecteur est infectieux, il est introduit par infection et/ou transduction des cellules hôtes, comme par exemple en infectant des cellules Sf9 par le baculovirus, des cellules de plantes avec le virus de la mosaïque du tabac (VMT), ou des bactéries avec des bactériophages. Selon un aspect particulier, la souche BL21(DE3) d'E. coli est transformée par choc thermique avec un vecteur d'expression bicistronique tel que décrit ci-dessus. L'invention a également pour objet un procédé de production de nanoparticules comprenant un assemblage de monomères d'encapsuline, selon lesquelles un peptide a été inséré dans la séquence d'acides aminés d'au moins un des monomères d'encapsuline, le site d'insertion du peptide étant situé dans un site externe du domaine A, en particulier dans celui constitué de la séquence d'acides aminés constitutive du premier feuillet β du domaine A et de la séquence d'acides aminés constitutive de la première structure dépliée contiguë à la séquence d'acides aminés du premier feuillet β, et comprenant en outre une ou des protéine(s) interne(s), selon lequel :
On cultive des cellules hôtes telles que décrites précédemment, dans des conditions favorisant l'expression des monomères d'encapsuline et de la ou des protéine(s) interne(s) ; et
On récupère les nanoparticules contenant la protéine interne, résultant de l'auto-assemblage des monomères d'encapsuline.
Les nanoparticules peuvent être récupérées à partir du culot cellulaire ou du surnageant, en mettant en oeuvre des moyens classiques tels que la centrifugation, la clarification, la microfiltration, ou la nanofiltration.
Selon un mode de réalisation, lorsque la cellule hôte est une bactérie, le vecteur peut contenir un opéron inductible (par exemple, un opéron lactose (Lacl) inductible par l'ajout d'Isopropyl β-D-l-thiogalactopyranoside, ou IPTG).
Selon un autre mode de réalisation, lorsque les cellules hôtes sont des cellules eucaryotes, par exemple des cellules de mammifères, d'insectes ou de levures, et si la séquence du monomère d'encapsuline, dans laquelle a été inséré un peptide, selon l'invention, contient un ou plusieurs sites potentiels de glycosylation (notamment, N-glycosylation, O-glycosylation ou fucosylation), un ou plusieurs acides aminés au niveau d'un ou plusieurs de ces sites peuvent être mutés, de façon à ce que le monomère d'encapsuline ne soit plus glycosylée au niveau du(des) site(s) muté(s).
Dans encore un autre aspect, l'invention a pour objet un procédé de purification de nanoparticules comprenant un assemblage de monomères d'encapsuline, selon lequel :
On clarifie un broyât de cellules contenant des nanoparticules comprenant un assemblage de monomères d'encapsuline;
On soumet la solution clarifiée contenant les nanoparticules à une ou plusieurs étape(s) de chromatographie de type multi-modale ;
On récupère l'éluat contenant les assemblages de monomères d'encapsuline, de diamètre supérieur ou égal à 10 nm ;
On élimine en une ou plusieurs fois les contaminants hydrophobes contenus dans l'éluat au moyen d'une solution biphasique;
On récupère la phase aqueuse que l'on soumet à une ou plusieurs étape(s) de polissage, et
On récupère la solution purifiée contenant les nanoparticules comprenant un assemblage de monomères d'encapsuline.
Les inventeurs ont montré de façon surprenante que ce procédé de purification, réalisable à l'échelle industrielle, permettait d'obtenir une solution contenant les nanoparticules comprenant un assemblage de monomères d'encapsuline, avec un degré de pureté généralement d'au moins 85 %.
Selon un mode de réalisation du procédé de purification, les nanoparticules comprenant un assemblage de monomères d'encapsuline ont été produites par des bactéries Gram + ou Gram -, notamment par E.coli, et plus particulièrement par la souche BL21(DE3) d'E. coli.
Les méthodes pour obtenir un broyât de cellules à partir d'un culot ou d'une suspension cellulaire et les méthodes de clarification sont bien connues de l'homme du métier (voir, par exemple : Effio & Hubbuch, Biotechnol. J (2015); 10(5) : 715-727). Le broyât de cellules peut par exemple être obtenu par des techniques de broyage, de lyse enzymatique, de casse mécanique ou de choc osmotique.
Dans l'étape de chromatographie de type multimodale, la séparation se fait en combinant au moins deux modes différents, sélectionnés dans l'ensemble des modes suivants : exclusion de taille, affinité, échange d'ions, interaction hydrophobe, ou encore des interactions hydrogène ou π-π, avec un seul et même support de chromatographie. Avantageusement, le support de chromatographie multimodale est choisi de telle sorte que la séparation se fait en combinant les modes d'exclusion de taille, d'interactions hydrophobes et basés sur la charge. La résine multimodale Capto™ Core 700 (GE Healthcare) convient à cet usage, mais d'autres résines pourraient être utilisées. Selon un mode de réalisation, la résine multimodale est utilisée pour garnir une colonne. Les dimensions et le nombre de colonnes, ainsi que les conditions expérimentales à utiliser, peuvent être optimisées par l'homme du métier. L'étape de séparation de phase est réalisée au moyen d'une solution biphasique, par exemple à base de détergent et d'une solution aqueuse, ou à base de polymère et d'une solution aqueuse (Effio & Hubbuch, Biotechnol. J (2015); 10(5) : 715-727) ; la solution aqueuse peut par exemple être une solution saline de type tampon phosphate. Le détergent peut être non ionique ou ionique. Il doit avoir une température de séparation de phase suffisamment basse, de façon à ne pas dénaturer les protéines. Selon un mode de réalisation particulier, le détergent utilisé est non ionique, et plus particulièrement le Triton X-114. Le procédé de purification selon l'invention peut comporter une, deux, trois, ou plus, étapes de séparation de phase. Dans le cas où la cellule hôte utilisée pour produire l'encapsuline est E.coli, cette étape de séparation de phase est particulièrement utile pour éliminer un contaminant hydrophobe majoritaire, la protéine OmpF (Outer membrane protein F). Cette étape permet aussi de diminuer le taux d'endotoxines bactériennes.
Parmi les méthodes convenant à l'étape de polissage, on peut citer la chromatographie par exclusion de taille (appelée également filtration sur gel), la filtration sur membrane, la chromatographie par échange d'ions, la chromatographie multimodale, ou toute autre méthode pouvant être sélectionnée par l'homme du métier. L'utilisation d'une colonne de filtration sur gel Superdex 200 10/300 Increase (GE Healthcare) est particulièrement adaptée pour cette étape de polissage. Cette étape permet d'isoler la fraction purifiée correspondant aux nanoparticules d'encapsuline.
La solution purifiée contenant les nanoparticules comprenant un assemblage de monomères d'encapsuline, peut être concentrée par des méthodes connues de l'homme du métier.
Le procédé de purification est également utilisable pour purifier des nanoparticules comprenant un assemblage de monomères d'encapsuline, dans lesquelles un peptide a été inséré dans la séquence d'acides aminés d'au moins un des monomères d'encapsuline, et comprenant éventuellement une protéine interne.
Ce procédé de purification peut également être utilisé pour purifier des nanoparticules comprenant un assemblage de monomères d'encapsuline, dans lesquelles un peptide comprenant la séquence EVETPXgRXgXg (SEQ ID NO : 8) où X6 est I ou T, X8 est N, S, T ou R, et X9 est E ou G, en particulier la séquence EVETPIRNE (SEQ ID NO : 9), ou comprenant la séquence DAEFRHDSG (SEQ ID NO : 33), a été inséré dans la séquence d'acides aminés d'au moins un desdits monomères d'encapsuline, et comprenant en outre une protéine interne. L'invention a également pour objet une composition immunogène comprenant des nanoparticules qui comprennent un assemblage de monomères d'encapsuline, selon lesquelles un peptide a été inséré dans la séquence d'acides aminés d'au moins un des monomères d'encapsuline, le site d'insertion du peptide étant situé dans un site externe du domaine A, en particulier dans celui constitué de la séquence d'acides aminés constitutive du premier feuillet β du domaine A et de la séquence d'acides aminés constitutive de la première structure dépliée contiguë à la séquence d'acides aminés du premier feuillet β et comprenant en outre une protéine interne, et telles que décrites dans leurs différents modes de réalisation.
Avantageusement, lorsque le peptide inséré et/ou la protéine interne provien(nen)t d'un agent pathogène ou représente(nt) une cible immunothérapeutique potentielle, la composition contenant les nanoparticules selon l'invention induit, après administration à un individu, une réponse immune spécifique à l'encontre du peptide inséré et/ou de la protéine interne.
Par composition immunogène (ou immunogénique) au sens de la présente invention, on entend une composition capable d'induire après administration chez un individu une réponse humorale (c'est-à-dire médiée par les anticorps) et/ou cellulaire (c'est-à-dire médiée par les lymphocytes T) spécifique(s) dirigée(s) contre au moins le peptide qui a été inséré dans au moins un des monomères d'encapsuline et/ou contre la protéine qui se trouve à l'intérieur des nanoparticules. Typiquement, la composition immunogène induit une réponse humorale spécifique à l'encontre du peptide qui a été inséré dans au moins un des monomères d'encapsuline, et pas contre l'encapsuline elle-même.
Le terme d'individu désigne aussi bien un sujet sain qu'un sujet malade et concerne aussi bien l'homme que l'animal.
La réponse immunitaire (ou immune) peut inclure un ou plusieurs des effets suivants : la production d'anticorps spécifiques (par exemple, IgA, IgG, IgM) par les lymphocytes B ; et/ou l'activation de lymphocytes T régulateurs, cytotoxiques ou auxiliaires, et/ou des lymphocytes T dirigés spécifiquement contre une protéine présente dans la composition immunogène. Elle peut inclure également l'activation des cellules impliquées dans le développement de l'immunité innée, telles que les monocytes/macrophages, les neutrophiles, les éosinophiles, les cellules dendritiques et plus généralement les cellules présentatrices de l'antigène.
Bien que la composition immunogène selon l'invention soit capable en tant que telle d'induire une réponse humorale spécifique à l'encontre du peptide qui a été inséré dans au moins un des monomères d'encapsuline, on peut renforcer la réponse immune spécifique à l'encontre de ce peptide en y ajoutant un adjuvant. Par adjuvant, on entend toute substance capable d'augmenter la réponse immune spécifique à l'encontre du peptide inséré et/ou de la protéine interne, qu'elle soit d'ordre humorale et/ou cellulaire. A titre d'exemple, on cite les adjuvants à base d'émulsions, telles que les émulsions huile dans eau ou eau dans huile, les sels de calcium ou d'aluminium tels que l'hydroxyde d'aluminium et/ou le phosphate d'aluminium, les agonistes du TLR ou les cytokines. Le(s) adjuvant(s) peu(ven)t être choisi(s) en fonction de l'orientation de la réponse immune spécifique que l'on souhaite renforcer. Il peut s'agir notamment d'un adjuvant de type Thl ou de type Th2.
La composition immunogène peut être administrée par n'importe quelle voie utilisée pour induire une réponse immune à un antigène, incluant notamment la voie intradermique, sous-cutanée, intramusculaire, parentérale, mucosale (par exemple, nasale) ou trans-cutanée.
Lorsque le peptide inséré dans au moins un des monomères d'encapsuline comprend la séquence EVETPX6RX8X9 (SEQ ID NO : 8) où X6 est I ou T, X8 est N, S, T ou R, et X9 est E ou G, ou plus particulièrement la séquence EVETPIRNE (SEQ ID NO : 9), la composition immunogène selon l'invention induit une réponse immune humorale et/ou cellulaire spécifique(s) à l'encontre de la protéine M2 du virus grippal, et plus globalement à l'encontre du virus grippal de type A, qu'il soit d'origine animale ou humaine, notamment contre le virus grippal de type A H1N1, puisque cette séquence comprend un épitope du domaine extracellulaire de la protéine M2 du virus grippal qui est un antigène universel de la grippe de type A (Neirynck S et Coll, Nature Medicine (1999) ; 5(10) :1157-1163 ; Fiers W et Coll., Virus Res (2004) ; 103 (1-2) :173-176 ; Deng L et Coll, Vaccines (2015) ; 3 :105-136). Ainsi, selon un mode de réalisation particulier de l'invention, la réponse immune est dirigée contre le virus grippal.
Dans un aspect particulier, l'invention a pour objet une composition immunogène comprenant des nanoparticules qui comprennent un assemblage de monomères d'encapsuline, selon lesquelles un peptide a été inséré dans la séquence d'acides aminés d'au moins un des monomères d'encapsuline, le site d'insertion du peptide étant situé dans un site externe du domaine A constitué de la séquence d'acides aminés constitutive du premier feuillet β du domaine A et de la séquence d'acides aminés constitutive de la première structure dépliée contiguë à la séquence d'acides aminés du premier feuillet β. L'invention a également pour objet un monomère d'encapsuline dans lequel a été inséré, dans sa séquence d'acides aminés, un peptide comprenant la séquence EVETPX6RX8X9 (SEQ ID NO : 8) où X6 est I ou T, X8 est N, S, T ou R, et X9 est E ou G, plus particulièrement la séquence EVETPIRNE (SEQ ID NO : 9), ou un peptide comprenant la séquence DAEFRHDSG (SEQ ID NO : 33).
Selon un mode de réalisation de cet objet, le peptide a été inséré dans un site externe du domaine A du monomère, en particulier dans celui constitué par la séquence d'acides aminés constitutive du premier feuillet β du domaine A et de la séquence d'acides aminés constitutive de la première structure dépliée contiguë à la séquence d'acides aminés du premier feuillet β.
Selon un mode de réalisation très particulier, la séquence du monomère d'encapsuline dans lequel a été inséré un peptide selon l'invention est la séquence SEQ ID NO : 30, la séquence SEQ ID NO : 31, ou la séquence SEQ ID NO : 32. L'invention a également pour objet une séquence d'acide nucléique codant pour : 1. une protéine monomérique d'encapsuline, telle que celle correspondant à la séquence SEQ ID NO : 1 ou 7, dans laquelle a été insérée une séquence peptidique comprenant la séquence EVETPX6RXgXg (SEQ ID NO : 8) où X6 est I ou T, X8 est N, S, T ou R, et X9 est E ou G, plus particulièrement la séquence EVETPIRNE (SEQ ID NO : 9), ou une séquence peptidique comprenant la séquence DAEFRHDSG (SEQ ID NO : 33), ou pour 2. une protéine monomérique d'encapsuline ayant la séquence SEQ ID NO : 30, la séquence ID NO: 31, ou la séquence ID NO: 32, ou une protéine dérivée de l'une de ces séquences.
La séquence d'acide nucléique objet de l'invention peut également être un vecteur comprenant l'une des séquences d'acides nucléiques telles que définies en 1. et 2.
Les séquences d'acides nucléiques codant pour l'une des protéines monomériques d'encapsuline peuvent être des ADN ou des ARN, simple brin ou double brin. Elles peuvent être obtenues au moyen de procédures de clonage classiques, comprenant par exemple l'excision de ladite séquence puis son isolement, par exemple sur gel d'agarose.
Selon un mode de réalisation très spécifique, la séquence d'acide nucléique codant pour une protéine monomérique d'encapsuline est la séquence SEQ ID NO : 43 :
ATGGAATTTCTGAAACGCAGCTTTGCGCCGCTGACCGAAAAACAGTGGCAGGAAATTGATAACCGCGCGC
GCGAAATTTTTAAAACCCAACTGTATGGCCGCAAATTTGTGGATGTGGAAGGCCCGTATGGCTGGGAATAT
GCGGCGCATCCGCTGGGCGAAGTGGAAGTGCTGAGCGATGAAAACGAAGTGGTGAAATGGGGCCTGCGC
AAAAGCCTGCCGCTGATTGAACTGCGCGCGACCTTTACCCTGGATCTGTGGGAACTGGATAACCTGGAACG
CGGCAAACCGAACGTGGATCTGAGCAGCCTGGAAGAAACCGTGCGCAAAGTGGCGGAATTTGAAGATGA
AGTGATTTTTCGCGGCTGCGAAAAAAGCGGCGTGAAAGGCCTGCTGAGCTTTGAAGAACGCAAAGGAGG
CGAAGTGGAGACTCCGATTCGCAACGAAGGTGGCATTGAATGCGGCAGCACCCCGAAGGATCTGCTGGAA
GCGATTGTGCGCGCGCTGAGCATTTTTAGCAAAGATGGCATTGAAGGCCCGTATACCCTGGTGATTAACAC
CGATCGCTGGATTAACTTTCTGAAAGAAGAAGCGGGCCATTATCCGCTGGAAAAACGTGTGGAAGAAAGC
CTGCGCGGCGGCAAAATTATTACCACCCCGCGCATTGAAGATGCGCTGGTGGTGAGCGAACGCGGCGGCG ATTTTAAACTGATTCTGGGCCAGGATCTGAGCATTGGCTATGAAGATCGCGAAAAAGATGCGGTGCGCCT GTTT ATT ACCG AAACCTTT ACCTTTCAGGTGGTG AACCCGG AAGCGCTG ATTCTGCTG AAATTT, ou une séquence d'acide nucléique dérivée de celle-ci comprenant une séquence d'acide nucléique ayant une identité de séquence d'au moins 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% avec la SEQID NO : 43.
La séquence d'acide nucléique d'intérêt peut être produite par des technologies d'ADN recombinant, des méthodes synthétiques, ou une combinaison de ces méthodes, bien connues de l'homme du métier.
Les codons de la séquence d'acide nucléique d'intérêt peuvent aussi être optimisés de façon à permettre une meilleure transcription et/ou traduction dans la cellule hôte. L'optimisation des codons dans une séquence d'ADN ou d'ARN, est basée sur l'existence de la dégénérescence du code génétique, et consiste par exemple à remplacer un ou plusieurs codons par des codons plus fréquemment utilisés par la cellule hôte, comme décrit dans US 2004/0209241, et/ou à optimiser le ratio du contenu en G/C, comme décrit dans US 2011/0269950. L'optimisation des codons des séquences d'acides nucléiques est mise en œuvre de façon à ne pas modifier de façon significative la séquence des acides aminés, et donc en utilisant préférentiellement des codons synonymes (c'est-à-dire, codant pour le même acide aminé).
On peut également introduire des mutations dans la séquence d'acide nucléique selon l'invention, de manière par exemple à supprimer des sites de glycosylation (N-glycosylation, O-glycosylation ou fucosylation) éventuels.
Le vecteur peut être, par exemple, un plasmide, un phage, un virus, un baculovirus, un cosmide, un phagemide, un transposon, un chromosome artificiel bactérien ou un chromosome artificiel de levure. Classiquement, le vecteur est un plasmide. Il contient les éléments nécessaires qui permettent la transcription et/ou la traduction des acides nucléiques d'intérêt en protéines. Il inclut au minimum un promoteur inductible ou constitutif approprié à la cellule hôte, un système de sélection (antibiotique, complémentation..), une séquence SD/kozac, un ou plusieurs sites de fixation des ribosomes, une séquence d'arrêt de la transcription, un codon stop et un codon initiateur. Classiquement, outre les séquences d'acide nucléique d'intérêt, on retrouve dans le plasmide une ou plusieurs origines de réplication (ori), un ou plusieurs promoteurs, un ou plusieurs sites de liaison aux ribosomes (RBS), un ou plusieurs codons « start », un ou plusieurs codons « stop », une ou plusieurs séquences de terminaison, un ou plusieurs marqueurs de sélection, tels que des gènes de résistance à un antibiotique, et/ou un ou plusieurs sites de restriction. Des exemples de plasmides pouvant être utilisés pour insérer les séquences d'acide nucléique d'intérêt, incluent les plasmides pKK (Clontech), pUC, pET (Novagen), pRSET, pREP (Invitrogen), pMAL(New England Biolabs), pVAXl (Life Technology). D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention pourront encore apparaître à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous, illustrés par les figures annexées, donnés à titre illustratif mais nullement limitatif.
[BREVE DESCRIPTION DES FIGURES]
Figure 1 : Structure du monomère d'encapsuline de A) Thermotoga maritima (PDB ID : 3DKT) et de B) Pyrococcus furiosus (PDB ID : 2E0Z). Le site d'insertion externe correspondant au premier feuillet β du domaine A et à la structure dépliée contiguë au premier feuillet β est présenté en noir sur les structures et cerclé de pointillés.
Figure 2 : Représentation schématique du plasmide utilisé pour le clonage (dérivé du plasmide pET28b).
Figure 3 : Analyse SDS-PAGE après les différentes étapes-clés du protocole de purification pour chacune des nanoparticules XIP1, XIP2 et XIP3. (M) marqueur de poids moléculaire (en kDa) ; (1) fraction totale ; (2a) fraction soluble ; (2b) fraction soluble filtrée ; (3) fraction après passage sur Capto™ Core 700 ; (4a, b, c) phase aqueuse après une première, une deuxième et éventuellement une troisième extraction différentielle au triton X-114, respectivement ; (5) assemblage purifié après chromatographie d'exclusion de taille et concentration de l'échantillon. La flèche noire pleine correspond au monomère d'encapsuline et la flèche en pointillé à l'eGFP.
Figure 4 : Analyse de la distribution de taille (nm) des nanoparticules XIP1 (en haut), XIP2 (au milieu) etXIP3 (en bas), par Diffusion dynamique de la lumière (DLS).
Figure 5 : Observation des nanoparticules d'encapsuline-M2e contenant l'eGFP (encapsuline-M2e + eGFP, ou XIP2), par microscopie électronique à transmission (MET).
Figure 6 : Analyse des réponses anticorps IgGl (A) et lgG2a (B) dans chaque groupe de souris avant immunisation (JO) et après immunisation (J42), avec l'une des compositions suivantes : encapsuline-M2e + eGFP (XIP2), avec ou sans adjuvant, ovalbumine-M2e avec adjuvant, eGFP avec adjuvant, ou une composition contrôle PBS avec adjuvant, vis-à-vis du contrôle tampon, l'eGFP, la streptavidine, la streptavidine-M2e, l'ovalbumine, l'ovalbumine-M2e, l'encapsuline et l'encapsuline-M2e + eGFP (XIP2).
Figure 7 : Production d'anticorps IgGl chez les groupes de souris immunisées avec l'encapsuline-M2e + eGFP (XIP2), avec adjuvant (symboles pleins) ou sans adjuvant (symboles creux), mesurée par ELISA sur les sérums prélevés à J42. Le test ELISA permet d'estimer la capacité des anticorps à reconnaître l'encapsuline-M2e + eGFP (XIP2) (symboles ronds), l'encapsuline (symboles triangles pointe en bas), la streptavidine-M2e (symboles carrés) et la streptavidine (symboles triangles pointe en haut).
Figure 8 : Production d'anticorps IgGl contre l'eGFP à J42, dans le sérum de chacune des 7 souris du groupe immunisé avec l'encapsuline-M2e + eGFP (XIP2) avec adjuvant.
[EXEMPLES]
Exemple 1 : Production de nanoparticules d'encapsuline contenant une protéine fluorescente (eGFP)
Trois préparations de nanoparticules d'encapsuline ont été préparées et évaluées pour leur capacité à encapsuler une protéine fluorescente, l'eGFP. L'eGFP correspond à de la GFP (L29345 ; Gl : 606383 ; product : green-fluorescent protein ; protéine ID : AAA58246), modifiée par l'introduction des 6 mutations Q25H, F64L, S65T, M141L, P157Q, K172E.
La première préparation, dite de référence, contenait des nanoparticules d'encapsuline dont la séquence du monomère (dit monomère de référence) a été dérivée de la séquence native de Thermotoga maritima. Elle contenait la séquence correspondant aux acides aminés 4 à 254 de la séquence native de T. maritima (NC 000853 ; GL15642775 gène locus TM0785, product « bactériocine », protéine ID : NP_228594) à laquelle ont été rajoutés les acides aminés FQWNPEALILLKF en C-terminal, en concordance avec la structure cristallisée de la protéine (PDB code : 3DKT) telle que décrite par Sutter et Coll. 2008. Elle contenait également une substitution C197S (C200S par rapport à la numérotation de l'encapsuline native de T. maritima).
La deuxième préparation contenait des nanoparticules d'encapsuline, dont la séquence du monomère correspondait à celle du monomère de référence, hormis l'insertion de la séquence GGEVETPIRNEGG entre les acides aminés K138 et 1139. La séquence EVETPIRNE, que l'on retrouve dans la séquence d'acides aminés consensus de l'ectodomaine de la protéine M2 du virus Influenza A H1N1 humain (GL21693176 ; gène locus AF389121.1 ; product « matrix protein M2 », UniProt ID : P06821 ; souche Puerto Rico 8/1934) a été encadrée par deux linkers GG. La séquence a été insérée dans le site externe du domaine A constitué de la séquence d'acides aminés constitutive du premier feuillet β du domaine A et de la séquence d'acides aminés constitutive de la première structure dépliée contiguë à la séquence d'acides aminés du premier feuillet β.
La troisième préparation contenait des nanoparticules d'encapsuline, dont la séquence du monomère correspondait à celle du monomère de référence, hormis l'insertion de la séquence GGGGGGHHHHHHGGGGG (boucle His) entre les acides aminés P42 et Y43. La séquence a été insérée dans un site interne du monomère d'encapsuline se trouvant dans le domaine P.
Ces 3 préparations de nanoparticules contenant eGFP ont été produites par des bactéries E.coli transformées au moyen de plasmides bicistroniques obtenus par insertion de constructions nucléotidiques spécifiques (Cl à C3, voir ci-dessous). Ces constructions contenaient notamment dans le sens 5'->3', la séquence codant pour l'un des monomères d'encapsuline tels que décrits ci-dessus et la séquence codant pour l'eGFP qui a été fusionnée à la séquence codant pour la séquence peptidique IEEETSGGSENTGGDLGIRKL qui correspond au domaine C-terminal (C-ter) conservé de la protéine Flp de T. maritima (NC 000853 ; Gl:15642775 gène locus TM0786, product « ferritin/ribonucleotide reductase-like protein », protéine ID : NP_228595). Un codon supplémentaire (CTT, codant pour une Leucine) a été inséré entre l'extrémité 3' terminale de la séquence codant pour l'eGFP et l'extrémité 5' terminale de la séquence codant pour le domaine C-ter de la protéine Flp, afin d'introduire un site de restriction Hindlll.
Préparation des plasmides bi-cistroniques
Les séquences, ainsi que le tableau indiquant les positions des différents éléments (inserts) dans les séquences nucléotidiques de ces 3 constructions, sont indiquées ci-dessous : > Construction Cl : Construction bicistronique Encapsulin eGFP-FIpCter
TCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGGAATTTCTGAAACGCAGCTTTGCGCCGC
TGACCGAAAAACAGTGGCAGGAAATTGATAACCGCGCGCGCGAAATTTTTAAAACCCAACTGTATGGCCG
CAAATTTGTGGATGTGGAAGGCCCGTATGGCTGGGAATATGCGGCGCATCCGCTGGGCGAAGTGGAAGT
GCTGAGCGATGAAAACGAAGTGGTGAAATGGGGCCTGCGCAAAAGCCTGCCGCTGATTGAACTGCGCGC
GACCTTTACCCTGGATCTGTGGGAACTGGATAACCTGGAACGCGGCAAACCGAACGTGGATCTGAGCAGC
CTGGAAGAAACCGTGCGCAAAGTGGCGGAATTTGAAGATGAAGTGATTTTTCGCGGCTGCGAAAAAAGCG
GCGTGAAAGGCCTGCTGAGCTTTGAAGAACGCAAAATTGAATGCGGCAGCACCCCGAAGGATCTGCTGGA
AGCGATTGTGCGCGCGCTGAGCATTTTTAGCAAAGATGGCATTGAAGGCCCGTATACCCTGGTGATTAACA
CCGATCGCTGGATTAACTTTCTGAAAGAAGAAGCGGGCCATTATCCGCTGGAAAAACGTGTGGAAGAAAG
CCTGCGCGGCGGCAAAATTATTACCACCCCGCGCATTGAAGATGCGCTGGTGGTGAGCGAACGCGGCGGC
GATTTTAAACTGATTCTGGGCCAGGATCTGAGCATTGGCTATGAAGATCGCGAAAAAGATGCGGTGCGCC
TGTTTATTACCGAAACCTTTACCTTTCAGGTGGTGAACCCGGAAGCGCTGATTCTGCTGAAATTTTAACTGA
CTAGGGATCCAAGGAGATATCATATGAGCAAAGGCGAAGAACTGTTTACCGGCGTGGTGCCGATTCTGGT
GGAACTGGATGGCGATGTGAACGGCCATAAATTTAGCGTGAGCGGCGAAGGCGAAGGCGATGCGACCTA
TGGCAAACTGACCCTGAAATTTATTTGCACCACCGGCAAACTGCCGGTGCCGTGGCCGACCCTGGTGACCA
CCCTGACCTATGGCGTGCAGTGCTTTAGCCGCTATCCGGATCACATGAAACGCCATGAI I I I I I IAAAAGCG
CGATGCCGGAAGGCTATGTGCAGGAACGCACCATTTTTTTTAAAGATGATGGCAACTATAAAACCCGCGCG
GAAGTGAAATTTGAAGGCGATACCCTGGTGAACCGCATTGAACTGAAAGGCATTGATTTTAAAGAAGATG
G C AAC ATT CTG G G CC AT A AACT G G A AT AT AACT AT A AC AG CC AT AACGT GT AT ATT ATGGCGG AT AAAC AG
AAAAACGGCATTAAAGTGAACTTTAAAATTCGCCATAACATTGAAGATGGCAGCGTGCAACTGGCGGATC
ATTATCAGCAGAACACCCCGATTGGCGATGGCCCGGTGCTGCTGCCGGATAACCATTATCTGAGCACCCAG
AGCGCGCTGAGCAAAGATCCGAACGAAAAACGCGATCACATGGTGCTGCTGGAATTTGTGACCGCGGCGG
GCATTACCCACGGCATGGATGAACTGTATAAGCTTATTGAAGAAGAAACCAGCGGCGGCAGCGAAAACAC CGGCGGCGATCTGGGCATTCGCAAACTGTAACTAAGTAACTCGAG (SEQ ID NO : 44) > Construction C2 : Construction bicistronique Encapsulin_M2e_eGFP-FlpCter
TCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGGAATTTCTGAAACGCAGCTTTGCGCCGC
TGACCGAAAAACAGTGGCAGGAAATTGATAACCGCGCGCGCGAAATTTTTAAAACCCAACTGTATGGCCG
CAAATTTGTGGATGTGGAAGGCCCGTATGGCTGGGAATATGCGGCGCATCCGCTGGGCGAAGTGGAAGT
GCTGAGCGATGAAAACGAAGTGGTGAAATGGGGCCTGCGCAAAAGCCTGCCGCTGATTGAACTGCGCGC
GACCTTTACCCTGGATCTGTGGGAACTGGATAACCTGGAACGCGGCAAACCGAACGTGGATCTGAGCAGC
CTGGAAGAAACCGTGCGCAAAGTGGCGGAATTTGAAGATGAAGTGATTTTTCGCGGCTGCGAAAAAAGCG
GCGTGAAAGGCCTGCTGAGCTTTGAAGAACGCAAAGGAGGCGAAGTGGAGACTCCGATTCGCAACGAAG
GTGGCATTGAATGCGGCAGCACCCCGAAGGATCTGCTGGAAGCGATTGTGCGCGCGCTGAGCATTTTTAG
CAAAGATGGCATTGAAGGCCCGTATACCCTGGTGATTAACACCGATCGCTGGATTAACTTTCTGAAAGAAG
AAGCGGGCCATTATCCGCTGGAAAAACGTGTGGAAGAAAGCCTGCGCGGCGGCAAAATTATTACCACCCC
GCGCATTGAAGATGCGCTGGTGGTGAGCGAACGCGGCGGCGATTTTAAACTGATTCTGGGCCAGGATCTG
AGCATTGGCTATGAAGATCGCGAAAAAGATGCGGTGCGCCTGTTTATTACCGAAACCTTTACCTTTCAGGT
GGTGAACCCGGAAGCGCTGATTCTGCTGAAATTTTAACTGACTAGGGATCCAAGGAGATATCATATGAGCA
AAGGCGAAGAACTGTTTACCGGCGTGGTGCCGATTCTGGTGGAACTGGATGGCGATGTGAACGGCCATAA
ATTTAGCGTGAGCGGCGAAGGCGAAGGCGATGCGACCTATGGCAAACTGACCCTGAAATTTATTTGCACC
ACCGGCAAACTGCCGGTGCCGTGGCCGACCCTGGTGACCACCCTGACCTATGGCGTGCAGTGCTTTAGCCG
CTATCCGGATCACATGAAACGCCATGA I I I I I I IAAAAGCGCGATGCCGGAAGGCTATGTGCAGGAACGCA
CCATTTTTTTTAAAGATGATGGCAACTATAAAACCCGCGCGGAAGTGAAATTTGAAGGCGATACCCTGGTG
AACCGC ATTG AACT G AAAGGCATT G ΑΤΠΤ AAAG AAG ATGGCAACATT CTGGGCCAT AAACTGG AATATAA
CTATAACAGCCATAACGTGTATATTATGGCGGATAAACAGAAAAACGGCATTAAAGTGAACTTTAAAATTC
GCCATAACATTGAAGATGGCAGCGTGCAACTGGCGGATCATTATCAGCAGAACACCCCGATTGGCGATGG
CCCGGTGCTGCTGCCGGATAACCATTATCTGAGCACCCAGAGCGCGCTGAGCAAAGATCCGAACGAAAAA
CGCGATCACATGGTGCTGCTGGAATTTGTGACCGCGGCGGGCATTACCCACGGCATGGATGAACTGTATA
AGCTTATTGAAGAAGAAACCAGCGGCGGCAGCGAAAACACCGGCGGCGATCTGGGCATTCGCAAACTGTA ACT AAGT AACT CG AG (SEQID NO : 45) > Construction C3 : Construction bicistronique Encapsulin Hisloop eGFP-FIpCter
TCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGGAATTTCTGAAACGCAGCTTTGCGCCGC
TGACCGAAAAACAGTGGCAGGAAATTGATAACCGCGCGCGCGAAATTTTTAAAACCCAACTGTATGGCCG
CAAATTTGTGGATGTGGAAGGTCCGGGCGGTGGAGGCGGAGGTCATCACCATCACCATCACGGCGGTGG
CGGAGGGTATGGCTGGGAATATGCGGCGCATCCGCTGGGCGAAGTGGAAGTGCTGAGCGATGAAAACGA
AGTGGTGAAATGGGGCCTGCGCAAAAGCCTGCCGCTGATTGAACTGCGCGCGACCTTTACCCTGGATCTGT
GGGAACTGGATAACCTGGAACGCGGCAAACCGAACGTGGATCTGAGCAGCCTGGAAGAAACCGTGCGCA
AAGTGGCGGAATTTGAAGATGAAGTGATTTTTCGCGGCTGCGAAAAAAGCGGCGTGAAAGGCCTGCTGA
GCTTTGAAGAACGCAAAATTGAATGCGGCAGCACCCCGAAGGATCTGCTGGAAGCGATTGTGCGCGCGCT
GAGCATTTTTAGCAAAGATGGCATTGAAGGCCCGTATACCCTGGTGATTAACACCGATCGCTGGATTAACT
TTCTGAAAGAAGAAGCGGGCCATTATCCGCTGGAAAAACGTGTGGAAGAAAGCCTGCGCGGCGGCAAAA
TTATTACCACCCCGCGCATTGAAGATGCGCTGGTGGTGAGCGAACGCGGCGGCGATTTTAAACTGATTCTG
GGCCAGGATCTGAGCATTGGCTATGAAGATCGCGAAAAAGATGCGGTGCGCCTGTTTATTACCGAAACCTT
TACCTTTCAGGTGGTGAACCCGGAAGCGCTGATTCTGCTGAAATTTTAACTGACTAGGGATCCAAGGAGAT
ATCATATGAGCAAAGGCGAAGAACTGTTTACCGGCGTGGTGCCGATTCTGGTGGAACTGGATGGCGATGT
GAACGGCCATAAATTTAGCGTGAGCGGCGAAGGCGAAGGCGATGCGACCTATGGCAAACTGACCCTGAA
ATTTATTTGCACCACCGGCAAACTGCCGGTGCCGTGGCCGACCCTGGTGACCACCCTGACCTATGGCGTGC
AGTGCTTTAGCCGCTATCCGGATCACATGAAACGCCATGAn I I I I IAAAAGCGCGATGCCGGAAGGCTAT
GTGCAGGAACGCACCAI I I I I ITTAAAGATGATGGCAACTATAAAACCCGCGCGGAAGTGAAATTTGAAGG
CGATACCCTGGTGAACCGCATTGAACTGAAAGGCATTGATTTTAAAGAAGATGGCAACATTCTGGGCCATA
AACTGGAATATAACTATAACAGCCATAACGTGTATATTATGGCGGATAAACAGAAAAACGGCATTAAAGTG
AACTTTAAAATTCGCCATAACATTGAAGATGGCAGCGTGCAACTGGCGGATCATTATCAGCAGAACACCCC
GATTGGCGATGGCCCGGTGCTGCTGCCGGATAACCATTATCTGAGCACCCAGAGCGCGCTGAGCAAAGAT
CCGAACGAAAAACGCGATCACATGGTGCTGCTGGAATTTGTGACCGCGGCGGGCATTACCCACGGCATGG
ATGAACTGTATAAGCTTATTGAAGAAGAAACCAGCGGCGGCAGCGAAAACACCGGCGGCGATCTGGGCAT TCGCAAACTGTAACTAAGTAACTCGAG (SEQ ID NO : 46)
Tableau 2. Position nucléotidique des différents éléments constituant les inserts pour les trois constructions.
Ces 3 constructions ont été clonées dans un plasmide qui a été dérivé du plasmide pET28b (Novagen), par introduction de la séquence stabilisatrice Cer, telle que décrite dans Summer et Coll. (Cell (1984) ; 36 (4) : 1097-103). Ce plasmide, dont la structure est reproduite dans la Figure 2, contient le promoteur T7, un gène de résistance à la kanamycine (kana) et la séquence Cer. Les constructions bicistroniques ont été introduites au niveau des sites de restriction Xbal et Xhol du plasmide par double digestion enzymatique.
Transformation des bactéries et production des nanoparticules 50 μΙ d'une suspension de bactéries d'f. coli BL21 (DE3) chimio-compétentes ont été transformées avec 1 pg de plasmide, en utilisant le kit « BL21(DE3) Competent E. coli » (Ref : C2527H, New England Biolabs), en suivant les recommandations du fournisseur. La transformation bactérienne a été effectuée par incubation dans la glace pendant 15 minutes, suivie d'un choc thermique de 45 secondes à 42 °C. Les bactéries transformées ont été ensuite incubées dans la glace pendant 15 minutes, puis 1 heure à 37°C dans un milieu enrichi (milieu Super Optimal broth with Catabolite repression (SOC) : 2% Tryptone, 0,5 %, 8,56 mM NaCI, 2,5 mM KCI, 10 mM MgCI2, 10 mM MgS04, 20 mM glucose). La sélection des bactéries transformées a été réalisée sur un milieu LB-agar contenant de la kanamycine (kana) à 50 pg.mL"1 (Sigma Life Science). Après incubation pendant une nuit à 37°C, les colonies de bactéries transformées par le plasmide ont été prélevées et mises en pré-culture dans un milieu LB (LB Broth Base, Ref : 12780-029, Invitrogen) contenant 50 pg/mL de kana à 37°C sous agitation pendant une nuit. Ces précultures ont servi à ensemencer des volumes de culture de 50 mL à 2 L de milieu LB contenant 50 pg/mL de Kana. Lorsque la concentration bactérienne de la culture a atteint une concentration correspondant à une densité optique à 600 nm (D060onm) comprise entre 0.4 et 0.6, la production des nanoparticules a été induite par ajout de 100 pM d'IPTG (Isopropyl β-D-l-thiogalactopyranoside) dans le milieu de culture. L'induction a été effectuée pendant une nuit à 18°C.
Purification des nanoparticules
Les culots issus des cultures bactériennes après induction ont été re-suspendus dans du tampon phosphate salin IX PBS pH 7,5 (137 mM NaCI ; 2.7 mM KCI ; 10 mM Na2HP04 ; 1.76 mM KH2P04) contenant 0,1 pg.mL"1 de désoxyribonucléase I. La lyse bactérienne a été effectuée par casse mécanique de 30 secondes à 4,5 m.s1 avec des billes de silice de 0,1 mm (Matrice B, réf : 116911050, MP Biomedicals), en utilisant l'appareil Fast Prep (MP Biomedicals). Le lysat a été ensuite clarifié par centrifugation pendant 45 minutes à 7000 g, suivie d'une filtration du surnageant à travers une membrane en polyéthersulfone de porosité 0,8 pm (Réf : 190-2580 Nalgène®, ThermoScientific).
Dans une première étape, la purification des différentes préparations de nanoparticules a été réalisée à l'aide du système chromatographique AKTA Pure 25M (GE Healthcare), en utilisant une ou plusieurs colonnes HiTrap Capto™ Core 700 (GE Healthcare Life Sciences; réf : 17-5481-51) montées en série. Le système a été équilibré avec du PBS IX puis on a chargé les colonnes avec le lysat clarifié à raison de 0,2 mL.min'1. Les protéines contenues dans le lysat clarifié ont été éluées en tampon PBS et recueillies par fractions de 1 mL.
Les fractions contenant les assemblages de monomères d'encapsuline de diamètre supérieur ou égal à 10 nm (protéines d'intérêt) ont été collectées et une à trois extractions différentielles successives (en fonction de la concentration du contaminant majoritaire) ont été effectuées avec du Triton X-114 à 0,1 %. L'extraction différentielle de protéines hydrophobes a été effectuée de la manière suivante : 0,1 % de Triton X-114 a été ajouté au mélange de fractions d'intérêt et mis à 4 °C jusqu'à homogénéisation de la solution. La solution homogénéisée a été ensuite incubée à 37°C pendant 15 minutes, ce qui a entraîné la formation de micelles de Triton et la séparation de la solution en deux phases. Une centrifugation à 15000 g pendant 20 minutes à 37°C a été effectuée pour séparer la phase aqueuse de la phase détergente hydrophobe contenant une grande quantité de contaminants.
Une fois le contaminant majoritaire éliminé, la fraction aqueuse a été récupérée puis soumise à une dernière étape de purification par chromatographie d'exclusion de taille selon laquelle on a chargé, à raison de 0,5 mL.min"1, une colonne de gel filtration Superdex 200 10/300 Increase (GE Healthcare; réf : 28990944) préalablement équilibrée avec du PBS IX. Les fractions contenant les nanoparticules d'encapsuline ont été ensuite concentrées sur concentrateurs Sartorius (Réf: VS2021) retenant les protéines de plus de 30 kDa.
Le degré de pureté des différentes préparations de nanoparticules : XIP1 (encapsuline + eGFP, correspondant à la construction Cl), XIP2 (encapsuline-M2e + eGFP, correspondant à la construction C2) et XIP3 (encapsuline-His + eGFP, correspondant à la construction C3) a été contrôlé par SDS-PAGE durant les différentes étapes de purification (voir figure 3). La figure 3 montre une disparition progressive des bandes correspondant aux produits contaminants au cours des étapes de purification. Le degré de pureté est estimé, de manière semi-quantitative, par évaluation de l'intensité de la bande correspondant à l'encapsuline, rapporté à l'intensité de toutes les bandes présentes, au moyen du logiciel Image Lab (BioRad). Après la dernière étape de purification (colonne 5 sur la figure 3), ce degré de pureté est d'environ 85-90%, au minimum, pour chacune des préparations de nanoparticules XIP1, XIP2 et XIP3.
On a vérifié également par une technique de western-blot au moyen d'un anticorps monoclonal dirigé contre l'ectodomaine de la protéine M2 (Réf : MA1-082, ThermoScientific) dilué au 1000ieme dans un tampon PBST (PBS IX supplémenté par 0,05% de Tween-20, Réf : P9416, Sigma-Aldrich) que la séquence peptidique GGEVETPIRNEGG a bien été insérée dans le monomère d'encapsuline de la préparation XIP2. On a retrouvé effectivement une bande spécifique qui correspond à la bande du monomère d'encapsuline (bande à 31 758 Da).
Exemple 2 : Caractérisation des nanoparticules d'encapsuline contenant une protéine fluorescente (eGFP)
Analyse structurale des nanoparticules d'encapsuline
La taille moyenne des nanoparticules contenues dans les différentes préparations purifiées (XIP1, XIP2 et XIP3) a été mesurée par DLS au moyen de l'appareillage Zetasizer Nano de Malvern. Après filtration d'une aliquote de 200 μΙ de chacune des préparations purifiées sur un filtre d'acétate de cellulose 0,22 μΜ (Réf : 8161, Costar Spin-X), les échantillons ont ensuite été placés dans une cuve compatible UV et analysés par mesure spectroscopique à corrélation de photons (laser He-Ne 633 nm) des rayonnements de diffusion des nanoparticules à un angle fixe de 173°. Les mesures ont été effectuées en duplicate à 25°C après une équilibration de 2 minutes puis analysées à l'aide du logiciel DTS.
Les résultats (voir figure 4) montrent que seule la préparation purifiée de nanoparticules XIP2, dont la surface du nano-compartiment est constituée de monomères d'encapsuline dans lesquels la séquence du monomère de référence a été modifiée par insertion de la séquence GGEVETPIRNEGG dans un site externe du domaine A du monomère d'encapsuline, a une population majoritaire de nanoparticules dont la taille moyenne, d'environ 24 nm, correspond à celle qui est classiquement décrite pour les nanoparticules d'encapsuline de Thermotoga maritima (Sutter M et Coll., Nat Struct Mol Biol (2008) ; 15(9) : 939-947), ce qui est un bon indicateur de l'efficacité de l'assemblage des monomères entre eux. L'analyse en microscopie électronique à transmission en champs clairs faite à l'aide d'un MET Tecnai Spirit (FEI, Eindhoven, The Netherlands) avec un objectif Biotwin à 120 kV, a confirmé l'efficacité de l'assemblage. 15 μΙ de la préparation purifiée XIP2 a été déposée sur une grille de cuivre prétraitée au bleu Alcian 1 %. Après incubation pendant 10 minutes suivie d'un rinçage deux fois à l'eau, la préparation sur la grille a été ensuite colorée avec une goutte d'acétate d'uranyle à 2 % (Agar Scientific) pendant 10 secondes, puis séchée à l'air libre à température ambiante. Les micrographes enregistrés ont été analysés via un récepteur à transfert de charge 4*4 K CCD (Eagle, FEI) à un grossissement de 30 000 fois. L'image telle que représentée dans la figure 5 montre de nombreuses nanoparticules, d'allure icosaédrique, ayant une taille d'environ 23,2 nm ± 0,5 nm dans lesquelles on retrouve une masse dense, ce qui indique la présence de la protéine fluorescente à l'intérieur des nanoparticules.
Mesure de la quantité d'eGFP par nanoparticule
Une droite d'étalonnage mesurant l'intensité relative de fluorescence (exprimée en RFUs, où RFU signifie : unité relative de fluorescence) en fonction de la concentration en eGFP, a été établie en mesurant l'intensité de fluorescence émise par une solution d'eGFP taggée His (SEQ ID NO : 47) purifiée, dans un tampon PBS IX dans une gamme de concentration allant de 0 à 30 pg.mL'1. La mesure a été faite à l'aide de l'appareil CFX96 Touch™ Real-Time PCR Détection System (Bio-Rad) en utilisant les filtres FAM pour l'excitation (450-490 nm) et pour l'émission (510-530 nm).
La droite d'étalonnage obtenue avait pour équation : Y= 2000,4X -170,55, avec un coefficient de corrélation R2 de 0,9838, Y désignant le nombre de RFUs et X désignant la concentration en eGFP en pg.mL'1.
La concentration en eGFP (CGFP) dans chaque préparation de nanoparticules purifiées a été déterminée en calculant l'intensité moyenne de fluorescence sur trois mesures, puis en se référant à la droite d'étalonnage pour déterminer la concentration en eGFP (en pg.mL"1). La concentration en eGFP (en μΜ) a alors été déduite en utilisant le poids moléculaire de l'EGFP (PMegfp = 27000g/mol).
En parallèle, une mesure de la densité optique à 280 nm a été réalisée à l'aide du NanoDrop
Le ratio CencapSU|ine/CGFP (ou [encapsuline] M/[eGFP] M) obtenu pour chaque préparation permet d'évaluer la capacité des nanoparticules à encapsuler la protéine fluorescente. Plus le ratio est faible et plus la capacité d'encapsulation de la protéine fluorescente par les nanoparticules est importante. Considérant qu'une nanoparticule à base de monomères d'encapsuline de T. maritima est constituée classiquement de 60 monomères, on peut estimer le nombre de molécules d'eGFP qui ont été encapsulées par nanoparticule dans chacune des préparations. Les résultats du tableau ci-dessous montrent que les nanoparticules de la préparation XIP2 dans lesquelles la séquence du monomère de référence a été modifiée par insertion de la séquence GGEVETPIRNEGG dans un site externe du monomère d'encapsuline, a une capacité d'encapsulation de l'ordre de 46 fois plus grande que les nanoparticules de la préparation XIP3 dans lesquelles la séquence du monomère de référence a été modifiée par insertion de la séquence GGGGGGHHHHHHGGGGG dans un site interne du monomère d'encapsuline, et encore plus grande vis-à-vis des nanoparticules de la préparation XIP1 résultant de l'assemblage des monomères de référence dont la capacité d'encapsulation de la protéine fluorescente est négligeable.
Tableau 3. Estimation du nombre d'eGFP encapsulés par nanoparticule.
Exemple 3 : Etude de l'immunogénicité des nanoparticules d'encapsuline contenant une protéine fluorescente (eGFP)
Le peptide « M2e » ayant pour séquence la séquence GGEVETPIRNEGG et le peptide « M2e biotinylé en C-terminal » [NH2]GGEVETPIRNEGG[CH2CH2Biotin] ont été synthétisés à façon par ThermoFisher scientific. L'ovalbumine (Sigma référence : A5503-1G) a été couplée au peptide M2e (Ovalbumine-M2e) par un couplage amine/amine à l'aide de bis[sulfosuccinimidyl] suberate (BS3); Thermo référence : 21580). L'ovalbumine, le peptide M2e, et l'agent de couplage BS3, ont été incubés pendant 30 minutes à 25 °c en solution dans le PBS, dans les proportions molaires respectives de 1:10 :10. La streptavidine (Thermo référence : 21122) a été mise en présence d'un excès du peptide M2e biotinylé en C-terminal (dans des proportions 1:10) et incubée 1 heure à 25°C. Pour bloquer les réactions et éliminer les peptides et BS3 non couplés, les protéines ont été dessalées immédiatement après incubation sur colonnes PD10 (GE Healhcare référence : 17-0851-01) équilibrées en PBS.
Quatre groupes de 7 souris femelles de souche BalB/c ont été immunisées par injection sous-cutanée avec l'un des antigènes suivants : l'encapsuline-M2e + eGFP (XIP2), l'eGFP, l'Ovalbumine-M2e, ou du PBS (contrôle négatif). Trois injections ont été réalisées, à JO, J14 et J28. La première injection (JO) a été effectuée avec 50 pg d'antigène mélangé volume à volume avec de l'adjuvant complet de Freund (CFA), tandis que la deuxième (J14) et la troisième injection (J28) ont été réalisées avec la même quantité d'antigène mais avec de l'adjuvant incomplet de Freund (IFA).
Un cinquième groupe de 7 souris, a été immunisé avec l'encapsuline-M2e + eGFP, en suivant le même protocole, mais sans l'utilisation d'adjuvant pour les 3 injections.
Pour chaque souris de chaque groupe, on a collecté 50 pL de sérum avant la première immunisation (JO), puis 14 jours, 28 jours et 42 jours après (J14, J28 et J42). La réponse anticorps IgGl et lgG2a a été dosée par ELISA direct. Les puits des plaques ELISA Nunc® 96 puits (Sigma, Ref M9410) ont été recouverts par 200 ng de l'un des antigènes suivants : 1) de l'eGFP purifiée par affinité sur colonne chargée avec la résine HisPur Ni-NTA (Thermo référence 88221) , 2) de la streptavidine (Thermo référence : 21122), 3) de la streptavidine couplée avec le peptide M2e biotinylé en C-terminal, 4) de l'ovalbumine (Sigma référence : A5503), 5) de l'ovalbumine couplée chimiquement avec le peptide M2e, 6) de l'encapsuline + eGFP (XIP1) et 7) de l'encapsuline-M2e + eGFP (XIP2), dilués en tampon bicarbonate 0,2 M pH 9,4 (Thermo référence : 10331414), à 4°C pendant une nuit. Des puits, utilisés comme « contrôle négatif » ont également été incubés pendant une nuit à 4°C avec un tampon bicarbonate.
Après saturation pendant 1 heure à température ambiante avec une solution de PBS IX - Lait 25 % (Sigma-Aldrich références : D8537, et 70166), suivie de trois lavages successifs avec du PBS additionné de Tween 20 à 0,05 % (Sigma-Aldrich références : D8537 et P9416), les plaques ont été incubées pendant lh30 avec les « pools » de sérums représentatifs des différents groupes de souris immunisées, dilués au centième dans du PBS-1% BSA (Sigma-Aldrich références : D8537 et A4503), chaque pool de sérum ayant été constitué en mélangeant les sérums des 7 souris d'un même groupe. Les plaques ont alors de nouveau été lavées en PBS-Tween 20 comme décrit précédemment, puis incubées pendant 30 minutes avec 100 ng d'anticorps de révélation qui est soit un anticorps de rat anti IgGl de souris couplé à la HRP (Thermo référence : 10097462), soit un anticorps de rat anti lgG2a de souris couplé à la HRP (Thermo référence : 10777993). Après trois lavages en PBS-Tween 20 comme précédemment, 100 μΙ de TMB (Thermo référence: 11869260) ont été ajoutés par puits et les plaques ont été incubées 5 minutes à température ambiante. Pour stopper la réaction, 100 μΙ d'acide sulfurique à 0,2 M (Sigma référence : 320501-1L-D) a été ajouté dans chaque puits. La plaque a ensuite été lue avec le lecteur de plaque TECAN à une absorbance de 450 nm.
Les résultats (Figures 6A et 6B) montrent que les anticorps produits par les souris immunisées avec l'encapsuline-M2e + eGFP (XIP2) en présence d'adjuvant sont dirigés contre M2e, mais, de façon surprenante, pas contre l'encapsuline elle-même, comme en témoigne la reconnaissance par les anticorps de l'encapsuline-M2e, de la streptavidine-M2e et de l'ovalbumine-M2e, et pas de l'encapsuline, de la streptavidine et de l'ovalbumine. De même, après immunisation avec l'encapsuline-M2e + eGFP (XIP2) sans adjuvant, les anticorps produits sont dirigés contre l'encapsuline-M2e, mais pas contre l'encapsuline seule. Par opposition, les anticorps produits par les souris immunisées avec l'ovalbumine-M2e en présence d'adjuvant, reconnaissent l'ovalbumine-M2e, mais également l'ovalbumine seule, et ne reconnaissent ni l'encapsuline-M2e ni la streptavidine-M2e. Les anticorps produits sont donc essentiellement dirigés contre l'ovalbumine mais pas contre M2e. Les anticorps produits lors de l'immunisation avec l'encapsuline-M2e, avec ou sans adjuvant, sont majoritairement de type IgGl, mais des anticorps de type lgG2a sont également produits. Suite à l'immunisation avec l'ovalbumine-M2e, il n'y a quasiment pas d'anticorps de type lgG2a produits.
Afin d'estimer le titre d'anticorps chez les groupes immunisés avec l'encapsuline-M2e +eGFP (XIP2), avec et sans adjuvant, les pools de sérums provenant de ces deux groupes ont été dilués en cascade au demi à partir d'une dilution au centième. La streptavidine, la streptavidine-M2e, l'encapsuline + eGFP (XIP1) et l'encapsuline-M2e + eGFP (XIP2) ont été adsorbées au fond des puits de la même manière que décrite précédemment. La révélation a été faite à l'aide de l'anticorps de rat anti IgGl de souris couplé à la HRP (Thermo référence : 10097462). Les résultats (Figure 7) confirment que, de façon surprenante, la présence d'adjuvants n'est pas nécessaire pour obtenir une réponse anticorps spécifique de M2e : les sérums des souris immunisées reconnaissent l'encapsuline-M2e, la streptavidine-M2e, mais ne reconnaissent pas la streptavidine ou l'encapsuline seule.
La réponse anticorps dirigée contre la protéine interne, eGFP, a été analysée à J42 dans les sera individuels des 7 souris immunisées avec l'encapsuline-M2e + eGFP (XIP2) en présence d'adjuvant. Les dilutions au 1/50 eme, au 1/100 eme et au 1/200 eme de chacun des sera ont été analysées par ELISA sur des plaques sensibilisées par de l'eGFP diluée en tampon bicarbonate 0,2M, pH=9 à raison de 200 ng par puits et en utilisant comme anticorps de révélation le même anticorps de rat anti IgGl de souris couplé à la HRP que précédemment. Les résultats de la Figure 8 montrent que 3 des 7 souris ont développé une réponse anti-eGFP significative
Claims (25)
- REVENDICATIONS1. Une nanoparticule comprenant un assemblage de monomères d'encapsuline, selon laquelle un peptide a été inséré dans la séquence d'acides aminés d'au moins un desdits monomères d'encapsuline, le site d'insertion du peptide étant situé dans un site externe du domaine A du monomère d'encapsuline, et comprenant en outre une protéine interne.
- 2. La nanoparticule selon la revendication 1, selon laquelle le peptide a été inséré dans la séquence d'acides aminés de tous les monomères d'encapsuline.
- 3. La nanoparticule selon la revendication 1 ou 2, selon laquelle le site externe du domaine A est constitué de la séquence d'acides aminés constitutive du premier feuillet β du domaine A et de la séquence d'acides aminés constitutive de la première structure dépliée contiguë à la séquence d'acides aminés du premier feuillet β.
- 4. La nanoparticule selon l'une des revendications 1 à 3, selon laquelle la séquence d'acides aminés du monomère d'encapsuline est la séquence SEQ ID NO : 1 ou une séquence dérivée dont le degré d'identité est d'au moins 90%.
- 5. La nanoparticule selon l'une des revendications 1 à 4, selon laquelle la séquence d'acides aminés du monomère d'encapsuline est la séquence SEQ ID NO : 7 ou une séquence dérivée dont le degré d'identité est d'au moins 90%.
- 6. La nanoparticule selon la revendication 5, selon laquelle le peptide a été inséré entre deux acides aminés consécutifs de la séquence K138I139E140C141G142S143, lorsque la séquence du monomère d'encapsuline est la séquence SEQ ID NO : 7, ou entre deux acides aminés consécutifs de la séquence correspondante lorsque la séquence du monomère d'encapsuline est une séquence dérivée de la séquence SEQ ID NO : 7, après alignement des deux séquences monomériques.
- 7. La nanoparticule selon l'une des revendications 1 à 6, selon laquelle le nombre total d'acides aminés du peptide inséré est compris entre 4 et 55 (bornes incluses).
- 8. La nanoparticule selon l'une des revendications 1 à 7, selon laquelle le peptide inséré comprend la séquence EVETPIRNE (SEQID NO : 9).
- 9. La nanoparticule selon l'une des revendications 1 à 8, selon laquelle la séquence d'acides aminés du monomère d'encapsuline après insertion du peptide est la séquence SEQ ID NO : 30.
- 10. La nanoparticule selon l'une des revendications 1 à 9, selon laquelle l'extrémité C- terminale ou N-terminale, respectivement, de la séquence d'acides aminés de la protéine interne se termine ou commence, respectivement, par un enchaînement d'acides aminés du type l-M-T, dans lequel : a. I désigne une séquence d'acides aminés dont le nombre total d'acides aminés est compris entre 0 et 30 (bornes incluses), de façon préférée entre 0 et 25 (bornes incluses et de façon encore plus préférée entre 0 et 20 (bornes incluses) ; b. M est la séquence XiGSLX5X6GX8LXio (SEQ ID NO : 36), dans laquelle Xi est D ou K, X5 est T, G ou N, X6 est I, V ou L, X8 est S ou I et Χω est K ou Y, la séquence X1APX4DGSLX9X10GSLKG (SEQ ID NO : 37), dans laquelle Xi et X4 désignent chacun un acide aminé non déterminé, Xg est T, G ou N, et Χω est I ou V, ou la séquence GGDLGIRK (SEQ ID NO : 38) et, c. T désigne une séquence d'acides aminés dont le nombre total d'acides aminés est compris entre 0 et 15 (bornes incluses), de façon préférée entre 0 et 10 (bornes incluses) et de façon encore plus préférée entre 0 et 5 (bornes incluses).
- 11. La nanoparticule selon la revendication 10, selon laquelle la protéine interne est une protéine de fusion selon laquelle l'extrémité C-terminale ou N-terminale d'une protéine d'intérêt a été fusionnée à l'enchaînement d'acides aminés du type l-M-T.
- 12. Un vecteur bicistronique comprenant une première séquence d'acide nucléique codant pour un monomère d'encapsuline dans lequel un peptide a été inséré dans un site externe du domaine A du monomère, en particulier dans celui constitué de la séquence d'acides aminés constitutive du premier feuillet β du domaine A et de la séquence d'acides aminés constitutive de la première structure dépliée contiguë à la séquence d'acides aminés du premier feuillet β, et une deuxième séquence d'acide nucléique codant pour une protéine dont l'extrémité C-terminale ou N-terminale, respectivement, se termine ou commence, respectivement, par un enchaînement d'acides aminés du type l-M-T, dans lequel I désigne une séquence d'acides aminés dont le nombre total d'acides aminés est compris entre 0 et 30 (bornes incluses) de façon préférée entre 0 et 25 (bornes incluses) et de façon encore plus préférée entre 0 et 20 (bornes incluses), M est la séquence SEQ ID NO : 36, SEQID NO : 37 ou SEQ ID NO : 38, et T désigne une séquence d'acides aminés dont le nombre total d'acides aminés est compris entre 0 et 15 (bornes incluses), de façon préférée entre 0 et 10 (bornes incluses) et de façon encore plus préférée entre 0 et 5 (bornes incluses).
- 13. Une cellule hôte comprenant un vecteur bicistronique selon la revendication 12.
- 14. Une cellule hôte comprenant un premier vecteur qui comprend une séquence d'acide nucléique codant pour un monomère d'encapsuline dans lequel un peptide a été inséré dans un site externe du domaine A du monomère, en particulier dans celui constitué par la séquence d'acides aminés constitutive du premier feuillet β du domaine A et de la séquence d'acides aminés constitutive de la première structure dépliée contiguë à la séquence d'acides aminés du premier feuillet β, et un deuxième vecteur qui comprend une séquence d'acide nucléique codant pour une protéine dont l'extrémité C- terminale ou N-terminale, respectivement, se termine ou commence, respectivement, par un enchaînement d'acides aminés du type l-M-T, dans lequel I désigne une séquence d'acides aminés dont le nombre total d'acides aminés est compris entre 0 et 30 (bornes incluses), de façon préférée entre 0 et 25 (bornes incluses) et de façon encore plus préférée entre 0 et 20 (bornes incluses), M est la séquence SEQ ID NO : 36, SEQ ID NO : 37 ou SEQ ID NO : 38, et T désigne une séquence d'acides aminés dont le nombre total d'acides aminés est compris entre 0 et 15 (bornes incluses, de façon préférée entre 0 et 10 (bornes incluses) et de façon encore plus préférée entre 0 et 5 (bornes incluses).
- 15. Un procédé de production de nanoparticules comprenant un assemblage de monomères d'encapsuline telles que définies selon l'une des revendications 1 à 10, selon lequel : a. On cultive des cellules hôtes telles que définies selon la revendication 13 ou 14 dans des conditions favorisant l'expression des monomères d'encapsuline et de la protéine interne ; et b. On récupère les nanoparticules contenant la protéine interne, résultant de l'auto-assemblage des monomères d'encapsuline.
- 16. Un procédé de purification de nanoparticules comprenant un assemblage de monomères d'encapsuline, selon lequel : a. On clarifie un broyât de cellules contenant des nanoparticules comprenant un assemblage de monomères d'encapsuline; b. On soumet la solution clarifiée contenant les nanoparticules à une ou plusieurs étape(s) de chromatographie de type multi-modale ; c. On récupère l'éluat contenant les assemblages de monomères d'encapsuline de diamètre supérieur ou égal à 10 nm ; d. On élimine en une ou plusieurs fois les contaminants hydrophobes contenus dans l'éluat au moyen d'une solution biphasique ; e. On récupère la phase aqueuse que l'on soumet à une ou plusieurs étape(s) de polissage, et f. On récupère la solution purifiée contenant les nanoparticules comprenant un assemblage de monomères d'encapsuline.
- 17. Une composition immunogène comprenant des nanoparticules selon l'une des revendications là 11.
- 18. Une composition immunogène comprenant des nanoparticules qui comprennent un assemblage de monomères d'encapsuline, selon lesquelles un peptide a été inséré dans la séquence d'acides aminés d'au moins un desdits monomères d'encapsuline, le site d'insertion du peptide étant situé dans un site externe du domaine A du monomère d'encapsuline constitué de la séquence d'acides aminés constitutive du premier feuillet β du domaine A et de la séquence d'acides aminés constitutive de la première structure dépliée contiguë à la séquence d'acides aminés du premier feuillet β.
- 19. La composition immunogène selon la revendication 17 ou 18, selon laquelle le peptide inséré comprend la séquence EVETPIRNE (SEQ ID NO : 9).
- 20. La composition immunogène selon la revendication 19, selon laquelle la réponse immune est dirigée contre le virus grippal.
- 21. Un monomère d'encapsuline dans lequel a été inséré dans sa séquence d'acides aminés un peptide comprenant la séquence EVETPIRNE (SEQ ID NO : 9).
- 22. Le monomère d'encapsuline selon la revendication 21, selon lequel le peptide a été inséré dans un site externe du domaine A du monomère, en particulier dans celui constitué par la séquence d'acides aminés constitutive du premier feuillet β du domaine A et de la séquence d'acides aminés constitutive de la première structure dépliée contiguë à la séquence d'acides aminés du premier feuillet β.
- 23. Une séquence d'acide nucléique codant pour un monomère d'encapsuline selon la revendication 21 ou 22.
- 24. La séquence d'acide nucléique selon la revendication 23, qui est la séquence SEQ ID NO : 43 ou une séquence dérivée ayant un degré d'identité d'au moins 80 % avec la séquence SEQ ID NO : 43.
- 25. Un vecteur comprenant une séquence d'acide nucléique selon la revendication 23 ou 24.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR1670187A FR3050448A1 (fr) | 2016-04-21 | 2016-04-21 | Nanoparticules a base d'encapsuline. |
| PCT/FR2017/050942 WO2017182760A1 (fr) | 2016-04-21 | 2017-04-20 | Nanoparticules a base d'encapsuline |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR1670187A FR3050448A1 (fr) | 2016-04-21 | 2016-04-21 | Nanoparticules a base d'encapsuline. |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR3050448A1 true FR3050448A1 (fr) | 2017-10-27 |
Family
ID=57121427
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR1670187A Withdrawn FR3050448A1 (fr) | 2016-04-21 | 2016-04-21 | Nanoparticules a base d'encapsuline. |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| FR (1) | FR3050448A1 (fr) |
| WO (1) | WO2017182760A1 (fr) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020061564A1 (fr) * | 2018-09-23 | 2020-03-26 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Conjugués de vecteur à nanoparticules de peptide de fusion env du vih-1 et utilisation de ces derniers |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009109428A2 (fr) * | 2008-02-01 | 2009-09-11 | Alpha-O Peptides Ag | Nanoparticules peptidiques à auto-assemblage utiles comme vaccins |
| WO2014093702A1 (fr) * | 2012-12-12 | 2014-06-19 | The Usa, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Agents thérapeutiques du vih et procédés de fabrication et d'utilisation associés |
| US20140271699A1 (en) * | 2013-03-13 | 2014-09-18 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Serv | Prefusion rsv f proteins and their use |
| WO2015054639A1 (fr) * | 2013-10-11 | 2015-04-16 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Vaccins contre le virus d'epstein-barr |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL142948A (en) * | 1999-09-03 | 2013-02-28 | Univ Ramot | Agents and compositions and methods utilizing same useful in diagnosing and/or treating or preventing plaque forming diseases |
| WO2013039792A1 (fr) * | 2011-09-12 | 2013-03-21 | The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Immunogènes à base d'un épitope vih-1 gp120 v1v2 |
| EP2766030A4 (fr) * | 2011-10-12 | 2015-09-16 | Univ Washington | Domaine externe génétiquement modifié (eod) de gp120 du vih et mutants associés |
-
2016
- 2016-04-21 FR FR1670187A patent/FR3050448A1/fr not_active Withdrawn
-
2017
- 2017-04-20 WO PCT/FR2017/050942 patent/WO2017182760A1/fr active Application Filing
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009109428A2 (fr) * | 2008-02-01 | 2009-09-11 | Alpha-O Peptides Ag | Nanoparticules peptidiques à auto-assemblage utiles comme vaccins |
| WO2014093702A1 (fr) * | 2012-12-12 | 2014-06-19 | The Usa, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Agents thérapeutiques du vih et procédés de fabrication et d'utilisation associés |
| US20140271699A1 (en) * | 2013-03-13 | 2014-09-18 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Serv | Prefusion rsv f proteins and their use |
| WO2015054639A1 (fr) * | 2013-10-11 | 2015-04-16 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Vaccins contre le virus d'epstein-barr |
Non-Patent Citations (10)
| Title |
|---|
| AKIO TAMURA ET AL: "Packaging guest proteins into the encapsulin nanocompartment from Rhodococcus erythropolis N771", BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING., vol. 112, no. 1, 2 September 2014 (2014-09-02), US, pages 13 - 20, XP055337349, ISSN: 0006-3592, DOI: 10.1002/bit.25322 * |
| CALEB CASSIDY-AMSTUTZ ET AL: "Identification of a Minimal Peptide Tag for in Vivo and in Vitro Loading of Encapsulin", BIOCHEMISTRY, vol. 55, no. 24, 21 June 2016 (2016-06-21), US, pages 3461 - 3468, XP055337406, ISSN: 0006-2960, DOI: 10.1021/acs.biochem.6b00294 * |
| DEVON RADFORD: "Understanding the Encapsulins: Prediction and Characterization of Phage Capsid-like Nanocompartments in Prokaryotes", 1 January 2015 (2015-01-01), XP055338255, ISBN: 978-1-339-00807-3, Retrieved from the Internet <URL:https://tspace.library.utoronto.ca/bitstream/1807/69450/7/Radford_Devon_R_201401_PhD_thesis.pdf> * |
| GIESSEN TOBIAS W ED - TAWFIK DAN S ET AL: "Encapsulins: microbial nanocompartments with applications in biomedicine, nanobiotechnology and materials science", CURRENT OPINION IN CHEMICAL BIOLOGY, vol. 34, 25 May 2016 (2016-05-25), pages 1 - 10, XP029806919, ISSN: 1367-5931, DOI: 10.1016/J.CBPA.2016.05.013 * |
| HYOJIN MOON ET AL: "Genetically engineering encapsulin protein cage nanoparticle as a SCC-7 cell targeting optical nanoprobe", BIOMATERIALS RESEARCH, BIOMED CENTRAL LTD, LONDON, UK, vol. 18, no. 1, 23 December 2014 (2014-12-23), pages 21, XP021208441, ISSN: 2055-7124, DOI: 10.1186/2055-7124-18-21 * |
| JOOST SNIJDER ET AL: "Assembly and Mechanical Properties of the Cargo-Free and Cargo-Loaded Bacterial Nanocompartment Encapsulin", BIOMACROMOLECULES, vol. 17, no. 8, 8 August 2016 (2016-08-08), US, pages 2522 - 2529, XP055337403, ISSN: 1525-7797, DOI: 10.1021/acs.biomac.6b00469 * |
| K. NAMBA ET AL: "Expression and Molecular Characterization of Spherical Particles Derived from the Genome of the Hyperthermophilic Euryarchaeote Pyrococcus furiosus", JOURNAL OF BIOCHEMISTRY, vol. 138, no. 2, 1 August 2005 (2005-08-01), GB, pages 193 - 199, XP055338017, ISSN: 0021-924X, DOI: 10.1093/jb/mvi111 * |
| KYUNG-MI CHOI ET AL: "Chimeric Capsid Protein as a Nanocarrier for siRNA Delivery: Stability and Cellular Uptake of Encapsulated siRNA", ACS NANO, vol. 5, no. 11, 22 November 2011 (2011-11-22), pages 8690 - 8699, XP055017554, ISSN: 1936-0851, DOI: 10.1021/nn202597c * |
| PRATIK SINGH ET AL: "Viruses and their uses in nanotechnology", DRUG DEVELOPMENT RESEARCH., vol. 67, no. 1, 1 January 2006 (2006-01-01), US, pages 23 - 41, XP055337385, ISSN: 0272-4391, DOI: 10.1002/ddr.20064 * |
| RAHMAN RAHMANPOUR ET AL: "Assembly in vitro of Rhodococcus jostii RHA1 encapsulin and peroxidase DypB to form a nanocompartment", FEBS JOURNAL, vol. 280, no. 9, 8 April 2013 (2013-04-08), GB, pages 2097 - 2104, XP055337397, ISSN: 1742-464X, DOI: 10.1111/febs.12234 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2017182760A1 (fr) | 2017-10-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP2029748B1 (fr) | Proteines de fusion proteine n d'un virus de la famille des paramyxoviridae-proteine d'interet | |
| JP7455785B2 (ja) | 虫刺され過敏症の治療 | |
| TWI354023B (en) | Lipidating sequences and use thereof for producing | |
| JP7385680B2 (ja) | 変異型ｒｓｖ ｆタンパク質及びその利用 | |
| MX2013008071A (es) | Vacuna de omv contra infecciones por burkholderia. | |
| JP2018521632A (ja) | グラム陰性外膜小胞における抗原の表面提示 | |
| JP2018505135A (ja) | ヤツメウナギ由来の配列への融合による組換えタンパク質の多量体化 | |
| KR20210110318A (ko) | 융합에 의해 변형된 cmv의 바이러스-유사 입자 | |
| FR3050448A1 (fr) | Nanoparticules a base d'encapsuline. | |
| BE1022949B1 (fr) | Composition immunogene | |
| US9926346B2 (en) | Recombinant mycobacterium encoding a heparin-binding hemagglutinin (HBHA) fusion protein and uses thereof | |
| Majidi et al. | Expression and Purification of Brucella spp. Lumazine Synthase Decameric Carrier in Fusion to Extracellular Domain of Influenza M2E Protein | |
| WO2022177990A2 (fr) | Polypeptides de spicule de sars-cov-2 modifiés et nanoparticules associées | |
| WO2022029389A1 (fr) | Approche vaccinale basée sur des antigènes viraux triméricues | |
| KR101953374B1 (ko) | 단백질 나노입자 기반의 복합백신 | |
| Gorbunov et al. | Vaccine building ‘kit’: Combining peptide bricks to elicit a desired immune response without adding an adjuvant | |
| JP2021533772A (ja) | フィロウイルス糖タンパク質の安定化された三量体 | |
| US20230190925A1 (en) | Production and functionalization of nanoparticles derived from phage t5 and therapeutic uses | |
| WO2012048430A1 (fr) | Nucléoprotéine-particule de type virus de la mosaïque de papaye conjugués par affinité | |
| RU2818278C2 (ru) | Пневмококковые поверхностные белки | |
| Wei | Strategies to improve the immunogenicity of subunit vaccine candidates | |
| BE1022553B1 (fr) | Mutants de spy0269 | |
| WO2000068398A1 (fr) | Procede de purification par affinite | |
| Walker | Biophysical Characterization of Optimized Self-Assembling Protein Nanoparticles as a Malaria Vaccine | |
| JP2023002492A (ja) | 変異型ｒｓｖ ｆタンパク質を含む医薬組成物 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 2 |
|
| PLSC | Publication of the preliminary search report |
Effective date: 20171027 |
|
| PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 3 |
|
| PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 4 |
|
| PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 5 |
|
| ST | Notification of lapse |
Effective date: 20211205 |