WO2017182760A1 - Nanoparticules a base d'encapsuline - Google Patents

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WO2017182760A1
WO2017182760A1 PCT/FR2017/050942 FR2017050942W WO2017182760A1 WO 2017182760 A1 WO2017182760 A1 WO 2017182760A1 FR 2017050942 W FR2017050942 W FR 2017050942W WO 2017182760 A1 WO2017182760 A1 WO 2017182760A1
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encapsulin
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acid sequence
peptide
seq
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Priscillia LAGOUTTE
Adrien LUGARI
Bettina WERLE
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Bioaster
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    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/735—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a domain for self-assembly, e.g. a viral coat protein (includes phage display)

Definitions

  • the present invention relates to the technical field of encapsulation, and in particular the encapsulation of proteins. More specifically, the subject of the present invention is nanoparticles based on specific encapsulin monomers having a high capacity to encapsulate proteins, the means for producing these nanoparticles, as well as their use in immunogenic compositions.
  • Encapsulation consists of enclosing a substance in a "capsule", to isolate it from the external environment and / or transport it to the desired place where it will be released to act.
  • This technology is used in particular to encapsulate proteins, which can be sensitive to certain environmental factors and degrade (for example, under the action of enzymes or under certain pH conditions), and thus preserve their biological activity and / or prolong their therapeutic effect. It can also be used to delay or prolong the release of proteins through the capsule.
  • the vaccine field it is also used to deliver the vaccine protein to cells of the immune system (Bonneer L. et al., Vaccine (2002); 20: 2287-2295).
  • the nano-compartment has a size generally between 10 and 40 nm, depending on the size and the number of encapsulin monomers that have self-assembled.
  • encapsulins from Thermotoga maritima or Rhodococcus jostii RHA1 assemble to form nanoparticles having a size of about 24 nm and composed of 60 encapsulin monomers.
  • Sutter analyzed the sequences of enzymatic proteins belonging to the family of DyP and showed that those which are present inside encapsulin nano-compartments were coded by genes which are on the same operon as the one that codes for encapsulin.
  • Sutter also determined the crystallographic structure of Thermotoga maritima encapsulin. He deduced the regions in helices a and in sheets ⁇ , as well as the presence of 3 domains called domain A, domain P and loop E, respectively. Domain A is defined as consisting of 3 segments in ⁇ -helices and 5 ⁇ -sheets, comprising the C-terminal end. The P domain is involved in the interaction with the proteins present inside. Sequence alignment with 10 encapsulins of different origin reveals some homology.
  • This recombinant encapsulin called Encap_loophis42C123, was used to graft a fluorescent marker or a prodrug. Furthermore, the SP94 peptide, which makes it possible to target hepatocellular carcinomas, has been inserted between residues 138 and 139. Fluorescence and cell survival monitoring has confirmed the correct targeting of the nanoparticles to the target cells.
  • Moon et al. (Biomaterials Research (2014), 18 (1): 21) used this same encapsulin Encapulin loop his42C123 to insert FcBP peptide between residues 138 and 139. After expression in Escherichia coli, the nanoparticles produced effectively target the SCC-7 cells for which the FcBP peptide has an affinity.
  • heterologous proteins such as eGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) or luciferase
  • eGFP Enhanced Green Fluorescent Protein
  • luciferase luciferase
  • Rhodococcus erythropolis N771 Rhodococcus erythropolis N771.
  • These heterologous proteins were modified by adding at their C-terminus a sequence corresponding to the last 37 C-terminal amino acids of the DypB peroxidase from R. erythropolis N771.
  • a sequence comprising 6 His residues was fused to the C-terminus of the recombinant encapsulin to allow its purification.
  • a relatively low encapsulation yield is reported, since at most one eGFP or luciferase molecule was encapsulated by nanoparticle.
  • WO 2009/109428 discloses, in a general manner, the possibility of using nanoparticles as a vaccine agent by incorporating an epitope of T or B cells, for example the M2e sequence derived from influenza strains, into the nanoparticles.
  • WO 2015/054639 discloses nanoparticles formed from fusion proteins incorporating an immunogenic portion of the EBV virus. When the encapsulins are used to form the nanoparticles, it is recommended to insert the immunogenic portion at the C-terminal.
  • the document US 2014/0271699 recommends binding an RSV virus antigen to a protein capable of forming nanoparticles such as encapsulin, at a site allowing the exposure of the antigen to the surface of the nanoparticles. , for example the N or C-termini.
  • the object of the invention is to propose encapsulin-based nanoparticles that make it possible to encapsulate a large quantity of proteins.
  • the subject of the present invention is a nanoparticle comprising an assembly of encapsulin monomers, according to which a peptide has been inserted into the amino acid sequence of at least one of said encapsulin monomers, the site of insertion of the peptide being located in an external domain A site of the encapsulin monomer, and further comprising an internal protein.
  • the peptide has been inserted into the amino acid sequence of all encapsulin monomers.
  • the external site of the domain A is constituted by the constitutive amino acid sequence of the first ⁇ sheet of domain A and the amino acid sequence constituting the first unfolded structure contiguous to the sequence of amino acids of the first ⁇ -sheet.
  • the amino acid sequence of the encapsulin monomer is the sequence SEQ ID NO: 1 or a derived sequence whose degree of identity is at least 90%.
  • the amino acid sequence of the encapsulin monomer is the sequence SEQ ID NO: 7 or a derived sequence whose degree of identity is at least 90%.
  • the peptide has been inserted between two consecutive amino acids of the sequence when the sequence of the encapsulin monomer is the sequence SEQ ID NO: 7, or between two consecutive amino acids of the corresponding sequence when the sequence of the encapsulin monomer is a sequence derived from the sequence SEQ ID NO: 7, after alignment of the two monomeric sequences.
  • the total number of amino acids of the inserted peptide is between 4 and 55 (inclusive).
  • the inserted peptide comprises the sequence EVETPIRNE (SEQ ID NO: 9).
  • the amino acid sequence of the encapsulin monomer after insertion of the peptide is the sequence ID NO: 30.
  • the C-terminus - Terminally or N-terminally, respectively, of the amino acid sequence of the internal protein ends or begins, respectively, by a sequence of amino acids of the IMT type, wherein:
  • I denotes an amino acid sequence whose total number of amino acids is between 0 and 30 (inclusive), preferably between 0 and 25 (inclusive), and even more preferably between 0 and 20 (bound). included);
  • vs. T denotes an amino acid sequence whose total number of amino acids is between 0 and 15 (inclusive), preferably between 0 and 10 (inclusive), and even more preferably between 0 and 5 (bound) included).
  • the internal protein is a fusion protein according to which the C-terminal or N-terminal end of a protein of interest has been fused to the sequence of amino acids of the type LMI.
  • the subject of the present invention is also a bicistronic vector comprising a first nucleic acid sequence coding for an encapsulin monomer in which a peptide has been inserted into an external site of the A domain of the monomer, in particular in that constituted by the sequence of amino acids constituting the first ⁇ sheet of domain A and the amino acid sequence constituting the first unfolded structure contiguous to the amino acid sequence of the first ⁇ sheet, and a second nucleic acid sequence coding for a a protein whose C-terminal or N-terminus, respectively, ends or begins, respectively, with a sequence of amino acids of the IMT type, in which I denotes an amino acid sequence whose total number of amines is between 0 and 30 (inclusive), preferably between 0 and 25 (inclusive), and even more preferably between 0 and 20 (bound).
  • M is the sequence SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37 or SEQ ID NO: 38, and T denotes an amino acid sequence whose total number of amino acids is between 0 and 15 (terminal included), preferably between 0 and 10 (inclusive), and even more preferably between 0 and 5 (inclusive).
  • Another subject of the invention is a host cell comprising a bicistronic vector as described above.
  • Another object of the invention is a host cell comprising a first vector which comprises a nucleic acid sequence encoding an encapsulin monomer in which a peptide has been inserted into an external site of the A domain of the monomer, particularly in that consisting of the constitutive amino acid sequence of the first ⁇ sheet of domain A and the amino acid sequence constituting the first unfolded structure contiguous to the amino acid sequence of the first ⁇ sheet, and a second vector which comprises a nucleic acid sequence encoding a protein whose C-terminus or N-terminus, respectively, terminates or begins, respectively, with a sequence of amino acids of the IMT type, wherein I denotes a sequence of amino acids whose total number of amino acids is between 0 and 30 (limits included), preferably between 0 and 25 (limits included) and even more preferred between 0 and 20 (inclusive), M is the sequence SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37 or SEQ ID NO: 38, and T denotes an amino acid sequence whose total
  • the subject of the invention is also a method for producing nanoparticles comprising an assembly of encapsulin monomers, as defined in the various previous embodiments, according to which:
  • Host cells are cultured as described above under conditions favoring the expression of the encapsulin monomers and of the internal protein;
  • the nanoparticles containing the internal protein resulting from the self-assembly of the encapsulin monomers are recovered.
  • the subject of the invention is also a method for purifying nanoparticles comprising an assembly of encapsulin monomers according to which:
  • a nanoparticle-containing cell grind comprising an encapsulin monomer assembly is clarified
  • the clarified solution containing the nanoparticles is subjected to one or more multi-modal chromatography stage (s);
  • the eluate containing the assemblages of encapsulin monomers with a diameter greater than or equal to 10 nm is recovered; d.
  • the hydrophobic contaminants contained in the eluate are removed in one or more times by means of a biphasic solution;
  • the aqueous phase is recovered which is subjected to one or more polishing step (s), and
  • the purified solution containing the nanoparticles comprising an assembly of encapsulin monomers is recovered.
  • the subject of the invention is also an immunogenic composition comprising nanoparticles as defined in their various previous embodiments.
  • the subject of the invention is also an immunogenic composition
  • nanoparticles which comprise an assembly of encapsulin monomers, according to which a peptide has been inserted into the amino acid sequence of at least one of said encapsulin monomers, the site insertion of the peptide being located in an external site of the domain A of the encapsulin monomer consisting of the constitutive amino acid sequence of the first sheet ⁇ of domain A and the amino acid sequence constituting the first contiguous unfolded structure to the amino acid sequence of the first ⁇ -sheet.
  • the inserted peptide comprises the sequence EVETPIRNE (SEQ ID NO: 9).
  • the immune response is directed against the influenza virus.
  • Another subject of the invention is an encapsulin monomer in which a peptide comprising the sequence EVETPIRNE (SEQ ID NO: 9) has been inserted in its amino acid sequence.
  • the peptide has been inserted into an external site of the A domain of the monomer, in particular into that consisting of the constitutive amino acid sequence of the first ⁇ sheet of domain A and the constitutive amino acid sequence. of the first unfolded structure contiguous to the amino acid sequence of the first ⁇ -sheet.
  • the invention also relates to a nucleic acid sequence encoding an encapsulin monomer as described above.
  • the nucleic acid sequence coding for an encapsulin monomer is the sequence SEQ ID NO: 43 or a derived sequence having a degree of identity of at least 80% with the sequence SEQ ID NO: 43.
  • the subject of the invention is a vector comprising a nucleic acid sequence as described above.
  • a nanoparticle comprising an assembly of encapsulin monomers, in which a peptide has been inserted into an external site of at least one of said encapsulin monomers, is capable of encapsulating a larger amount of protein than a nanoparticle having the same characteristics except that no peptide was inserted into the amino acid sequence of the encapsulin monomers, as illustrated in Example 2.
  • these nanoparticles can be immunogenic and surprisingly induce a humoral response against the inserted peptide and / or against the protein that has been encapsulated, but not against the encapsulin.
  • the nanoparticle according to the invention can also be used to conserve and / or stabilize the internal protein, especially when the latter is in an unfavorable environment, such as a temperature too high and / or a pH incompatible with the maintenance of the integrity of the protein, or where the medium contains enzymes or agents that rapidly alter or degrade the protein.
  • the encapsulation of a protein in the nanoparticle according to the invention may also be advantageous to reduce its toxicity, or prolong its half-life by delaying its release.
  • the invention relates to a nanoparticle comprising:
  • an assembly of encapsulin monomers in which a peptide is inserted into the amino acid sequence of at least one of said encapsulin monomers, the insertion site of the peptide being located in an outer loop, advantageously within the domain Has encapsulin monomer, so that the peptide is located outside the nanoparticle and
  • nanoparticle is meant a particle of matter, at least one of whose dimensions is at the nano-scale (that is, less than about 200 nm). Preferably, its three dimensions are at the nanoscale.
  • nano-compartment that is, less than about 200 nm.
  • nanocapsule or “nanocage” may also be used.
  • the nanoparticle or the nano-compartment is formed following self-assembly of encapsulin monomers as described in the invention.
  • the nanoparticle can contain up to 60, 120, 180 or 240 encapsulin monomers, depending on the origin of the monomer.
  • the nanoparticle has an icosahedral form, the external diameter of which is typically between 10 and 40 nm, more particularly between 20 and 40 nm.
  • Techniques for measuring the size of this type of particles are well known to those skilled in the art. There may be mentioned, for example, transmission electron microscopy (TEM) or dynamic light scattering (Dynamic Light Scattering or DLS).
  • TEM transmission electron microscopy
  • DLS Dynamic Light Scattering
  • the TEM makes it possible to determine the internal and / or external diameter of the nanoparticles.
  • the DLS based on the principle of Rayleigh scattering, makes it possible to measure the hydrodynamic radius of a particle (that is to say the radius of a theoretical sphere that would have the same diffusion coefficient as the particle considered) .
  • encapsulin monomer is meant a protein belonging to the family of encapsulins, which are bacterial proteins and which have 3 structural domains: the peripheral domain P (domain P), the axial domain A (domain A) and the elongated loop E (loop E) as described by Sutter M et al. (Nat Struct Mol Mol (2008); 15 (9): 939-947).
  • encapsulin monomers in sense of the present invention have in common a very strong structural homology, which can be defined by means of RMSD (Root Mean Square Deviation), in particular at the P and A domains.
  • the P domain contains an internal cavity in which there are amino acids having the ability to bind by non-covalent bonds via ionic and / or hydrophobic interactions at the C-terminus of at least one of the proteins belonging to the family iron-dependent peroxidases (especially Dyp), ferritin-like proteins (Flp), ferredoxins, Dps-bacterioferritin-like proteins, hemerythrin-like proteins, or rubrerythrin-like proteins.
  • Dyp iron-dependent peroxidases
  • Fep ferritin-like proteins
  • ferredoxins ferredoxins
  • Dps-bacterioferritin-like proteins hemerythrin-like proteins
  • rubrerythrin-like proteins especially rubrerythrin-like proteins.
  • RMSD makes it possible to compare the structural resemblance of two encapsulin monomers. For each of the N atoms compared, the atom i of coordinates
  • first monomer is mapped to the coordinate atom i '
  • ferredoxins ferredoxins
  • Dps-bacterioferritin-like proteins Dps-bacterioferritin-like proteins
  • hemerythrin-like proteins or rubrerythrin-like proteins
  • the amino acids of the internal cavity of the P domain which are involved in these interactions are conserved or the possible modifications are limited to conservative substitutions, according to which the amino acids are replaced by amino acids of the same subgroup.
  • the encapsulin monomers of T. maritima (SEQ ID NO: 1), P. furiosus (SEQ ID NO: 2), B. linens (SEQ ID NO: 3), R. jostii (SEQ ID NO: 4), R. erythropolis (SEQ ID NO: 5), and M xanthus (SEQ ID NO: 6) are particularly suitable for the object of the invention.
  • a peptide has been inserted into the amino acid sequence of at least one of the encapsulin monomers that form the nano-compartment according to the invention.
  • the nano-compartment may therefore consist of a set of encapsulin monomers identical to each other and at least one different encapsulin monomer, distinguished by the insertion of the amino acid sequence of the peptide.
  • the nano-compartment may also consist of a mixture of two sets of monomers; a first set of encapsulin monomers all identical to each other and a second set of encapsulin monomers, also all identical to each other, but differing from the monomers of the first set by the insertion of the amino acid sequence of the peptide.
  • the nanoparticle according to the invention comprises an assembly of encapsulin monomers all identical to each other, according to which the amino acid sequence of a peptide has been inserted into the amino acid sequence of all the monomers of 'encapsuline.
  • the peptide is inserted into an external site of the encapsulin monomer, in particular in an external site of the domain A of the encapsulin monomer which is localized by aligning the sequence of the encapsulin monomer with the sequence of a Reference encapsulin monomer whose crystalline structure is known, such as that of the encapsulin monomer of T. maritima.
  • This alignment can be done structurally if the structure of the target encapsulin is known, such as that of P. furiosus, or simply by alignment of the protein sequences when the structure of the target encapsulin is not known, such as that of R. erythropolis.
  • Pymol Schotinger
  • the domain A of the encapsulin monomer comprises ⁇ -helices and ⁇ -sheets, these structures being interconnected by amino acid sequences that do not have a characteristic secondary structure (unfolded structures).
  • the constitutive amino acid sequence of the first ⁇ sheet of domain A and the amino acid sequence constituting the first unfolded structure which lies between this first sheet ⁇ and the first ⁇ helix of domain A represent a external site of the A domain and are particularly suitable for inserting the peptide according to the invention, as indicated in FIG. 1, in which the three-dimensional structures of the encapsulin monomers of T. Maritima and P. furiosus have been represented as an indication.
  • the peptide can be inserted between two consecutive amino acids of the sequence K 2 i 6 which corresponds to the amino acid sequence of the first ⁇ -sheet
  • the encapsulin monomer can originate from a thermophilic or extremophilic bacterium, such as T. maritima.
  • the amino acid sequence of the monomer from which the peptide sequence according to the invention is inserted may correspond to the T. Maritima encapsulin sequence (SEQ ID NO: 1), or to an amino acid sequence. derived from it.
  • amino acid sequence derived from a reference amino acid sequence of an encapsulin monomer is meant an amino acid sequence containing variations from the reference sequence, but these should not significantly alter the three-dimensional structure of the encapsulin monomer, so that the RMSD at the P and A domains is less than 5 ⁇ with respect to the corresponding P and A domains of at least one of the monomers selected from the group consisting of the encapsulin monomers of T. maritima (SEQ ID NO: 1), P. furiosus (SEQ ID NO: 2), B. linens (SEQ ID NO: 3), R. jostii (SEQ ID NO: 4), R. erythropolis (SEQ ID NO: 5), and M.
  • xanthus (SEQ ID NO: 6) using the software jFATCAT, and should not alter its functionality, ie its ability to self-regulate. to assemble and bind with non-covalent bonds, i.e. by means of ionic and / or hydrophobic interactions, with the C-terminal end of at least one of the proteins belonging to the family of iron-dependent peroxidases (especially Dyp), ferritin-like proteins (Flp), ferredoxins, Dps-bacterioferritin-like proteins, hemerythrin -like proteins, or rubrerythrin-like proteins.
  • Dyp iron-dependent peroxidases
  • Fep ferritin-like proteins
  • ferredoxins ferredoxins
  • Dps-bacterioferritin-like proteins hemerythrin -like proteins, or rubrerythrin-like proteins.
  • sequence variations may be naturally occurring variations, or introduced by genetic engineering techniques, known to those skilled in the art (such as those described in Sambrook J and Coll, Molecular Cloning-A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, pp. 9.31-9.57, or in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1989), 6.3.1-6.3.6).
  • the variations include deletion (s), substitution (s), or insertion of an amino acid, for example after the N-terminal methionine of the reference amino acid sequence, as well as combinations thereof. of these variations.
  • amino acid sequences derived from the sequences SEQ ID NO: 2 to 6 there may be mentioned sequences in which a glycine is inserted in second position of the sequences SEQ ID NO: 2 to 6, just after the N-terminal methionine .
  • the percentage identity between a reference amino acid sequence and an amino acid sequence derived from this sequence is at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%.
  • X% represents the number of amino acids of the first sequence which are identical to the corresponding amino acids of the second sequence, after optimal alignment of the two sequences, relative to the total length of the second amino acid sequence.
  • the two sequences are optimally aligned when the value of X% is maximum. Sequence alignment and percent identity determination can be done manually or automatically using the Needleman and Wunsch algorithm (Needleman and Wunsch (1970), J. Mol Biol., 48: 443-453). using, as parameters, the Blossum 62 comparison matrix of Henikoff (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
  • index of hydropathy of amino acids which takes into account their hydrophobicity properties.
  • indices are the following (from the most hydrophobic to the most hydrophilic): isoleucine (+4.5); valine (+4.2); leucine (+3.8); phenylalanine (+2.8); cysteine (+2.5); methionine (+1.9); alanine (+1.8); glycine (-0.4); threonine (-0.7); serine (-0.8); tryptophan (-0.9); tyrosine (- 1.3); proline (-1.6); histidine (-3.2); glutamate (-3.5); glutamine (-3.5); aspartate (-3.5); asparagine (-3.5); lysine (-3.9); and arginine (-4.5).
  • hydropathic indexes with respect to the activity of a protein is known to those skilled in the art (Kyte et al., J. Mol Biol (1982) 157: 105-31).
  • a substitution of an amino acid with another amino acid of close hydropathy index (the difference between the hydropathy index values of less than 2, preferably less than 1, and even more preferably less than 0.5).
  • sequences derived from SEQ ID NO: 1 are amino acid sequences identical to the sequence SEQ ID NO: 1, but in which the N-termini have deletions of 1 to 3 amino acids, since these first 3 amino acids are not involved in the interaction with the internal protein. On the other hand, these derived sequences retain their ability to self-assemble and the RMSDs of the P and A domains are less than 5 ⁇ with respect to the P and A domains of SEQ ID NO: 1 of T. maritima, using the jFATCAT software.
  • amino acid sequence of the monomer from which a peptide according to the invention has been inserted is a sequence derived from the sequence SEQ ID NO: 1 in which the first 3 amino acids of the N-terminal end have been deleted, and that includes the C200S substitution.
  • amino acid sequence of the encapsulin monomer from which a peptide according to the invention is inserted is the sequence:
  • the amino acid sequence of the encapsulin monomer is chosen from the following sequences: the sequence SEQ ID NO: 1, the sequence SEQ ID NO: 7, a sequence exhibiting 90% of identity with the sequence SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 7, advantageously the sequence SEQ ID NO: 7.
  • the insertion of the peptide preferably takes place between two consecutive amino acids of the sequence
  • the insertion of the peptide takes place between the amino acids or, in the case of a derived sequence, between the amino acids of the corresponding sequence after alignment of the two monomeric sequences.
  • the amino acid sequence is the sequence SEQ ID NO: 7 or a derived sequence
  • the insertion of the peptide takes place preferably between two consecutive amino acids of the sequence or, in the case of a sequence
  • the insertion of the peptide takes place between the amino acids or, in the case of a
  • the peptide is inserted between two consecutive amino acids of the region 138-143 of the sequence SEQ ID NO: 7, or between two consecutive amino acids of the corresponding region in the sequence of the monomer of encapsuline.
  • this region corresponds to the amino acid sequence KIECGS which is also found at positions 141 to 146 of the sequence SEQ ID NO: 1.
  • the term "Corresponding region in the sequence of the encapsulin monomer” the region present in a sequence of any other encapsulin (more particularly one of the 590 "conventional” encapsulins described by Radford) which is identified by comparison of the three-dimensional structure of this encapsulin encapsulin with that of Thermotoga maritima encapsulin whose crystallographic structure is available (Sutter et al., Nat Struct Mol Biol (2008); 15 (9): 939-947).
  • the three-dimensional structure of the encapsulin (as resolved by crystallography, for example) is used directly when it is available, as is the case for encapsulins of Myxococcus xanthus (PDB: 4PT2) and Pyrococcus furiosus (PDB: 2E0Z).
  • the alignment of the structures can for example be realized using the PROMALS3D webserver or the PyMol software. If the three-dimensional structure of encapsulin is not available, it is possible to model it from its amino acid sequence, notably using the SWISS-MODEL webserver.
  • the corresponding region is defined as follows:
  • the peptide is inserted between two consecutive amino acids of the KMKLSS sequence.
  • the peptide is inserted between two consecutive amino acids of the AVAIPD sequence.
  • the peptide is inserted between two consecutive amino acids of the VLSLPE sequence.
  • the peptide is inserted between two consecutive amino acids of the sequence ELKLPI or ELKLPV. According to another particular embodiment, the peptide is inserted between amino acids K 141 and L 142 .
  • the peptide is inserted between two consecutive amino acids of the sequence TVPLGD.
  • the total number of amino acids of the sequence of the inserted peptide, optionally including one or more linkers is greater than or equal to 4 and / or less than or equal to 100, or even 90, 80, 70, 60 or even 55, advantageously between 4 and 55 (including terminals), in particular between 9 and 55 (inclusive), more particularly between 13 and 55 (inclusive), or between 4 and 28 (inclusive), in particular between 9 and 28 (terminals included), more particularly between 13 and 28 (terminals included), or between 4 and 13 (included terminals), in particular between 9 and 13 (terminals included).
  • the total number of amino acids inserted can therefore be in particular 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 , 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, or 55.
  • the inserted peptide may optionally contain one or more saccharide or lipid chains.
  • the insertion of the peptide therefore entails an extension of the sequence of the encapsulin monomer by the number of amino acids contained in the sequence of said peptide, this elongation being as described above in relation to with the size of the peptide, preferably 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 , 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 , 50, 51, 52, 53, 54 or 55 amino acids.
  • any encapsulin monomer which, after insertion of the peptide according to the invention, would have an amino acid sequence which would be identical to any encapsulin sequence already described, in particular to one of the sequences SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 6 would be purely coincidental and should be excluded from the subject of the invention.
  • the sequence of the inserted peptide comprises or consists of the sequence, where X 6 is I or T,
  • EVETPIRNE SEQ ID NO: 9
  • EVETPIRNG SEQ ID NO: 10
  • EVETPIRSE SEQ ID NO: 11
  • EVETPIRSG SEQ ID NO: 12
  • EVETPIRT SEQ ID NO: 13
  • EVETPIRTG SEQ ID NO: 14
  • EVETPIRRE SEQ ID NO: 15
  • EVETPIRRG SEQ ID NO: 16
  • EVETPTRNE SEQ ID NO: 17
  • EVETPTRNG SEQ ID NO: 18
  • EVETPTRSE SEQ ID NO : 19
  • EVETPTRSG SEQ ID NO: 20
  • EVETPTRTE SEQ ID NO: 21
  • EVETPTRTG SEQ ID NO: 22
  • EVETPRET SEQ ID NO: 23
  • EVETPTRRG SEQ ID NO: 24
  • the inserted amino acid sequence comprises or consists of the sequence EVETPIRNE (SEQ ID NO: 9). It is also possible to insert a sequence comprising or consisting of the sequence of the 24 N-terminal amino acids of the M2 protein derived from an H1N1 influenza virus, such as MSLLTEVETPIRNE WGCRCNGS SD (SEQ ID NO: 25) or a repeated sequence of this, possibly with a connecting arm between the two sequences, for example the sequence
  • MSLLTEVETPIRNEWGCRCNGS SDGGGMSLLTEVETPIRNE WGCRCNGS SD SEQ ID NO: 26 which comprises the GGG motif between the two repeated sequences of MSLLTEVETPIRNEWGCRCNGSSD (SEQ ID NO: 25).
  • the inserted peptide sequence may further comprise an N-terminal and / or C-terminal linker linker.
  • Binding arms are sequences of a few amino acids, well known to those skilled in the art, and chosen according to the desired degree of flexibility. For example, mention may be made of the Gly, Gly / Ser or Gly / Ala binding arms (Reddy Chichili VP et al., Protein Sci. (2013); 22 (2): 153-167).
  • the link arms located in N-terminal and C-terminal may be identical or different from each other. According to a particular embodiment, the link arms located at the N-terminal and at the C-terminal consist of the GG sequence.
  • sequence of the inserted peptide is, for example, the sequence GGEVETPIRNEGG (SEQ ID NO: 27), the sequence GGMSLLTEVETPIRNEWGCRCNGSSDGG (SEQ ID NO: 28) or the sequence GGMSLLTEVETPIRNEWGCRCNGSSDGGGMSLLTEVETPIRNEWGCRCNGSSDGG
  • sequence of the encapsulin monomer after insertion of the sequence SEQ ID NO: 27 is the sequence:
  • sequence of the encapsulin monomer after insertion of the sequence SEQ ID NO: 28 is the sequence:
  • sequence of the encapsulin monomer after insertion of the sequence SEQ ID NO: 29 is the sequence:
  • the inserted peptide sequence comprises or consists of the sequence DAEFRHDSG (SEQ ID NO: 33). According to a particular embodiment, this sequence comprises in N-ter and C-ter two GG linker arms, so that the sequence of the inserted peptide is the sequence GGDAEFRHDSGGG (SEQ ID NO: 34). According to another particular aspect, the sequence of the encapsulin monomer after insertion of the sequence SED ID NO: 34 is the sequence:
  • the nanoparticle according to the invention also comprises an internal protein, that is to say a protein which is on the internal surface of the surface of the nanoparticle or inside the nano-compartment, without being bound to its surface. by means of a covalent bond.
  • an internal protein encompasses both an oligopeptide, a peptide, a polypeptide or a protein, which may optionally contain one or more saccharide or lipid chains. This protein internal can be in monomeric or multimeric form.
  • Any protein capable of binding at its N- or C-terminal end, by means of non-covalent bonds, ie by means of ionic and / or hydrophobic interactions, to the internal cavity of the P domain of a encapsulin monomer, is considered an internal protein, within the meaning of the present invention, since it is located inside the nanoparticle.
  • the N or C-terminal end of the internal protein must contain a sufficient number of amino acids capable of interacting by means of ionic and / or hydrophobic interactions with the amino acids of the internal cavity of the P domain of the monomer. 'encapsuline.
  • GGDLGIRK SEQ ID NO: 38
  • Flp ferritin-like protein family
  • the amino acid sequence of the C-terminal or N-terminal portion, respectively, of the internal protein ends or begins, respectively, with a chain of amino acids of the IMT type, in which : I denotes an amino acid sequence whose total number of amino acids is between 0 and 30 (inclusive), preferably between 0 and 25 (inclusive), and even more preferably between 0 and 20 (bound). included), where Xi is D the sequence in which X
  • T denotes a terminal amino acid sequence whose total number of amino acids is between 0 and 15 (inclusive), preferably between 0 and 10 (inclusive, and even more preferably between 0 and 5 ( terminals included).
  • IMT-like sequence is generally fused to the C-terminus or N-terminus of a protein of interest.
  • the sequence I or sequence T can advantageously start or terminate, respectively, with an amino acid sequence acting as a linker, to facilitate insertion of the protein into the internal P-domain cavity of the encapsulin monomer.
  • the total number of amino acids of the IMT sequence does not exceed 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, or 60 amino acids.
  • amino acids in positions 1 and 4 of the sequence SEQ ID NO: 37 do not have a determining role, they can be any amino acid chosen from the 20 natural amino acids or even be a modified amino acid.
  • the choice of amino acids in position 1 and 4 may be used to adjust more finely the interactions of the sequence SEQ ID NO: 37 with the amino acids of the internal cavity of the P domain of the encapsulin monomer.
  • the encapsulin monomer used for the insertion of the peptide sequence according to the invention comes from T. Maritima, in particular when its amino acid sequence is the sequence SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 7 or a derived sequence, including when the degree of identity of the sequence derived from the sequence ID NO: 1 or SEQ ID NO: 7 is at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% , 96%, 97%, 98%, 99%, the C-terminal or N-terminal portion, respectively, of the internal protein ends or begins, respectively, by a chain of amino acids of the IMT type, in which I denotes an amino acid sequence whose total number of amino acids is between 0 and 30 (inclusive), preferably between 0 and 25 (inclusive), and even more preferably between 0 and 20 (inclusive) ), M is the sequence
  • X 4 each denotes an undetermined amino acid
  • X9 is T, G or N
  • Xi 0 is I or V
  • T is a terminating amino acid sequence in which the total number of amino acids is between 0 and (inclusive), preferably 0 to 10 (inclusive), and even more preferably 0 to 5 (inclusive).
  • M is the sequence GGDLGIRK (SEQ ID NO: 38)
  • I is the GGSENT sequence, or, even more preferably, the IEEETSGGSENT sequence, so that the IM sequence is the sequence GGSENTGGDLGIRK (SEQ ID NO: 39) or the sequence IEEETSGGSENTGGDLGIRK (SEQ ID NO: 40).
  • the IMT sequence is the sequence GGSENTGGDLGIRKL (SEQ ID NO: 41), or, even more preferably, the sequence IEEETSGGSENTGGDLGIRKL (SEQ ID NO: 42).
  • the internal protein according to the invention is a fusion protein (that is to say an artificial protein) obtained by genetic recombination, according to which the C-terminal or N-terminal end of a protein of interest
  • the fusion protein is therefore in the form of NH 2 -IMT-Pr-COOH or NH 2 -PN-IMT-COOH in which Pr denotes the protein of interest.
  • the protein of interest is an enzyme, such as Glutathione S-transferase (GST), more particularly Schistosoma japonicum Glutathione S-transferase, or a fluorescent protein, such as eGFP.
  • GST Glutathione S-transferase
  • eGFP fluorescent protein
  • the invention also relates to a bicistronic vector comprising a first nucleic acid sequence encoding an encapsulin monomer, wherein a peptide has been inserted as defined above, and a second nucleic acid sequence encoding an internal protein.
  • I designates a sequence of amino acids whose total number of amino acids is between 0 and 30 (inclusive), preferably between 0 and 25 (inclusive), and even more preferably between 0 and 20 (inclusive)
  • M is the sequence SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37 or SEQ ID NO: 38
  • T denotes an amino acid sequence whose total number of amino acids is between 0 and 15 (inclusive), preferred way between 0 and 10 (inclusive) and even more preferably between 0 and 5 (inclusive).
  • This bicistronic vector is preferably an expression vector.
  • the vector may be, for example, a plasmid, a phage, a virus, a baculovirus, a cosmid, a phagemid, a transposon, a bacterial artificial chromosome or an artificial yeast chromosome.
  • the vector is a plasmid. It contains the necessary elements that allow the transcription and / or translation of nucleic acids of interest into proteins.
  • the plasmid contains one or more origins of replication (ori), one or more promoters, one or more ribosome binding sites (RBS), one or more codons " start ", one or more stop codons, one or more termination sequences, one or more selection markers, such as antibiotic resistance genes, and / or one or more restriction sites.
  • the nucleic acid sequences coding respectively for the encapsulin monomeric protein, into which a peptide has been inserted, and for the internal protein, may be under the control of a single promoter.
  • the bicistronic expression vector according to the invention may be a plasmid comprising: an appropriate operational promoter for the host cell, a first ribosome binding site (RBS), an initiation codon, a first sequence of nucleic acid encoding an amino acid sequence of an encapsulin monomer, such as the amino acid sequence SEQ ID NO: 1 or 7, or encoding an amino acid sequence derived from that sequence, wherein a peptide, a stop codon, a second ribosome binding site, a second initiation codon, a second nucleic acid sequence coding for a second protein (internal protein) whose end C- terminally or N-terminally, respectively, terminates or begins, respectively, with a sequence of amino acids of type IMT, and a stop codon.
  • This bicistronic expression vector after introduction into a host cell, allows the simultaneous expression in the same cell of the encapsulin monomeric proteins according to the invention and of the internal protein, which facilitates the encapsulation of the internal protein. in the nanoparticle.
  • the expression vector may also be a polycistronic vector. According to a first alternative, it comprises a first nucleic acid sequence coding for an encapsulin monomeric protein according to the invention and two or more nucleic acid sequences coding for different internal proteins which it is desired to encapsulate, in which the C-terminal or N-terminal ends, respectively, terminate or start, respectively, by a chain of amino acids of the IMT type, as described above.
  • the polycistronic vector comprises a first nucleic acid sequence encoding a first monomeric encapsulin protein, a second nucleic acid sequence encoding a second monomeric encapsulin protein distinguished from the first protein in that that a peptide has been inserted in an external site of the domain A of the encapsulin monomer, in particular in that consisting of the constitutive amino acid sequence of the first sheet ⁇ of domain A and the amino acid sequence constituting the the first unfolded structure contiguous to the amino acid sequence of the first ⁇ -sheet, and one or more sequences coding for one or more internal proteins that it is desired to encapsulate, the C-terminal or N-terminal ends, respectively, of these proteins terminating or starting, respectively, by a chain of amino acids of the IMT type.
  • This type of vector makes it possible to obtain nanoparticles the surface of which consists of a mixture of two sets of monomers; a first set of encapsulin monomers all identical to each other and a second set of encapsulin monomers, also all identical to each other, but differing from the monomers of the first set by the insertion into their amino acid sequences of the additional peptide sequence at domain A of encapsulin monomers.
  • These nanoparticles also contain one or more internal proteins.
  • the subject of the invention is also a host cell comprising a bicistronic or polycistronic vector as described above.
  • the subject of the invention is also a host cell comprising two or more expression vectors, making it possible to produce the nanoparticles of the invention.
  • a host cell containing two vectors, the first vector comprising a nucleic acid sequence coding for an encapsulin monomer in which a peptide has been inserted as defined above, and the second vector comprising a nucleic acid sequence coding for an internal protein as defined above, advantageously whose C-terminal or N-terminal end, respectively, ends or begins, respectively, with a sequence of amino acids of the IMT type wherein I denotes an amino acid sequence whose number is between 0 and 30 (inclusive), preferably between 0 and 25 (inclusive), and even more preferably between 0 and 20 (inclusive) , M is the sequence SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37 or SEQ ID NO: 38, and T denotes an amino acid sequence whose number is between 0 and 15 (inclusive), preferably between 0 and 10 (terminals inc luses) and even more preferably between 0 and 5 (limits included).
  • I denotes an amino acid sequence whose number is between 0 and 30 (
  • the host cell may be a prokaryotic cell or a eukaryotic cell.
  • prokaryotic cells that are suitable for the invention are eubacteria, such as Gram + or Gram- bacteria, Agrobacterium, and Archaebacteria.
  • Gram- bacteria BL21 (DE3), JM109, FB850, Shuffle, Lemo21, rosetta, K12 and E. coli.
  • Gram + bacteria the host of choice is Bacillus subtilis strain RIK 1285.
  • mammalian cells such as cells of a CHO line, insect cells (for example, cells of the Sf9 line), yeast cells originating from Saccharomyces cerevisiae or Pichia are exemplified as examples. pastoris as well as any other unicellular eukaryotic cell, and plant cells.
  • the nature of the expression vector is chosen according to the type of host cell.
  • the methods used to introduce one or more expression vector (s) according to the invention into host cells are well known to those skilled in the art.
  • the vector is for example a plasmid, a cosmid, an artificial chromosome of bacteria or yeast, it is possible, for example, to use the methods of electroporation, chemical transfection or heat shock.
  • the vector is infectious, it is introduced by infection and / or transduction of the host cells, for example by infecting Sf9 cells with baculovirus, plant cells with tobacco mosaic virus (TMV), or bacteria. with bacteriophages.
  • TMV tobacco mosaic virus
  • the strain BL21 (DE3) of E. coli is transformed by heat shock with a bicistronic expression vector as described above.
  • the subject of the invention is also a method for producing nanoparticles according to the invention according to which:
  • Host cells are cultured as described above, under conditions that promote the expression of the encapsulin monomers and of the internal protein (s); and
  • nanoparticles containing the internal protein are recovered, resulting from the self-assembly of the encapsulin monomers.
  • the nanoparticles can be recovered from the cell pellet or supernatant, using conventional means such as centrifugation, clarification, microfiltration, or nanofiltration.
  • the vector when the host cell is a bacterium, may contain an inducible operon (for example, a lactose operon (Lad) inducible by the addition of Isopropyl ⁇ -D-1-thiogalactopyranoside, or IPTG).
  • an inducible operon for example, a lactose operon (Lad) inducible by the addition of Isopropyl ⁇ -D-1-thiogalactopyranoside, or IPTG).
  • the host cells are eukaryotic cells, for example mammalian, insect or yeast cells
  • the sequence of the encapsulin monomer, in which a peptide has been inserted contains one or more potential glycosylation sites (in particular, N-glycosylation, O-glycosylation or fucosylation)
  • one or more amino acids at one or more of these sites can be mutated, so that the encapsulin monomer is no longer glycosylated at the site (s) mutated (s).
  • the invention relates to a method for purifying nanoparticles comprising an assembly of encapsulin monomers, wherein:
  • a nanoparticle-containing cell grind comprising an encapsulin monomer assembly is clarified
  • the clarified solution containing the nanoparticles is subjected to one or more multi-modal chromatography stage (s);
  • hydrophobic contaminants contained in the eluate are removed in one or more times by means of a biphasic solution
  • the aqueous phase is recovered which is subjected to one or more polishing step (s), and
  • the purified solution containing the nanoparticles comprising an assembly of encapsulin monomers is recovered.
  • the inventors have surprisingly shown that this method of purification, which can be carried out on an industrial scale, makes it possible to obtain a solution containing the nanoparticles comprising an assembly of encapsulin monomers, with a degree of purity generally of at least 85%. .
  • the nanoparticles comprising an assembly of encapsulin monomers have been produced by Gram + or Gram - bacteria, in particular by E. coli, and more particularly by the strain BL21 (DE3) of E. coli.
  • the crushed cell can for example be obtained by grinding, enzymatic lysis, mechanical breakage or osmotic shock techniques.
  • the separation is done by combining at least two different modes, selected in the following set of modes: size exclusion, affinity, ion exchange, hydrophobic interaction, or even hydrogen interactions or with one and the same chromatography medium.
  • the multimodal chromatography support is chosen such that the separation is done by combining the size exclusion and hydrophobic and charge-based interaction modes.
  • Capto TM Core 700 multimodal resin GE Healthcare
  • the multimodal resin is used to garnish a column. The dimensions and the number of columns, as well as the experimental conditions to be used, can be optimized by those skilled in the art.
  • the phase separation step is carried out by means of a biphasic solution, for example based on detergent and an aqueous solution, or on the basis of polymer and an aqueous solution (Effio & Hubbuch, Biotechnol. 2015), 10 (5): 715-727); the aqueous solution may for example be a phosphate buffer type saline solution.
  • the detergent may be nonionic or ionic. It must have a phase separation temperature sufficiently low, so as not to denature the proteins. According to a particular embodiment, the detergent used is nonionic, and more particularly Triton X-114.
  • the purification process according to the invention may comprise one, two, three or more phase separation steps. In the case where the host cell used to produce the encapsulin is E. coli, this phase separation step is particularly useful for remove a predominant hydrophobic contaminant, OmpF protein (Outer membrane protein F). This step also makes it possible to reduce the level of bacterial endotoxins.
  • size exclusion chromatography also known as gel filtration
  • membrane filtration also known as membrane filtration
  • ion exchange chromatography multimodal chromatography
  • any other method that may be used be selected by the skilled person.
  • the use of a Superdex 200 10/300 Increase (GE Healthcare) gel filtration column is particularly suitable for this polishing step. This step makes it possible to isolate the purified fraction corresponding to the encapsulin nanoparticles.
  • the purified solution containing the nanoparticles comprising an assembly of encapsulin monomers may be concentrated by methods known to those skilled in the art.
  • the purification method is also useful for purifying nanoparticles comprising an assembly of encapsulin monomers, wherein a peptide has been inserted into the amino acid sequence of at least one of the encapsulin monomers, and optionally comprising a protein internal. According to a particular embodiment, this method is implemented to purify the nanoparticles of the invention.
  • This purification process can also be used to purify nanoparticles comprising an assembly of encapsulin monomers, wherein a peptide comprising the sequence
  • X 9 is E or G, in particular the sequence EVETPIRNE (SEQ ID NO: 9), or comprising the sequence DAEFRHDSG (SEQ ID NO: 33), was inserted into the amino acid sequence of at least one of said encapsulin monomers, and further comprising an internal protein.
  • the subject of the invention is also an immunogenic composition comprising nanoparticles which comprise an assembly of encapsulin monomers, in which a peptide has been inserted into the amino acid sequence of at least one of the encapsulin monomers, the site the insertion of the peptide being located in an outer loop, advantageously of the A domain, still more advantageously at the insertion sites defined above optionally comprising an internal protein, for example as described in their various embodiments.
  • the composition containing the nanoparticles according to the invention induces, after administration to an individual, a specific immune response against the inserted peptide and / or the internal protein.
  • immunogenic (or immunogenic) composition within the meaning of the present invention is meant a composition capable of inducing after administration in an individual a humoral (that is to say mediated by the antibodies) and / or cellular (c ') response. that is, T-cell mediated) directed against at least one peptide that has been inserted into at least one of the encapsulin monomers and / or against the protein that is inside nanoparticles.
  • the immunogenic composition induces a specific humoral response against the peptide that has been inserted into at least one of the encapsulin monomers, and not against the encapsulin itself.
  • the invention relates to the use of nanoparticles as defined above as an immunogen.
  • an immunogen can be used as a vaccine or adjuvant.
  • the present invention also relates to an immunization method comprising the administration to a subject of nanoparticles as defined above.
  • the term "individual” refers to both a healthy subject and a sick subject and concerns both man and animal.
  • the immune (or immune) response may include one or more of the following: the production of specific antibodies (eg, IgA, IgG, IgM) by B cells; and / or the activation of regulatory, cytotoxic or helper T cells, and / or T lymphocytes directed specifically against a protein present in the immunogenic composition. It may also include the activation of cells involved in the development of innate immunity, such as monocytes / macrophages, neutrophils, eosinophils, dendritic cells and more generally antigen-presenting cells.
  • innate immunity such as monocytes / macrophages, neutrophils, eosinophils, dendritic cells and more generally antigen-presenting cells.
  • the immunogenic composition according to the invention is capable as such of inducing a specific humoral response against the peptide which has been inserted into at least one of the encapsulin monomers, the specific immune response to against this peptide by adding an adjuvant.
  • adjuvant is meant any substance capable of increasing the specific immune response against the inserted peptide and / or the internal protein, whether humoral and / or cellular.
  • adjuvants based on emulsions, such as oil-in-water or water-in-oil emulsions, calcium or aluminum salts such as aluminum hydroxide and / or calcium phosphate. aluminum, TLR agonists or cytokines.
  • the adjuvant (s) can be chosen depending on the orientation of the specific immune response that is to be strengthened. It may be in particular a Thl or Th2 type adjuvant.
  • the immunogenic composition may be administered by any route used to induce an immune response to an antigen, including in particular the intradermal, subcutaneous, intramuscular, parenteral, mucosal (eg, nasal) or transcutaneous route.
  • routes used to induce an immune response to an antigen including in particular the intradermal, subcutaneous, intramuscular, parenteral, mucosal (eg, nasal) or transcutaneous route.
  • the immunogenic composition according to the invention induces a specific humoral and / or cellular immune response (s) against the M2 protein of the influenza virus , and more generally against the influenza virus type A, whether of animal or human origin, in particular against the influenza A type H1N1 virus, since this sequence comprises an epitope of the extracellular domain of the M2 protein of the influenza virus which is a universal influenza A antigen (Neirynck S et al., Nature Medicine (1999); 5 (10): 1157-1163; Fiers W et al., Virus Res (2004); 2): 173-176, Deng L et al., Vaccines (2015), 3: 105-136).
  • the immune response is directed against the influenza virus.
  • the subject of the invention is an immunogenic composition
  • an immunogenic composition comprising nanoparticles which comprise an assembly of encapsulin monomers, wherein a peptide has been inserted into the amino acid sequence of at least one of the monomers of encapsulin, the site of insertion of the peptide being located in an external site of the domain A consisting of the constitutive amino acid sequence of the first sheet ⁇ of domain A and the amino acid sequence constituting the first unfolded structure contiguous to the amino acid sequence of the first ⁇ -sheet.
  • the subject of the invention is also an encapsulin monomer in which has been inserted, in its amino acid sequence, a peptide comprising the sequence EVETPX ⁇ RXsXg (SEQ ID NO: 8) where X 6 is I or T, X 8 is N, S, T or R, and X 9 is E or G, particularly the EVETPIRNE sequence (SEQ ID NO: 9), or a peptide comprising the sequence DAEFRHDSG (SEQ ID NO: 33).
  • the peptide has been inserted into an external site of the domain A of the monomer, in particular in that constituted by the constitutive amino acid sequence of the first sheet ⁇ of domain A and the sequence of amino acid constitutive of the first unfolded structure contiguous to the amino acid sequence of the first ⁇ -sheet.
  • the sequence of the encapsulin monomer into which a peptide according to the invention has been inserted is the sequence SEQ ID NO: 30, the sequence SEQ ID NO: 31, or the sequence SEQ ID NO: 32.
  • the subject of the invention is also a nucleic acid sequence coding for:
  • an encapsulin monomeric protein such as that corresponding to the sequence SEQ ID NO: 1 or 7, d which has been inserted a peptide sequence comprising the sequence where X 6
  • EVETPIRNE sequence (SEQ ID NO: 9), or a peptide sequence comprising the sequence DAEFRHDSG (SEQ ID NO: 33), or for
  • a monomeric encapsulin protein having the sequence SEQ ID NO: 30, the sequence ID NO: 31, or the sequence ID NO: 32, or a protein derived from one of these sequences.
  • the nucleic acid sequence that is the subject of the invention may also be a vector comprising one of the nucleic acid sequences as defined in 1 and 2.
  • the nucleic acid sequences coding for one of the monomeric proteins of encapsulin can be DNA or RNA, single-stranded or double-stranded. They may be obtained by means of conventional cloning procedures, for example comprising the excision of said sequence and then its isolation, for example on an agarose gel.
  • the nucleic acid sequence coding for a monomeric encapsulin protein is the sequence SEQ ID NO: 43:
  • the nucleic acid sequence of interest may be produced by recombinant DNA technologies, synthetic methods, or a combination of these methods, well known to those skilled in the art.
  • the codons of the nucleic acid sequence of interest may also be optimized to allow better transcription and / or translation in the host cell. Optimization of codons in a DNA or RNA sequence is based on the existence of the degeneracy of the genetic code, and consists, for example, of replacing one or more codons with codons more frequently used by the host cell, as described in US 2004/0209241, and / or to optimize the content ratio in G / C, as described in US 2011/0269950.
  • the codon optimization of the nucleic acid sequences is carried out so as not to significantly modify the amino acid sequence, and therefore preferably using synonymous codons (i.e., coding for the same amino acid).
  • Mutations in the nucleic acid sequence according to the invention may also be introduced, for example to eliminate possible sites of glycosylation (N-glycosylation, O-glycosylation or fucosylation).
  • the vector may be, for example, a plasmid, a phage, a virus, a baculovirus, a cosmid, a phagemid, a transposon, a bacterial artificial chromosome or an artificial yeast chromosome.
  • the vector is a plasmid. It contains the necessary elements that allow the transcription and / or translation of nucleic acids of interest into proteins. It includes at least one inducible or constitutive promoter suitable for the host cell, a selection system (antibiotic, complementation, etc.), an SD / kozac sequence, one or more ribosome binding sites, a transcription stop sequence , a stop codon and an initiator codon.
  • the plasmid contains one or more origins of replication (ori), one or more promoters, one or more ribosome binding sites (RBS), one or more codons " start ", one or more stop codons, one or more termination sequences, one or more selection markers, such as antibiotic resistance genes, and / or one or more restriction sites.
  • origins of replication ori
  • promoters e.g., a promoter
  • RBS ribosome binding sites
  • RBS ribosome binding sites
  • Figure 1 Structure of encapsulin monomer A) Thermotoga maritima (PDB ID: 3DKT) and B) Pyrococcus furiosus (PDB ID: 2E0Z).
  • the external insertion site corresponding to the first sheet ⁇ of the domain A and the unfolded structure contiguous to the first sheet ⁇ is presented in black on the structures and circled with dots.
  • Figure 2 Schematic representation of the plasmid used for cloning (derived from plasmid pET28b).
  • Figure 3 SDS-PAGE analysis after the different key steps of the purification protocol for each of the nanoparticles XIP1, XIP2 and XIP3.
  • M molecular weight marker (in kDa); (1) total fraction; (2a) soluble fraction; (2b) filtered soluble fraction; (3) fraction after passage on Capto TM Core 700; (4a, b, c) aqueous phase after a first, a second and optionally a third triton X-114 differential extraction, respectively; (5) purified assembly after size exclusion chromatography and concentration of the sample.
  • the solid black arrow corresponds to the encapsulin monomer and the dotted arrow to the eGFP.
  • Figure 4 Analysis of the size distribution (nm) of nanoparticles XIP1 (top), XIP2 (middle) and XIP3 (bottom), by dynamic light scattering (DLS).
  • FIG. 6 Analysis of the IgG1 (A) and IgG2a (B) antibody responses in each group of mice before immunization (J0) and after immunization (J42), with one of the following compositions: encapsulin-M2e + eGFP (XIP2), with or without adjuvant, adjuvanted ovalbumin-M2e, adjuvanted eGFP, or an adjuvanted PBS control composition, with respect to buffer control, eGFP, streptavidin, M2-streptavidin, ovalbumin, ovalbumin-M2e, encapsulin and encapsulin-M2e + eGFP (XIP2).
  • FIG. 7 IgG1 antibody production in groups of mice immunized with encapsulin-M2e + eGFP (XIP2), with adjuvant (solid symbols) or without adjuvant (hollow symbols), measured by ELISA on the sera collected at
  • the ELISA test estimates the ability of antibodies to recognize encapsulin-M2e + eGFP (XIP2) (round symbols), encapsulin (triangles symbols point down), streptavidin-M2e (square symbols) and streptavidin (triangles symbols point up).
  • Figure 9 Schematization of new constructs involving A) a different size of M2e insert, B) a different sequence of inserted peptide (BAP) and, C) a different encapsulated protein (GST).
  • eGFP fluorescent protein
  • the eGFP corresponds to GFP (L29345; GI: 606383; product: green-fluorescent protein; protein ID: AAA58246), modified by the introduction of the 6 mutations Q25H, F64L, S65T, M141L, P157Q, K172E.
  • the first preparation contained encapsulin nanoparticles whose monomer sequence (referred to as reference monomer) was derived from the native sequence of Thermotoga maritima. It contained the sequence corresponding to amino acids 4 to 254 of the native T. maritima sequence (NC_000853; GI: 15642775 locus gene TM0785, product "bacteriocin", protein ID: NP 228594) to which were added the amino acids FQVVNPEALILLKF in C-terminal, consistent with the crystallized structure of the protein (PDB code: 3DKT) as described by Sutter et al. 2008. It contained also a C197S substitution (C200S compared to the numbering of the native encapsulin of T. maritima).
  • the second preparation contained encapsulin nanoparticles, the monomer sequence of which corresponded to that of the reference monomer, except for the insertion of the GGEVETPIRNEGG sequence between amino acids Kl 38 and 1139.
  • the sequence EVETPIRNE which is found in the consensus amino acid sequence of the ectodomain of the human influenza A H1N1 virus M2 (GL21693176, gene locus AF389121.1, product matrix protein M2, UniProt ID: P06821, strain Puerto Rico 8/1934); been framed by two GG linkers.
  • the sequence was inserted into the external domain A site consisting of the constitutive amino acid sequence of the first ⁇ sheet of domain A and the amino acid sequence constituting the first unfolded structure contiguous to the amino acid sequence.
  • the third preparation contained encapsulin nanoparticles, whose monomer sequence corresponded to that of the reference monomer, except for the insertion of the sequence GGGGGGHHHHHHGGGGGG (His loop) between amino acids P42 and Y43. The sequence was inserted into an internal site of the encapsulin monomer in the P domain.
  • eGFP-containing nanoparticle preparations were produced by E. coli bacteria transformed with bicistronic plasmids obtained by insertion of specific nucleotide constructs (C1-C3, see below). These constructs contained in particular in the 5 ' ⁇ 3' direction, the coding sequence for one of the encapsulin monomers as described above and the coding sequence for the eGFP which was fused to the coding sequence for the sequence. peptide IEEETSGGSENTGGDLGIRKL which corresponds to the conserved C-terminal domain (C-ter) of the T.
  • maritima Flp protein (NC 000853; GL15642775 locus gene TM0786, product "ferritin / ribonucleotide reductase-like protein", protein ID: NP 228595).
  • An additional codon (CTT, encoding a Leucine) was inserted between the 3 'end of the eGFP coding sequence and the 5' terminus of the C-ter domain coding sequence of the Flp protein. , in order to introduce a HindIII restriction site.
  • BL21 (DE3) Competent E. coli 50 ⁇ l of a suspension of E. Chemo-competent BL21 (DE3) coli were transformed with 1 ⁇ g of plasmid, using the kit "BL21 (DE3) Competent E. coli" (Ref: C2527H, New England Biolabs), following the recommendations of the supplier.
  • the bacterial transformation was carried out by incubation in ice for 15 minutes, followed by a 45 second heat shock at 42 ° C. The transformed bacteria were then incubated in ice for 15 minutes, then 1 hour at 37 ° C.
  • the production of the nanoparticles was induced by adding 100 ⁇ l of IPTG (Isopropyl ⁇ -Dl-thiogalactopyranoside ) in the culture medium. Induction was carried out overnight at 18 ° C. Purification of nanoparticles
  • the pellets from the bacterial cultures after induction were resuspended in phosphate buffered saline IX PBS pH 7.5 (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.76 mM KH2PO4) containing 0.1 ⁇ g.mL -1 Deoxyribonuclease I.
  • the bacterial lysis was performed by mechanical breakage of 30 seconds to 4.5 ms -1 with 0.1 mm silica beads (Matrix B, ref: 116911050, MP Biomedicals), using the Fast apparatus. Prep (MP Biomedicals).
  • the lysate was then clarified by centrifugation for 45 minutes at 7000 g, followed by filtration of the supernatant through a polyethersulfone membrane with a porosity of 0.8 ⁇ (Ref: 190-2580 Nal imperative®, Thermo S cientifc).
  • the purification of the different nanoparticle preparations was carried out using the AKTA Pure 25M chromatography system (GE Healthcare), using one or more HiTrap Capto TM Core 700 columns (GE Healthcare Life Sciences ref: 17 -5481-51) in series. The system was equilibrated with 1X PBS and the columns were loaded with the clarified lysate at a rate of 0.2 ml.min- 1 .
  • the proteins contained in the clarified lysate were eluted in PBS buffer and collected in fractions of 1 mL.
  • the fractions containing encapsulin monomer assemblies with a diameter greater than or equal to 10 nm were collected and one to three successive differential extractions (as a function of the concentration of the majority contaminant) were carried out with Triton. 0.1% X-114.
  • the differential extraction of hydrophobic proteins was carried out as follows: 0.1% Triton X-114 was added to the mixture of fractions of interest and set at 4 ° C until the solution was homogenized. The The homogenized solution was then incubated at 37 ° C for 15 minutes resulting in the formation of Triton micelles and separation of the solution into two phases. Centrifugation at 15000 g for 20 minutes at 37 ° C was performed to separate the aqueous phase from the hydrophobic detergent phase containing a large amount of contaminants.
  • the aqueous fraction was recovered and then subjected to a final purification step by size exclusion chromatography in which a column of gel was charged at a rate of 0.5 mL.min -1.
  • Superdex 200 filtration 10/300 Increase (GE Healthcare, ref: 28990944) previously equilibrated with IX PBS.
  • the fractions containing the encapsulin nanoparticles were then concentrated on Sartorius concentrators (Ref: VS2021) retaining proteins of more than 30 kDa.
  • the degree of purity of the different nanoparticle preparations was controlled by SDS-PAGE during the various purification steps (see Figure 3).
  • Figure 3 shows a gradual disappearance of the strips corresponding to the contaminants during the purification steps.
  • the degree of purity is estimated semi-quantitatively by evaluating the intensity of the band corresponding to encapsulin, based on the intensity of all the bands present, using the Image Lab software (BioRad). After the last purification step (column 5 in Fig. 3), this degree of purity is at least about 85-90%, for each of the XIP1, XIP2 and XIP3 nanoparticle preparations.
  • the average size of the nanoparticles contained in the various purified preparations was measured by DLS using the Malvern Zetasizer Nano apparatus. After filtration of an aliquot of 200 ⁇ l of each of the purified preparations on a 0.22 ⁇ cellulose acetate filter (Ref: 8161, Costar Spin-X), the samples were then placed in a UV-compatible vat and analyzed. by photon correlation spectroscopic measurement (633 nm He-Ne laser) of diffusion radiations of the nanoparticles at a fixed angle of 173 °. The measurements were performed in duplicate at 25 ° C. after equilibration for 2 minutes and then analyzed using the DTS software. The results (see FIG.
  • a calibration line measuring the relative fluorescence intensity (expressed in RFUs, where RFU stands for relative fluorescence unit) as a function of eGFP concentration, was established by measuring the fluorescence intensity emitted by a solution of purified eGFP tagged His (SEQ ID NO: 47), in a PB S IX buffer in a concentration range from 0 to 30 ⁇ g.mL -1 .
  • the measurement was made using the CFX96 Touch TM Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad) using FAM filters for excitation (450- 490 nm) and for emission (510- 530 nm).
  • the ratio [encapsulin] M / [eGFP] M) obtained for each preparation makes it possible to evaluate the capacity of the nanoparticles to encapsulate the fluorescent protein.
  • a nanoparticle based on T. maritima encapsulin monomers is conventionally composed of 60 monomers, it is possible to estimate the number of eGFP molecules which have been encapsulated by nanoparticle in each of the preparations.
  • the "M2e” peptide having the sequence sequence GGEVETPIRNEGG and the peptide "M2e biotinylated C-terminal" [NH2] GGEVETPIRNEGG [CH2CH2Biotin] were synthesized by ThermoFisher scientific method.
  • Ovalbumin Sigma Ref: A5503- 1G
  • M2e-Ovalbumin M2e peptide
  • Ovalbumin, the peptide M2e, and the coupling agent BS 3 were incubated for 30 minutes at 25 ° C.
  • mice Four groups of 7 female BalB / c strain mice were immunized by subcutaneous injection with one of the following antigens: encapsulin-M2e + eGFP (XIP2), eGFP, Ovalbumin-M2e, or PBS (negative control). Three injections were performed on day 0, day 14 and day 28. The first injection (J0) was carried out with 50 ⁇ g of antigen mixed volume to volume with Freund's complete adjuvant (CFA), while the second (J14) and the third injection (J28) were performed with the same amount of antigen but with incomplete Freund's adjuvant (IF A).
  • CFA Freund's complete adjuvant
  • IF A incomplete Freund's adjuvant
  • mice A fifth group of 7 mice was immunized with encapsulin-M2e + eGFP, following the same protocol, but without adjuvant use for the 3 injections.
  • 50 ⁇ of serum was collected before the first immunization (D0), then 14 days, 28 days and 42 days later (D14, D28 and D42).
  • the IgG1 and IgG2a antibody response was assayed by direct ELISA.
  • the plates were then washed again with PBS-Tween 20 as previously described, and then incubated for 30 minutes with 100 ng of revealing antibody which is either an anti mouse IgG1 rat antibody coupled to HRP (Thermo Ref. No. 10097462 ), or a rat anti mouse IgG2a antibody coupled to HRP (Thermo reference: 10777993).
  • 100 ⁇ l of TMB (Thermo reference: 11869260) were added per well and the plates were incubated for 5 minutes at room temperature.
  • 100 ⁇ l of 0.2 M sulfuric acid (Sigma reference: 320501-1L-D) was added to each well. The plate was then read with the TECAN plate reader at an absorbance of 450 nm.
  • FIGS. 6A and 6B show that the antibodies produced by mice immunized with encapsulin-M2e + eGFP (XIP2) in the presence of adjuvant are directed against M2e, but, surprisingly, not against encapsulin. -same, as evidenced by the recognition by the antibodies of encapsulin-M2e, streptavidin-M2e and ovalbumin-M2e, and not encapsulin, streptavidin and ovalbumin. Similarly, after immunization with encapsulin-M2e + eGFP (XIP2) without adjuvant, the antibodies produced are directed against encapsulin-M2e, but not against encapsulin alone.
  • XIP2 encapsulin-M2e + eGFP
  • antibodies produced by immunized mice with ovalbumin-M2e in the presence of adjuvant recognize ovalbumin-M2e, but also ovalbumin alone, and recognize neither encapsulin-M2e nor streptavidin-M2e.
  • the antibodies produced are therefore essentially directed against ovalbumin but not against M2e.
  • the antibodies produced during immunization with encapsulin-M2e, with or without adjuvant, are predominantly IgG1 type, but IgG2a type antibodies are also produced. Following immunization with ovalbumin-M2e, there is almost no IgG2a antibodies produced.
  • bi-cistronic (C4 to C6) constructs were made, coding for three protein sequences (XIP4 to XIP6). All the constructions were carried out according to the methods described in Example 1 and a summary diagram of these constructions is presented in FIG. 9. Preparation of bi-cistronic plasmids
  • the C4 construct is based on the C2 construct and consists in increasing the size of the epitope presented on the surface by the encapsulin. For this, a dimer of the entire M2e sequence, with linkers, is added to the surface of the encapsulin, ie 55 amino acids inserted into the encapsulin sequence.
  • the M2e epitope selected corresponds to the ectodomain of the M2 Matrix protein of PR8 strain Influenza virus.
  • the M2 matrix protein is 97 amino acids in size and divides into a transmembrane domain, an external domain, and an internal domain. It is the outer part (ectodomain of 24 amino acids) that is of interest. It corresponds to the nucleic sequence:
  • Influenza A virus (A / Puerto Rico / 8/34 / Mount Sinai (H1N1)), GI: 21693176: Accession: AF389121; Protein Id: AAM75162.1; product "matrix protein 2": Ectodomain
  • the corresponding protein sequence is composed of 24 amino acids described below:
  • Matrix protein 2 24 AA: Ectodomain M2e epitope of the strain M2e InfluenzaA / PR8
  • the inserted 55 AA sequence corresponds to the duplication of the M2e sequence of 24 AA, linked by a glycine linker (three glycines) and flanked by two glycine linkers, namely the sequence:
  • the nucleic sequence has been modified for one of the monomers to avoid the formation of secondary structures related to complementarity or recombination between sequences.
  • This sequence has been optimized by using the codon usage table of E. coli, and the total sequence of the resulting C4 construct corresponds to:
  • Construction C5 corresponds to construction C2 for which the epitope M2e of 9 amino acids was changed by the peptide of the amyloid- ⁇ protein (BAP).
  • the references of this gene are: NP 000475 and Uniprot: P05067 Gene ID: 351 and the inserted sequences are:
  • the C6 construct corresponds to the C2 construct in which the encapsulated protein was modified: the eGFP fluorescent protein was replaced by glutathione-S transferase (GST) of the Schistosoma japonicum strain.
  • GST glutathione-S transferase
  • the sequence used is derived from the vector pGEX-2T which expresses GST (Genescript, references: pGEX-2T cloning vector).
  • the sequence of the commercial selected GST was optimized for expression in E.coli, using a Cad4BIO software harmonization algorithm.
  • the HindIII, BamHI, EcoRI and XhoI restriction enzyme sites were removed so as not to interfere with the cloning experiments.
  • the resulting sequence was fused to the Flp-Cter domain of Flp protein derived from Thermotoga Maritima.
  • the sequence is directly fused without the addition of a leucine to have the HindIII restriction site in contrast to what could have been done for the Flp-Cter fused eGFP.
  • each expressed protein (XIP4 to XIP6) was purified as described in FIG. EXAMPLE 1
  • the XIP4 to 6 proteins were first analyzed by SDS-PAGE and western blot using anti-M2e, anti-GFP and anti-GST antibodies, in order to confirm the presence of the different elements on the purified proteins. Subsequently, an electron microscopy study was performed on the proteins as described in Example 2. This study showed the good assembly of the various nanoparticles for new constructions XIP4 to XIP6.
  • the first step was to determine the concentration of encapsulin in each sample. For this, a measurement of the total protein concentration of each sample was carried out using a colorimetric assay of proteins, based on bicinchonic acid (BCA, ThermoFisher ref 23235). In parallel, the percentage of encapsulin present in the total sample was estimated based on SDS-PAGE gels analysis. analyzed by the ImageJ software (https://imagej.nih.gov/).
  • a kit using 1-chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB) was used (Sigma, ref CS0410).
  • CDNB 1-chloro-2,4-dinitrobenzene
  • the activity of the GST is measured during the conjugation by the enzyme of the thiol group of glutathione reduced to CDNB. This conjugation causes an increase in absorbance at 340 nm which is measured over time.
  • a standard range of GST concentration was achieved and following the addition of the substrates, the absorbance at 340 nm per minute (A340nm / min) was measured for the standard range and samples.
  • molar concentrations for eGFP and GST are calculated by dividing the concentrations in mg / mL by the molar masses of the corresponding proteins. All values obtained are shown in Table 4. The number of encapsulated proteins per particle was then determined as described in Example 2 and reported in Table 4.

Abstract

La présente invention a pour objet une nanoparticule comprenant un assemblage de monomères d'encapsuline, selon laquelle un peptide a été inséré dans la séquence d'acides aminés d'au moins un desdits monomères d'encapsuline, le site d'insertion du peptide étant situé dans un site externe du domaine A du monomère d'encapsuline, et comprenant en outre une protéine interne.

Description

NANOPARTICULES A BASE D'ENCAPSULINE
DOMAINE TECHNIQUE La présente invention concerne le domaine technique de l'encapsulation, et en particulier l'encapsulation de protéines. Plus précisément, la présente invention a pour objet des nanoparticules à base de monomères d'encapsuline spécifiques ayant une grande capacité à encapsuler des protéines, les moyens pour produire ces nanoparticules, ainsi que leur utilisation dans des compositions immunogènes.
ETAT DE LA TECHNIQUE
Le domaine de l'encapsulation connaît un essor important depuis plusieurs années. L'encapsulation consiste à enfermer une substance dans une « capsule », pour l'isoler du milieu extérieur et/ou la transporter jusqu'à l'endroit désiré où elle sera libérée pour agir. Cette technologie est notamment mise à profit pour encapsuler des protéines, qui peuvent être sensibles à certains facteurs environnementaux et se dégrader (par exemple, sous l'action d'enzymes ou dans certaines conditions de pH), et préserver ainsi leur activité biologique et/ou prolonger leur effet thérapeutique. Elle peut être aussi mise en œuvre pour différer ou prolonger le relargage des protéines à travers la capsule. Dans le domaine vaccinal, elle est également mise à profit pour délivrer la protéine vaccinale aux cellules du système immunitaire (Bungener L. et coll. Vaccine (2002); 20: 2287-2295).
Plusieurs techniques ont été décrites dans la littérature pour l'encapsulation de protéines, conduisant à des systèmes de type microparticules ou nanoparticules, par exemple à base de polymères (Amidi M et Coll. Advanced Drug Delivery Reviews (2010); 62 :59-82), des systèmes à base de lipides, tels que des émulsions, des nanoparticules lipidiques solides ou des liposomes (Martins S et Coll., Int J Nanomedicine (2007) ; 2(4) : 595-607), ou encore des systèmes de type virosomes (Bungener L. et coll. Vaccine (2002); 20: 2287-2295) ou utilisant des Virus-Like-P articles (Patterson DP et Coll. ACS Chem Biol ( 2014) ; 9(2) : 359-365).
Récemment, Sutter et Coll. ont décrit une famille de protéines bactériennes, les encapsulines, ayant la capacité de s'auto-assembler pour former un nano-compartiment (ou nanoparticule ou nanocapsule ou « nanocage ») contenant des protéines enzymatiques particulières appartenant à la famille des DyP (dye-decolorizing peroxydase) ou des Flp (ferritin-like protein) (Sutter M et Coll., Nat Struct Mol Biol (2008) ; 15(9) : 939-947). Cette structure pourrait servir de micro -réacteur à l'intérieur de la bactérie, dans lequel des réactions enzymatiques se produisent dans un espace confiné. Le nano-compartiment a une taille généralement comprise entre 10 et 40 nm, en fonction de la taille et du nombre de monomères d'encapsuline qui se sont auto-assemblés. Par exemple, les encapsulines provenant de Thermotoga maritima (ou de Rhodococcus jostii RHAl) s'assemblent pour former des nanoparticules ayant une taille d'environ 24 nm et composées de 60 monomères d'encapsuline. A partir d'une banque de données, Sutter a analysé les séquences des protéines enzymatiques appartenant à la famille des DyP et montré que celles qui sont présentes à l'intérieur des nano-compartiments d'encapsuline étaient codées par des gènes qui se trouvent sur le même opéron que celui qui code pour l'encapsuline. Par ailleurs, en alignant les séquences de leurs extrémités C-terminales, Sutter a également montré qu'il existait une séquence conservée d'acides aminés. Cette séquence conservée d'acides aminés est également retrouvée sur l'extension C-terminale d'autres protéines enzymatiques qui sont encapsulées dans les nano-compartiments d'encapsuline telles que celles qui appartiennent à la famille des Flp.
Par ailleurs, Sutter a déterminé la structure cristallographique de l'encapsuline de Thermotoga maritima. Il en a déduit les régions en hélices a et en feuillets β, ainsi que la présence de 3 domaines appelés domaine A, domaine P et boucle E, respectivement. Le domaine A est défini comme étant constitué de 3 segments en hélices a et de 5 feuillets β, comprenant l'extrémité C-terminale. Le domaine P est impliqué dans l'interaction avec les protéines présentes à l'intérieur. Un alignement de séquence avec 10 encapsulines d'origine différente révèle une certaine homologie.
Moon et Coll. (Biomacromolecules (2014); 15 : 3794-3801) ont testé l'ajout d'une séquence comprenant 6 résidus histidine (His) à l'encapsuline de Thermotoga maritima. L'ajout en C-terminal ne permet pas la purification, indiquant que cette région n'est pas entièrement exposée à l'extérieur. En revanche, l'insertion entre les résidus 138 et 139 permet la purification, révélant ainsi l'exposition à la surface extérieure de l'encapsuline. L'insertion entre les résidus 42 et 43 ne permet pas la purification mais confère une plus grande stabilité thermique. Cette dernière forme a ensuite été modifiée pour ne garder que la cystéine en position 123, exposée à l'extérieur. Cette encapsuline recombinante, appelée Encap_loophis42C123, a été utilisée pour greffer un marqueur fluorescent ou une prodrogue. Par ailleurs, le peptide SP94, permettant de cibler les carcinomes hépatocellulaires, a été inséré entre les résidus 138 et 139. Le suivi de la fluorescence et de la survie cellulaire a permis de confirmer l'adressage correct des nanoparticules aux cellules cibles. Moon et Coll. (Biomaterials Research (2014); 18(1): 21) a utilisé cette même encapsuline Encap loop his42C123 pour insérer entre les résidus 138 et 139 le peptide FcBP. Après expression chez Escherichia coli, les nanoparticules produites ciblent effectivement les cellules SCC-7 pour lesquelles le peptide FcBP présente une affinité.
Très récemment, Tamura et Coll. (Biotechnology and Bioengineering (2014) ; 112(1) : 13- 20) ont montré que l'on pouvait encapsuler des protéines hétérologues, telles que l'eGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) ou la luciférase, dans des nanoparticules d'encapsuline provenant de Rhodococcus erythropolis N771. Ces protéines hétérologues ont été modifiées par addition à leur extrémité C-terminale, d'une séquence correspondant aux 37 derniers acides aminés C-terminaux de la peroxydase DypB provenant de R. erythropolis N771. A noter que dans ce document, une séquence comprenant 6 résidus His a été fusionnée à l'extrémité C-terminale de l' encapsuline recombinante et ce pour permettre sa purification. Il est rapporté un rendement d'encapsulation relativement faible, puisque tout au plus une molécule d'eGFP ou de luciférase était encapsulée par nanoparticule.
Par ailleurs, le document WO 2009/109428 divulgue, de manière générale, la possibilité d'utiliser des nanoparticules comme agent vaccinal en incorporant un épitope des cellules T ou B, par exemple la séquence M2e issue de souches d'influenza, dans les nanoparticules. Le document WO 2015/054639 décrit des nanoparticules formées à partir de protéines de fusion intégrant une portion immunogénique du virus EBV. Lorsque les encapsulines sont utilisées pour former les nanoparticules, il est préconisé d'insérer la portion immunogénique au niveau du C-terminal. De même, le document US 2014/0271699 préconise de lier un antigène du virus RSV à une protéine capable de former des nanoparticules telle que l'encapsuline, au niveau d'un site permettant l'exposition de l'antigène à la surface des nanoparticules, par exemple les extrémités N ou C-terminales.
PROBLEME TECHNIQUE
Le but de l'invention est de proposer des nanoparticules à base d'encapsuline permettant notamment d'encapsuler une grande quantité de protéines. RESUME DE L'INVENTION
A cet effet, la présente invention a pour objet une nanoparticule comprenant un assemblage de monomères d'encapsuline, selon laquelle un peptide a été inséré dans la séquence d'acides aminés d'au moins un desdits monomères d'encapsuline, le site d'insertion du peptide étant situé dans un site externe du domaine A du monomère d'encapsuline, et comprenant en outre une protéine interne.
Selon un mode de réalisation de l'invention, le peptide a été inséré dans la séquence d'acides aminés de tous les monomères d'encapsuline.
Dans un autre mode de réalisation, le site externe du domaine A est constitué par la séquence d'acides aminés constitutive du premier feuillet β du domaine A et de la séquence d'acides aminés constitutive de la première structure dépliée contiguë à la séquence d'acides aminés du premier feuillet β.
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, la séquence d'acides aminés du monomère d'encapsuline est la séquence SEQ ID NO : 1 ou une séquence dérivée dont le degré d'identité est d'au moins 90%.
Selon encore un autre mode de réalisation particulier de l'invention, la séquence d'acides aminés du monomère d'encapsuline est la séquence SEQ ID NO : 7 ou une séquence dérivée dont le degré d'identité est d'au moins 90%. Selon un autre mode de réalisation particulier de l'invention, le peptide a été inséré entre deux acides aminés consécutifs de la séquence
Figure imgf000005_0001
lorsque la séquence du monomère d'encapsuline est la séquence SEQ ID NO : 7, ou entre deux acides aminés consécutifs de la séquence correspondante lorsque la séquence du monomère d'encapsuline est une séquence dérivée de la séquence SEQ ID NO : 7, après alignement des deux séquences monomériques.
Dans un autre mode de réalisation de l'invention le nombre total d'acides aminés du peptide inséré est compris entre 4 et 55 (bornes incluses). Selon un autre mode de réalisation particulier de l'invention, le peptide inséré comprend la séquence EVETPIRNE (SEQ ID NO : 9). Selon un autre mode de réalisation très particulier de l'invention, la séquence d'acides aminés du monomère d'encapsuline après insertion du peptide est la séquence ID NO : 30. Selon un mode de réalisation de l'invention, l'extrémité C- terminale ou N-terminale, respectivement, de la séquence d'acides aminés de la protéine interne se termine ou commence, respectivement, par un enchaînement d'acides aminés du type I-M-T, dans lequel :
a. I désigne une séquence d'acides aminés dont le nombre total d'acides aminés est compris entre 0 et 30 (bornes incluses), de façon préférée entre 0 et 25 (bornes incluses) et de façon encore plus préférée entre 0 et 20 (bornes incluses) ;
b.
Figure imgf000006_0001
c. T désigne une séquence d'acides aminés dont le nombre total d'acides aminés est compris entre 0 et 15 (bornes incluses), de façon préférée entre 0 et 10 (bornes incluses) et de façon encore plus préférée entre 0 et 5 (bornes incluses).
Selon un mode de réalisation de l'invention, la protéine interne est une protéine de fusion selon laquelle l'extrémité C-terminale ou N-terminale d'une protéine d'intérêt a été fusionnée à l'enchaînement d'acides aminés du type I-M-T.
La présente invention a également pour objet un vecteur bicistronique comprenant une première séquence d'acide nucléique codant pour un monomère d'encapsuline dans lequel un peptide a été inséré dans un site externe du domaine A du monomère, en particulier dans celui constitué par la séquence d'acides aminés constitutive du premier feuillet β du domaine A et de la séquence d'acides aminés constitutive de la première structure dépliée contiguë à la séquence d'acides aminés du premier feuillet β, et une deuxième séquence d'acide nucléique codant pour une protéine dont l'extrémité C-terminale ou N-terminale, respectivement, se termine ou commence, respectivement, par un enchaînement d'acides aminés du type I-M-T, dans lequel I désigne une séquence d'acides aminés dont le nombre total d'acides aminés est compris entre 0 et 30 (bornes incluses) de façon préférée entre 0 et 25 (bornes incluses) et de façon encore plus préférée entre 0 et 20 (bornes incluses), M est la séquence SEQ ID NO : 36, SEQ ID NO : 37 ou SEQ ID NO : 38, et T désigne une séquence d'acides aminés dont le nombre total d'acides aminés est compris entre 0 et 15 (bornes incluses), de façon préférée entre 0 et 10 (bornes incluses) et de façon encore plus préférée entre 0 et 5 (bornes incluses). Un autre objet de l'invention est une cellule hôte comprenant un vecteur bicistronique tel que décrit précédemment.
Un autre objet de l'invention est une cellule hôte comprenant un premier vecteur qui comprend une séquence d'acides nucléiques codant pour un monomère d'encapsuline dans lequel un peptide a été inséré dans un site externe du domaine A du monomère, en particulier dans celui constitué de la séquence d'acides aminés constitutive du premier feuillet β du domaine A et de la séquence d'acides aminés constitutive de la première structure dépliée contiguë à la séquence d'acides aminés du premier feuillet β, et un deuxième vecteur qui comprend une séquence d'acides nucléiques codant pour une protéine dont l'extrémité C-terminale ou N-terminale, respectivement, se termine ou commence, respectivement, par un enchaînement d'acides aminés du type I-M-T, dans lequel I désigne une séquence d'acides aminés dont le nombre total d'acides aminés est compris entre 0 et 30 (bornes incluses), de façon préférée entre 0 et 25 (bornes incluses) et de façon encore plus préférée entre 0 et 20 (bornes incluses), M est la séquence SEQ ID NO : 36, SEQ ID NO : 37 ou SEQ ID NO : 38, et T désigne une séquence d'acides aminés dont le nombre total d'acides aminés est compris entre 0 et 15 (bornes incluses), de façon préférée entre 0 et 10 (bornes incluses) et de façon encore plus préférée entre 0 et 5 (bornes incluses).
L'invention a aussi pour objet un procédé de production de nanoparticules comprenant un assemblage de monomères d'encapsuline, telles que définies dans les différents modes de réalisation précédents, selon lequel:
a. On cultive des cellules hôtes telles que décrites précédemment dans des conditions favorisant l'expression des monomères d'encapsuline et de la protéine interne ; et
b. On récupère les nanoparticules contenant la protéine interne résultant de l'auto- assemblage des monomères d'encapsuline. L'invention a encore pour objet un procédé de purification de nanoparticules comprenant un assemblage de monomères d'encapsuline selon lequel :
a. On clarifie un broyât de cellules contenant des nanoparticules comprenant un assemblage de monomères d'encapsuline;
b. On soumet la solution clarifiée contenant les nanoparticules à une ou plusieurs étape(s) de chromatographie de type multi-modale ;
c. On récupère l'éluat contenant les assemblages de monomères d'encapsuline de diamètre supérieur ou égal à 10 nm ; d. On élimine en une ou plusieurs fois les contaminants hydrophobes contenus dans l'éluat au moyen d'une solution biphasique;
e. On récupère la phase aqueuse que l'on soumet à une ou plusieurs étape(s) de polissage, et
f. On récupère la solution purifiée contenant les nanoparticules comprenant un assemblage de monomères d'encapsuline.
L'invention a également pour objet une composition immunogène comprenant des nanoparticules telles que définies dans leurs différents modes de réalisation précédents.
L'invention a aussi pour objet une composition immunogène comprenant des nanoparticules qui comprennent un assemblage de monomères d'encapsuline, selon lesquelles un peptide a été inséré dans la séquence d'acides aminés d'au moins un desdits monomères d'encapsuline, le site d'insertion du peptide étant situé dans un site externe du domaine A du monomère d'encapsuline constitué de la séquence d'acides aminés constitutive du premier feuillet β du domaine A et de la séquence d'acides aminés constitutive de la première structure dépliée contiguë à la séquence d'acides aminés du premier feuillet β. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, le peptide inséré comprend la séquence EVETPIRNE (SEQ ID NO : 9).
Selon ce mode de réalisation particulier de l'invention, la réponse immune est dirigée contre le virus grippal.
Un autre objet de l'invention est un monomère d'encapsuline dans lequel a été inséré, dans sa séquence d'acides aminés, un peptide comprenant la séquence EVETPIRNE (SEQ ID NO : 9). Selon un mode de réalisation, le peptide a été inséré dans un site externe du domaine A du monomère, en particulier dans celui constitué de la séquence d'acides aminés constitutive du premier feuillet β du domaine A et de la séquence d'acides aminés constitutive de la première structure dépliée contiguë à la séquence d'acides aminés du premier feuillet β. L'invention a également pour objet une séquence d'acides nucléiques codant pour un monomère d'encapsuline tel que décrit précédemment. Selon un mode de réalisation, la séquence d'acides nucléiques codant pour un monomère d'encapsuline est la séquence SEQ ID NO : 43 ou une séquence dérivée ayant un degré d'identité d'au moins 80 % avec la séquence SEQ ID NO : 43. Enfin, l'invention a pour objet un vecteur comprenant une séquence d'acides nucléiques telle que décrite précédemment.
La présente invention sera mieux comprise à la lecture de la description qui suit. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Les inventeurs ont montré de façon surprenante qu'une nanoparticule comprenant un assemblage de monomères d'encapsuline, dans laquelle un peptide a été inséré dans un site externe d'au moins un desdits monomères d'encapsuline, est capable d'encapsuler une plus grande quantité de protéines qu'une nanoparticule ayant les mêmes caractéristiques excepté qu'aucun peptide n'a été inséré dans la séquence d'acides aminés des monomères d'encapsuline, comme illustré dans l'Exemple 2. En outre, selon la nature du peptide inséré et de la protéine interne, ces nanoparticules peuvent être immunogènes et induire de façon surprenante une réponse humorale contre le peptide inséré et/ou contre la protéine qui a été encapsulée, mais pas contre l'encapsuline.
La nanoparticule selon l'invention peut également être utilisée pour conserver et/ou stabiliser la protéine interne, notamment lorsque celle-ci se trouve dans un milieu défavorable, tel qu'une température trop élevée et/ou un pH incompatibles avec le maintien de l'intégrité de la protéine, ou lorsque le milieu contient des enzymes ou des agents qui altèrent ou dégradent rapidement la protéine. Dans le cadre d'une utilisation à des fins thérapeutiques ou préventives, l'encapsulation d'une protéine dans la nanoparticule selon l'invention peut aussi être avantageuse pour diminuer sa toxicité, ou prolonger sa demi- vie en retardant son relargage.
Ainsi et selon un premier aspect, l'invention concerne une nanoparticule comprenant :
- un assemblage de monomères d'encapsuline, dans lequel un peptide est inséré dans la séquence d'acides aminés d'au moins un desdits monomères d'encapsuline, le site d'insertion du peptide étant situé dans une boucle externe, avantageusement du domaine A du monomère d'encapsuline, de sorte que le peptide est localisé à l'extérieur de la nanoparticule et
- une protéine interne localisée à l'intérieur de la nanoparticule. Dans la présente demande, les termes « un », « une », « le », « la » doivent être interprétés de façon large en désignant indifféremment le singulier ou le pluriel (« des », « les »...), sauf s'il est clairement indiqué dans le texte que le terme « un », « une », « le » ou « la » doit être compris dans un sens excluant le pluriel. En particulier, ce terme désigne uniquement le singulier lorsqu'il est précédé ou suivi d'une mention excluant le pluriel, telle que « seul » ou « seulement ».
Par « nanoparticule », on entend une particule de matière, dont au moins une des dimensions se situe à l'échelle nano métrique (c'est-à-dire, inférieure à 200 nm environ). De préférence, ses trois dimensions sont à l'échelle nanométrique. Dans le cadre de la présente demande, les termes « nano-compartiment », « nanocapsule » ou « nanocage » peuvent également être utilisés.
Dans le cas de la présente invention, la nanoparticule ou le nano-compartiment est formé suite à Γ auto-assemblage de monomères d'encapsuline tels que décrits dans l'invention. La nanoparticule peut contenir jusqu'à 60, 120, 180 ou 240 monomères d'encapsuline, en fonction de l'origine du monomère. Classiquement, la nanoparticule a une forme icosaédrique, dont le diamètre externe est typiquement compris entre 10 et 40 nm, plus particulièrement entre 20 et 40 nm. Les techniques permettant de mesurer la taille de ce type de particules (représentée par exemple par son diamètre externe ou interne) sont bien connues de l'homme du métier. On peut citer, par exemple, la microscopie électronique à transmission (MET) ou encore la diffusion dynamique de la lumière {Dynamic Light Scattering ou DLS). La MET permet de déterminer le diamètre interne et/ou externe des nanoparticules. La DLS, basée sur le principe de la diffusion de Rayleigh, permet de mesurer le rayon hydrodynamique d'une particule (c'est-à-dire le rayon d'une sphère théorique qui aurait le même coefficient de diffusion que la particule considérée).
Par « monomère d'encapsuline », on entend une protéine appartenant à la famille des encapsulines, qui sont des protéines bactériennes et qui possèdent 3 domaines structuraux : le domaine périphérique P (domaine P), le domaine axial A (domaine A) et la boucle allongée E (boucle E) comme décrit par Sutter M et Coll. (Nat Struct Mol Biol (2008) ; 15(9) : 939-947). Hormis les encapsulines de Thermotoga maritima (T. maritima), Pyrococcus furiosus (P. furiosus), Brevibacterium linens (B. linens), Rhodococcus jostii (R. jostii), Rhodococcus erythropolis (R. erythropolis) et Myxococcus xanthus (M. xanthus) déjà décrites, Radford dans « Prédiction and Characterization of Phage Capsid-like Nanocompartments in Prokaryotes », Rapport de thèse (2015), Faculté de Médecine, Université de Toronto, a identifié 590 encapsulines provenant de nombreuses espèces bactériennes. Outre leurs propriétés d'auto-assemblage, les monomères d'encapsuline au sens de la présente invention, possèdent en commun une très forte homologie structurale, que l'on peut définir au moyen du RMSD {Root Mean Square Déviation), en particulier au niveau des domaines P et A. D'autre part, le domaine P contient une cavité interne dans laquelle se trouvent des acides aminés ayant la capacité de se lier au moyen de liaisons non covalentes, via des interactions ioniques et/ou hydrophobes à l'extrémité C-terminale d'au moins une des protéines appartenant à la famille des iron-dependent peroxidases (notamment les Dyp), des ferritin-like protéines (Flp), des ferredoxins, des Dps- bacterioferritin-like protéines, des hemerythrin-like protéines, ou des rubrerythrin-like protéines.
Le RMSD permet de comparer la ressemblance structurale de deux monomères d'encapsuline. Pour chacun des N atomes comparés, l'atome i de coordonnées
premier monomère est mis en correspondance avec l'atome i' de coordonnées
Figure imgf000011_0002
du second monomère, et le RMSD est obtenu par la formule suivante :
Figure imgf000011_0001
L'homme du métier peut identifier un logiciel pertinent permettant de réaliser cette mise en correspondance, et de calculer le RMSD. A titre d'exemple, on cite les logiciels Multiprot, SuperPose, jFATCAT, Dalilite, C-alphamatch, Pymol.
Tout monomère d'encapsuline ayant :
1) la capacité de s'auto-assembler,
2) un RMSD au niveau des domaines P et A inférieur à 5 Â par rapport aux domaines correspondants P et A d'au moins un des monomères des encapsulines de référence choisies parmi les encapsulines de T. maritima, P. furiosus, B. linens, R. jostii, R. erythropolis, et M. xanthus, telles que définies par leurs séquences respectives SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, telles que mentionnées ci- dessous, en particulier un RMSD au niveau des domaines P et A inférieur à 5 Â par rapport aux domaines correspondants P et A du monomère d'encapsuline de T. maritima (SEQ ID NO : 1), en utilisant le logiciel jFATCAT, et
3) dont le domaine P possède une cavité interne capable de se lier au moyen de liaisons non covalentes via des interactions ioniques et/ou hydrophobes à l'extrémité C-terminale d'au moins une des protéines appartenant à la famille des iron-dependent peroxidases (notamment les Dyp), des ferritin-like protéines
(Flp), des ferredoxins, des Dps-bacterioferritin-like protéines, des hemerythrin- like protéines, ou des rubrerythrin-like protéines ;
convient à l'objet de l'invention.
Figure imgf000012_0001
En particulier, les acides aminés de la cavité interne du domaine P qui sont impliqués dans ces interactions sont conservés ou les modifications éventuelles sont limitées à des substitutions conservatives, selon lesquelles les acides aminés sont remplacés par des acides aminés du même sous-groupe. Les monomères d'encapsuline de T. maritima (SEQ ID NO : 1), P. furiosus (SEQ ID NO : 2), B. linens (SEQ ID NO : 3), R.jostii (SEQ ID NO : 4), R. erythropolis (SEQ ID NO : 5), et M xanthus (SEQ ID NO : 6) conviennent particulièrement à l'objet de l'invention. En outre, un peptide a été inséré dans la séquence d'acides aminés d'au moins un des monomères d'encapsuline qui forment le nano-compartiment selon l'invention. Le nano- compartiment peut donc être constitué d'un ensemble de monomères d'encapsuline identiques entre eux et au moins un monomère d'encapsuline différent, se distinguant par l'insertion de la séquence d'acides aminés du peptide. Le nano-compartiment peut également être constitué d'un mélange de deux ensembles de monomères ; un premier ensemble constitué de monomères d'encapsuline tous identiques entre eux et un deuxième ensemble constitué de monomères d'encapsuline, également tous identiques entre eux, mais se distinguant des monomères du premier ensemble par l'insertion de la séquence d'acides aminés du peptide. De manière préférée, la nanoparticule selon l'invention comprend un assemblage de monomères d'encapsuline tous identiques entre eux, selon laquelle la séquence d'acides aminés d'un peptide a été inséré dans la séquence d'acides aminés de tous les monomères d'encapsuline.
De plus, le peptide est inséré dans un site externe du monomère d'encapsuline, notamment dans un site externe du domaine A du monomère d'encapsuline que l'on localise en alignant la séquence du monomère d'encapsuline avec la séquence d'un monomère d'encapsuline de référence dont la structure cristallisée est connue, comme celle du monomère d'encapsuline de T. maritima. Cet alignement peut se faire structurellement si la structure de l'encapsuline cible est connue, comme celle de P.furiosus, ou simplement par alignement des séquences protéiques lorsque la structure de l'encapsuline cible n'est pas connue, comme celle de R. erythropolis. A titre d'exemple, on cite le logiciel Pymol (Schrôdinger) pour l'alignement structurel et l'application Clustal Oméga
Figure imgf000013_0001
pour l'alignement des séquences protéiques. Structurellement, le domaine A du monomère d'encapsuline comprend des hélices a et des feuillets β, ces structures étant reliées entre elles par des séquences d'acides aminés qui n'ont pas de structure secondaire caractéristique (structures dépliées). On a identifié que la séquence d'acides aminés constitutive du premier feuillet β du domaine A et la séquence d'acides aminés constitutive de la première structure dépliée qui se situe entre ce premier feuillet β et la première hélice a du domaine A, représentent un site externe du domaine A et sont particulièrement appropriées pour insérer le peptide selon l'invention, comme indiqué sur la figure 1, où ont été représentées à titre indicatif les structures tridimensionnelles des monomères d'encapsuline de T. Maritima et de P.furiosus. On peut par exemple insérer le peptide entre deux acides aminés consécutifs de la séquence K2i6 qui correspond à la séquence d'acides aminés du premier feuillet β
Figure imgf000014_0001
et de la première structure dépliée du domaine A du monomère d'encapsuline de P. furiosus. A noter que Moon et Coll. (Bio macro molécules (2014); 15: 3794-3801) ont montré que la région C-terminale de l'encapsuline n'était pas entièrement exposée à l'extérieur de l'encapsuline, notamment lorsqu'une séquence comprenant 6 résidus His était fusionnée à son extrémité. Par conséquent, une telle région ne tombe pas dans la définition d'un site externe au sens de l'invention. Par ailleurs et dans les documents Moon et Coll. (Biomacromolecules (2014); 15: 3794-3801 ; Biomaterials Research (2014); 18(1): 21), la région 216-221 de l'encapsuline est appelée « boucle » ou « boucle de surface », qui sera la terminologie adoptée dans le cadre de la présente demande.
En particulier, le monomère d'encapsuline peut provenir d'une bactérie thermophile ou extrêmophile, telle que T. maritima. La séquence d'acides aminés du monomère à partir de laquelle on insère la séquence peptidique selon l'invention peut correspondre à la séquence de l'encapsuline de T. Maritima (SEQ ID NO : 1), ou à une séquence d'acides aminés dérivée de celle-ci. Par « séquence d'acides aminés dérivée d'une séquence d'acides aminés de référence d'un monomère d'encapsuline », on entend une séquence d'acides aminés contenant des variations par rapport à la séquence de référence, mais celles-ci ne doivent pas modifier signifîcativement la structure tridimensionnelle du monomère d'encapsuline, de sorte que le RMSD au niveau des domaines P et A est inférieur à 5 Â par rapport aux domaines correspondants P et A d'au moins un des monomères choisis parmi ceux de l'ensemble constitué par les monomères d'encapsuline de T. maritima (SEQ ID NO : 1), P. furiosus (SEQ ID NO : 2), B. linens (SEQ ID NO : 3), R. jostii (SEQ ID NO : 4), R. erythropolis (SEQ ID NO : 5), et M. xanthus (SEQ ID NO : 6) en utilisant le logiciel jFATCAT, et ne doivent pas altérer sa fonctionnalité, à savoir sa capacité à s'auto-assembler et à se lier au moyen de liaisons non covalentes, c'est-à-dire au moyen d'interactions ioniques et/ou hydrophobes, à l'extrémité C-terminale d'au moins une des protéines appartenant à la famille des iron-dependent peroxidases (notamment les Dyp), des ferritin-like protéines (Flp), des ferredoxins, des Dps-bacterioferritin-like protéines, des hemerythrin-like protéines, ou des rubrerythrin-like protéines. Ces variations de séquence peuvent être des variations se produisant naturellement, ou être introduites par des techniques de génie génétique, connues de l'homme du métier (telles que celles décrites dans Sambrook J et Coll, Molecular Cloning— A Laboratory Manual, 2ème Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, p. 9.31-9.57, ou dans Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6). Les variations incluent une ou des délétion(s), une ou des substitution(s), ou une insertion d'un acide aminé, par exemple après la méthionine N-terminale de la séquence d'acides aminés de référence, ainsi que des combinaisons de ces variations. Comme exemples de séquences d'acides aminés dérivées des séquences SEQ ID NO : 2 à 6, on peut citer des séquences dans lesquelles une glycine est insérée en deuxième position des séquences SEQ ID NO : 2 à 6, juste après la méthionine N-terminale.
Généralement, le pourcentage d'identité entre une séquence d'acides aminés de référence et une séquence d'acide aminés dérivée de cette séquence est d'au moins 90%, 91%, 92% , 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%.
Dans le cadre de la présente invention, lorsqu'une première séquence d'acides aminés est identique à X% à une seconde séquence d'acides aminés, cela signifie que ce X% représente le nombre d'acides aminés de la première séquence qui sont identiques aux acides aminés correspondants de la seconde séquence, après alignement optimal des deux séquences, par rapport à la longueur totale de la seconde séquence d'acides aminés. Les deux séquences sont alignées de façon optimale lorsque la valeur de X% est maximale. L'alignement des séquences et la détermination du pourcentage d'identité peuvent être faits manuellement ou de façon automatique en utilisant l'algorithme de Needleman et Wunsch (Needleman et Wunsch (1970), J. Mol. Biol. 48 :443-453), en utilisant comme paramètres, la matrice de comparaison Blossum 62 de Henikoff (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89 : 10915-10919, une pénalité de 8 lorsqu'il y a un trou, et une pénalité de 2 lorsqu'il y a une différence de longueur entre les deux séquences. Lorsqu'un acide aminé est substitué par un autre acide aminé, on le remplace de préférence par un acide aminé du même groupe ou du même sous-groupe, comme indiqué dans le tableau 1 ci-dessous (substitutions dites « conservatives »).
Figure imgf000016_0001
Pour le choix des substitutions, il est également possible d'utiliser par exemple l'index d'hydropathie des acides aminés, qui prend en compte leurs propriétés d'hydrophobicité. Ces index sont les suivants (du plus hydrophobe au plus hydrophile) : isoleucine (+4.5); valine (+4.2); leucine (+3.8); phénylalanine (+2.8); cystéine (+2.5); méthionine (+1.9); alanine (+1.8); glycine (-0.4); thréonine (-0.7); sérine (-0.8); tryptophane (-0.9); tyrosine (- 1.3); proline (-1.6); histidine (-3.2); glutamate (-3.5); glutamine (-3.5); aspartate (-3.5); asparagine (-3.5); lysine (-3.9); et arginine (-4.5). L'importance de ces index hydropathiques par rapport à l'activité d'une protéine est connue de l'homme du métier (Kyte et Coll., J. Mol. Biol. (1982) ; 157: 105-31). De préférence, on choisira une substitution d'un acide aminé par un autre acide aminé d'index d'hydropathie proche (écart entre les index d'hydropathie inférieur à 2, de préférence inférieur à 1, et de manière encore plus préférée inférieur à 0.5).
Comme exemples de séquences dérivées de la SEQ ID NO : 1, on cite des séquences d'acides aminés identiques à la séquence SEQ ID NO : 1, mais dans lesquelles les extrémités N-terminales comportent des délétions de 1 à 3 acides aminés, puisque ces 3 premiers acides aminés ne sont pas impliqués dans l'interaction avec la protéine interne. D'autre part, ces séquences dérivées conservent bien leur capacité à s'auto-assembler et les RMSD des domaines P et A sont inférieurs à 5 Â par rapport aux domaines P et A de la SEQ ID NO : 1 de T. maritima, en utilisant le logiciel jFATCAT. En particulier, la séquence d'acides aminés du monomère à partir de laquelle a été inséré un peptide selon l'invention est une séquence dérivée de la séquence SEQ ID NO : 1 dans laquelle les 3 premiers acides aminés de l'extrémité N-terminale ont été délétés, et qui comprend la substitution C200S. Ainsi, selon un aspect particulier de l'invention, la séquence d'acides aminés du monomère d'encapsuline à partir de laquelle on insère un peptide selon l'invention est la séquence :
Figure imgf000017_0001
Ainsi et selon un mode de réalisation particulier, la séquence d'acides aminés du monomère d'encapsuline est choisie parmi les séquences suivantes : la séquence SEQ ID NO : 1, la séquence SEQ ID NO : 7, une séquence présentant 90% d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 1 ou SEQ ID NO : 7, avantageusement la séquence SEQ ID NO : 7.
Lorsque la séquence d'acides aminés du monomère d'encapsuline correspond à la séquence de T. maritima (SEQ ID NO : 1) ou à une séquence dérivée, l'insertion du peptide a lieu de préférence entre deux acides aminés consécutifs de la séquence
Figure imgf000017_0006
ou, dans le cas d'une séquence dérivée, entre deux acides aminés
Figure imgf000017_0003
consécutifs de la séquence correspondante après alignement des deux séquences monomériques. Selon un mode de réalisation encore plus particulier, l'insertion du peptide a lieu entre les acides aminés
Figure imgf000017_0004
ou, dans le cas d'une séquence dérivée, entre les acides aminés de la séquence correspondante après alignement des deux séquences monomériques. Lorsque la séquence d'acides aminés est la séquence SEQ ID NO : 7 ou une séquence dérivée, l'insertion du peptide a lieu de préférence entre deux acides aminés consécutifs de la séquence ou, dans le cas d'une séquence
Figure imgf000017_0002
dérivée, entre deux acides aminés consécutifs de la séquence correspondante après alignement des deux séquences monomériques. Selon un mode de réalisation particulier, l'insertion du peptide a lieu entre les acides aminés ou, dans le cas d'une
Figure imgf000017_0005
séquence dérivée, entre les acides aminés de la séquence correspondante après alignement des deux séquences monomériques. Ainsi et selon un mode de réalisation préféré, le peptide est inséré entre deux acides aminés consécutifs de la région 138-143 de la séquence SEQ ID NO : 7, ou entre deux acides aminés consécutifs de la région correspondante dans la séquence du monomère d'encapsuline.
En rapport avec la séquence SEQ ID NO : 7, cette région correspond à la séquence en acides aminés KIECGS qui est également retrouvée aux positions 141 à 146 de la séquence SEQ ID NO : 1. Dans le cadre de l'invention, on entend par « région correspondante dans la séquence du monomère d'encapsuline », la région présente dans une séquence de toute autre encapsuline (plus particulièrement l'une des 590 encapsulines « classiques » décrites par Radford) qui est identifiée par comparaison de la structure tridimensionnelle de cette encapsuline avec celle de l' encapsuline de Thermotoga maritima dont la structure cristallographique est disponible (Sutter et Coll., Nat Struct Mol Biol (2008) ; 15(9) : 939- 947). De préférence, pour cette comparaison, on utilise directement la structure tridimensionnelle de l' encapsuline (telle que résolue par cristallographie par exemple) lorsqu'elle est disponible, comme c'est le cas pour les encapsulines de Myxococcus xanthus (PDB : 4PT2) et Pyrococcus furiosus (PDB : 2E0Z). L'alignement des structures peut par exemple être réalisé à l'aide du webserver PROMALS3D ou du logiciel PyMol. Si la structure tridimensionnelle de l'encapsuline n'est pas disponible, il est possible de la modéliser à partir de sa séquence en acides aminés, notamment à l'aide du webserver SWISS-MODEL. Ainsi et à titre d'exemple, la région correspondante est définie comme suit :
- la région 216-221 de la séquence de l'encapsuline de Pyrococcus furiosus, avantageusement de séquence SEQ ID NO : 2. Selon un mode de réalisation préféré, le peptide est inséré entre deux acides aminés consécutifs de la séquence KMKLSS.
- de la région 139-144 de la séquence de l'encapsuline de Brevibacterium linens, avantageusement de séquence SEQ ID NO : 3. Selon un mode de réalisation préféré, le peptide est inséré entre deux acides aminés consécutifs de la séquence AVAIPD.
- de la région 142-147 de la séquence de l'encapsuline de Rhodococcus jostii, avantageusement de séquence SEQ ID NO : 4. Selon un mode de réalisation préféré, le peptide est inséré entre deux acides aminés consécutifs de la séquence VLSLPE.
- de la région 139-144 de la séquence de l'encapsuline de Rhodococcus erythropolis, avantageusement de séquence SEQ ID NO : 5. Selon un mode de réalisation préféré, le peptide est inséré entre deux acides aminés consécutifs de la séquence ELKLPI ou ELKLPV. Selon un autre mode de réalisation particulier, le peptide est inséré entre les acides aminés K141 et L142.
- de la région 156-161 de la séquence de Pencapsuline de Myxococcus xanthus, avantageusement de séquence SEQ ID NO : 6. Selon un mode de réalisation préféré, le peptide est inséré entre deux acides aminés consécutifs de la séquence TVPLGD.
Typiquement, le nombre total d'acides aminés de la séquence du peptide inséré, incluant éventuellement un ou plusieurs bras de liaison, est supérieur ou égal à 4 et/ou inférieur ou égal à 100, voire 90, 80, 70, 60 voire même 55, avantageusement compris entre 4 et 55 (bornes incluses), en particulier entre 9 et 55 (bornes incluses), plus particulièrement entre 13 et 55 (bornes incluses), ou entre 4 et 28 (bornes incluses), en particulier entre 9 et 28 (bornes incluses), plus particulièrement entre 13 et 28 (bornes incluses), ou entre 4 et 13 (bornes incluses), en particulier entre 9 et 13 (bornes incluses). Ainsi, le nombre total d'acides aminés insérés peut donc être notamment de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, ou de 55.
Le peptide inséré peut éventuellement contenir une ou plusieurs chaînes saccharidiques ou lipidiques.
L'insertion du peptide, se faisant typiquement au moyen de liaisons peptidiques, entraine donc un allongement de la séquence du monomère d'encapsuline du nombre d'acides aminés contenus dans la séquence dudit peptide, cet allongement étant comme décrit ci- dessus en relation avec la taille du peptide, avantageusement de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 ou 55 acides aminés.
Dans un souci de clarté, tout monomère d'encapsuline qui, après insertion du peptide selon l'invention, aurait une séquence d'acides aminés qui serait identique à une quelconque séquence d'encapsuline déjà décrite, en particulier à l'une des séquences SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 6 serait purement fortuite et devrait être exclu de l'objet de l'invention.
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, la séquence du peptide inséré comprend ou consiste en la séquence , où X6 est I ou T,
Figure imgf000019_0002
est E ou G. Plus particulièrement, la séquence du peptide inséré
Figure imgf000019_0001
peut comprendre ou consister en une séquence choisie dans l'ensemble des séquences suivantes : EVETPIRNE (SEQ ID NO : 9), EVETPIRNG (SEQ ID NO : 10), EVETPIRSE (SEQ ID NO : 11), EVETPIRSG (SEQ ID NO : 12), EVETPIRTE (SEQ ID NO : 13), EVETPIRTG (SEQ ID NO : 14), EVETPIRRE (SEQ ID NO : 15), EVETPIRRG (SEQ ID NO : 16), EVETPTRNE (SEQ ID NO : 17), EVETPTRNG (SEQ ID NO : 18), EVETPTRSE (SEQ ID NO : 19), EVETPTRSG (SEQ ID NO : 20), EVETPTRTE (SEQ ID NO : 21), EVETPTRTG (SEQ ID NO : 22), EVETPTRRE (SEQ ID NO : 23), EVETPTRRG (SEQ ID NO : 24). Selon un mode de réalisation très particulier de l'invention, la séquence d'acides aminés insérée comprend ou consiste en la séquence EVETPIRNE (SEQ ID NO : 9). On peut également insérer une séquence comprenant ou consistant en la séquence des 24 acides aminés N-terminaux de la protéine M2 provenant d'un virus grippal de type H1N1, telle que MSLLTEVETPIRNE WGCRCNGS SD (SEQ ID NO : 25) ou une séquence répétée de celle-ci, avec éventuellement un bras de liaison entre les deux séquences, comme par exemple la séquence
MSLLTEVETPIRNEWGCRCNGS SDGGGMSLLTEVETPIRNE WGCRCNGS SD (SEQ ID NO :26 ) qui comporte le motif GGG entre les deux séquences répétées de MSLLTEVETPIRNEWGCRCNGSSD (SEQ ID NO : 25).
La séquence du peptide inséré peut comporter en outre un bras de liaison (linker) en N- terminal et/ou C-terminal. Les bras de liaison sont des séquences de quelques acides aminés, bien connues de l'homme du métier, et choisies en fonction du degré de flexibilité recherché. On peut par exemple citer les bras de liaison de type Gly, Gly/Ser, ou encore Gly/Ala (Reddy Chichili VP et Coll., Protein Sci. (2013) ; 22(2) : 153-167). Les bras de liaison situés en N-terminal et C-terminal peuvent être identiques ou différents entre eux. Selon un mode de réalisation particulier, les bras de liaison situés en N-terminal et en C- terminal consistent en la séquence GG. Dans ce cas, la séquence du peptide inséré est par exemple la séquence GGEVETPIRNEGG (SEQ ID NO : 27), la séquence GGMSLLTEVETPIRNEWGCRCNGSSDGG (SEQ ID NO : 28) ou la séquence GGMSLLTEVETPIRNEWGCRCNGSSDGGGMSLLTEVETPIRNEWGCRCNGSSDGG
(SEQ ID NO : 29).
Selon un aspect particulier, la séquence du monomère d'encapsuline après insertion de la séquence SEQ ID NO : 27 est la séquence :
Figure imgf000020_0001
Selon un autre aspect particulier, la séquence du monomère d'encapsuline après insertion de la séquence SEQ ID NO : 28 est la séquence :
Figure imgf000021_0001
Selon encore un autre aspect particulier, la séquence du monomère d'encapsuline après insertion de la séquence SEQ ID NO : 29 est la séquence :
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TFTFQVVN PEALILLKF (SEQ I D NO : 32).
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la séquence du peptide inséré comprend ou consiste en la séquence DAEFRHDSG (SEQ ID NO : 33). Selon un mode de réalisation particulier, cette séquence comprend en N-ter et en C-ter deux bras de liaisons GG, si bien que la séquence du peptide inséré est la séquence GGDAEFRHDSGGG (SEQ ID NO : 34). Selon un autre aspect particulier, la séquence du monomère d'encapsuline après insertion de la séquence SED ID NO : 34 est la séquence :
Figure imgf000021_0003
La nanoparticule selon l'invention comprend également une protéine interne, c'est-à-dire une protéine qui se trouve sur la face interne de la surface de la nanoparticule ou à l'intérieur du nano-compartiment, sans être liée à sa surface au moyen d'une liaison covalente. Dans le cas de la présente invention, le terme de « protéine interne » englobe à la fois un oligopeptide, un peptide, un polypeptide ou une protéine, pouvant contenir éventuellement une ou plusieurs chaînes saccharidiques ou lipidiques. Cette protéine interne peut être sous forme monomérique ou multimérique. Toute protéine capable de se lier par son extrémité N ou C-terminale, au moyen de liaisons non covalentes, c'est-à-dire au moyen d'interactions ioniques et/ou hydrophobes, à la cavité interne du domaine P d'un monomère d'encapsuline, est considérée comme une protéine interne, au sens de la présente invention, puisqu'elle se trouve à l'intérieur de la nanoparticule. L'extrémité N ou C-terminale de la protéine interne doit contenir un nombre suffisant d'acides aminés capables d'interagir au moyen d'interactions ioniques et/ou hydrophobes, avec les acides aminés de la cavité interne du domaine P du monomère d'encapsuline. Sutter et Coll puis Radford ont montré en effet qu'une vingtaine d'acides aminés de la cavité interne du domaine P interagissent avec les acides aminés de l'extrémité C-terminale d'une protéine appartenant à l'une des familles suivantes : iron-dependent peroxidases (comprenant les Dyp), ferritin-like protéines (Flp), ferredoxins, Dps-bacterioferritin-like protéines, hemerythrin-like protéines, rubrerythrin-like protéines. Spatialement, cette vingtaine d'acides aminés se trouvent à 5 Â ou moins de l'extrémité C-terminale de la protéine interne et sont bien conservés indépendamment de l'origine du monomère d'encapsuline. De façon corollaire, il a été montré que les séquences des acides aminés qui se situent au niveau des extrémités C- terminales des protéines appartenant aux familles ci-dessus étaient également bien conservées. Radford a identifié un motif de 10 acides aminés
Figure imgf000022_0001
dans laquelle Xi est D ou K, X5 est T, G ou N, dans le domaine C-terminal de ces
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protéines, comme étant étroitement impliqués dans les interactions avec la vingtaine d'acides aminés conservés de la cavité interne du domaine P du monomère d'encapsuline (tel qu'explicité dans la Figure 2.16 du Rapport de thèse de Radford, 2015), à partir duquel a été défini un motif consensus de 15 acides aminés ayant pour séquence :
Figure imgf000022_0002
désignent chacun un acide aminé non déterminé, X9 est T, G ou N, et Xi0 est I ou V) retrouvé dans la majorité des séquences d'acides aminés C-terminales des protéines appartenant à l'une des familles suivantes : iron-dependent peroxidases (comprenant les Dyp), ferritin-like protéines (Flp), ferredoxins, Dps-bacterioferritin-like protéines, hemerythrin-like protéines, rubrerythrin- like protéines, interagissant avec les monomères d'encapsuline. D'autre part, Sutter et Coll ont identifié un motif minimal GGDLGIRK (SEQ ID NO : 38) se trouvant dans la séquence d'acides aminés de l'extrémité C-terminale d'une protéine appartenant à la famille des ferritin-like protéines (Flp), qui interagit avec les acides aminés de la cavité interne du domaine P du monomère d'encapsuline provenant de T. maritima.
Selon un mode de réalisation préféré, la séquence d'acides aminés de la partie C-terminale ou N-terminale, respectivement, de la protéine interne se termine ou commence, respectivement, par un enchaînement d'acides aminés du type I-M-T, dans lequel : I désigne une séquence d'acides aminés dont le nombre total d'acides aminés est compris entre 0 et 30 (bornes incluses), de façon préférée entre 0 et 25 (bornes incluses) et de façon encore plus préférée entre 0 et 20 (bornes incluses),
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dans laquelle Xi est D
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la séquence
Figure imgf000023_0003
dans laquelle X
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désignent chacun un acide aminé non déterminé, X est T, G ou N, et X est I ou
Figure imgf000023_0006
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V, ou la séquence GGDLGIRK (SEQ ID NO : 38), et
T désigne une séquence d'acides aminés de terminaison dont le nombre total d'acides aminés est compris entre 0 et 15 (bornes incluses), de façon préférée entre 0 et 10 (bornes incluses et de façon encore plus préférée entre 0 et 5 (bornes incluses).
Hormis les protéines appartenant à l'une des familles suivantes : iron-dependent peroxidases (comprenant les Dyp), ferritin-like protéines (Flp), ferredoxins, Dps- bacterioferritin-like protéines, hemerythrin-like protéines, rubrerythrin-like protéines, qui peuvent naturellement se terminer par un enchaînement du type I-M-T au niveau de leur extrémité C-terminale, l'enchaînement du type I-M-T est généralement fusionné à l'extrémité C-terminale ou N-terminale d'une protéine d'intérêt. Selon la structure de la protéine d'intérêt et selon que l'enchaînement I-M-T est fusionné respectivement à l'extrémité C-terminale ou N-terminale de la protéine d'intérêt, la séquence I ou la séquence T, respectivement, peut avantageusement commencer ou se terminer, respectivement, par une séquence d'acides aminés exerçant un rôle de bras de liaison, pour faciliter l'insertion de la protéine dans la cavité interne du domaine P du monomère d'encapsuline. Généralement, le nombre total d'acides aminés de l'enchaînement I-M-T n'excède pas 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, ou 60 acides aminés.
Les acides aminés en positions 1 et 4 de la séquence SEQ ID NO : 37 n'ayant pas de rôle déterminant, ils peuvent être n'importe quel acide aminé choisi parmi les 20 acides aminés naturels ou même être un acide aminé modifié. Le choix des acides aminés en position 1 et 4 peut servir éventuellement à ajuster plus finement les interactions de la séquence SEQ ID NO : 37 avec les acides aminés de la cavité interne du domaine P du monomère d'encapsuline.
Lorsque le monomère d'encapsuline servant à l'insertion de la séquence peptidique selon l'invention provient de T. Maritima, notamment lorsque sa séquence d'acides aminés est la séquence SEQ ID NO : 1 ou la SEQ ID NO : 7 ou une séquence dérivée, notamment lorsque le degré d'identité de la séquence dérivée vis-à-vis de la séquence ID NO : 1 ou SEQ ID NO : 7 est d'au moins 90%, 91%, 92% , 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, la partie C-terminale ou N-terminale, respectivement, de la protéine interne se termine ou commence, respectivement, par un enchaînement d'acides aminés du type I-M-T, dans lequel I désigne une séquence d'acides aminés dont le nombre total d'acides aminés est compris entre 0 à 30 (bornes incluses), de façon préférée entre 0 et 25 (bornes incluses) et de façon encore plus préférée entre 0 et 20 (bornes incluses), M est la séquence
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X4 désignent chacun un acide aminé non déterminé, X9 est T, G ou N, et Xi0 est I ou V, et T désigne une séquence d'acides aminés de terminaison dans laquelle le nombre total d'acides aminés est compris entre 0 et 15 (bornes incluses), de façon préférée entre 0 et 10 (bornes incluses) et de façon encore plus préférée entre 0 et 5 (bornes incluses). De façon préférée, lorsque M est la séquence GGDLGIRK (SEQ ID NO : 38), I est la séquence GGSENT, ou, de façon encore plus préférée, la séquence IEEETSGGSENT, de sorte que l'enchaînement I-M est la séquence GGSENTGGDLGIRK (SEQ ID NO : 39) ou la séquence IEEETSGGSENTGGDLGIRK (SEQ ID NO : 40). Dans une variante, l'enchaînement I-M-T est la séquence GGSENTGGDLGIRKL (SEQ ID NO : 41), ou, de façon encore plus préférée, la séquence IEEETSGGSENTGGDLGIRKL (SEQ ID NO : 42).
Typiquement, la protéine interne selon l'invention est une protéine de fusion (c'est-à-dire une protéine artificielle) obtenue par recombinaison génétique, selon laquelle l'extrémité C-terminale ou N-terminale d'une protéine d'intérêt a été fusionnée à l'enchaînement I-M- T. La protéine de fusion se présente donc sous la forme NH2-I-M-T-Pr-COOH ou NH2-Pr- I-M-T-COOH dans laquelle Pr désigne la protéine d'intérêt.
A titre d'exemple, la protéine d'intérêt est une enzyme, telle que la Glutathion S- transférase (GST), plus particulièrement la Glutathion S-transférase de Schistosoma japonicum, ou une protéine fluorescente, telle que l'eGFP.
L'invention concerne également un vecteur bicistronique comprenant une première séquence d'acide nucléique codant pour un monomère d'encapsuline, dans lequel un peptide a été inséré comme défini ci-dessus, et une deuxième séquence d'acide nucléique codant pour une protéine interne comme définie ci-dessus, avantageusement dont l'extrémité C-terminale ou N-terminale, respectivement, se termine ou commence, respectivement, par un enchaînement du type I-M-T, dans lequel I désigne une séquence d'acides aminés dont le nombre total d'acides aminés est compris entre 0 et 30 (bornes incluses), de façon préférée entre 0 et 25 (bornes incluses) et de façon encore plus préférée entre 0 et 20 (bornes incluses), M est la séquence SEQ ID NO : 36, SEQ ID NO : 37 ou SEQ ID NO : 38, et T désigne une séquence d'acides aminés dont le nombre total d'acides aminés est compris entre 0 et 15 (bornes incluses), de façon préférée entre 0 et 10 (bornes incluses) et de façon encore plus préférée entre 0 et 5 (bornes incluses).
Ce vecteur bicistronique est préférentiellement un vecteur d'expression. Le vecteur peut être, par exemple, un plasmide, un phage, un virus, un baculovirus, un cosmide, un phagemide, un transposon, un chromosome artificiel bactérien ou un chromosome artificiel de levure. Classiquement, le vecteur est un plasmide. Il contient les éléments nécessaires qui permettent la transcription et/ou la traduction des acides nucléiques d'intérêt en protéines. Il inclut au minimum un promoteur inductible ou constitutif approprié à la cellule hôte, un système de sélection (antibiotique, complémentation..), une séquence SD/kozac, un ou plusieurs sites de fixation des ribosomes, une séquence d'arrêt de la transcription, un codon stop et un codon initiateur. Classiquement, outre les séquences d'acide nucléique d'intérêt, on retrouve dans le plasmide une ou plusieurs origines de réplication (ori), un ou plusieurs promoteurs, un ou plusieurs sites de liaison aux ribosomes (RBS), un ou plusieurs codons « start », un ou plusieurs codons « stop », une ou plusieurs séquences de terminaison, un ou plusieurs marqueurs de sélection, tels que des gènes de résistance à un antibiotique, et/ou un ou plusieurs sites de restriction. Des exemples de plasmides pouvant être utilisés pour insérer les séquences d'acide nucléique d'intérêt, incluent les plasmides pKK (Clontech), pUC, pET (Novagen), pRSET, pREP (Invitrogen), pMAL (New England Biolabs), pVAXl (Life Technology).
Les séquences d'acides nucléiques codant respectivement pour la protéine monomérique d'encapsuline, dans laquelle un peptide a été inséré, et pour la protéine interne, peuvent être sous le contrôle d'un seul et même promoteur. Plus spécifiquement, le vecteur d'expression bicistronique selon l'invention peut être un plasmide comprenant : un promoteur opérationnel approprié à la cellule hôte, un premier site de fixation aux ribosomes (RBS), un codon d'initiation, une première séquence d'acide nucléique codant pour une séquence d'acides aminés d'un monomère d'encapsuline, telle que la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 ou 7, ou codant pour une séquence d'acides aminés dérivée de cette séquence, dans laquelle a été inséré un peptide, ainsi qu'un codon stop, un deuxième site de fixation aux ribosomes, un deuxième codon d'initiation, une deuxième séquence d'acide nucléique codant pour une seconde protéine (protéine interne) dont l'extrémité C-terminale ou N-terminale, respectivement, se termine ou commence, respectivement, par un enchaînement d'acides aminés de type I-M-T, et un codon stop.
Ce vecteur d'expression bicistronique, après introduction dans une cellule hôte, permet l'expression simultanée dans une même cellule, des protéines monomériques d'encapsuline selon l'invention et de la protéine interne, ce qui facilite l'encapsulation de la protéine interne dans la nanoparticule.
Le vecteur d'expression peut être également un vecteur polycistronique. Selon une première alternative, il comprend une première séquence d'acide nucléique codant pour une protéine monomérique d'encapsuline selon l'invention et deux séquences d'acides nucléiques ou plus, codant pour des protéines internes différentes que l'on souhaite encapsuler, dans lesquelles les extrémités C-terminales ou N-terminales, respectivement, se terminent ou commencent, respectivement, par un enchaînement d'acides aminés du type I-M-T, tel que décrit précédemment. Selon une deuxième alternative, le vecteur polycistronique comprend une première séquence d'acide nucléique codant pour une première protéine monomérique d'encapsuline, une deuxième séquence d'acide nucléique codant pour une seconde protéine monomérique d'encapsuline se distinguant de la première protéine en ce qu'un peptide a été inséré dans un site externe du domaine A du monomère d'encapsuline, en particulier dans celui constitué de la séquence d'acides aminés constitutive du premier feuillet β du domaine A et de la séquence d'acides aminés constitutive de la première structure dépliée contiguë à la séquence d'acides aminés du premier feuillet β, et une ou plusieurs séquences codant pour une ou plusieurs protéines internes que l'on souhaite encapsuler, les extrémités C-terminales ou N-terminales, respectivement, de ces protéines se terminant ou commençant, respectivement, par un enchaînement d'acides aminés du type I-M-T. Ce type de vecteur permet d'obtenir des nanoparticules dont la surface est constituée d'un mélange de deux ensembles de monomères ; un premier ensemble constitué de monomères d'encapsuline tous identiques entre eux et un deuxième ensemble constitué de monomères d'encapsuline, également tous identiques entre eux, mais se distinguant des monomères du premier ensemble par l'insertion dans leurs séquences d'acides aminés de la séquence peptidique additionnelle au niveau du domaine A des monomères d'encapsuline. Ces nanoparticules contiennent en outre une ou plusieurs protéines internes. L'invention a également pour objet une cellule hôte comprenant un vecteur bicistronique ou polycistronique tels que décrits précédemment. L'invention a encore pour objet une cellule hôte comprenant deux ou plusieurs vecteurs d'expression, permettant de produire les nanoparticules de l'invention. A titre d'exemple, on peut citer une cellule hôte contenant deux vecteurs, le premier vecteur comprenant une séquence d'acide nucléique codant pour un monomère d'encapsuline dans lequel un peptide a été inséré comme défini ci-dessus, et le deuxième vecteur comprenant une séquence d'acide nucléique codant pour une protéine interne comme définie ci-dessus, avantageusement dont l'extrémité C-terminale ou N-terminale, respectivement, se termine ou commence, respectivement, par un enchaînement d'acides aminés du type I-M-T, dans lequel I désigne une séquence d'acides aminés dont le nombre est compris entre 0 et 30 (bornes incluses), de façon préférée entre 0 et 25 (bornes incluses) et de façon encore plus préférée entre 0 et 20 (bornes incluses), M est la séquence SEQ ID NO : 36, SEQ ID NO : 37 ou SEQ ID NO : 38, et T désigne une séquence d'acides aminés dont le nombre est compris entre 0 et 15 (bornes incluses), de façon préférée entre 0 et 10 (bornes incluses) et de façon encore plus préférée entre 0 et 5 (bornes incluses).
La cellule hôte peut être une cellule procaryote ou une cellule eucaryote. Parmi les cellules procaryotes convenant à l'invention, on cite les eubactéries, telles que les bactéries Gram+ ou Gram-, les agrobacterium, et les archéobactéries. Parmi les bactéries Gram-, on cite comme hôtes de choix les souches BL21(DE3), JM109, FB850, Shuffle, Lemo21, rosetta, K12 et origami d'E. coli. Parmi les bactéries Gram+, on cite comme hôte de choix la souche RIK 1285 de Bacillus subtilis. Parmi les cellules eucaryotes, on cite comme exemples des cellules de mammifères telles que les cellules d'une lignée CHO, des cellules d'insectes (par exemple, les cellules de la lignée Sf9), des cellules de levures provenant de Saccharomyces cerevisiae ou Pichia pastoris ainsi que toute autre cellule eucaryote unicellulaire, et des cellules de plantes.
La nature du vecteur d'expression est choisie en fonction du type de cellule hôte. Les méthodes utilisées pour introduire un ou plusieurs vecteur(s) d'expression selon l'invention dans des cellules hôtes sont bien connues de l'homme de métier. Lorsque le vecteur est par exemple un plasmide, un cosmide, un chromosome artificiel de bactérie ou de levure, on peut par exemple utiliser les méthodes d'électroporation, de transfection chimique ou de choc thermique. Lorsque le vecteur est infectieux, il est introduit par infection et/ou transduction des cellules hôtes, comme par exemple en infectant des cellules Sf9 par le baculovirus, des cellules de plantes avec le virus de la mosaïque du tabac (VMT), ou des bactéries avec des bactériophages. Selon un aspect particulier, la souche BL21(DE3) d'E. coli est transformée par choc thermique avec un vecteur d'expression bicistronique tel que décrit ci-dessus. L'invention a également pour objet un procédé de production de nanoparticules selon l'invention selon lequel :
On cultive des cellules hôtes telles que décrites précédemment, dans des conditions favorisant l'expression des monomères d'encapsuline et de la ou des protéine(s) interne(s) ; et
On récupère les nanoparticules contenant la protéine interne, résultant de l'auto- assemblage des monomères d'encapsuline.
Les nanoparticules peuvent être récupérées à partir du culot cellulaire ou du surnageant, en mettant en œuvre des moyens classiques tels que la centrifugation, la clarification, la microfïltration, ou la nanofiltration.
Selon un mode de réalisation, lorsque la cellule hôte est une bactérie, le vecteur peut contenir un opéron inductible (par exemple, un opéron lactose (Lad) inductible par l'ajout d'Isopropyl β-D-l-thiogalactopyranoside, ou IPTG).
Selon un autre mode de réalisation, lorsque les cellules hôtes sont des cellules eucaryotes, par exemple des cellules de mammifères, d'insectes ou de levures, et si la séquence du monomère d'encapsuline, dans laquelle a été inséré un peptide, selon l'invention, contient un ou plusieurs sites potentiels de glycosylation (notamment, N-glycosylation, O- glycosylation ou fucosylation), un ou plusieurs acides aminés au niveau d'un ou plusieurs de ces sites peuvent être mutés, de façon à ce que le monomère d'encapsuline ne soit plus glycosylée au niveau du(des) site(s) muté(s). Dans encore un autre aspect, l'invention a pour objet un procédé de purification de nanoparticules comprenant un assemblage de monomères d'encapsuline, selon lequel :
On clarifie un broyât de cellules contenant des nanoparticules comprenant un assemblage de monomères d'encapsuline;
On soumet la solution clarifiée contenant les nanoparticules à une ou plusieurs étape(s) de chromatographie de type multi-modale ;
On récupère l'éluat contenant les assemblages de monomères d'encapsuline, de diamètre supérieur ou égal à 10 nm ;
On élimine en une ou plusieurs fois les contaminants hydrophobes contenus dans l'éluat au moyen d'une solution biphasique;
- On récupère la phase aqueuse que l'on soumet à une ou plusieurs étape(s) de polissage, et
On récupère la solution purifiée contenant les nanoparticules comprenant un assemblage de monomères d'encapsuline. Les inventeurs ont montré de façon surprenante que ce procédé de purification, réalisable à l'échelle industrielle, permettait d'obtenir une solution contenant les nanoparticules comprenant un assemblage de monomères d'encapsuline, avec un degré de pureté généralement d'au moins 85 %.
Selon un mode de réalisation du procédé de purification, les nanoparticules comprenant un assemblage de monomères d'encapsuline ont été produites par des bactéries Gram + ou Gram -, notamment par E. coli, et plus particulièrement par la souche BL21(DE3) d'E. coli.
Les méthodes pour obtenir un broyât de cellules à partir d'un culot ou d'une suspension cellulaire et les méthodes de clarification sont bien connues de l'homme du métier (voir, par exemple : Effio & Hubbuch, Biotechnol. J (2015); 10(5) : 715-727). Le broyât de cellules peut par exemple être obtenu par des techniques de broyage, de lyse enzymatique, de casse mécanique ou de choc osmotique.
Dans l'étape de chromatographie de type multimodale, la séparation se fait en combinant au moins deux modes différents, sélectionnés dans l'ensemble des modes suivants : exclusion de taille, affinité, échange d'ions, interaction hydrophobe, ou encore des interactions hydrogène ou
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avec un seul et même support de chromatographie. Avantageusement, le support de chromatographie multimodale est choisi de telle sorte que la séparation se fait en combinant les modes d'exclusion de taille, d'interactions hydrophobes et basés sur la charge. La résine multimodale Capto™ Core 700 (GE Healthcare) convient à cet usage, mais d'autres résines pourraient être utilisées. Selon un mode de réalisation, la résine multimodale est utilisée pour garnir une colonne. Les dimensions et le nombre de colonnes, ainsi que les conditions expérimentales à utiliser, peuvent être optimisées par l'homme du métier.
L'étape de séparation de phase est réalisée au moyen d'une solution biphasique, par exemple à base de détergent et d'une solution aqueuse, ou à base de polymère et d'une solution aqueuse (Effio & Hubbuch, Biotechnol. J (2015); 10(5) : 715-727) ; la solution aqueuse peut par exemple être une solution saline de type tampon phosphate. Le détergent peut être non ionique ou ionique. Il doit avoir une température de séparation de phase suffisamment basse, de façon à ne pas dénaturer les protéines. Selon un mode de réalisation particulier, le détergent utilisé est non ionique, et plus particulièrement le Triton X-114. Le procédé de purification selon l'invention peut comporter une, deux, trois, ou plus, étapes de séparation de phase. Dans le cas où la cellule hôte utilisée pour produire l'encapsuline est E.coli, cette étape de séparation de phase est particulièrement utile pour éliminer un contaminant hydrophobe majoritaire, la protéine OmpF (Outer membrane protein F). Cette étape permet aussi de diminuer le taux d'endotoxines bactériennes.
Parmi les méthodes convenant à l'étape de polissage, on peut citer la chromatographie par exclusion de taille (appelée également filtration sur gel), la filtration sur membrane, la chromatographie par échange d'ions, la chromatographie multimodale, ou toute autre méthode pouvant être sélectionnée par l'homme du métier. L'utilisation d'une colonne de filtration sur gel Superdex 200 10/300 Increase (GE Healthcare) est particulièrement adaptée pour cette étape de polissage. Cette étape permet d'isoler la fraction purifiée correspondant aux nanoparticules d'encapsuline.
La solution purifiée contenant les nanoparticules comprenant un assemblage de monomères d'encapsuline, peut être concentrée par des méthodes connues de l'homme du métier.
Le procédé de purification est également utilisable pour purifier des nanoparticules comprenant un assemblage de monomères d'encapsuline, dans lesquelles un peptide a été inséré dans la séquence d'acides aminés d'au moins un des monomères d'encapsuline, et comprenant éventuellement une protéine interne. Selon un mode de réalisation particulier, ce procédé est mis en œuvre pour purifier les nanoparticules de l'invention.
Ce procédé de purification peut également être utilisé pour purifier des nanoparticules comprenant un assemblage de monomères d'encapsuline, dans lesquelles un peptide comprenant la séquence
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T ou R, et X9 est E ou G, en particulier la séquence EVETPIRNE (SEQ ID NO : 9), ou comprenant la séquence DAEFRHDSG (SEQ ID NO : 33), a été inséré dans la séquence d'acides aminés d'au moins un desdits monomères d'encapsuline, et comprenant en outre une protéine interne. L'invention a également pour objet une composition immunogène comprenant des nanoparticules qui comprennent un assemblage de monomères d'encapsuline, dans lesquels un peptide a été inséré dans la séquence d'acides aminés d'au moins un des monomères d'encapsuline, le site d'insertion du peptide étant situé dans une boucle externe, avantageusement du domaine A, encore plus avantageusement au niveau des sites d'insertion définis ci-dessus comprenant éventuellement une protéine interne, par exemple telles que décrites dans leurs différents modes de réalisation. Avantageusement, lorsque le peptide inséré et/ou la protéine interne provien(nen)t d'un agent pathogène ou représente(nt) une cible immunothérapeutique potentielle, la composition contenant les nanoparticules selon l'invention induit, après administration à un individu, une réponse immune spécifique à l'encontre du peptide inséré et/ou de la protéine interne.
Par composition immunogène (ou immunogénique) au sens de la présente invention, on entend une composition capable d'induire après administration chez un individu une réponse humorale (c'est-à-dire médiée par les anticorps) et/ou cellulaire (c'est-à-dire médiée par les lymphocytes T) spécifîque(s) dirigée(s) contre au moins le peptide qui a été inséré dans au moins un des monomères d'encapsuline et/ou contre la protéine qui se trouve à l'intérieur des nanoparticules. Typiquement, la composition immunogène induit une réponse humorale spécifique à l'encontre du peptide qui a été inséré dans au moins un des monomères d'encapsuline, et pas contre Pencapsuline elle-même.
Ainsi et selon un autre aspect, l'invention concerne l'utilisation de nanoparticules comme définies ci-dessus comme agent immunogène. En particulier, un tel agent immunogène peut être utilisé comme vaccin ou comme adjuvant. En d'autres termes, la présente invention concerne également une méthode d'immunisation comprenant l'administration à un sujet de nanoparticules comme définies ci-dessus.
Le terme d'individu désigne aussi bien un sujet sain qu'un sujet malade et concerne aussi bien l'homme que l'animal. La réponse immunitaire (ou immune) peut inclure un ou plusieurs des effets suivants : la production d'anticorps spécifiques (par exemple, IgA, IgG, IgM) par les lymphocytes B ; et/ou l'activation de lymphocytes T régulateurs, cytotoxiques ou auxiliaires, et/ou des lymphocytes T dirigés spécifiquement contre une protéine présente dans la composition immunogène. Elle peut inclure également l'activation des cellules impliquées dans le développement de l'immunité innée, telles que les monocytes/macrophages, les neutrophiles, les éosinophiles, les cellules dendritiques et plus généralement les cellules présentatrices de l'antigène.
Bien que la composition immunogène selon l'invention soit capable en tant que telle d'induire une réponse humorale spécifique à l'encontre du peptide qui a été inséré dans au moins un des monomères d'encapsuline, on peut renforcer la réponse immune spécifique à l'encontre de ce peptide en y ajoutant un adjuvant. Par adjuvant, on entend toute substance capable d'augmenter la réponse immune spécifique à l'encontre du peptide inséré et/ou de la protéine interne, qu'elle soit d'ordre humorale et/ou cellulaire. A titre d'exemple, on cite les adjuvants à base d'émulsions, telles que les émulsions huile dans eau ou eau dans huile, les sels de calcium ou d'aluminium tels que l'hydroxyde d'aluminium et/ou le phosphate d'aluminium, les agonistes du TLR ou les cytokines. Le(s) adjuvant(s) peu(ven)t être choisi(s) en fonction de l'orientation de la réponse immune spécifique que l'on souhaite renforcer. Il peut s'agir notamment d'un adjuvant de type Thl ou de type Th2.
La composition immunogène peut être administrée par n'importe quelle voie utilisée pour induire une réponse immune à un antigène, incluant notamment la voie intradermique, sous-cutanée, intramusculaire, parentérale, mucosale (par exemple, nasale) ou transcutanée.
Lorsque le peptide inséré dans au moins un des monomères d'encapsuline comprend la séquence
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est E ou G, ou plus particulièrement la séquence EVETPIRNE (SEQ ID NO : 9), la composition immunogène selon l'invention induit une réponse immune humorale et/ou cellulaire spécifïque(s) à l' encontre de la protéine M2 du virus grippal, et plus globalement à l'encontre du virus grippal de type A, qu'il soit d'origine animale ou humaine, notamment contre le virus grippal de type A H1N1, puisque cette séquence comprend un épitope du domaine extracellulaire de la protéine M2 du virus grippal qui est un antigène universel de la grippe de type A (Neirynck S et Coll, Nature Medicine (1999) ; 5(10) : 1157-1163 ; Fiers W et Coll., Virus Res (2004) ; 103 (1-2) : 173-176 ; Deng L et Coll, Vaccines (2015) ; 3 : 105-136). Ainsi, selon un mode de réalisation particulier de l'invention, la réponse immune est dirigée contre le virus grippal.
Dans un aspect particulier, l'invention a pour objet une composition immunogène comprenant des nanoparticules qui comprennent un assemblage de monomères d'encapsuline, selon lesquelles un peptide a été inséré dans la séquence d'acides aminés d'au moins un des monomères d'encapsuline, le site d'insertion du peptide étant situé dans un site externe du domaine A constitué de la séquence d'acides aminés constitutive du premier feuillet β du domaine A et de la séquence d'acides aminés constitutive de la première structure dépliée contiguë à la séquence d'acides aminés du premier feuillet β.
L'invention a également pour objet un monomère d'encapsuline dans lequel a été inséré, dans sa séquence d'acides aminés, un peptide comprenant la séquence EVETPXôRXsXg (SEQ ID NO : 8) où X6 est I ou T, X8 est N, S, T ou R, et X9 est E ou G, plus particulièrement la séquence EVETPIRNE (SEQ ID NO : 9), ou un peptide comprenant la séquence DAEFRHDSG (SEQ ID NO : 33). Selon un mode de réalisation de cet objet, le peptide a été inséré dans un site externe du domaine A du monomère, en particulier dans celui constitué par la séquence d'acides aminés constitutive du premier feuillet β du domaine A et de la séquence d'acides aminés constitutive de la première structure dépliée contiguë à la séquence d'acides aminés du premier feuillet β.
Selon un mode de réalisation très particulier, la séquence du monomère d'encapsuline dans lequel a été inséré un peptide selon l'invention est la séquence SEQ ID NO : 30, la séquence SEQ ID NO : 31, ou la séquence SEQ ID NO : 32.
L'invention a également pour objet une séquence d'acide nucléique codant pour :
1. une protéine monomérique d'encapsuline, telle que celle correspondant à la séquence SEQ ID NO : 1 ou 7, d
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ans laquelle a été insérée une séquence peptidique comprenant la séquence où X6
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est
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plus particulièrement la
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séquence EVETPIRNE (SEQ ID NO : 9), ou une séquence peptidique comprenant la séquence DAEFRHDSG (SEQ ID NO : 33), ou pour
2. une protéine monomérique d'encapsuline ayant la séquence SEQ ID NO : 30, la séquence ID NO: 31, ou la séquence ID NO: 32, ou une protéine dérivée de l'une de ces séquences.
La séquence d'acide nucléique objet de l'invention peut également être un vecteur comprenant l'une des séquences d'acides nucléiques telles que définies en 1 et 2. Les séquences d'acides nucléiques codant pour l'une des protéines monomériques d'encapsuline peuvent être des ADN ou des ARN, simple brin ou double brin. Elles peuvent être obtenues au moyen de procédures de clonage classiques, comprenant par exemple l'excision de ladite séquence puis son isolement, par exemple sur gel d'agarose. Selon un mode de réalisation très spécifique, la séquence d'acide nucléique codant pour une protéine monomérique d'encapsuline est la séquence SEQ ID NO : 43 :
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La séquence d'acide nucléique d'intérêt peut être produite par des technologies d'ADN recombinant, des méthodes synthétiques, ou une combinaison de ces méthodes, bien connues de l'homme du métier.
Les codons de la séquence d'acide nucléique d'intérêt peuvent aussi être optimisés de façon à permettre une meilleure transcription et/ou traduction dans la cellule hôte. L'optimisation des codons dans une séquence d'ADN ou d'ARN, est basée sur l'existence de la dégénérescence du code génétique, et consiste par exemple à remplacer un ou plusieurs codons par des codons plus fréquemment utilisés par la cellule hôte, comme décrit dans US 2004/0209241, et/ou à optimiser le ratio du contenu en G/C, comme décrit dans US 2011/0269950. L'optimisation des codons des séquences d'acides nucléiques est mise en œuvre de façon à ne pas modifier de façon significative la séquence des acides aminés, et donc en utilisant préférentiellement des codons synonymes (c'est-à-dire, codant pour le même acide aminé).
On peut également introduire des mutations dans la séquence d'acide nucléique selon l'invention, de manière par exemple à supprimer des sites de glycosylation (N- glycosylation, O-glycosylation ou fucosylation) éventuels.
Le vecteur peut être, par exemple, un plasmide, un phage, un virus, un baculovirus, un cosmide, un phagemide, un transposon, un chromosome artificiel bactérien ou un chromosome artificiel de levure. Classiquement, le vecteur est un plasmide. Il contient les éléments nécessaires qui permettent la transcription et/ou la traduction des acides nucléiques d'intérêt en protéines. Il inclut au minimum un promoteur inductible ou constitutif approprié à la cellule hôte, un système de sélection (antibiotique, complémentation..), une séquence SD/kozac, un ou plusieurs sites de fixation des ribosomes, une séquence d'arrêt de la transcription, un codon stop et un codon initiateur. Classiquement, outre les séquences d'acide nucléique d'intérêt, on retrouve dans le plasmide une ou plusieurs origines de réplication (ori), un ou plusieurs promoteurs, un ou plusieurs sites de liaison aux ribosomes (RBS), un ou plusieurs codons « start », un ou plusieurs codons « stop », une ou plusieurs séquences de terminaison, un ou plusieurs marqueurs de sélection, tels que des gènes de résistance à un antibiotique, et/ou un ou plusieurs sites de restriction. Des exemples de plasmides pouvant être utilisés pour insérer les séquences d'acide nucléique d'intérêt, incluent les plasmides pKK (Clontech), pUC, pET (Novagen), pRSET, pREP (Invitrogen), pMAL (New England Biolabs), pVAXl (Life Technology).
D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention pourront encore apparaître à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous, illustrés par les figures annexées, donnés à titre illustratif mais nullement limitatif. BREVE DESCRIPTION DES FIGURES
Figure 1 : Structure du monomère d'encapsuline de A) Thermotoga maritima (PDB ID : 3DKT) et de B) Pyrococcus furiosus (PDB ID : 2E0Z). Le site d'insertion externe correspondant au premier feuillet β du domaine A et à la structure dépliée contiguë au premier feuillet β est présenté en noir sur les structures et cerclé de pointillés.
Figure 2 : Représentation schématique du plasmide utilisé pour le clonage (dérivé du plasmide pET28b).
Figure 3 : Analyse SDS-PAGE après les différentes étapes-clés du protocole de purification pour chacune des nanoparticules XIP1, XIP2 et XIP3. (M) marqueur de poids moléculaire (en kDa) ; (1) fraction totale ; (2a) fraction soluble ; (2b) fraction soluble filtrée ; (3) fraction après passage sur Capto™ Core 700 ; (4a, b, c) phase aqueuse après une première, une deuxième et éventuellement une troisième extraction différentielle au triton X-114, respectivement ; (5) assemblage purifié après chromatographie d'exclusion de taille et concentration de l'échantillon. La flèche noire pleine correspond au monomère d'encapsuline et la flèche en pointillé à l'eGFP.
Figure 4 : Analyse de la distribution de taille (nm) des nanoparticules XIP1 (en haut), XIP2 (au milieu) et XIP3 (en bas), par Diffusion dynamique de la lumière (DLS).
Figure 5 : Observation des nanoparticules d'encapsuline-M2e contenant l'eGFP (encapsuline-M2e + eGFP, ou XIP2), par microscopie électronique à transmission (MET). Figure 6 : Analyse des réponses anticorps IgGl (A) et IgG2a (B) dans chaque groupe de souris avant immunisation (J0) et après immunisation (J42), avec l'une des compositions suivantes : encapsuline-M2e + eGFP (XIP2), avec ou sans adjuvant, ovalbumine-M2e avec adjuvant, eGFP avec adjuvant, ou une composition contrôle PBS avec adjuvant, vis-à-vis du contrôle tampon, l'eGFP, la streptavidine, la streptavidine-M2e, l'ovalbumine, l'ovalbumine-M2e, l'encapsuline et l'encapsuline-M2e + eGFP (XIP2).
Figure 7 : Production d'anticorps IgGl chez les groupes de souris immunisées avec l'encapsuline-M2e + eGFP (XIP2), avec adjuvant (symboles pleins) ou sans adjuvant (symboles creux), mesurée par ELISA sur les sérums prélevés à
J42. Le test ELISA permet d'estimer la capacité des anticorps à reconnaître l'encapsuline-M2e + eGFP (XIP2) (symboles ronds), l'encapsuline (symboles triangles pointe en bas), la streptavidine-M2e (symboles carrés) et la streptavidine (symboles triangles pointe en haut).
- Figure 8 : Production d'anticorps IgGl contre l'eGFP à J42, dans le sérum de chacune des 7 souris du groupe immunisé avec Pencapsuline-M2e + eGFP (XIP2) avec adjuvant.
Figure 9 : Schématisation des nouvelles constructions impliquant A) une taille différente d'insert M2e, B) une séquence différente de peptide inséré (BAP) et, C) une protéine encapsulée différente (GST).
EXEMPLES
Exemple 1 : Production de nanoparticules d'encapsuline contenant une protéine fluorescente (eGFP)
Trois préparations de nanoparticules d'encapsuline ont été préparées et évaluées pour leur capacité à encapsuler une protéine fluorescente, l'eGFP. L'eGFP correspond à de la GFP (L29345 ; GI : 606383 ; product : green- fluorescent protein ; protéine ID : AAA58246), modifiée par l'introduction des 6 mutations Q25H, F64L, S65T, M141L, P157Q, K172E.
La première préparation, dite de référence, contenait des nanoparticules d'encapsuline dont la séquence du monomère (dit monomère de référence) a été dérivée de la séquence native de Thermotoga maritima. Elle contenait la séquence correspondant aux acides aminés 4 à 254 de la séquence native de T. maritima (NC_000853 ; GI: 15642775 gène locus TM0785, product « bactériocine », protéine ID : NP 228594) à laquelle ont été rajoutés les acides aminés FQVVNPEALILLKF en C-terminal, en concordance avec la structure cristallisée de la protéine (PDB code : 3DKT) telle que décrite par Sutter et Coll. 2008. Elle contenait également une substitution C197S (C200S par rapport à la numérotation de l'encapsuline native de T. maritima).
La deuxième préparation contenait des nanoparticules d'encapsuline, dont la séquence du monomère correspondait à celle du monomère de référence, hormis l'insertion de la séquence GGEVETPIRNEGG entre les acides aminés Kl 38 et 1139. La séquence EVETPIRNE, que l'on retrouve dans la séquence d'acides aminés consensus de l'ectodomaine de la protéine M2 du virus Influenza A H1N1 humain (GL21693176 ; gène locus AF389121.1 ; product « matrix protein M2 », UniProt ID : P06821 ; souche Puerto Rico 8/1934) a été encadrée par deux linkers GG. La séquence a été insérée dans le site externe du domaine A constitué de la séquence d'acides aminés constitutive du premier feuillet β du domaine A et de la séquence d'acides aminés constitutive de la première structure dépliée contiguë à la séquence d'acides aminés du premier feuillet β. La troisième préparation contenait des nanoparticules d'encapsuline, dont la séquence du monomère correspondait à celle du monomère de référence, hormis l'insertion de la séquence GGGGGGHHHHHHGGGGG (boucle His) entre les acides aminés P42 et Y43. La séquence a été insérée dans un site interne du monomère d'encapsuline se trouvant dans le domaine P.
Ces 3 préparations de nanoparticules contenant eGFP ont été produites par des bactéries E.coli transformées au moyen de plasmides bicistroniques obtenus par insertion de constructions nucléotidiques spécifiques (Cl à C3, voir ci-dessous). Ces constructions contenaient notamment dans le sens 5'→3', la séquence codant pour l'un des monomères d'encapsuline tels que décrits ci-dessus et la séquence codant pour l'eGFP qui a été fusionnée à la séquence codant pour la séquence peptidique IEEETSGGSENTGGDLGIRKL qui correspond au domaine C-terminal (C-ter) conservé de la protéine Flp de T. maritima (NC 000853 ; GL15642775 gène locus TM0786, product « ferritin/ribonucleotide reductase-like protein », protéine ID : NP 228595). Un codon supplémentaire (CTT, codant pour une Leucine) a été inséré entre l'extrémité 3' terminale de la séquence codant pour l'eGFP et l'extrémité 5' terminale de la séquence codant pour le domaine C-ter de la protéine Flp, afin d'introduire un site de restriction HindIII.
Préparation des plasmides bi-cistroniques
Les séquences, ainsi que le tableau indiquant les positions des différents éléments (inserts) dans les séquences nucléotidiques de ces 3 constructions, sont indiquées ci-dessous :
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Ces 3 constructions ont été clonées dans un plasmide qui a été dérivé du plasmide pET28b (Novagen), par introduction de la séquence stabilisatrice Cer, telle que décrite dans Summer et Coll. (Cell (1984) ; 36 (4) : 1097-103). Ce plasmide, dont la structure est reproduite dans la Figure 2, contient le promoteur T7, un gène de résistance à la kanamycine (kana) et la séquence Cer. Les constructions bicistroniques ont été introduites au niveau des sites de restriction Xbal et Xhol du plasmide par double digestion enzymatique.
Transformation des bactéries et production des nanoparticules
50 μΐ d'une suspension de bactéries d'E. coli BL21 (DE3) chimio-compétentes ont été transformées avec 1 μg de plasmide, en utilisant le kit « BL21(DE3) Compétent E. coli » (Ref : C2527H, New England Biolabs), en suivant les recommandations du fournisseur. La transformation bactérienne a été effectuée par incubation dans la glace pendant 15 minutes, suivie d'un choc thermique de 45 secondes à 42 °C. Les bactéries transformées ont été ensuite incubées dans la glace pendant 15 minutes, puis 1 heure à 37°C dans un milieu enrichi (milieu Super Optimal broth with Catabolite repression (SOC) : 2% Tryptone, 0,5 %, 8,56 mM NaCl, 2,5 mM KC1, 10 mM MgC12, 10 mM MgS04, 20 mM glucose). La sélection des bactéries transformées a été réalisée sur un milieu LB-agar contenant de la kanamycine (kana) à 50 μg.mL~1 (Sigma Life Science). Après incubation pendant une nuit à 37°C, les colonies de bactéries transformées par le plasmide ont été prélevées et mises en pré-culture dans un milieu LB (LB Broth Base, Ref : 12780-029, Invitrogen) contenant 50 μg/mL de kana à 37°C sous agitation pendant une nuit. Ces précultures ont servi à ensemencer des volumes de culture de 50 mL à 2 L de milieu LB contenant 50 μg/mL de Kana. Lorsque la concentration bactérienne de la culture a atteint une concentration correspondant à une densité optique à 600 nm (DOôoonm) comprise entre 0.4 et 0.6, la production des nanoparticules a été induite par ajout de 100 μΜ d'IPTG (Isopropyl β-D-l-thiogalactopyranoside) dans le milieu de culture. L'induction a été effectuée pendant une nuit à 18°C. Purification des nanoparticules
Les culots issus des cultures bactériennes après induction ont été re-suspendus dans du tampon phosphate salin IX PBS pH 7,5 (137 mM NaCl ; 2.7 mM KC1 ; 10 mM Na2HP04 ; 1.76 mM KH2P04) contenant 0,1 μg.mL-1 de désoxyribonucléase I. La lyse bactérienne a été effectuée par casse mécanique de 30 secondes à 4,5 m.s_1 avec des billes de silice de 0,1 mm (Matrice B, réf : 116911050, MP Biomedicals), en utilisant l'appareil Fast Prep (MP Biomedicals). Le lysat a été ensuite clarifié par centrifugation pendant 45 minutes à 7000 g, suivie d'une fîltration du surnageant à travers une membrane en polyéthersulfone de porosité 0,8 μιη (Réf : 190-2580 Nalgène®, Thermo S cientifîc). Dans une première étape, la purification des différentes préparations de nanoparticules a été réalisée à l'aide du système chromatographique AKTA Pure 25M (GE Healthcare), en utilisant une ou plusieurs colonnes HiTrap Capto™ Core 700 (GE Healthcare Life Sciences ; réf : 17-5481-51) montées en série. Le système a été équilibré avec du PBS IX puis on a chargé les colonnes avec le lysat clarifié à raison de 0,2 mL.min"1. Les protéines contenues dans le lysat clarifié ont été éluées en tampon PBS et recueillies par fractions de 1 mL.
Les fractions contenant les assemblages de monomères d'encapsuline de diamètre supérieur ou égal à 10 nm (protéines d'intérêt) ont été collectées et une à trois extractions différentielles successives (en fonction de la concentration du contaminant majoritaire) ont été effectuées avec du Triton X-114 à 0,1 %. L'extraction différentielle de protéines hydrophobes a été effectuée de la manière suivante : 0,1 % de Triton X-114 a été ajouté au mélange de fractions d'intérêt et mis à 4 °C jusqu'à homogénéisation de la solution. La solution homogénéisée a été ensuite incubée à 37°C pendant 15 minutes, ce qui a entraîné la formation de micelles de Triton et la séparation de la solution en deux phases. Une centrifugation à 15000 g pendant 20 minutes à 37°C a été effectuée pour séparer la phase aqueuse de la phase détergente hydrophobe contenant une grande quantité de contaminants.
Une fois le contaminant majoritaire éliminé, la fraction aqueuse a été récupérée puis soumise à une dernière étape de purification par chromatographie d'exclusion de taille selon laquelle on a chargé, à raison de 0,5 mL.min-1, une colonne de gel fïltration Superdex 200 10/300 Increase (GE Healthcare; réf : 28990944) préalablement équilibrée avec du PBS IX. Les fractions contenant les nanoparticules d'encapsuline ont été ensuite concentrées sur concentrateurs Sartorius (Réf : VS2021) retenant les protéines de plus de 30 kDa. Le degré de pureté des différentes préparations de nanoparticules : XIP1 (encapsuline + eGFP, correspondant à la construction Cl), XIP2 (encapsuline-M2e + eGFP, correspondant à la construction C2) et XIP3 (encapsuline-His + eGFP, correspondant à la construction C3) a été contrôlé par SDS-PAGE durant les différentes étapes de purification (voir figure 3). La figure 3 montre une disparition progressive des bandes correspondant aux produits contaminants au cours des étapes de purification. Le degré de pureté est estimé, de manière semi-quantitative, par évaluation de l'intensité de la bande correspondant à Pencapsuline, rapporté à l'intensité de toutes les bandes présentes, au moyen du logiciel Image Lab (BioRad). Après la dernière étape de purification (colonne 5 sur la figure 3), ce degré de pureté est d'environ 85-90%, au minimum, pour chacune des préparations de nanoparticules XIP1, XIP2 et XIP3.
On a vérifié également par une technique de western-blot au moyen d'un anticorps monoclonal dirigé contre l'ectodomaine de la protéine M2 (Réf : MAI -082, Thermo S cientifîc) dilué au 1000ieme dans un tampon PBST (PBS IX supplémenté par 0,05% de Tween-20, Réf : P9416, Sigma- Aldrich) que la séquence peptidique GGEVETPIRNEGG a bien été insérée dans le monomère d'encapsuline de la préparation XIP2. On a retrouvé effectivement une bande spécifique qui correspond à la bande du monomère d'encapsuline (bande à 31 758 Da). Exemple 2 : Caractérisation des nanoparticules d'encapsuline contenant une protéine fluorescente (eGFP)
Analyse structurale des nanoparticules d'encapsuline
La taille moyenne des nanoparticules contenues dans les différentes préparations purifiées (XIP1, XIP2 et XIP3) a été mesurée par DLS au moyen de l'appareillage Zetasizer Nano de Malvern. Après fïltration d'une aliquote de 200 μΐ de chacune des préparations purifiées sur un filtre d'acétate de cellulose 0,22 μΜ (Réf : 8161, Costar Spin-X), les échantillons ont ensuite été placés dans une cuve compatible UV et analysés par mesure spectroscopique à corrélation de photons (laser He-Ne 633 nm) des rayonnements de diffusion des nanoparticules à un angle fixe de 173°. Les mesures ont été effectuées en duplicate à 25°C après une équilibration de 2 minutes puis analysées à l'aide du logiciel DTS. Les résultats (voir figure 4) montrent que seule la préparation purifiée de nanoparticules XIP2, dont la surface du nano-compartiment est constituée de monomères d'encapsuline dans lesquels la séquence du monomère de référence a été modifiée par insertion de la séquence GGEVETPIRNEGG dans un site externe du domaine A du monomère d'encapsuline, a une population majoritaire de nanoparticules dont la taille moyenne, d'environ 24 nm, correspond à celle qui est classiquement décrite pour les nanoparticules d'encapsuline de Thermotoga maritima (Sutter M et Coll., Nat Struct Mol Biol (2008) ; 15(9) : 939-947), ce qui est un bon indicateur de l'efficacité de l'assemblage des monomères entre eux. L'analyse en microscopie électronique à transmission en champs clairs faite à l'aide d'un MET Tecnai Spirit (FEI, Eindhoven, The Netherlands) avec un objectif Biotwin à 120 kV, a confirmé l'efficacité de l'assemblage. 15 μΐ de la préparation purifiée XIP2 a été déposée sur une grille de cuivre prétraitée au bleu Alcian 1 %. Après incubation pendant 10 minutes suivie d'un rinçage deux fois à l'eau, la préparation sur la grille a été ensuite colorée avec une goutte d'acétate d'uranyle à 2 % (Agar Scientific) pendant 10 secondes, puis séchée à l'air libre à température ambiante. Les micrographes enregistrés ont été analysés via un récepteur à transfert de charge 4*4 K CCD (Eagle, FEI) à un grossissement de 30 000 fois. L'image telle que représentée dans la figure 5 montre de nombreuses nanoparticules, d'allure icosaédrique, ayant une taille d'environ 23,2 nm ± 0,5 nm dans lesquelles on retrouve une masse dense, ce qui indique la présence de la protéine fluorescente à l'intérieur des nanoparticules. Mesure de la quantité d'eGFP par nanoparticule
Une droite d'étalonnage mesurant l'intensité relative de fluorescence (exprimée en RFUs, où RFU signifie : unité relative de fluorescence) en fonction de la concentration en eGFP, a été établie en mesurant l'intensité de fluorescence émise par une solution d'eGFP taggée His (SEQ ID NO : 47) purifiée, dans un tampon PB S IX dans une gamme de concentration allant de 0 à 30 μg.mL-1. La mesure a été faite à l'aide de l'appareil CFX96 Touch™ Real- Time PCR Détection System (Bio-Rad) en utilisant les filtres FAM pour l'excitation (450- 490 nm) et pour l'émission (510-530 nm). La droite d'étalonnage obtenue avait pour équation : Y= 2000,4X -170,55, avec un coefficient de corrélation R2 de 0,9838, Y désignant le nombre de RFUs et X désignant la concentration en eGFP en μg.mL-1.
La concentration en eGFP (CGFP) dans chaque préparation de nanoparticules purifiées a été déterminée en calculant l'intensité moyenne de fluorescence sur trois mesures, puis en se référant à la droite d'étalonnage pour déterminer la concentration en eGFP (en μg.mL-1). La concentration en eGFP (en μΜ) a alors été déduite en utilisant le poids moléculaire de l'EGFP (PMEGFP = 27000g/mol). En parallèle, une mesure de la densité optique à 280 nm a été réalisée à l'aide du NanoDrop (Thermoscientifïc) afin de déterminer la concentration d'encapsuline en Utilisant la loi de Beer-Lambert :
Figure imgf000044_0002
Figure imgf000044_0005
du trajet optique (en cm); C = concentration (en M) et ε =
Figure imgf000044_0006
coefficient d'extinction molaire (en L. mol-1 .cm-1), avec et
Figure imgf000044_0001
Figure imgf000044_0003
Le ratio
Figure imgf000044_0004
[encapsuline] M/[eGFP] M) obtenu pour chaque préparation permet d'évaluer la capacité des nanoparticules à encapsuler la protéine fluorescente. Plus le ratio est faible et plus la capacité d'encapsulation de la protéine fluorescente par les nanoparticules est importante. Considérant qu'une nanoparticule à base de monomères d'encapsuline de T. maritima est constituée classiquement de 60 monomères, on peut estimer le nombre de molécules d'eGFP qui ont été encapsulées par nanoparticule dans chacune des préparations. Les résultats du tableau 3 montrent que les nanoparticules de la préparation XIP2 dans lesquelles la séquence du monomère de référence a été modifiée par insertion de la séquence GGEVETPIRNEGG dans un site externe du monomère d'encapsuline, a une capacité d'encapsulation de l'ordre de 46 fois plus grande que les nanoparticules de la préparation XIP3 dans lesquelles la séquence du monomère de référence a été modifiée par insertion de la séquence GGGGGGHHHHHHGGGGG dans un site interne du monomère d'encapsuline, et encore plus grande vis-à-vis des nanoparticules de la préparation XIPl résultant de l'assemblage des monomères de référence dont la capacité d'encapsulation de la protéine fluorescente est négligeable.
Figure imgf000045_0001
Le peptide « M2e » ayant pour séquence la séquence GGEVETPIRNEGG et le peptide « M2e biotinylé en C-terminal » [NH2]GGEVETPIRNEGG[CH2CH2Biotin] ont été synthétisés à façon par ThermoFisher scientific. L'ovalbumine (Sigma référence : A5503- 1G) a été couplée au peptide M2e (Ovalbumine-M2e) par un couplage amine/amine à l'aide de bis[sulfosuccinimidyl] suberate (BS3); Thermo référence : 21580). L'ovalbumine, le peptide M2e, et l'agent de couplage BS3, ont été incubés pendant 30 minutes à 25 °c en solution dans le PB S, dans les proportions molaires respectives de 1 : 10 : 10. La streptavidine (Thermo référence : 21122) a été mise en présence d'un excès du peptide M2e biotinylé en C-terminal (dans des proportions 1 : 10) et incubée 1 heure à 25°C. Pour bloquer les réactions et éliminer les peptides et BS3 non couplés, les protéines ont été dessalées immédiatement après incubation sur colonnes PD10 (GE Healhcare référence : 17-0851-01) équilibrées en PBS.
Quatre groupes de 7 souris femelles de souche BalB/c ont été immunisées par injection sous-cutanée avec l'un des antigènes suivants : l'encapsuline-M2e + eGFP (XIP2), l'eGFP, l'Ovalbumine-M2e, ou du PBS (contrôle négatif). Trois injections ont été réalisées, à J0, J14 et J28. La première injection (J0) a été effectuée avec 50 μg d'antigène mélangé volume à volume avec de l'adjuvant complet de Freund (CFA), tandis que la deuxième (J14) et la troisième injection (J28) ont été réalisées avec la même quantité d'antigène mais avec de l'adjuvant incomplet de Freund (IF A).
Un cinquième groupe de 7 souris, a été immunisé avec l'encapsuline-M2e + eGFP, en suivant le même protocole, mais sans l'utilisation d'adjuvant pour les 3 injections. Pour chaque souris de chaque groupe, on a collecté 50 μΐ, de sérum avant la première immunisation (J0), puis 14 jours, 28 jours et 42 jours après (J14, J28 et J42). La réponse anticorps IgGl et IgG2a a été dosée par ELIS A direct. Les puits des plaques ELIS A Nunc® 96 puits (Sigma, Ref M9410) ont été recouverts par 200 ng de l'un des antigènes suivants : 1) de l'eGFP purifiée par affinité sur colonne chargée avec la résine HisPur Ni- NTA (Thermo référence 88221) , 2) de la streptavidine (Thermo référence : 21122), 3) de la streptavidine couplée avec le peptide M2e biotinylé en C-terminal, 4) de l'ovalbumine (Sigma référence : A5503), 5) de l'ovalbumine couplée chimiquement avec le peptide M2e, 6) de l'encapsuline + eGFP (XIP1) et 7) de l'encapsuline-M2e + eGFP (XIP2), dilués en tampon bicarbonate 0,2 M pH 9,4 (Thermo référence : 10331414), à 4°C pendant une nuit. Des puits, utilisés comme « contrôle négatif » ont également été incubés pendant une nuit à 4°C avec un tampon bicarbonate.
Après saturation pendant 1 heure à température ambiante avec une solution de PBS IX - Lait 25 % (Sigma- Aldrich références : D8537, et 70166), suivie de trois lavages successifs avec du PBS additionné de Tween 20 à 0,05 % (Sigma-Aldrich références : D8537 et P9416), les plaques ont été incubées pendant lh30 avec les « pools » de sérums représentatifs des différents groupes de souris immunisées, dilués au centième dans du PBS-1% BSA (Sigma-Aldrich références : D8537 et A4503), chaque pool de sérum ayant été constitué en mélangeant les sérums des 7 souris d'un même groupe. Les plaques ont alors de nouveau été lavées en PBS-Tween 20 comme décrit précédemment, puis incubées pendant 30 minutes avec 100 ng d'anticorps de révélation qui est soit un anticorps de rat anti IgGl de souris couplé à la HRP (Thermo référence : 10097462), soit un anticorps de rat anti IgG2a de souris couplé à la HRP (Thermo référence : 10777993). Après trois lavages en PBS-Tween 20 comme précédemment, 100 μΐ de TMB (Thermo référence : 11869260) ont été ajoutés par puits et les plaques ont été incubées 5 minutes à température ambiante. Pour stopper la réaction, 100 μΐ d'acide sulfurique à 0,2 M (Sigma référence : 320501-1L-D) a été ajouté dans chaque puits. La plaque a ensuite été lue avec le lecteur de plaque TECAN à une absorbance de 450 nm.
Les résultats (Figures 6A et 6B) montrent que les anticorps produits par les souris immunisées avec l'encapsuline-M2e + eGFP (XIP2) en présence d'adjuvant sont dirigés contre M2e, mais, de façon surprenante, pas contre l'encapsuline elle-même, comme en témoigne la reconnaissance par les anticorps de l'encapsuline-M2e, de la streptavidine- M2e et de l'ovalbumine-M2e, et pas de l'encapsuline, de la streptavidine et de l'ovalbumine. De même, après immunisation avec l'encapsuline-M2e + eGFP (XIP2) sans adjuvant, les anticorps produits sont dirigés contre l'encapsuline-M2e, mais pas contre l'encapsuline seule. Par opposition, les anticorps produits par les souris immunisées avec l'ovalbumine-M2e en présence d'adjuvant, reconnaissent l'ovalbumine-M2e, mais également l'ovalbumine seule, et ne reconnaissent ni l'encapsuline-M2e ni la streptavidine-M2e. Les anticorps produits sont donc essentiellement dirigés contre l'ovalbumine mais pas contre M2e. Les anticorps produits lors de l'immunisation avec l'encapsuline-M2e, avec ou sans adjuvant, sont majoritairement de type IgGl, mais des anticorps de type IgG2a sont également produits. Suite à l'immunisation avec l'ovalbumine-M2e, il n'y a quasiment pas d'anticorps de type IgG2a produits.
Afin d'estimer le titre d'anticorps chez les groupes immunisés avec l'encapsuline-M2e +eGFP (XIP2), avec et sans adjuvant, les pools de sérums provenant de ces deux groupes ont été dilués en cascade au demi à partir d'une dilution au centième. La streptavidine, la streptavidine-M2e, l'encapsuline + eGFP (XIP1) et l'encapsuline-M2e + eGFP (XIP2) ont été adsorbées au fond des puits de la même manière que décrite précédemment. La révélation a été faite à l'aide de l'anticorps de rat anti IgGl de souris couplé à la HRP (Thermo référence : 10097462). Les résultats (Figure 7) confirment que, de façon surprenante, la présence d'adjuvants n'est pas nécessaire pour obtenir une réponse anticorps spécifique de M2e : les serums des souris immunisées reconnaissent l'encapsuline-M2e, la streptavidine-M2e, mais ne reconnaissent pas la streptavidine ou l'encapsuline seule.
La réponse anticorps dirigée contre la protéine interne, eGFP, a été analysée à J42 dans les sera individuels des 7 souris immunisées avec l'encapsuline-M2e + eGFP (XIP2) en présence d'adjuvant. Les dilutions au 1/50 eme, au 1/100 eme et au 1/200 eme de chacun des sera ont été analysées par ELISA sur des plaques sensibilisées par de l'eGFP diluée en tampon bicarbonate 0,2M, pH=9 à raison de 200 ng par puits et en utilisant comme anticorps de révélation le même anticorps de rat anti IgGl de souris couplé à la HRP que précédemment. Les résultats de la Figure 8 montrent que 3 des 7 souris ont développé une réponse anti-eGFP significative Exemple 4 : Etude de la capacité des nanoparticules d'encapsuline à présenter à la surface des peptides d'intérêt et à encapsuler des protéines variées
Afin d'illustrer plus avant le système de nanoparticules à base d'encapsuline selon l'invention, trois constructions bi-cistroniques (C4 à C6) ont été réalisées, codant pour trois séquences protéiques (XIP4 à XIP6). Toutes les constructions ont été réalisées suivant les méthodes décrites de l'Exemple 1 et un schéma résumé de ces constructions est présenté à la Figure 9. Préparation des plasmides bi-cistroniques
La construction C4 est basée sur la construction C2 et consiste à augmenter la taille de l'épitope présenté en surface par l'encapsuline. Pour cela un dimère de la séquence entière de M2e, avec des linkers, est ajouté à la surface de l'encapsuline, soit 55 acides aminés insérés dans la séquence de l'encapsuline. L'épitope M2e sélectionné correspond à l'ectodomaine de la protéine de Matrice M2 de la souche PR8 du virus Influenza. La protéine de matrice M2 a une taille de 97 acides aminés et se divise en un domaine transmembranaire, un domaine externe et un domaine interne. C'est la partie externe (ectodomaine de 24 acides aminés) qui est d'intérêt. Il correspond à la séquence nucléique :
> Influenza A virus (A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai(HlNl)), GI: 21693176 : Accession: AF389121; Protein Id: AAM75162.1; product "matrix protein 2" : Ectodomain
Figure imgf000048_0002
La séquence protéique correspondante est composée de 24 acides aminés décrits ci-après :
> Matrix protein 2 : 24 AA : Ectodomain epitope M2e de la souche M2e InfluenzaA/PR8
Figure imgf000048_0003
La séquence de 55 AA insérée correspond à la duplication de la séquence M2e de 24 AA, liée par un linker glycine (trois glycines) et flanquée par des linkers constitués de deux glycines soit la séquence :
Figure imgf000048_0004
La séquence nucléique a été modifiée pour un des monomères afin d'éviter la formation de structures secondaires liées à une complémentarité ou recombinaison entre séquences. Cette séquence a été optimisée en s'aidant du tableau d'usage des codons d'E. coli, et la séquence totale de la construction C4 résultante correspond à :
Figure imgf000048_0001
Figure imgf000049_0001
La construction C5 correspond à la construction C2 pour laquelle l'épitope M2e de 9 acides aminés a été changé par le peptide de la protéine amyloïde-β (BAP). Les références de ce gène sont : NP 000475 et Uniprot :P05067 Gene ID : 351 et les séquences insérées sont :
> Séquence nucléique du peptide BAP :
GATGCAGAATTCCGACATGACTCAGGA (SEQ I D NO : 50)
> Séquence protéique du peptide BAP :
DAEFRH DSG (SEQ I D NO : 33)
Une mutation dans la séquence nucléique a été réalisée afin de supprimer le site de restriction enzymatique EcoRI. La construction bi-cistronique finale C5 correspond à :
Figure imgf000050_0001
La construction C6, correspond à la construction C2 dans laquelle la protéine encapsulée a été modifiée : la protéine fluorescente eGFP a été remplacée par de la glutathione-S transferase (GST) de la souche Schistosoma japonicum. La séquence utilisée dérive du vecteur pGEX-2T qui exprime la GST (Genescript, références : gi|595709|gb|U13850.1 |XXU13850 pGEX-2T cloning vector).
Figure imgf000050_0002
Figure imgf000051_0001
La séquence de la GST sélectionnée commerciale a été optimisée pour une expression chez E.coli, en utilisant un algorithme d'harmonisation du logiciel Cad4BIO. Les sites de restriction enzymatique HindIII, BamHI, EcoRI et Xhol ont été éliminés pour ne pas interférer avec les expériences de clonage. La séquence résultante a été fusionnée au domaine Flp-Cter de la protéine Flp dérivant de Thermotoga Maritima. La séquence est directement fusionnée sans ajout d'une leucine pour avoir le site de restriction HindIII contrairement à ce qui avait pu être fait pour l'eGFP fusionnée à Flp-Cter.
Figure imgf000051_0002
Figure imgf000052_0001
Analyse structurale des nanoparticules d'encapsuline
Les constructions C4 à C6 ont ensuite été clonées et transformées chez E. coli, comme décrit à l'exemple 1. Suite à leur production dans 200 mL de milieu LB, chaque protéine exprimée (XIP4 à XIP6) a été purifiée comme décrit à l'exemple 1. Pour leur caractérisation, les protéines XIP4 à 6 ont tout d'abord été analysées par SDS-PAGE et western blot à l'aide d'anticorps anti-M2e, anti-GFP et anti-GST, de manière à confirmer la présence des différents éléments sur les protéines purifiées. Par la suite, une étude de microscopie électronique a été réalisée sur les protéines comme décrit à l'exemple 2. Cette étude a montré le bon assemblage des diverses nanoparticules pour les nouvelles constructions XIP4 à XIP6.
Mesure de la quantité de protéines (eGFP et GST) par nanoparticule
Pour l'estimation du nombre de protéines (eGFP ou GST) encapsulées par nanoparticule, la première étape a été de déterminer la concentration d'encapsuline dans chaque échantillon. Pour cela, une mesure de la concentration protéique totale de chaque échantillon a été réalisée grâce à un dosage colorimétrique des protéines, basé sur l'acide bicinchonique (BCA, ThermoFisher ref 23235). En parallèle, le pourcentage d'encapsuline présent dans l'échantillon total a été estimé en se basant sur l'analyse des gels SDS-PAGE analysés par le logiciel ImageJ (https://imagej.nih.gov/). Ce pourcentage est ensuite utilisé pour estimer la concentration en encapsuline de l'échantillon en mg / mL à partir des mesures de concentration protéique totale de la concentration molaire correspondante est calculée en divisant la concentration en mg / mL par la masse molaire de l'encapsuline correspondante. Les résultats sont rapportés dans le tableau 4.
La détermination de la concentration en eGFP dans les constructions a été réalisée comme décrit dans l'exemple 2. Pour ces constructions, la droite d'étalonnage d'eGFP avait pour équation Y = 175,04 X - 13,15 avec un coefficient de corrélation R2 = 0,9965.
Pour la détermination de la concentration en GST, un kit utilisant du l-chloro-2,4- dinitrobenzene (CDNB) a été utilisé (Sigma, ref CS0410). L'activité de la GST est mesurée lors de la conjugaison par l'enzyme du groupement thiol du glutathion réduit au CDNB. Cette conjugaison entraine une augmentation de l'absorbance à 340 nm qui est mesurée au cours du temps. Suivant les recommandations du kit, une gamme étalon de concentration de GST a été réalisée et suite à l'ajout des substrats, l'absorbance à 340 nm par minute (A340nm / min) a été mesurée pour la gamme étalon et les échantillons. La droite d'étalonnage de GST obtenue avait pour équation Y = 0,0749 X - 0,0047 avec un coefficient de corrélation R2 = 0,9908 et a permis d'obtenir la concentration de GST dans les échantillons en mg / mL.
Les concentrations molaires pour l'eGFP et la GST sont calculées en divisant les concentrations en mg / mL par les masses molaires des protéines correspondantes. Toutes les valeurs obtenues figurent dans le tableau 4. Le nombre de protéines encapsulées par particule a alors été déterminé comme décrit à l'exemple 2 et rapporté dans le tableau 4.
Figure imgf000053_0001

Claims

REVENDICATIONS 1. Nanoparticule comprenant :
- un assemblage de monomères d'encapsuline, dans lequel un peptide est inséré dans la séquence d'acides aminés d'au moins un desdits monomères d'encapsuline, le site d'insertion du peptide étant situé dans une boucle externe, avantageusement du domaine A du monomère d'encapsuline, de sorte que le peptide est localisé à l'extérieur de la nanoparticule et
- une protéine interne localisée à l'intérieur de la nanoparticule.
2. Nanoparticule selon la revendication 1, dans laquelle le peptide est inséré dans la séquence d'acides aminés de tous les monomères d'encapsuline.
3. Nanoparticule selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle la séquence d'acides aminés du monomère d'encapsuline est choisie parmi les séquences suivantes : la séquence SEQ ID NO : 1, la séquence SEQ ID NO : 7, une séquence présentant 90% d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 1 ou SEQ ID NO : 7, avantageusement la séquence SEQ ID NO : 7.
4. Nanoparticule selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle le peptide est inséré entre deux acides aminés consécutifs de la région 138-143 de la séquence SEQ ID NO : 7, ou entre deux acides aminés consécutifs de la région correspondante dans la séquence du monomère d'encapsuline.
5. Nanoparticule selon la revendication 4, dans laquelle le peptide est inséré entre deux acides aminés consécutifs :
Figure imgf000054_0001
6. Nanoparticule selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle le nombre total d'acides aminés du peptide inséré est compris entre 4 et 100, avantageusement entre 4 et 55.
7. Nanoparticule selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle le peptide inséré comprend la séquence EVETPIRNE (SEQ ID NO : 9) ou DAEFRHDSG (SEQ ID NO : 33).
8. Nanoparticule selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle la séquence d'acides aminés du monomère d'encapsuline après insertion du peptide est la séquence SEQ ID NO : 30.
9. Nanoparticule selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle l'extrémité C- terminale ou N-terminale, respectivement, de la séquence d'acides aminés de la protéine interne se termine ou commence, respectivement, par un enchaînement d'acides aminés du type I-M-T, dans lequel :
a. I désigne une séquence d'acides aminés dont le nombre total d'acides aminés est compris entre 0 et 30, de façon préférée entre 0 et 25 , et de façon encore plus préférée entre 0 et 20 ;
b.
Figure imgf000055_0001
c. T désigne une séquence d'acides aminés dont le nombre total d'acides aminés est compris entre 0 et 15, de façon préférée entre 0 et 10 , et de façon encore plus préférée entre 0 et 5.
10. Nanoparticule selon la revendication 9, dans laquelle la protéine interne est une protéine de fusion dans laquelle l'extrémité C-terminale ou N-terminale d'une protéine d'intérêt a été fusionnée à l'enchaînement d'acides aminés du type I-M-T.
11. Vecteur bicistronique comprenant une première séquence d'acides nucléiques codant pour un monomère d'encapsuline tel que défini dans l'une des revendications 1 et 3 à
8, et une deuxième séquence d'acides nucléiques codant pour une protéine interne telle que définie dans les revendications 1 et 9 à 10.
12. Cellule hôte comprenant un vecteur bicistronique selon la revendication 11.
13. Cellule hôte comprenant un premier vecteur qui comprend une séquence d'acides nucléiques codant pour un monomère d'encapsuline tel que défini dans l'une des revendications 1 et 3 à 8, et un deuxième vecteur qui comprend une séquence d'acides nucléiques codant pour une protéine interne telle que définie dans les revendications 1 et 9 à 10.
14. Procédé de production de nanoparticules selon l'une des revendications 1 à 10, selon lequel :
a. On cultive des cellules hôtes telles que définies selon la revendication 12 ou 13 dans des conditions favorisant l'expression des monomères d'encapsuline et de la protéine interne ; et
b. On récupère les nanoparticules contenant la protéine interne, résultant de l'auto- assemblage des monomères d'encapsuline.
15. Nanoparticules selon l'une des revendications 1 à 10 pour utilisation comme ag immunogène, avantageusement comme vaccin.
16. Procédé de purification de nanoparticules comprenant un assemblage de monomères d'encapsuline, avantageusement de nanoparticules selon l'une des revendications 1 à 10, selon lequel :
a. On clarifie un broyât de cellules contenant des nanoparticules comprenant un assemblage de monomères d'encapsuline;
b. On soumet la solution clarifiée contenant les nanoparticules à une ou plusieurs étape(s) de chromatographie de type multi-modale ;
c. On récupère l'éluat contenant les assemblages de monomères d'encapsuline de diamètre supérieur ou égal à 10 nm ;
d. On élimine en une ou plusieurs fois les contaminants hydrophobes contenus dans l'éluat au moyen d'une solution biphasique ;
e. On récupère la phase aqueuse que l'on soumet à une ou plusieurs étape(s) de polissage, et
f. On récupère la solution purifiée contenant les nanoparticules comprenant un assemblage de monomères d'encapsuline.
17. Nanoparticules comprenant un assemblage de monomères d'encapsuline tels que définis dans l'une des revendications 1 et 3 à 8 pour utilisation comme agent immunogène, avantageusement comme vaccin.
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