TWI780058B

TWI780058B - 作為抗瘧疾疫苗之生物融合蛋白

Info

Publication number: TWI780058B
Application number: TW106124623A
Authority: TW
Inventors: 皮耶德呂耶
Original assignee: 新加坡商全民疫苗私人有限公司
Priority date: 2016-07-21
Filing date: 2017-07-21
Publication date: 2022-10-11
Also published as: TW201803907A; EP4147715A1; JP2019526274A; KR20240154691A; AU2017300965A1; EP3487526B1; AU2017300965B2; WO2018017020A1; EP3487526A1; US20220409712A1; US20210038706A1; CA3031399A1; KR20190090775A; BR112019001115A2; CN109963586A; JP2022116169A; JP7579298B2; CN109963586B

Abstract

本發明係關於包括至少一個融合至載體異源蛋白序列之抗原性胺基酸序列之融合蛋白，其中該抗原性序列包括瘧原蟲屬(Plasmodium)蛋白之表位序列且該載體異源蛋白序列係在人類中具有免疫原性之序列。該等蛋白質可用作抗瘧疾疫苗。

Description

作為抗瘧疾疫苗之生物融合蛋白

本發明係關於對抗瘧疾之保護，更特定而言係關於包括融合蛋白之瘧疾疫苗。

造成人類瘧疾之寄生蟲(尤其包含惡性瘧原蟲( Plasmodium falciparum))在人類宿主中展現不同形態且隨其在所感染宿主之生物體中之定位而表現不同抗原。該等寄生蟲在人類生命循環期間之形態及抗原性差異使得能夠具有至少4個不同發育階段。寄生蟲在人類中之最初發育階段對應於藉由寄生蟲之昆蟲載體之叮咬引入宿主血液中的子孢子形式。第二階段對應於寄生蟲通過肝且感染肝細胞，其中寄生蟲發育形成肝裂殖體，該等肝裂殖體在其成熟(例如在子孢子侵入之後第6天之惡性瘧原蟲情形)時藉由破裂釋放肝裂殖子。第三階段之特徵在於在成熟時釋放游離裂殖子之寄生蟲之無性形式(血液階段裂殖體)感染血液紅血球；此紅細胞發育階段對應於疾病之病原期。第四階段對應於形成具有性潛力之形式(或配子母細胞)，該等形式在蚊子中變成細胞外性形式或配子。並無引入臨床實踐中之實踐或有效疫苗。瘧疾亞單位疫苗迄今為止已展示免疫原性之重大缺陷。所觀察到之免疫反應效價低且持續時間短。已探究各種方式來解決此缺陷，包含選擇佐劑、於諸如病毒樣顆粒(VLP)、腺病毒載體等複合載體中表現及設置複雜初免-加強方案。即使使用來自惡性瘧原蟲瘧疾寄生蟲之紅血球前環子孢子蛋白(CSP)及B型肝炎病毒(HBsAg)之病毒套膜蛋白中之重複序列及T細胞表位的基因及複雜佐劑(例如ASO1)所改造之RTS,S/AS01疫苗(Mosquirix®)亦受困於瘧疾特異性免疫反應之極短持續時間(而B型肝炎反應長時間保持較高)。亦揭示瘧原蟲屬(Plasmodium)抗原至載體蛋白之化學偶聯。舉例而言，包括偶聯至銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)胞外蛋白A (repA)之去毒形式之瘧原蟲屬蛋白Pfs25H之疫苗正處於評估中。然而，化學偶聯具有若干缺點。其在技術上較為吃力，難以再現，且相當昂貴。仍亟需展示良好免疫原性及對抗瘧疾之保護而易於複製並負擔得起之疫苗產品。

本發明提供源於由與載體蛋白(例如CRM197)融合之瘧原蟲屬多肽組成之新穎構築體之改良免疫原性的優點。並非以化學方式使瘧原蟲屬分子偶合至載體蛋白，發明者研發一種新穎方式，其中將寄生蟲蛋白與載體蛋白一起編碼為融合蛋白，從而製備「生物偶聯之融合產物」，其在本文中亦稱為「生物融合分子」且可以重組方式在(例如)大腸桿菌(E. coli)中產生。更特定而言，本發明提供包括至少一個融合於載體異源蛋白序列之N-末端及/或C-末端之抗原性胺基酸序列之融合蛋白，其中抗原性序列包括瘧原蟲屬蛋白之表位序列且載體異源蛋白序列係在人類中具有免疫原性之序列。抗原性序列可為由紅血球階段之瘧原蟲屬所表現之抗原性蛋白或其表位片段。或者，抗原性序列可為由紅血球前階段之瘧原蟲屬所表現之抗原性蛋白或其表位片段。本發明之另一目標係編碼如本文所定義之融合蛋白之核酸構築體。亦提供包括表現盒中之核酸構築體之載體以及插入載體之宿主細胞。另外闡述製備融合蛋白之活體外方法，該方法包括使宿主細胞在誘導表現核酸構築體之條件下繁殖，且收集如此表現之融合蛋白。根據本發明，提供一種疫苗，其包括該融合蛋白或至少兩種融合蛋白(其分別包括至少兩種不同抗原性胺基酸序列)之組合或編碼該(等)融合蛋白之核酸構築體與生理上可接受之媒劑。該疫苗可用於向人類個體接種疫苗，來對抗瘧疾。

定義「疫苗」應理解為意指用以產生免疫性，以用於預防及/或治療疾病之組合物。因此，疫苗係包括抗原之藥劑，且計畫用於人類或動物中，藉由接種疫苗而產生特定防禦及保護性物質。本文所用之「疫苗」意指能夠誘發之部分或完全保護之免疫原性組合物。疫苗可在受感染個體中用於預防感染及/或治療感染。術語「免疫原性」意指所提及組合物或蛋白質能夠在投與時誘發免疫反應。個體中之「免疫反應」係指對抗原產生適應性及/或先天性免疫反應，包含體液免疫反應、細胞免疫反應或體液與細胞免疫反應。「體液免疫反應」係指由抗體所調介者。本文件中所用之術語「保護」或「預防」係指在與瘧原蟲屬寄生蟲接觸之後不會出現症狀或出現之疾病症狀減少。特定而言，術語「預防瘧疾」係指所治療個體在與造成瘧疾之瘧原蟲屬接觸之後，不會出現症狀或出現之症狀減少。「患者」或「個體」通常係哺乳動物個體，較佳係人類個體。個體可為雄性或雌性、兒童或成人。個體可為先前已診斷或鑑別為患有瘧疾者。或者，個體亦可為過去未曾被診斷患有瘧疾但處於發生該病症之風險下(例如因感染或因在瘧疾流行之區域內旅行)者。舉例而言，個體可為具有一或多種瘧疾症狀者。舉例而言，個體可感染惡性瘧原蟲或間日瘧原蟲(Plasmodium vivax)。原始多肽之「同源」或「實質上同源」序列通常係如下序列：其與原始多肽序列或原始多肽之免疫原性或表位片段具有至少約80%一致性，且實質上保留該原始多肽對預期靶之期望效應(亦即誘發免疫原性反應或被抗體識別)。在越佳之實施例中，同源序列與原始多肽序列或其免疫原性或表位片段具有至少約85%、90%、95%、97%或99%之一致性。「免疫原性片段」通常具有至少5個胺基酸之長度。越佳地，免疫原性片段之長度為至少7、9、11、13、15、17及19個胺基酸。「表位」通常具有至少5個胺基酸，較佳為至少7至14個胺基酸之長度。「表位片段」包括該表位且因此可以更長。在本發明之上下文中，術語「融合或生物融合」意指在重組蛋白中，載體蛋白係直接連接至抗原性瘧原蟲屬序列，或藉由肽連接體連接至抗原性瘧原蟲屬序列。肽連接體可為1至35個胺基酸，較佳為5至20個胺基酸，仍較佳為5至10個胺基酸之序列。在較佳實施例中，連接體肽係(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser) _n、(Gly) _n或(EAAAK) _n，其中n為1至4，較佳為1至3。在任一實施例中，形成單一多肽。 載體蛋白載體異源蛋白序列可有利地選自由以下組成之群：白喉類毒素之交叉反應材料(CRM)、白喉類毒素(D)、銅綠假單胞菌胞外蛋白A之無毒突變重組體(repA)、腦膜炎球菌外膜蛋白複合物(OMPC)、破傷風類毒素 (T)、流行性感冒嗜血桿菌蛋白D (H. influenza protein D，hiD)及其免疫原性片段。在較佳實施例中，載體異源蛋白序列可為CRM197或其免疫原性片段，該片段較佳地選自由以下組成之群：CRM197之片段A、跨膜結構域T、受體結合結構域R、CRM197之胺基酸序列1-190及CRM197之胺基酸序列1-389。白喉毒素之片段A自胺基酸1延伸至201。CRM197擁有酶促惰性片段A，該片段展示甘胺酸52經麩胺酸取代。白喉毒素之片段B自胺基酸202延伸至535。下表 1展示關於特定載體之其他資訊。

亦可使用實質上同源序列。 抗原性瘧原蟲屬序列本發明之融合蛋白構築體包括至少一個包括瘧原蟲屬蛋白之表位序列之抗原性序列。該抗原性序列可為來自任一瘧原蟲屬物種之任一瘧原蟲屬抗原之序列。感染人類之寄生蟲之「瘧原蟲屬」包括(但不限於)惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、諾氏症原蟲(P. knowles)、卵形瘧原蟲(P. ovale)及三日瘧原蟲(P. malariae)。下文所列示之抗原主要係來自惡性瘧原蟲之抗原。然而，亦涵蓋其他瘧原蟲屬物種中之直向同源物。特定而言，間日瘧原蟲抗原與惡性瘧原蟲抗原展示相同之低免疫原性。該抗原可表現於紅血球階段(亦稱為「血液階段」)或紅血球前階段(子孢子及肝階段)中。可使用之抗原性序列之實例列示於下表 2中。亦可使用實質上同源序列。表現於紅血球階段中且作為Ab依賴性細胞抑制(ADCI)防禦機制之靶之抗原包含： MSP3 (例如MSP3-1、MSP3-2、MSP3-3、MSP3-4、MSP3-7、MSP3-8)、11-1之PEBS子區(亦稱為LSA5)、Glurp R0及R2、SERP、P27及P27A、P45、P90及P77、P14、P181 (其係P77之組合)、MSP1-區2、MSP2 (兩個3D7及FC27等位基因，二者皆係二態及恆定區域)、GBP 130 (尤其N及C部分二者)、蛋白質332、蛋白質11-1、MSP4或其任一表位片段。較佳地，融合蛋白中之抗原性序列係MSP3或其表位片段。在另一較佳實施例中，融合蛋白中之抗原性序列係LSA5或其表位片段。惡性瘧原蟲裂殖子表面蛋白3 (MSP-3)係已知無性血液階段瘧疾疫苗候選抗原(Sirima等人，N Engl J Med 2011, 365(11):1062-1064；Demanga等人，Infect Immun 2010, 78(1):486-494；Daher等人，Infect Immun 2010, 78(1):477-485；Rousillon等人、Roussilhon等人，PLoS Medicine，2007年11月4日，第11期，e320)。特定而言，可使用6種MSP3蛋白中之任一者，較佳為MSP3-1以及蛋白質之肽a、b、c、d、e、f、重組體C-末端亦及全長及N-末端。在一較佳實施例中，抗原性序列係MSP3或其表位片段，該片段涵蓋選自MSP3-1、MSP3-2、MSP3-3、MSP3-4、MSP3-7、MSP3-8之瘧原蟲屬MSP3蛋白之C-末端區域之基序a、b、c、d、e及/或f。涵蓋來自裂殖子表面之其他抗原、尤其鬆散附接或裂解且由此可自裂殖子表面釋放者。表現於紅血球前階段中之抗原包含LSA3、PEBS、CS、Trap及Salsa及其任一表位片段。在惡性瘧原蟲中，肝階段抗原-3 (LSA-3)係表現於紅血球前階段之抗原(Toure-Balde等人：Infect Immun 2009, 77(3):1189-1196；Daubersies等人：Nat Med 2000, 6(11):1258-1263)。亦涵蓋涉及其他階段或其他機制之抗原。彼等抗原包含涉及有性階段之抗原(例如Pf25或Pf45/48)及涉及紅血球中之裂殖子侵襲抑制之GIA機制的血液階段抗原(例如Rh5、AMA1、MSP1-19、MSP1-42、MSP2或MSP4-5)或涉及細胞黏附之抗原(例如Var CSA)。表 2：抗原性序列(惡性瘧原蟲)

#係指與上一列相同之參考 融合構築體在一特定實施例中，融合蛋白包括融合至CRM197或其免疫原性片段(作為載體序列)之MSP3 (較佳地MSP3-1)、LSA3、LSA5 (亦稱為PEBS)或其表位片段(作為抗原性序列)或由其組成。在一較佳態樣中，融合蛋白包括兩個抗原性序列，該等抗原性序列各自位於載體蛋白序列之C-末端及N-末端，或二者皆位於同一末端，其中兩個抗原性序列彼此相同或不同。在一較佳實施例中，抗原性序列與載體序列之間之融合係直接融合。在另一實施例中，至少一個胺基酸序列可藉由肽連接體連接於載體異源蛋白序列之N-末端及/或C-末端，其中肽連接體較佳係1至35個胺基酸，較佳為5至20個胺基酸之序列。在一較佳態樣中，肽連接體係(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser) _n、(Gly) _n或(EAAAK) _n，其中n為1至4，較佳為1至3。 核酸、載體及宿主細胞可藉由任一重組技術來製備本發明融合蛋白。因此，本發明之另一態樣係關於含有編碼該融合蛋白之核酸之載體，較佳為表現載體。本發明中所使用之表現載體可提供活體外及/或活體內表現(例如在適宜宿主細胞、宿主生物體及/或表現系統中)。其通常包括如上文所定義之多核苷酸序列及調控序列(例如適宜啟動子、增強子、終止子等)，從而容許將蛋白質產物表現(例如轉錄及轉譯)於宿主細胞或宿主生物體中。本發明載體可呈載體形式，例如質體、黏粒、YAC、病毒載體或轉座子。在一較佳但非限制性態樣中，本發明載體包括i)至少一個如上文所闡述之核酸；其可操作地連結至ii)一或多個調控元件，例如啟動子及視情況選用之適宜終止子；及亦視情況選用之iii)一或多個基因構築體之其他元件，例如3'-或5'-UTR序列、前導序列、選拔標記物、表現標記物/報導子基因及/或可促進或增加轉變或整合(效率)之元件。較佳宿主細胞係大腸桿菌。然而，可使用任一原核或真核表現系統，例如細菌、酵母、絲狀真菌、昆蟲、植物細胞及哺乳動物細胞。較佳載體、啟動子及宿主細胞皆係能夠表現醣基化或非醣基化重組蛋白之載體、啟動子及宿主細胞，例如：用於原核表現之pET26a (具有T7啟動子)或pTrcHis2 (具有trp lac啟動子)質體、用於轉移之pUC19、pUC 57或 pCR4 TOPO質體、及用於蛋白質表現之大腸桿菌BL21 (DE3)或大腸桿菌NiCo21宿主細胞、或僅用於質體擴增之大腸桿菌Top 10。 疫苗調配物將融合蛋白與生理上可接受之媒劑一起、視情況與佐劑組合調配於醫藥組合物中。由此提供包括融合蛋白或至少兩種融合蛋白(其分別包括至少兩個不同抗原性胺基酸序列)之組合與生理上可接受之媒劑之疫苗。在另一實施例中，提供包括編碼該(等)融合蛋白之核酸構築體之疫苗組合物。在一些實施例中，疫苗可包括一或多種醫藥上可接受之媒劑或賦形劑。賦形劑包括本身不會誘導產生抗體且不會傷害接受組合物之個體之組分。適宜賦形劑通常係緩慢代謝之大分子，例如醣、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合胺基酸、胺基酸共聚物、蔗糖、海藻糖、乳糖及脂質聚集體(例如油微滴或脂質體)。熟習此項技術者已熟知適宜醫藥媒劑，包括(但不限於)稀釋劑，例如水、生理鹽水及其他。適宜地，無菌無熱原磷酸鹽緩衝生理鹽水係醫藥媒劑。另外，可包含添加劑，例如潤濕劑或乳化劑、pH緩衝物質及諸如此類。醫藥組合物、免疫原性組合物或疫苗可進一步包括佐劑。「佐劑」係用於增強組合物效能且包括(但不限於)氫氧化鋁(alum)、磷酸鋁、水包油或油包水性乳液、類鐸(Toll-like)受體激動劑、N-乙醯基-降胞壁醯基-L-丙胺醯基- D-異麩醯胺酸(-MDP)、N-乙醯基-胞壁醯基-L-蘇胺醯基-D-異麩醯胺酸(nor-MDP)、PEI、AS01或AS02 (GlaxoSmithKline)、GLA-SE (IDRI)及類似調配物；與業內已知之類似佐劑。亦可使用基於純化角鯊烯及角鯊烷、經高度純化之二縮甘露醇單油酸酯乳化之Montanide®佐劑，包含ISA 51及720。MF59®係佐劑之另一實例，其係角鯊烯、聚氧乙烯山梨醇酐單油酸酯(Tween® 80)及山梨醇酐三油酸酯之水包油性乳液。將疫苗調配成用於擬投與個體之適宜劑量。所投與劑量可隨個體之病狀、性別、體重及年齡、投與途徑及所用佐劑而變化。可使用諸如懸浮液或液體溶液等劑型之疫苗。可將疫苗與如上文所闡述之醫藥上可接受之媒劑一起調配。適宜劑量包括(但不限於)約0.1微克至約100微克，較佳為約1微克至約50微克、仍較佳地1微克至20微克、1微克至15微克或甚至1微克至10微克之本文所闡述之融合蛋白。 接種疫苗免疫原性組合物或疫苗可為對組分/多抗原免疫原性組合物或疫苗。在免疫原性組合物或疫苗預期用於多投與方案(例如初免-加強方案)之情形下，初免組合物可與加強組合物包括相同或不同組合物。然而，初免-加強方案在本發明背景中並非強制性。可藉由任一便利途徑，較佳為非經腸、經肌內、經真皮內、經皮下、經黏膜或經靜脈內投與免疫原性組合物或疫苗。可利用各種技術來進行DNA接種疫苗，例如電穿孔、無針方式(例如顆粒轟擊及高壓遞送)、真皮貼劑、呈微粒或脂質體形式之DNA疫苗調配物。本發明闡述在個體中產生免疫反應之方法，其包括投與有效量之本發明疫苗之步驟。疫苗可預防性投與(亦即預防感染)或用以提供保護且較佳地涉及誘導抗體及/或T細胞免疫性。該方法可產生一級免疫反應、二級免疫反應、加強反應或免疫反應之組合。疫苗意欲在任一階段(包含紅血球前階段(例如肝階段)及/或有性或無性血液階段)對抗瘧疾來保護個體。根據本發明來增加針對瘧原蟲屬抗原之免疫反應之量值及/或記憶。尤其地，本發明之MSP3融合構築體觸發產生抗MSP3嗜細胞抗體，例如IgG1及IgG3抗體。可藉由量測該等抗體之效價來測定保護程度。圖及實例闡釋本發明，而不限制其範圍。實例：先前研究已展示，頻繁瘧疾暴露使得在成人中產生免疫性，此會預防或緩解疾病。此免疫性可藉由投與免疫球蛋白(IgG)自瘧疾免疫成人被動轉移。鑑別出寄生蟲殺死機制，稱為抗體依賴性細胞調介之抑制(ADCI)。藉由ADCI篩選寬基因體DNA庫使得可鑑別裂殖子-表面蛋白3 (MSP3)且隨後鑑別若干其他抗原(包含PEBS)。將嗜細胞抗體鑑別為保護代用品：發現調介ADCI之嗜細胞(結合白血球)抗MSP3抗體 IgG1及IgG3始終與在流行病學研究中於許多不同環境中瘧疾風險之減小有關。該等抗體亦調介針對感染動物中之惡性瘧原蟲之保護。該等研究指示有效免疫反應所具有之特性且指導研發改良之疫苗調配物。基於此，發明者現已展示，與MSP3-LSP (涵蓋MSP3-1之186-271區域之長合成肽)相比，在B細胞及T細胞層面上，融合蛋白CRM97-MSP3將免疫原性增加20-100倍。參見實例 1。使用10倍低之免疫化劑量，可由此達成對來自人類、小鼠及松鼠猴之淋巴球之免疫原性之重大改良及抗體持續時間之主要改良。在紅血球前階段，先前研究已另外展示，可在黑猩猩中藉由LSA3來誘發針對大規模子孢子攻擊之保護效能，該效能取決於很可能抑制LS產生之IFN-γ及預防子孢子侵襲之抗體。在實例 2中，發明者已展示，生物融合體CRM-LSA3構築體強烈增加T細胞及B細胞反應。實例1及2中所獲得之結果已證實可使用來自紅血球階段之其他抗原(例如MSP3-2及MSP3-3與CRM之構築體)再現(參見實例 3)。實例 4提供使用LSA5-CRM構築體之結果。 材料及方法 表現構築體之生成及大腸桿菌中之生物融合蛋白之產生以化學方式合成(GenScript)編碼由去毒白喉毒素CRM197 (在N-末端及C-末端共價連接至瘧疾肽抗原)構成之嵌合免疫原之基因序列(圖1)且密碼子最佳化以在大腸桿菌中產生。分別在5’及3’末端添加用於Nco I及Xho I之限制位點以選殖於表現質體pET-26a (Novagen)中。藉由測序檢查插入穿梭質體pUC57中之序列且加速凍乾(4 µg)。 PP21中之MSP3-1肽(plasmodB acc. Nbr PF3D7_1035400)對應於MSP3-1中之胺基酸(AA) 155至249。已針對CRM197設計其他混合免疫原(表3)。在PP22中，MSP3-1肽藉由MSP3-2肽(MSP3-2之AA 178至257，PlasmodB acc. Nbr PF3D7_1035500)代替。在PP23中，C-末端之MSP3-2肽由MSP3-3肽(MSP3-3中之AA 246至307，PlasmodB acc. Nbr PF3D7_1035600)代替。PP25在兩個CRM197末端含有相同LSA3肽(AA 176至325，PlasmodB acc. Nbr PF3D7_0220000)。表 3：免疫原PP21、PP22、PP23、PP25及LSA5-CRM之物理化學特性

*lsp：長合成肽將大腸桿菌轉移菌株Top 10 (Invitrogen) [F– mcrA Δ( mrr- hsdRMS- mcrBC) Φ80 lacZΔM15 Δ lacX74 recA1 araD139 Δ( ara leu) 7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG]用於選殖分子程序及質體繁殖。在菌株BL21 (DE3) [F – ompT hsdSB( rB– mB) gal dcm(DE3)] (NEB)中表現重組體。使用Nco I及Xho I消解含有混合序列之穿梭質體pUC57 (Genscript)及表現質體pET26a。藉由在電泳之後進行凝膠提取(QIAGEN)來回收插入體及線性化pET26a之帶。將凝膠純化插入體以3之插入體對質體比率接合於pET26a內部。使用接合反應來轉變化學感受態大腸桿菌Top 10且平鋪於皮氏培養皿(Petri dish)中含有50µg/mL卡那黴素(kanamycin)之LB瓊脂培養基中。在含有卡那黴素之液體培養基中挑選6個細菌菌落以用於二氧化矽管柱上之質體小量製備(QIAGEN)。藉由使用資訊性限制酶進行消解來檢查插入體在pET26a中之正確插入( 圖 2)。選拔具有正確限制特徵之質體來轉變BL21 (DE3)細菌。針對6個藉由上述限制酶消解分析之BL21 (DE3)純系來證實使用正確質體之轉變。 小體積細菌培養物中之重組蛋白產生之最佳化在愛倫美氏器皿(Erlenmeyer vessel)中以小培養規模(1 L)分析諸如重組蛋白產生持續時間、誘導劑(IPTG)濃度及溫度等參數。將5 mL穩態過夜培養物稀釋至1 L (1:200)且進一步在30℃下培養至600nm下之光學密度為0,7-0,8。使用兩種IPTG誘導劑濃度：0.1 mM及1 mM在三個溫度：22℃、30℃及37℃下分析重組蛋白表現之誘導。在22℃下過夜培養且藉由0.1 mM IPTG誘導之後獲得最佳重組體產量。在藉由固定金屬親和力層析(IMAC)純化之後獲得1 mg至2 mg重組產物/公升細菌培養物之產量。 PP21 之產生及純化實施研究實驗室規模(1至2公升)之產生以獲得足夠PP21重組蛋白來實施鼠類及靈長類動物模型中之臨床前免疫原性研究。先前已在小規模培養物中確立用於細菌培養及重組蛋白產生之方案。藉由親和力在Ni-NTA樹脂(QIAGEN)上來純化C-末端六組胺酸加標籤重組蛋白PP21。探究在天然或變性條件下之兩種純化程序。實際上，儘管在天然條件中於細菌裂解物不溶性部分中看不到重組蛋白，但亦分析變性條件下之純化以評價三維PP21結構之假定構象效應對組胺酸標籤針對Ni-NTA樹脂上固定Ni ²⁺金屬之可用性的效應。 天然條件下之純化 ：-藉由離心(4000g, 30 min, 4℃)回收細菌細胞。 -將細菌糰粒懸浮於5 mL裂解緩衝液(50 mM NaH ₂PO ₄、300 mM NaCl、10 mM咪唑，pH 8.0)/克生物質中。 -將裂解物在冰上與1 mg/mL溶菌酶一起搖晃30 min。 -藉由530 sec破裂在150 W下使用30 sec冷卻間隔來裂解細菌。 -將裂解物在冰上與5µg/mL DNAse I及10µg/mL RNAse A以及完整組蛋白酶抑制劑(Roche)一起搖晃30 min。 -藉由在10000g、30 min及4℃下離心來清洗裂解物。 -經由0,22 µm篩過濾裂解物且在4℃下於擺盤上以20 mL體積與200 µL Ni NTA樹脂一起培育過夜。 -將樹脂在40 mL體積之裂解緩衝液中深度洗滌5次。將第一步驟上清液(樹脂培育後之裂解物)之等分試樣保存用於分析。離心步驟在200g下不超過5 min。 -藉由在500 µL含有250 mM咪唑之裂解緩衝液中培育樹脂5倍來回收重組蛋白。 -彙集洗脫部分且針對pH 7.3 PBS藉由超濾經由30 kDa篩來進行透析。藉由分光光度法在280 nM下量測蛋白質濃度且進一步藉由如圖3中針對PP21所展示之電泳(SDS-PAGE 10%)及免疫印漬進行表徵。 變性條件下之純化 ：藉由離心(4000g, 30 min, 4℃)回收細菌細胞。將細菌糰粒懸浮於5 mL變性裂解緩衝液(100 mM NaH2PO4、10 mM Tris-Cl、8 M脲、pH 8.0 NaOH)/克生物質中。將裂解物在冰上搖晃30 min。藉由530 sec破裂在150 W下使用30 sec冷卻間隔來進一步裂解細菌。藉由在10000g、30 min及4℃下離心來清洗裂解物。經由0,22 µm篩過濾裂解物且在4℃下於擺盤上以20 mL體積與200 µL Ni NTA樹脂一起培育過夜。將樹脂在40 mL體積之變性裂解緩衝液中深度洗滌5次。將第一步驟上清液(樹脂培育後之裂解物)之等分試樣保存用於分析。離心步驟在200g下不超過5 min。藉由在500 µL含有250 mM咪唑之裂解緩衝液中培育樹脂5倍來回收重組蛋白。彙集洗脫部分且針對pH 7.3 PBS藉由超濾經由30 kDa篩來進行透析。藉由兩種方法所達成之純化產量類似，從而表明親和力組胺酸標籤在天然形式之PP21中具有功能性。在愛倫美氏器皿中以1公升規模於10個以上產生/純化試驗中重複獲得0,7 mg至1mg重組蛋白PP21/公升細菌培養物之產量。圖 3展示藉由IMAC純化之重組蛋白PP21。 PP21 之溫度穩定性藉由西方印漬評價之隨儲存溫度而變化之PP21穩定性展示於圖 4中。在在6℃溫度下儲存於冰箱中21天時段之後觀察到並無降解跡象。在室溫下，PP21開始在相同時段下展示降解跡象，而其在37℃下於8天之後完全降解。然而，此不穩定性不能歸因於假定固有分子不穩定性，此乃因其並非GMP製造產物且其可含有痕量蛋白酶。藉由pET26a表現於大腸桿菌中之重組蛋白之胺基酸序列展示於下文中。括號中之序列係來自表現質體，粗體係來自CRM197白喉毒素。將C-末端用於藉由固定金屬親和力層析(IMAC)純化之六組胺酸加下劃線。 PP21 ；以斜體加下劃線之MSP3-1之序列(PlasmodB ID : PF3D7_1035400)，殘基155至249 (95 aa) [MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAMG] KTKEYAEKAKNAYEKAKNAYQKANQAVLKAKEASSYDYILGWEFGGGVPEHKKEENMLSHLYVSSKDKENISKENDDVLDEKEEEAEETEEEELE GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHKTQPFLHDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDIKITAENTPLPIAGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNGRKIRMRCRAIDGDVTFCRPKSPVYVGNGVHANLHVAFHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQKTVDHTKVNSKLSLFFEIKS K TKEYAEKAKNAYEKAKNAYQKANQAVLKAKEASSYDYILGWEFGGGVPEHKKEENMLSHLYVSSKDKENISKENDDVLDEKEEEAEETEEEELE[ LE HHHHHH] (SEQ ID NO: 85)。 PP22 ；以斜體加下劃線之MSP3-2之序列(PlasmodB ID : PF3D7_1035500)，殘基178至257 (79 aa) [MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAMG] LNNNILGWEFGGGAPQNGAAEDKKTEYLLEQIKIPSWDRNNIPDENEQVIEDPQEDNKDEDEDEETETENLETEDDNNEE GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHKTQPFLHDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDIKITAENTPLPIAGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNGRKIRMRCRAIDGDVTFCRPKSPVYVGNGVHANLHVAFHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQKTVDHTKVNSKLSLFFEIKS LNNNILGWEFGGGAPQNGAAEDKKTEYLLEQIKIPSWDRNNIPDENEQVIEDPQEDNKDEDEDEETETENLETEDDNNEE[ LE HHHHHH] (SEQ ID NO: 86)。 PP23 ；在CRM197之前以斜體加下劃線之MSP3-2之序列(PlasmodB ID : PF3D7_1035500)，殘基178至257 (79 aa)，及在CRM197之後之斜體之MSP3-3之序列(PlasmodB acc. Nbr PF3D7_1035600)，殘基246至307 (61 aa)。 [MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAMG] LNNNILGWEFGGGAPQNGAAEDKKTEYLLEQIKIPSWDRNNIPDENEQVIEDPQEDNKDEDEDEETETENLETEDDNNEE GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHKTQPFLHDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDIKITAENTPLPIAGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNGRKIRMRCRAIDGDVTFCRPKSPVYVGNGVHANLHVAFHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQKTVDHTKVNSKLSLFFEIKS SNEKGRPPTYSPILDDGIEFSGGLYFNEKKSTEENKQKNVLESVNLTSWDKEDIVKENEDVK[ LE HHHHHH] (SEQ ID NO: 87)。 PP25 ；以斜體加下劃線之LSA-3之序列(PlasmodB ID : PF3D7_0220000)，殘基176至325 (150 aa) [MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAMG] SDELFNELLNSVDVNGEVKENILEESQVNDDIFNSLVKSVQQEQQHNVEEKVEESVEENDEESVEENVEENVEENDDESVASSVEESIASSVDESIDSSIEENVAPTVEEIVAPTVEEIVAPSVVESVAPSVEESVEENVEESVAENVEE GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHKTQPFLHDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDIKITAENTPLPIAGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNGRKIRMRCRAIDGDVTFCRPKSPVYVGNGVHANLHVAFHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQKTVDHTKVNSKLSLFFEIKS SDELFNELLNSVDVNGEVKENILEESQVNDDIFNSLVKSVQQEQQHNVEEKVEESVEENDEESVEENVEENVEENDDESVASSVEESIASSVDESIDSSIEENVAPTVEEIVAPTVEEIVAPSVVESVAPSVEESVEENVEESVAENVEE[ LE HHHHHH] (SEQ ID NO: 88)。 LSA5-CRM蛋白序列(SEQ ID NO: 89) IPEEQIEEVIQEEIIEQVVPEELIEEVVPEEIIEEVIPEEIVEEVIYEEVIPEELVEEVIAEKLVKEIVPEQVREEVTLEEIVEEMIPEEFVEEVAPEVEIEEIIPEELIEEVIPEVLVEEAVPEELIEKVI PGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHKTQPFLHDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDIKITAENTPLPIAGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNGRKIRMRCRAIDGDVTFCRPKSPVYVGNGVHANLHVAFHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQKTVDHTKVNSKLSLFFEIKS IPEEQIEEVIQEEIIEQVVPEELIEEVVPEEIIEEVIPEEIVEEVIYEEVIPEELVEEVIAEKLVKEIVPEQVREEVTLEEIVEEMIPEEFVEEVAPEVEIEEIIPEELIEEVIPEVLVEEAVPEELIEKVI PHHHHHH 人類免疫原性小鼠模型 (HIMM)：該模型係基於在免疫缺陷 NOD-SCID-IL-2rγnull (NSG)小鼠中植入人類脾淋巴球(Hu-SPL-NSG)，且補充使用常見實驗室小鼠(例如Balb/C及C57BL)所獲得之資訊。 Balb/c 或 C57Bl/6 小鼠之免疫化及血液採樣使4至5隻Balb/c或C57Bl/6小鼠之組接受2或3次注射之10 µg MSP3-1-LSP或1 µg PP21 (稀釋於100 µl pH 7.2磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)且乳化於100 µl佐劑Montanide ISA 720中)。藉由皮下注射免疫化化且重複一次或兩次(間隔15天)。藉由尾部采血自第二注射之後兩週開始來收集血液且以15天間隔重複直至第一抗原注射之後160天。分離血清且儲存於-20℃下直至使用。使同時平行處置之其他組接受1 µg或0.2 µg PP21。 小鼠血清中之抗 MSP3-LSP 抗體效價之測定在小鼠血清中藉由酶聯免疫吸附分析(ELISA)測定MSP3-LSP特異性抗體效價。使用2µg/ml經PBS稀釋之MSP3-1-LSP或MSP3-1-LSP肽a、b、c或d中之一者在4℃下過夜塗覆平底微量滴定板(Nunc-Thermo Scientific, USA)。在洗滌(PBS, pH 7.2)及飽和(PBS, 3%非脂乳)之後，添加測試血清之連續稀釋液(稀釋於PBS、3%非脂乳、0.05% Tween20中)且培育1小時。陰性對照係由免疫前小鼠血清組成。藉由隨後添加辣根過氧化物酶偶聯之山羊抗小鼠IgG (H+L) (Invitrogen, USA)一小時、隨後添加過氧化物酶受質四甲基聯苯胺(Amresco, USA)來揭示特異性抗體。特異性抗體效價對應於最後正稀釋度之倒數。 人類脾供予及倫理考慮根據National Organization for Organ & Tissues Donation & Transplantation (NOOTDT)，Lebanon之倫理協議自死亡器官移植供體獲得人類脾。由患者自己在其生命期間或在死亡後由其父母簽署供予器官以用於移植或科學研究之知情同意。 人類脾細胞製備如先前所闡述，在手術切除之後24小時內處理人類脾(Brams P, 1998)。簡言之，解剖脾組織且製備細胞懸浮液。使用格氏溶液(Gey’s solution)將紅血球在25℃下裂解5-10 min。在洗滌之後，將白血球再懸浮於由37%胎牛血清(FCS) (Sigma,USA)、10%二甲基亞碸(DMSO) (Sigma,USA)及53% RPMI 1640 (Sigma,USA)組成之培養基中，且然後冷藏保存於液氮中直至使用。自每一脾供體分離之細胞之平均數量為100 ± 40億。 NSG 小鼠中之人類脾細胞之植入及免疫化自Jackson實驗室(USA)獲得NOD.Cg-Prkdcscid-IL2rγtm1WjI /SzJ (NSG)小鼠且飼養於無菌微型隔離器中。在使用之前將所有食物、水、籠及襯墊高壓滅菌。將6-至8週齡NSG小鼠包含於實驗中。將人類脾細胞在第0天以4 × 10 ⁶個細胞/ml與或不與1 µg/ml抗原在補充有10%胎牛血清、1%非必需胺基酸(NEAA 100×)、2 mM麩醯胺酸、2 mM丙酮酸鈉及50 µg/ml慶大黴素(gentamicin) (完全培養基)之RPMI1640培養基中一起培養。所有培養試劑皆係購自Sigma, USA。在第1天，添加25 IU/ml之重組人類IL-2 (Gibco Invitrogen)。在第3天，收穫脾細胞，洗滌且再懸浮於漢克氏平衡鹽溶液(Hank’s Balanced Salt Solution，HBSS)中。使每一NSG小鼠接受30 × 10 ⁶個經抗原引發或未引發之脾細胞之腹膜腔內注射(ip)。在第7天及第21天，使用10 µg經腹膜腔內(ip)注射之於200 µl HBSS-Montanide ISA 720或MF59佐劑(v/v)中之抗原加強重構小鼠(Hu-SPL-NSG)。使用未引發脾細胞重構之小鼠僅接受佐劑。在每一加強之後一週收集血樣。 Hu-SPL-NSG 小鼠血清中之人類 MSP3-1-LSP 特異性抗體之測定藉由ELISA實施該等測定。簡言之，為檢測小鼠血清中之總人類IgG，使用於0.1M pH 9.5碳酸鹽緩衝液中之2.5µg/ml經純化山羊抗人類IgG (H + L) (Invitrogen, USA)在4℃下過夜塗覆平底微量滴定板(Nunc-Thermo Scientific, USA)。在洗滌(PBS, pH 7.2)及飽和(PBS, 3%非脂乳)之後，添加測試血清(稀釋於PBS、3%非脂乳、0.05% Tween20中)且培育1小時。陰性對照係由相同動物之免疫前小鼠血清組成。藉由隨後添加辣根過氧化物酶偶聯之山羊抗人類IgG (H+L) (Invitrogen, USA)一小時、隨後添加過氧化物酶受質四甲基聯苯胺(Amresco, USA)來揭示人類IgG。計算Hu-SPL-NSG小鼠血清中之總人類IgG濃度並與標準人類IgG溶液(Zymed, USA)進行比較。實施相同測試以檢測抗原特異性抗體，只是使用於PBS中之2.5µg/ml MSP3-1-LSP塗覆板。在此情形下，陰性對照係由從未感染瘧原蟲屬之個體之血清組成，而陽性對照係由來自超免疫非洲成人之血清池組成。在兩種情形下，測試每一血清之連續稀釋液以測定抗體效價。對於特異性抗體效價測定而言，在產生高於截止值(陰性對照OD × 2)之吸光度時，測試可視為陽性。使用人類IgG子類之特異性二級小鼠單株抗體(分別以最終稀釋度1/4,000、1/10,000、1/10,000及1/60,000使用純系NL16 [IgG1；Skybio, UK]、HP6002 [IgG2；Sigma-Aldrich, Germany]及Zg4及GB7B [分別係IgG3及IgG4；Skybio, UK))、隨後使用辣根過氧化物酶偶聯之山羊抗小鼠IgG (以1/4000稀釋於PBS中) (Invitrogen)來檢測IgG子類。 藉由實時逆轉錄 PCR (RTqPCR) 來量化不同細胞介素、趨化介素及轉錄因子之基因表現將經免疫化及未免疫化小鼠之脾細胞以2×10 ⁶個細胞/ml於完全RPMI1640培養基中在使用免疫化抗原刺激或不刺激下進行培養。在培養24h之後使用RNeasy Mini套組(Quiagen, Germany)提取細胞RNA。使用RevertAid M-MuLV酶(RevertAid套組第一鏈合成套組，Thermo Scientific Fermentas)在20 µl反應混合物中實施逆轉錄。簡言之，將1 µl寡dT18引子添加至約400 ng總RNA中，混合且在65℃下培育 5 min。將管置於冰上保持數分鐘且短暫離心，然後添加如由製造商所推薦之5×反應緩衝液、Ribolock Rnase抑制劑(20 u/µl)、dNTP (10 mM)及逆轉錄酶(200 u/µl)。將反應混合物在42℃下培育60 min。藉由在70℃下加熱5 min來使酶鈍化。使用定量PCR量測可視為Th1或Treg細胞之特性之不同人類細胞介素、趨化介素及轉錄因子之相對表現。使用如由製造商所推薦之LightCycler 480 SYBR Green Master, La Roche來實施PCR混合物分析。在95℃下於LightCycler 480機器(La Roche)中實施PCR擴增5 min (1個循環)，隨後進行45個循環之95℃、10 sec培育及55-57℃、10 sec培育。一式三份運行每一試樣。用作內部參考之管家基因係貝塔-肌動蛋白(β-肌動蛋白)及次黃嘌呤磷酸核糖基轉移酶1 (HPRT1) (geNorm分析)。基於所產生PCR曲線來計算循環臨限值(Ct)值。藉由2ΔΔCt方法計算相對表現程度。 免疫螢光分析。使用來自主要含有惡性瘧原蟲(3D7)之成熟裂殖體之紅血球培養物之風乾、丙酮固定之薄塗片來免疫化螢光分析。將稀釋於PBS–1%牛血清白蛋白中之Hu-SPL-NSG血清在37℃下於濕潤室中培育1 h。在使用PBS洗滌之後，藉由使用在PBS中稀釋至1/400之Alexa Fluor偶聯山羊抗小鼠IgG (Molecular Probes及Invitrogen)利用伊文思藍色對比染色(Evans blue counterstain) (1/200)來檢測抗體。結論實例 1 ： PP21 (CRMP97-MS3 融合構築體 ) 之免疫原性在下列動物模型中評價由PP21誘導之免疫反應： • BALB-C小鼠 • C57BL小鼠 • 松鼠猴 •人類免疫原性小鼠模型(HIMM)，其中在活體內對來自免疫受損NSG小鼠中所移植之人類脾組織之細胞免疫化且使用來自免疫化動物之血清及細胞用於免疫分析。所有實驗皆係以對比方式利用臨床實驗中所使用之基準抗原MSP3-LSP (涵蓋MSP3-1之186-271區域之長合成肽)且使用Montanide ISA 720來實施，此乃因實驗室小鼠通常難以對氫氧化鋁具有反應且HIMM中之注射途徑不容許使用氫氧化鋁，且主要係由於旨在比較構築體而非佐劑，從而知曉在人類中，呈MSP3 LSP形式之氫氧化鋁佐劑化CRM (以腦膜炎球菌或肺炎球菌疫苗形式)提供極良好反應。然而，亦在實驗室小鼠中使用氫氧化鋁實施成功免疫化，其在Balb/C中產生＞ 25600之效價(即使在兩次免疫化之後)，且在C57bl中產生3200-25600之效價(圖19)。 與小鼠中之 MSP3-LSP 相比， 使用本發明之 PP21 生物融合體 MSP3-1 構築體可觀察到免疫原性之重大改良。PP21在所使用所有模型中誘導高於基準抗原MSP3-LSP之靶嗜細胞子類之血清學反應。 1. 低劑量極為有效：對於其他CRM偶聯疫苗而言，獲得免疫原性之巨大增加，從而指示融合程序產生與化學偶聯同等有效之產物。易於採用顯著較低劑量，此使得可比較僅1 µg PP21與10 µg參考MSP3-LSP (過去，發現10 µG與臨床中所採用之15 µG在實驗室小鼠中並不顯著不同)。藉由不同方式測定該等差異，參見圖6至9。使用4個不同批次之PP21在4組Balb/C及C57bl小鼠中可再現結果。使用PP21之其他劑量發現著眼於較低劑量，例如在小鼠及松鼠猴中探究0.2 µg以及1 µg。高免疫原性亦引導探究僅2次(與3次相比)免疫化。 2. ADCI靶之識別之較寬廣度：含於疫苗構築體內之肽「b」、「c」及「d」定義由在ADCI中有效之抗體靶向之不同B細胞表位。分別在1 µg及10 µg下，與當前的MSP3-1-LSP (左側圖)相比，在使用PP21接種疫苗之小鼠之血清中與該等肽之反應性較高，如圖9 (右側圖)中所展示，從而表明在使用PP21時ADCI靶識別之量值及廣度較高且較寬。與此發現一致，主要經由肽«b»及«c-d»展現交叉反應之MSP3家族之6個成員之識別模式在使用PP21時較寬。此亦意指，由PP21誘發之抗體將經由與裂殖子表面上之6種(且並非僅一種)蛋白質之抗體橋觸發來觸發ADCI。 3. 人類淋巴球中之極高B細胞反應：更重要的是，人類B細胞反應(如在HIMM模型中所評價)展示類似重大改良且免疫原性增加40-100倍。(圖10)。在平行實驗中，使用PP21以及96個胺基酸之當前MSP3-LSP，使用1 µg PP21之抗體效價高於使用10 µg MSP3-LSP20至100倍。在3組各5隻屬於3 HLA種類之動物可再現結果。 4. 在使用Montanide ISA720或MF59作為佐劑時，結果亦可再現(圖14) 5. 在活體外使用寄生蟲組分MSP3-LSP攻擊人類淋巴球時，獲得高IFN-γ分泌 (圖11)。此重要結果指示，CRM Th表位並不優先於瘧原蟲屬特異性MSR3 T細胞表位且由此在藉由寄生蟲攻擊時預計可自接種疫苗個體獲得T輔助細胞，從而有較大機會在需要時快速產生回憶性抗體。細胞介素特徵之詳細分析指示，具反應細胞主要係T輔助細胞類型1 (圖12展示使用CXCL10及Tbet獲得之結果之實例) 6. 嗜細胞IgG1之主導性：同型研究揭示(如使用強Th1反應所預計)幾乎完全有IgG1 (其亦係MSP3-LSP免疫化個體中之主導同型)構成之嗜細胞同型之較大主導性。此可見於使用Montanide或MF59作為佐劑時(圖15及16)。儘管該等結果係在人類模型中所獲得，但其可重複預測可在志願者中誘發之將來反應。 7. 與天然寄生蟲蛋白之反應性：在IFAT(圖13)及西方印漬中使由PP21接種疫苗誘發之抗體與寄生蟲天然蛋白進行反應。抗體反應性(不僅與合成抗原，且主要與寄生蟲蛋白)係在瘧疾攻擊期間活化ADCI防禦機制及適當加強天然寄生蟲攻擊之抗體反應之關鍵特徵。 8. 極低免疫化劑量較為有效：評價0.2 µg及1 µg/免疫化且與10 µg MSP3-LSP 進行比較(圖17)。在1 µg劑量之PP21下，在第2免疫化之後達到平穩，而在0.2 µg劑量下，需要第三免疫化方達到大致相同之高抗體濃度，且一隻動物不具有反應。然而，1 µg特徵指示，2次免疫化可足夠，且由此可值得探究。 9. 在南美松鼠猴中觀察到類似高免疫原性(圖20)：使用1 µg及0.2 µg由Montanide 720佐劑化之PP21來對通常對免疫化之反應較差之南美靈長類動物免疫化。在1 µg下達到接近小鼠中所看到之效價之高反應(參見圖18)且在0.2 µg下效價低約5倍(未展示)。儘管同一實驗中之效價對比尚未由巴西同事實施，但MSP3 LSP在用於此模型中時具有極差免疫原性。 10. 免疫反應之持續時間得以顯著改良(圖8之上圖及下圖)：長期分析展示基本組分之顯著改良；抗體反應之持續時間：在免疫化後隨訪藉由PP21或LSP免疫化之小鼠6個月。效價之衰減係漸進性，但較為緩慢，從而在6個月時，剩餘效價高於使用 MSP3-LSP所獲得之最大值。使用PP21在6個月以上時剩餘之效價在1/200 000 – 1/300 000範圍內，與之相比，使用當前MSP3-LSP之範圍約為1/50 000。實例 2 ： PP25 (CRMP97-LSA3 融合構築體 ) 之免疫原性LSA3係紅血球前階段抗原，其具有許多有吸引力之特徵，藉由經保護對未保護志願者之差異反應發現，其在菌株中較為保守，其在大量動物(包含高級靈長類動物及黑猩猩)中具有高度抗原性及免疫原性，且隨後誘導針對子孢子階段之人類寄生蟲惡性瘧原蟲之大規模攻擊之免疫反應保護。保護與抗原特異性干擾素γ反應有關。將PP25之免疫原性與使用LSA3但並無偶聯或任一融合之對照構築體(DG729)進行比較。免疫化及免疫分析之條件與上文使用PP21所闡述相同。如針對PP21中之MSP3之情形，使用LSA3-CRM97生物融合體(甚至使用低劑量抗原)觀察到抗體反應之類似顯著增加。亦可看到IFN-γ反應之增加，但顯著性較小，此乃因不含載體之LSA3 (DG729)已係IFN-g反應之極良好誘導劑。在人類免疫原性模型中亦證實balb/C及C57bl小鼠中所記錄之增加。另外，抗LSA3抗體效價與子孢子階段之惡性瘧原蟲寄生蟲之抑制之間展示極強關聯。參見圖 21-26中所展示之結果。實例 3 ： PP23 (MSP3-2-CRMP97-MSP3-3) 融合構築體之免疫原性已證實，使用PP21 (其依賴於MSP3-1與CRM及與LSA3之融合)所獲得之結果可使用來自紅血球階段之其他抗原(例如MSP3-2及MSP3-3與CRM之構築體，稱為PP23)來再現。實際上，藉由構築體PP23 (MSP3-2-CRMP97-MSP3-3)在HIMM模型中所移植之人類淋巴球中誘發強B細胞及T細胞反應( 圖 27)，效價平均高於藉由於Montanide中之單獨MSP3-2 CT免疫化之小鼠10倍。抗體子類主要係IgG1種類，其係能夠與單核球在ADCI機制中協同作用之主要嗜細胞種類。類似地，誘導強T細胞反應，如藉由在活體外由MSP3-2或MSP3-3再刺激之PP23免疫化人類淋巴球之IFN-γ分泌所量測。實例 4 ： LSA5-CRM肝階段抗原-5 (LSA5) (亦稱為PEBS (紅血球前及血液階段抗原)或SR 11.1 (11.1惡性瘧原蟲基因之子區))在單一分子中組合MSP3及LSA3之特徵。其含有使其不同於mega-gene Pf 11.1之其餘部分之獨特序列，且在菌株中完全保守。其由來自經輻射-減毒之子孢子免疫之志願者之血清識別且因其誘導針對紅血球前及無性血液階段之保護而較為獨特。其表現於紅血球前及血液階段中。藉由以下方式來證實LSA5針對紅血球前階段之保護作用：彙聚性活體外侵襲抑制研究，藉由被動轉移抗LSA5抗體所達成之活體內保護，及藉由使用重組LSA5接種疫苗來防止攻擊之靈長類動物中之概念證據研究。對於血液階段而言，天然人類及人工誘導之動物抗Pf LSA5抗體施加殺死寄生蟲之ADCI調介之效應。在來自病區之個體中之抗原性較高，其中IgG3抗體在具有傳染免疫(亦即暴露誘導之保護)之個體中佔主導地位。大量流行病學研究發現與針對臨床瘧疾攻擊之保護之密切關聯及經藥物治療之腦瘧疾之改良預後。最後，LSA5具有高度免疫原性，從而達成小鼠中之顯著較高效價及大於來自MSP3免疫化小鼠之血清之ADCI活性。將LSA5與CRM197之生物融合體(其原理類似於先前3個實例)表現於大腸桿菌中，證實其抗原性且實施初級免疫原性研究。在使用與CRM之融合體時，LSA5免疫原性極高(圖28)；在BALb/c小鼠(n=5)中比較1 µg與10 µg劑量之生物融合體LSA5-CRM/Montanide ISA720之免疫原性。實驗條件類似於在圖8中使用MSP3所闡述者。在第0、14及28天(箭頭)藉由生物融合體LSA5-CRM /Montanide ISA720免疫化。藉由ELISA滴定利用LSA5-LSP作為抗原使用在第0、7、21、42天收集之血清來實施血清抗體檢測。

圖 1係PP21 (亦稱為「生物融合體MSP3-1」)之編碼序列之代表圖。鹼基對之標度自Nco I位點開始展示於下文中。圖 2展示pET26a-PP21質體圖(A)、藉由限制酶消解使用Sma I (B)或Eco R I (C)進行之小量製備分析。圖 3 ：藉由IMAC純化之重組蛋白PP21。(A)藉由電泳在變性條件及考馬斯藍色染(Coomassie blue)下進行之分析。(B)藉由西方印漬(Western blotting)使用鼠類抗MSP3免疫血清在1:1000稀釋下評價之抗原性。所觀察上區帶與全長PP21之84 kDa之理論分子量一致。37 kDa處之另一帶(在較小程度上由抗MSP3免疫血清充分識別)可對應於PP21之降解片段。圖 4 ：藉由西方印漬使用抗MSP3-1 mAb RAM1在1:1000稀釋下所評價在不同儲存溫度下之PP21穩定性之時間量表。圖 5 ：與陽性對照MSP3-LSP相比所測定之PP21抗原含量。藉由與大量人類及動物抗MSP3血清(包含人類重組抗體)之反應性來測定臨床前PP21之抗原性。抗原含量提供反應性表位之量之較精確量度。其係藉由用於Elisa分析中之塗層之抗原連續稀釋液來實施且藉由充分定義之陽性對照(此處係藉由MSP3之C-末端區域免疫化之大鼠之集合)予以揭示。PP21之反應性與MSP3合成及重組構築體相同。圖 6 ：在藉由生物融合體MSP3-1偶聯物免疫化2次後於小鼠中所誘導之特異性抗體反應與當前MSP3-1-LSP相比之顯著改良。使用於Montanide ISA720中之僅1 µg生物融合體MSP3-1或10 µg MSP3-1 LSP在第0、14及28天對5隻(BALB/c)或4隻(C57BL/6)小鼠之組免疫化。在第2注射之後一週(亦即在第21天) (A)及在第3免疫化之後一週(亦即在第35天)收集血樣。藉由ELISA測定特異性MSP3-1 LSP抗體效價。單獨展示每一小鼠(1至5)之結果(此處係在僅兩次免疫化之後)。圖 7 ：在藉由生物融合體MSP3-1免疫化2次及3次後於小鼠中所誘導之抗體反應與當前MSP3-1-LSP 之對比。第三注射加強抗體反應且證實生物融合體MSP3-1在C57Bl/6小鼠及Balb/c小鼠中之較佳免疫原性。藉由1 µg生物融合體MSP3-1之3次注射誘導之MSP3-1-LSP特異性抗體之平均效價在C57Bl/6及Balb/c中分別達到3×10 ⁵及2×10 ⁵；而10 µg MSP3-1-LSP之3次注射在C57Bl/6及Balb/c小鼠中分別誘導最大10 ⁵及2.5×10 ⁴之平均效價。圖 8：藉由生物融合體MSP3-1在小鼠中所誘導之MSP3-1特異性抗體之持續時間與當前MSP3-1-LSP相比之重大改良。 A及B：生物融合體MSP3-CRM與MSP3-1-LSP之對比：使用於Montanide ISA720中之僅1 µg生物融合體MSP3-1或10 µg MSP3-1 LSP在第0、14及28天對BALB/c (A-上左圖)及C57BL/6 (B-上右圖)小鼠免疫化。在隨訪中之不同日期收集血樣。藉由ELISA測定特異性MSP3-1 LSP抗體效價。所展示結果對應於在不同日期於每一組小鼠中所獲得之抗MSP3-1 LSP抗體效價之幾何平均值。在160天隨訪之後，生物融合體-MSP3-1偶聯物免疫小鼠中之平均抗體效價在C57bl/6及Balb/c中分別為1.5×10 ⁵及10 ⁵，其至少高於藉由MSP3-1-LSP誘導且在第一免疫化之後第160天量測之抗體之平均效價10倍。 C及D：藉由MSP3-CRM誘發之免疫反應之長期持久性：藉由在第0、14及103天經皮下注射在Montanide ISA 720佐劑(v/v)中佐劑化之1µg生物融合體MSP3-CRM來對Balb/c及C57Bl6小鼠(4至5隻小鼠/組)之組免疫化。在不同日期收集血樣。藉由ELISA測定特異性MSP3抗體效價。結果展示，在兩次免疫化之後效價顯著增加且在第49天達到最大，而第三抗原注射(實施於第103天)不誘導抗體反應量值之任何可檢測增加。該等特異性抗體僅隨時間略微降低，且即使在免疫化之後第540天仍可以高效價檢測到。 E：在僅2次免疫化之後藉由MSP3-CRM誘發之免疫反應之長期持久性。就在僅兩次免疫化之後觀察之滿意反應而言，在藉由皮下注射僅在第0及14天使用2µg在Montanide ISA 720 (v/v)中佐劑化之生物融合體MSP3-CRM免疫化之其他17隻Balb/c小鼠中分析此免疫化方案。在不同日期收集血樣。藉由ELISA測定特異性MSP3-1-LSP抗體效價。結果展示，MSP3抗體效價在兩個抗原注射之後有所增加且在所有小鼠中於第42與72天之間達到最大，且展示在380天實驗隨訪中免疫反應僅適當降低。圖 9：與MSP3-1-LSP相比，在使用生物融合體MSP3-1免疫化之小鼠中誘導之抗體對MSP3-1 ADCI (Ab依賴性細胞抑制)靶表位之改良識別。在MSP3-1-LSP中，肽「b」、「c」及「d」定義由在ADCI分析中有效之抗體靶向之不同B細胞表位，其與抗MSP3-1抗體之保護效應相關。為評估生物融合體MSP3-1誘導抗體靶向該等表位之能力，藉由ELISA測定抗體對血清中之肽a、b、c及d之效價。因此，由新穎調配物識別之ADCI靶數相當大且具有較高效價。使用於Montanide ISA720中之僅1 µg生物融合體MSP3-1或10 µg MSP3-1 LSP在第0、14及28天對BALB/c及C57BL/6小鼠免疫化。在第3免疫化之後一週(亦即在第35天)收集血樣。以1/400稀釋小鼠血清且藉由ELISA測定不同MSP3-1肽(a、b、c及d)之特異性抗體之效價。所展示結果對應於使用每一測試小鼠之血清獲得之光學密度。圖 10 ：使用1 µg生物融合體MSP3-1、10 µg當前MSP3-1 LSP或10 µg MSP3-1 C-末端重組蛋白免疫化之HIMM模型(人類免疫原性小鼠模型)中之人類抗體反應。向NOD.Cg - Prkdc ^scid- IL2rg ^tm1WjI/SzJ (NSG)小鼠中植入在活體外經1 µg/ml抗原(4隻小鼠/組)刺激或未刺激之人類脾細胞。使每一NSG小鼠接受30 × 10 ⁶個經抗原引發或未引發之脾細胞之腹膜腔內注射(ip)。在第7及21天，使用1 µg生物融合體MSP3-1或10 µg MSP3-1-LSP或10 µg MSP3-1 C-末端重組蛋白加強重構小鼠。使用Montanide ISA 720 (v/v)將所有抗原佐劑化且經腹膜腔內(ip)進行注射。使用未引發脾細胞重構之小鼠僅接受佐劑。在每一免疫化之後一週收集血樣。藉由總IgG及特異性IgG ELISA來分析特異性抗體。使用下式計算經調節特異性抗體效價：(抗原特異性抗體效價/總人類IgG濃度) × 10 (10 mg/ml可視為平均人類總IgG濃度)。表示出ELISA效價之幾何平均值(95 % CI)。圖 11 ：使用1 µg生物融合體MSP3-1、10 µg當前MSP3-1 LSP或10 µg MSP3-1 C-末端重組蛋白免疫化之HIMM模型(Hu淋巴NSG小鼠)中之人類IFN-γ細胞反應。免疫化條件與上文相同。藉由IFN-γ ELISPOT評估細胞反應。在第28天，回收每一組小鼠之脾細胞，彙集且在活體外使用或不使用抗原刺激進行培養。所展示結果對應於使用每一組小鼠獲得之特異性斑點形成細胞(SFC)。圖 12 ：HIMM中之T細胞反應：藉由1 µg生物偶聯物PP21或10 µg MSP3-LSP免疫化之小鼠中之移植人類淋巴球中之CD4-Th1反應的顯著改良。圖 13 ：在使用生物融合體MSP3-1免疫化之HIMM模型中誘發之人類抗體對寄生蟲天然蛋白之改良識別。向NSG小鼠中植入人類脾細胞且使用1 µg生物融合體MSP3-1、10 µg當前MSP3-1 LSP或10 µg MSP3-1 C-末端重組蛋白免疫化(如圖6中所闡述)。藉由免疫螢光抗體測試(IFAT)在3D7惡性瘧原蟲(Pf)感染之紅血球上評估第28天小鼠血清中之人類抗體與寄生蟲蛋白之反應性(其係在瘧疾攻擊期間活化ADCI防禦機制之關鍵特徵)。所展示結果對應於使用每一組小鼠獲得之效價範圍。圖 14 ：使用1 µg生物融合體MSP3-1免疫化之HIMM模型中所誘發之人類抗體反應不取決於疫苗製劑中所使用之佐劑。(A)向NSG小鼠中植入衍生自兩個不同供體且使用1 µg經Montanide ISA720佐劑化之生物融合體MSP3-1進行刺激或並不刺激之人類脾細胞(如圖6中所闡述) (4隻小鼠/組/供體)。(B)向NSG小鼠中植入使用1 µg經MF59而非Montanide ISA720佐劑化之生物融合體MSP3-1進行刺激(9隻小鼠)或並不刺激(8隻小鼠)之人類脾細胞(如圖6中所闡述，但使用來自不同供體之人類淋巴球)。在兩種情形下，藉由ELISA在第28天測定特異性MSP3-1 LSP抗體效價。所展示結果對應於使用每一組小鼠獲得之ELISA效價之平均值 ± SD。圖 15 ：使用經Montanide ISA720佐劑化之生物融合體MSP3-1免疫化之HIMM模型中之人類淋巴球中所誘發人類IgG抗體之抗體子類。向NSG小鼠中植入使用1 µg MSP3生物融合體刺激或並不刺激之人類脾細胞(如圖10中所闡述)。以1/20稀釋在第28天收集之小鼠血清。藉由子類IgG ELISA測定特異性MSP3-1 LSP抗體效價。所展示結果對應於使用經免疫化小鼠及未免疫化小鼠獲得之光學密度之平均值± SD。圖 16 ：使用經MF59佐劑化之生物融合體MSP3-1免疫化之HIMM模型中所誘發人類IgG抗體之子類。向NSG小鼠中植入使用1 µg經MF59佐劑化之生物融合體MSP3-1刺激或並不刺激之人類脾細胞(如圖14中所闡述)。以1/20稀釋在第28天收集之小鼠血清。藉由子類IgG ELISA在具反應小鼠之血清中測定特異性MSP3-1 LSP抗體效價。所展示結果對應於使用經免疫化小鼠及未免疫化小鼠獲得之光學密度之平均值± SD。兩種佐劑皆獲得嗜細胞子類IgG1之主導性。圖 17 ：0.2 µg或1 µg PP21在Balbc小鼠 PP21-montanide (上左及上右)或相同劑量在C57bl小鼠(下圖左及下右圖)中之免疫原性。如圖6-8中來測定抗MSP3-1-LSP抗體效價之演變。圖 18 ：藉由PP21誘發之抗MSP3-1抗體與MSP3蛋白質家族之其他成員之交叉反應性(藉由ELISA測得之OD值)。使C57Bl/6 (C)及Balb/c (B)小鼠接受2次注射(J0、J14)之4µg PP21。在第63天收集試樣。圖 19 ：在C57BL(C)及Balb/C小鼠(B)中由氫氧化鋁佐劑化之PP21在1 µg劑量/免疫化下之免疫原性。展示在2次免疫化或3次免疫化後藉由ELISA在C57BL (C)及Balb/C小鼠(B)中測得之抗體效價。未測試高於25:600之稀釋度。應注意，氫氧化鋁在人類中係產生高Th1反應之強力佐劑，與之相反，其在齧齒類動物中通常係較差佐劑，且仍與PP21一起誘導強力反應。圖 20.南美松鼠猴中之生物融合體偶聯物PP21之高免疫原性。藉由1µg由MontanideI Isa 720佐劑化之PP21 (在第0、28及112天經皮下投與)對出生於Primate Center of Belem, Brasil之動物屋中之籠中之南美松鼠猴免疫化(虛線，與僅接受Montanide之對照(直線)相比)。藉由ELISA針對MSP3-LSP抗原以及藉由IFAT及WB測定抗體(未展示)。即使在每次免疫化僅使用0.1µg抗原時，免疫反應約低5倍，亦即仍極顯著(未展示)。圖 21 ：藉由LSA3-CRM (PP25)與LSA3-729在接受1µg PP25與Montanide ISA720或10µg LSA3-729與Montanide ISA720之Balb/C小鼠中所誘發之抗體反應。在第0、7、28天免疫化，在第45天收集血清。圖 22 ：LSA3-CRM (PP25)與LSA3-729免疫化Balb/C小鼠(在活體外藉由DG 729攻擊)中所誘發之IFNγ (ELISPOT)。圖 23 ：HIMM中之抗LSA3-729人類抗體反應及結果之改良再現性：使用來自兩個人類供體«A»及«B»之淋巴球在HIMM中對LSA3-CRM構築體PP25之抗LSA3-729人類抗體反應圖 24 ：藉由PP25誘發之免疫反應之持續時間之改良。圖 25 ：研發用於HuH7.5中之惡性瘧原蟲肝階段發育之新穎宿主細胞且與人類原代肝細胞(HPH)進行比較。該圖展示在感染子孢子之後第4、5及7天肝裂殖體之經小鼠多株抗PfHsp-70免疫染色之代表性試樣。放大率：400倍，比例尺：10 µm。在第7天於HPH中難以發現滿意LS。然後將此肝細胞瘤模型用於功能分析中以量測能夠抑制子孢侵襲子至肝細胞中之抗體。圖 26 ：抗Pf LSA3抗體對Hu7.5肝細胞瘤細胞中之子孢子侵襲之抑制(ILSDA)。展示天然蛋白質上之抗LSA3反應性之間之關聯(藉由IFAT分析)以及肝階發育期抑制分析(ILSDA)中之功能抑制效應。較小圖形展示使用抗環子孢子mAb 2A10之相同分析。圖 27：在HIMM模型中所移植之人類淋巴球中藉由構築體PP23 (MSP3-2-CRMP97-MSP3-3)誘發強B及T細胞反應。上圖(A)展示抗體反應，中間圖(B)展示同型分佈，其主要係IgG1種類，主要嗜細胞種類能夠與ADCI機制中之單核球協同作用。下圖(C)展示藉由在活體外藉由MSP3-2或MSP3-3再刺激之IFN-γ之分泌評估之T細胞反應。圖 28 ：BALb/c小鼠(n=5)中之1 µg與10 µg劑量之生物融合體LSA5-CRM/Montanide ISA720之免疫原性。實驗條件類似於圖8中所闡述者。在第0、14及28天(箭頭)藉由生物融合體LSA5-CRM/Montanide ISA720免疫化化。藉由ELISA滴定利用LSA5-LSP作為抗原使用在第0、7、21、42天收集之血清來實施血清抗體檢測。

Claims

一種生物融合體經純化瘧疾疫苗，其包括由特定抗體及/或淋巴球辨識之瘧原蟲屬(Plasmodium)抗原性胺基酸序列，該序列與源自微生物毒素之非寄生免疫原性分子融合，該生物融合體經純化瘧疾疫苗於體內引起抗瘧原蟲屬感染之特定免疫反應及保護性免疫學反應。
如請求項1之疫苗，其中該非寄生免疫原性分子係選自由以下組成之群：白喉類毒素之交叉反應材料(CRM)、白喉類毒素(D)、無毒突變重組銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)胞外蛋白A(repA)、腦膜炎球菌外膜蛋白複合物(OMPC)、破傷風類毒素(T)、流行性感冒嗜血桿菌蛋白D(H.influenza protein D，hiD)及其免疫原性片段。
如請求項2之疫苗，其中該非寄生免疫原性分子係CRM197或其免疫原性片段。
如請求項3之疫苗，其中該片段係選自由以下組成之群：CRM197之片段A、跨膜結構域T、受體結合結構域R、CRM197之胺基酸序列1至190及CRM197之胺基酸序列1至389。
如請求項1至4中任一項之疫苗，其中該抗原性胺基酸序列係由紅血球階段之瘧原蟲屬表現之抗原性蛋白或其表位片段。
如請求項5之疫苗，其中該抗原性胺基酸序列係選自由以下組成之群：MSP3、LSA5(亦稱為PEBS或11-1之子區)、Glurp R0及R2、SERP、P27及P27A、P45、P90及P77、P14、P181、MSP1-區2、MSP2、GBP 130、蛋白質332、蛋白質11-1、MSP4或其任一表位片段。
如請求項6之疫苗，其中該抗原性胺基酸序列係MSP3或其表位片段。
如請求項7之疫苗，其中該片段涵蓋選自MSP3-1、MSP3-2、MSP3-3、MSP3-4、MSP3-7及MSP3-8之瘧原蟲屬MSP3蛋白之C-末端區域之基序a、b、c、d、e及/或f。
如請求項8之疫苗，其中該瘧原蟲屬MSP3蛋白係MSP3-1。
如請求項1至4中任一項之疫苗，其中該抗原性胺基酸序列係由紅血球前階段之瘧原蟲屬表現之抗原性蛋白或其表位片段。
如請求項10之疫苗，其中該抗原性胺基酸序列係選自由以下組成之群：LSA3、LSA5(亦稱為PEBS或11-1之子區)、CS、Trap及Salsa及其任一表位片段。
如請求項1至4中任一項之疫苗，其中該抗原性胺基酸序列係選自由以下組成之群：Pf25、Pf45/48、Rh5、AMA1、MSP1-19、MSP1-42、 MSP2、MSP4-5、Var CSA及其任一表位片段。
如請求項1至4中任一項之疫苗，其包括作為該抗原性胺基酸序列之MSP3、LSA3、LSA5或其表位片段，其融合至作為該非寄生免疫原性分子之CRM197或其免疫原性片段。
如請求項13之疫苗，其中該MSP3係MSP3-1。
如請求項1至4中任一項之疫苗，其中該抗原性胺基酸序列係選自SEQ ID NO：1至80。
如請求項1至4中任一項之疫苗，其包括兩個各自位於該非寄生免疫原性分子之C-末端及N-末端或皆位於相同末端之抗原性胺基酸序列。
如請求項1至4中任一項之疫苗，其中該抗原性胺基酸序列藉由肽連接體連接於該非寄生免疫原性分子之N-末端及/或C-末端。
如請求項17之疫苗，其中該肽連接體係1至35個胺基酸之序列。
如請求項18之疫苗，其中該肽連接體係5至20個胺基酸之序列。
如請求項17之疫苗，其中該肽連接體係(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)_n、(Gly)_n或(EAAAK)_n，其中n為1至4。
如請求項20之疫苗，其中n為1至3。
一種核酸構築體，其編碼如請求項1至21中任一項所定義之生物融合體。
一種載體，其在表現盒中包括如請求項22之核酸構築體。
一種宿主細胞，其中已插入如請求項23之載體。
一種製備如請求項1至21中任一項所定義之生物融合體之活體外方法，該方法包括容許如請求項24之宿主細胞在誘導表現如請求項22所定義之核酸構築體之條件下繁殖，及收集所表現之該生物融合體。
一種疫苗，其包括如請求項1至21中任一項所定義之生物融合體、或至少兩種分別包括至少兩個不同抗原性胺基酸序列之如請求項1至21中任一項所定義之生物融合體之組合、或如請求項22所定義之編碼該(等)生物融合體之核酸構築體，與生理上可接受之媒劑。
如請求項26之疫苗，其用於對人類個體接種疫苗來對抗瘧疾。
一種如請求項1至21及26中任一項之疫苗之用途，其用以製造用於對人類個體接種疫苗來對抗瘧疾之藥物。