MXPA05000811A

MXPA05000811A - Npcili(npc3) y metodos de uso del mismo.

Info

Publication number: MXPA05000811A
Application number: MXPA05000811A
Authority: MX
Inventors: Michael P Graziano
Original assignee: Schering Corp
Priority date: 2002-07-19
Filing date: 2003-07-17
Publication date: 2005-04-19
Also published as: WO2004009772A3; WO2004009772A2; JP2010142238A; JP2006517085A; AU2003252026A8; AU2003252026A1; CA2492017A1; EP1572954A2; JP2006314325A; US20040093629A1; EP1572954A4

Abstract

La presente invencion provee polipeptidos y polinucleotidos de NPCIL1 de rata y de raton que codifican los polipeptidos, tambien se proveen metodos para detectar agonistas y antagonistas de NPC1 LI; los inhibidores de NPC1 Li se pueden utilizar para inhibir la absorcion intestinal de colesterol en un sujeto.

Description

NPC1 L1 (NPC3) Y METODOS DE USO DEL MISMO Esta solicitud reclama el beneficio de la Solicitud de Patente Provisional de los E.U.A. No. 60/397,442; presentada el 19 de julio del 2002 la cual se incorpora en la presente invención como referencia en su totalidad.

CAMPO DE LA INVENCION La presente invención incluye polipéptidos y polinucleótidos de NPC1 L1 los cuales codifican los polipéptidos junto con los métodos de uso de los mismos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Un factor principal para el desarrollo de la enfermedad vascular, una causa importante de muerte en naciones industrializadas, es el colesterol elevado en suero. Se estima que 19% de los norteamericanos entre las edades de 20 y 74 de edad tienen niveles elevados de colesterol en suero. La forma más prevalente de enfermedad vascular es la arterioesclerosis, una condición asociada con el engrosamiento y endurecimiento de la pared arterial. La arterioesclerosis de los vasos sanguíneos grandes se refiere como ateroesclerosis. La ateroesclerosis es el factor subyacente predominante en los trastornos vasculares tales como enfermedad arterial coronaria, aneurisma aórtico, enfermedad arterial de las extremidades inferiores y enfermedad cerebrovascular. Los ésteres de colesterilo son un componente principal de las lesiones ateroscleróticas y son la forma principal de almacenamiento del colesterol en las células de la pared arterial. La formación de ésteres de colesterilo también es un paso en la absorción intestinal del colesterol de la dieta. Por lo tanto, la inhibición de la formación del éster de colesterilo y la reducción del colesterol en suero pueden inhibir la progresión de la formación de la lesión aterosclerótica, disminuir la acumulación de los ésteres de colesterilo en la pared arterial, y bloquear la absorción intestinal del colesterol de la dieta. La regulación de la homeostasis del colesterol en todo el cuerpo en mamíferos y animales implica la regulación de la absorción del colesterol intestinal, el tráfico del colesterol celular, el colesterol de la dieta y la modulación de la biosintesis del colesterol, la biosíntesis de ácido biliar, la biosíntesis de esteroide y el catabolismo de las lipoproteínas plasmáticas que contienen colesterol. La regulación de la absorción del colesterol intestinal ha demostrado ser un método efectivo por medio del cual se regulan los niveles de colesterol en suero. Por ejemplo, un inhibidor de la absorción del colesterol, la ezetimiba ( ), ha demostrado ser efectiva a este respecto. La identificación de un blanco génico a través del cual actúa la ezetimiba es importante para entender el procedimiento de la absorción del colesterol y para el desarrollo de otros inhibidores novedosos de la absorción. La presente invención se dirige a esta necesidad mediante la provisión de un homólogo de rata o de un homólogo de ratón del NPC1 L1 de humano (también conocido como NPC3; No. de acceso Genbank AF192522; Davies, et al., (2000) Genomics 65 (2): 137-45 y loannou, (2000) Mol. Genet. Metab. 71 (1-2): 175-81 ), el blanco ezetimiba. NPC1 L1 es una proteína N-glicosilada que comprende un motivo YQRL (SEQ ID NO: 38) (por ejemplo, una señal de transporte de la red trans-Golgi a la membrana plasmática; véase Bos, et al., (1993) EMBO J. 12: 2219-2228; Humphrey, et al., (1993) J. Cell. Biol. 120: 1123-1 135; Ponnambalam, et al., (1994) J. Cell. Biol. 125: 253-268 y Rothman, et al., (1996) Science 272: 227-234) la cual exhibe distribución limitada en el tejido y abundancia gastrointestinal. También, el promotor de NPC1L1 de humano incluye una secuencia consenso unida a una Proteina de Unión del Elemento Regulado por Esteral 1 (SREBP1 ) (Athanikar, et al., (1998) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95: 4935-4940; Ericsson, et al., (1996) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93: 945-950; Metherall, et al., (1989) J. Biol. Chem. 264: 15634-15641 ; Smith, et al., (1990) J. Biol. Chem. 265: 2306-2310; Bennett, et al., (1999) J. Biol. Chem. 274: 13025-13032 y Brown, et al., (1997) Cell 89: 331 -340). NPC1 L1 tiene 42% de homología de secuencia de aminoácidos con respecto al NPC1 de humano (No. de acceso Genbank AF002020), un receptor responsable de la enfermedad de Niemann-Pick C1 (Carstea, et al., (1997) Science 277: 228-231). La enfermedad de Niemann-Pick C1 es un trastorno genético extraño en humanos el cual produce la acumulación de colesterol no esterificado derivado de la lipoproteína de baja densidad (LDL) en lisosomas (Pentchev, et al., (1994) Biochim. Biophys. Acta. 1225: 235-243 y Vanier, et al., (1991 ) Biochim. Biophys. Acta. 1096: 328-337). Además, el colesterol se acumula en la red trans-Golgi de las células, y se retrasa la re-localización del colesterol, hacia y a partir de la membrana plasmática. NPC1 y NPC1 L1 cada uno posee 13 segmentos transmembranales que atraviesan la membrana asi como un dominio sensible al esteral (SSD). Otras proteínas diferentes, incluyendo HMG-CoA Reductasa (HMG-R), la proteína de activación para escisión de la proteína de unión al elemento regulador en parche (PTC) y del esteral (SCAP), incluyen un SSD el cual está implicado en la sensibilidad a los niveles de colesterol posiblemente mediante un mecanismo el cual implica la unión directa del colesterol (Gil, et al., (1985) Cell 41 : 249-258; Kumagai, et al., (1995) J. Biol. Chem. 270: 19107-19113 y Hua, et al., (1996) Cell 87: 415-426). BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención incluye un polipéptido aislado que comprende 42 o más aminoácidos contiguos a partir de una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir de SEQ ID NOs: 2 y 12, preferiblemente que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada a partir de SEQ ID NOs: 2 y 12. La invención también incluye un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido de SEQ ID NO: 2 o 12, preferiblemente que comprende una secuencia nucleotídica seleccionada a partir de SEQ ID NOs: 1 , 5-10, 11 y 13. Un vector recombinante que comprende un polinucleótido de la invención también se provee junto con una célula hospedera que comprende el vector. La presente invención también provee un anticuerpo el cual se une específicamente a NPC1 L1 (por ejemplo, NPC1 L1 de ratón o NPC1L1 de humano) o cualquier fragmento antigénico del mismo, preferiblemente NPC1 L1 de rata, más preferiblemente un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir de SEQ ID NO: 39-42. Preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo policlonal o monoclonal. Preferiblemente, el anticuerpo se obtiene a partir de un conejo. La presente invención también incluye un método para elaborar un polipéptido NPC1L1 de la invención que comprende cultivar una célula hospedera de la invención bajo condiciones en las cuales se expresa el ácido nucleico en la célula el cual codifica el polipéptido NPC1L1. Preferiblemente, el método incluye el paso de aislar el polipéptido a partir del cultivo. La presente invención incluye métodos para identificar un agonista o antagonista de NPC1L1 que comprende (a) poner en contacto a una células hospedera (por ejemplo, célula de ovario de hámster chino (CHO), una célula J774, una célula macrófago y una célula Caco2) que expresa un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 12 o un fragmento funcional de la misma en una superficie celular, en la presencia de una cantidad conocida de ezetimiba marcada (por ejemplo, con 3H o 25l), con una muestra a ser probada para la presencia de un agonista o antagonista de NPC1 L1 ; y (b) midiendo la cantidad de ezetimiba marcada de manera detectable específicamente unida al polipéptido; en donde un agonista o antagonista de NPC1 L1 en la muestra se identifica mediante la medición de la unión sustancialmente reducida de la ezetimiba marcada de manera detectable al polipéptido, en comparación con lo que se podría medir en la ausencia de dicho agonista o antagonista. También se provee otro método para identificar un agonista o antagonista de NPC1L1. El método comprende (a) colocar, en una suspensión acuosa, una pluralidad de partículas de soporte, impregnadas con un elemento fluorescente (por ejemplo, silicato de itrio, óxido de itrio, difeniloxazol y poliviniltolueno), al cual está unida una célula hospedera (por ejemplo, célula de ovario de hámster chino (CHO), una célula J774, una célula macrófago y una célula Caco2) que expresa un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 12 o un fragmento funcional de la misma en una superficie celular; (b) añadiendo, a la suspensión, ezetimiba radiomarcada (por ejemplo, con 3H o 125l) y una muestra a ser probada para la presencia de un antagonista o agonista, en donde la radiomarca emite energía de radiación capaz de activar el elemento fluorescente después de la unión de la ezetimiba al polipéptido para producir energía luminosa, mientras que la ezetimiba radiomarcada que no se une al polipéptido, generalmente, se remueve demasiado lejos a partir de las partículas de soporte para permitir que la energía radioactiva active el elemento fluorescente; y (c) medir la energía luminosa emitida por el elemento fluorescente en la suspensión; en donde un agonista o antagonista de NPC1 L1 en la muestra se identifica mediante la medición sustancialmente reducida de la emisión de la energía luminosa, en comparación con lo que se podría medir en la ausencia de dicho agonista o antagonista. También se provee un método para identificar un agonista o antagonista de NPC1L1 que comprende (a) poner en contacto a una célula hospedera (por ejemplo, célula de ovario de hámster chino (CHO), una célula J774, una célula macrófago y una célula Caco2) que expresa un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 12 o un fragmento funcional del mismo en una superficie celular con colesterol marcado de manera detectable (por ejemplo, con 3H y 1Z5I) y con una muestra a ser probada para la presencia de un antagonista o agonista; y (b) medir la cantidad de colesterol marcado de manera detectable en la célula; en donde un antagonista de NPC1L1 en la muestra se identifica al medir el colesterol sustancialmente reducido marcado de manera detectable dentro de la célula hospedera, en comparación con lo que se podría medir en la ausencia de dicho antagonista y en donde un agonista de NPC1L1 en la muestra se identifica al medir el colesterol sustancialmente incrementado marcado de manera detectable dentro de la célula hospedera, en comparación con lo que se podría medir en la ausencia de dicho agonista.

También se incluye en la presente invención un ratón mutante que comprende una alteración homocigota o heterocigota del NPC1L1 cromosomal endógeno, en donde, preferiblemente, el ratón no produce ninguna proteína NPC1 L1 funcional.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La presente invención incluye un polipéptido NPC1L1 a partir de rata y a partir de ratón junto con polinucleótidos que codifican los polipéptidos respectivos. Preferiblemente, el polipéptido NPC1 L1 de rata comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 2 y el polipéptido NPC1 L1 de ratón comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO. 12. El polinucleótido NPC1L1 de rata de SEQ ID NO: 1 ó 10 codifica el polipéptido NPC1 L1 de rata. El polinucleótido NPC1L1 de ratón de SEQ ID NO: 1 1 ó 13 codifica el polipéptido NPC1L1 de ratón. La presente invención incluye cualquier polinucleótido o polipéptido que comprende una secuencia nucleotídica o una secuencia de aminoácidos referida, a continuación, en el cuadro 1.

CUADRO 1 Polinucleótidos y polipéptidos de la invención Un NPC1 L1 de humano también se describe bajo el Número de acceso Genbank AF192522. Como se discute a continuación, la secuencia nucleotídica del NPC1L1 de rata que se establece en SEQ ID NO: 1 se obtuvo a partir de una marca de secuencia expresada (EST) a partir de una librería de ADNc de enterocito de yeyuno de rata. Las SEQ ID NOs: 5-7 incluyen secuencias nucleotídicas parciales de tres clonas independientes de ADNc. Se determinó la secuencia hacia 3' de la SEQ ID NO: 5 EST(603662080F1 ); los datos de secuencia a partir de estos experimentos se establecen en SEQ ID NO: 8. las secuencias hacia 5' también se determinaron; estos datos se establecen en SEQ ID NO; 9. Las SEQ ID NOs: 43 y 44 son las secuencias nucleotídicas y de aminoácidos, respectivamente, de NPC1 L1 de humano las cuales se describen bajo el No. de acceso Genbank: AF192522 (véase Davies, et al., (2000) Genomics 65 (2): 137-45). La SEQ ID NO: 45 es la secuencia nucleotídica de un NPC1L1 de ratón la cual se describen bajo el No. de acceso Genbank AK078947.

Biología Molecular De conformidad con la presente invención se pueden emplear técnicas convencionales de biología molecular, microbiología, y ADN recombinante dentro de la habilidad de la técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la literatura. Véase, por ejemplo, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Segunda Edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (en adelante "Sambrook, et al., 1989"); DNA Cloning: A Practical Approach. Volúmenes I y II (D. N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesís (M. J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1985)); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins, eds. (1984)); Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed. (1986)); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, (1986)); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F. M. Ausubel, et al.(eds.), Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Inc. (1994). Las secuencias retro-transcritas de SEQ ID NO: 10 y de SEQ ID NO: 13 utiliza el código de una sola letra que se muestra en el cuadro 1 de Anexo C, Apéndice 2 de la Instrucción Administrativa de la PCT en el Manual de Procedimiento para Examen de Patente. Un "polinucleótido", "ácido nucleico" o "molécula de ácido nucleico" se puede referir a la forma polimérica de éster de fosfato de los ribonucleósidos (adenosina, guanosina, uridina o citidina; "moléculas de ARN") o deoxirribonucleósidos (deoxiadenosina, deoxiguanosina, deoxitimidina, o deoxicitidina; "moléculas de ADN"), o cualesquiera análogos de fosfoéster de los mismos, tales como fosforotioatos y tioésteres, en forma de una sola cadena, en forma de doble cadena o en otra forma. Una "secuencia polinucleotídica", "secuencia de ácido nucleico" o "secuencia nucleotídica" es una serie de bases nucleotídicas (también denominados "nucleótidos") en un ácido nucleico, tales como ADN o ARN, y significa cualquier cadena de dos o más nucleótidos. Una "secuencia codificante" o una secuencia "que codifica" un producto de expresión, tal como un ARN, polipéptido, proteína, o enzima, es una secuencia nucleotídica que, cuando se expresa, induce la producción del producto. El término "gen" significa una secuencia de ADN que codifica o que corresponde a una secuencia particular de ribonucleótidos o de aminoácidos la cual comprende toda o una parte de una o más moléculas de ARN, proteínas o enzimas, y puede o no incluir secuencias reguladoras de ADN, tales como secuencias promotoras, las cuales determinan, por ejemplo, las condiciones bajo las cuales se expresa el gen. Los genes se pueden transcribir a partir de ADN o de ARN el cual puede o no traducirse hacia una secuencia de aminoácidos. La presente invención incluye fragmentos de ácido nucleico de cualesquiera de SEQ ID NOs: 1 , 5-11 ó 13. Un "fragmento" de ácido nucleico incluye al menos aproximadamente 30 (por ejemplo, 31 , 32, 33, 34), preferiblemente al menos aproximadamente 35 (por ejemplo, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33 ó 34), más preferiblemente al menos aproximadamente 45 (por ejemplo, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43 ó 44), y más preferiblemente al menos aproximadamente 126 o más nucleótidos contiguos (por ejemplo, 130, 131 , 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 300, 400, 500, 000 ó 1200) a partir de cualesquiera de SEQ ID NOs: 1 , 5-11 ó 13. La presente invención también incluye fragmentos de ácido nucleico que consisten de al menos aproximadamente 7 (por ejemplo, 9, 12, 17, 19), preferiblemente al menos aproximadamente 20 (por ejemplo, 30, 40, 50, 60), más preferiblemente aproximadamente 70 (por ejemplo, 80, 90, 95), incluso más preferiblemente al menos aproximadamente 100 (por ejemplo, 105, 110, 114) e incluso más preferiblemente al menos aproximadamente 115 (por ejemplo, 117, 119, 120, 122, 124, 125, 126) nucleótidos contiguos a partir de cualesquiera de SEQ ID NOs: 1 , 5-11 ó 13. Como se utiliza en la presente invención, el término "oligonucleótido" se refiere a un ácido nucleico, generalmente de no más de aproximadamente 100 nucleótidos (por ejemplo, 30, 40, 50, 60, 70, 80, ó 90), que se pueden hibridar a una molécula de ADN genómico, una molécula de ADNc, o una molécula de ARNm que codifica un gen, ARNm, ADNc, u otro ácido nucleico de interés. Los oligonucleótidos se pueden marcar, por ejemplo, mediante la incorporación de 32P-nucleótidos, 3H-nucleótidos, 14C-nucleótidos, 35S-nucleótidos o nucleótidos a los cuales se le conjuga covalentemente una marca, tal como biotina. En una modalidad, un oligonucleótido marcado se puede utilizar como una sonda para detectar la presencia de un ácido nucleico. En otra modalidad, los oligonucleótidos (uno o ambos de los cuales puede estar marcado) se pueden utilizar como iniciadores de PCR, ya sea para clonar un fragmento de longitud total o un fragmento del gen, o para detectar la presencia de ácidos nucleicos. Generalmente, los oligonucleótidos se preparan sintéticamente, preferiblemente en un sintetizador de ácido nucleico. Una "secuencia protéica", "secuencia peptídica" o "secuencia polipeptídica" o "secuencia de aminoácidos" se puede referir a una serie de dos o más aminoácidos en una proteína, péptido o polipéptido. "Proteína", "péptido" o "polipéptido" incluye una extensión continua de dos o más aminoácidos. Los péptidos preferidos de la invención incluyen aquellos como se establecen en cualesquiera de SEQ ID NOs: 2 ó 12 así como variantes y fragmentos de los mismos. Dichos fragmentos preferiblemente comprenden al menos aproximadamente 10 (por ejemplo, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ó 19), más preferiblemente al menos aproximadamente 20 (por ejemplo, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40), e incluso más preferiblemente al menos aproximadamente 42 (por ejemplo, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120 ó 130) o residuos de aminoácidos más contiguos a partir de cualesquiera de SEQ ID NOs: 2 ó 12. La presente invención también incluye polipéptidos, preferiblemente polipéptidos antigénicos, que consisten de al menos aproximadamente 7 (por ejemplo, 9, 10, 13, 15, 17, 19), preferiblemente al menos aproximadamente 20 (por ejemplo, 22, 24, 26, 28), incluso más preferiblemente al menos aproximadamente 30 (por ejemplo, 32, 34, 36, 38) e incluso más preferiblemente al menos aproximadamente 40 (por ejemplo, 41 , 42) aminoácidos contiguos a partir de cualesquiera de SEQ ID NOs: 2 ó 12. Los polipéptidos de la invención se pueden producir mediante escisión proteolítica de un péptido intacto, mediante síntesis química o mediante la aplicación de tecnología de ADN recombinante y no se limitan a polipéptidos delineados por los sitios de escisión proteolítica. Los polipéptidos, ya sea solos o entrecruzados o conjugados a una molécula vehículo para volverlos más inmunogénicos, son útiles como antígenos para inducir la producción de anticuerpos y fragmentos de los mismos. Los anticuerpos se pueden utilizar, por ejemplo, en inmunoensayos para purificación por inmunoafinidad o para la inhibición de NPC1L1 , etc. Los términos "polinucleótido aislado" o "polipéptido aislado" incluyen un polinucleótido (por ejemplo, molécula de ARN o ADN, o un polímero mezclado) o un polipéptido, respectivamente, los cuales están parcialmente o completamente separados a partir de otros componentes que se encuentran normalmente en las células o en sistemas de expresión de ADN recombinante. Estos componentes incluyen, pero no se limitan a, membranas celulares, paredes celulares, ribosomas, polimerasas, componentes del suero y secuencias genómicas extrañas. Un polinucleótido o polipéptido aislado será, preferiblemente una composición esencialmente homogénea de moléculas pero pueden contener cierta heterogeneicidad. "Amplificación" de ADN como se utiliza en la presente invención puede denotar el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para incrementar la concentración de una secuencia particular de ADN en una mezcla de secuencias de ADN. Para una descripción de PCR véase Saiki, et al., Science (1988) 239: 487. El término "célula hospedera" incluye cualquier célula o cualquier organismo que se selecciona, modifica, transfecta, transforma, crece, o se utiliza o se manipula de cualquier forma, para la producción de una sustancia por la célula, por ejemplo la expresión o replicación, por la célula, de un gen, una secuencia de ADN o de ARN o una proteína. Las células hospederas preferidas incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), células macrófago de murino J774 o cualquier otra línea celular de macrófago y células epiteliales intestinales de humano Caco2. La secuencia nucleotídica de un ácido nucleico se puede determinar mediante cualquier método conocido en la técnica (por ejemplo, secuenciación química o secuenciación enzimática). La "secuenciación química" del ADN incluye métodos tales como aquellos de Maxam y Gilbert (1977) (Proa Nati. Acad. Sci. USA 74: 560), en el cual el ADN se escinde al azar utilizando reacciones individuales específicas de la base. La "secuenciación enzimática" del ADN incluye métodos tales como aquellos de Sanger (Sanger, et al., (1977) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 74: 5463). Los ácidos nucleicos de la presente invención se pueden flanquear mediante secuencias reguladoras naturales (control de la expresión), o se pueden asociar con secuencias heterólogas, incluyendo promotores, sitios internos para entrada al ribosoma (IRES) y otras secuencias para el sitio de unión al ribosoma, potenciadores, elementos de respuesta, supresores, secuencias señal, secuencias de poliadenilación, intrones, regiones no codificantes 5' y 3', y los similares. En general, un "promotor" o "secuencia promotora" es una región reguladora del ADN capaz de unirse a una ARN polimerasa en una célula (por ejemplo, directamente o a través de otras proteínas o sustancias para unión al promotor) e iniciar la transcripción de una secuencia codificante. Una secuencia promotora, en general se une en su extremo 3' mediante el sitio de inicio de la transcripción y se extiende hacia el extremo 5' (dirección 5') para incluir el número mínimo de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripción en cualquier nivel. Dentro de la secuencia promotora se puede encontrar un sitio de inicio de la transcripción (convenientemente definido, por ejemplo, mediante mapeo con la nucleasa S1 ), así como dominios para unión de la proteína (secuencias consenso) responsables de la unión de la ARN polimerasa. El promotor puede estar operativamente asociado con otras secuencias control de la expresión, incluyendo secuencias potenciadoras y represoras o con un ácido nucleico de la invención. Los promotores que se pueden utilizar para controlar la expresión génica incluyen, pero no se limitan a, promotor del citomegalovirus (CMV) (Patentes de E.U.A. Nos. 5,385,839 y 5,168,062), la región del promotor temprano de SV40 (Benoist, et al., (1981 ) Nature 290: 304-310), el promotor contenido en el repetido terminal largo hacia 3' del virus del sarcoma de Rous (Yamamoto, et al., (1980) Cell 22: 787-797), el promotor de la timidina cinasa del herpes (Wagner, et al., (1981 ) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78: 1441-1445), las secuencias reguladoras del gen de la metalotioneína (Brinster, et al., (1982) Nature 296: 39-42); vectores de expresión procarionte tales como el promotor de la ß-lactamasa (Villa-Komaroff, et al., (1978) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731 ), o el promotor tac (DeBoer, et al., (1983) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 80: 21-25); véase también "Useful proteins from recombinant bacteria" en Scientific American (1980) 242: 74-94; y elementos promotores a partir de la levadura o de otros hongos tales como el promotor Gal 4, el promotor ADC (alcohol deshidrogenase), promotor PGK (fosfoglicerol cinasa) o el promotor de la fosfatasa alcalina. Una secuencia codificante está "bajo el control de", "funcionalmente asociada con" u "operativamente asociada con" las secuencias de control transcripcional y traduccional en una célula cuando las secuencias dirigen la transcripción mediada por la ARN polimerasa de la secuencia codificante en el ARN, preferiblemente ARNm, las cuales pueden ser entonces ARN procesadas (si contienen intrones) y opcionalmente, se traducen hacia una proteína codificada por la secuencia codificante. Los términos "expresa" y "expresión" significa que permite o que ocasiona que la información en un gen, ARN o secuencia de ADN se manifieste; por ejemplo, produciendo una proteína mediante la activación de las funciones celulares implicadas en la transcripción y traducción de un gen correspondiente. Una secuencia de ADN se expresa en o mediante una célula para formar un "producto de expresión" tal como un ARN (por ejemplo, ARNm) o una proteína. También se puede decir que el producto de expresión mismo se "expresa" por la célula. El término "transformación" significa la introducción de un ácido nucleico dentro de una célula. El gen o la secuencia introducida se puede denominar una "clona". Una célula hospedera que recibe el ADN o ARN introducido ha sido "transformada" y es un "transformante" o una "clona". El ADN o ARN introducido a una célula hospedera puede ser a partir de cualquier fuente, incluyendo células del mismo género o especie que la célula hospedera, o a partir de células de un género o especie diferente.

El término "vector" incluye un vehículo (por ejemplo, un plásmido) por medio del cual se puede introducir una secuencia de ADN o de ARN dentro de una célula hospedera, de manera que el hospedero se transforma y, opcionalmente, promueve la expresión y/o replicación de la secuencia introducida. Los vectores que se pueden utilizar en esta invención incluyen plásmidos, virus, bacteriófago, fragmentos de ADN que se pueden integrar, y otros vehículos que pueden facilitar la introducción de los ácidos nucleicos dentro del genoma del hospedero. Los plásmidos son la forma más comúnmente utilizada de vectores pero son adecuados para uso en la presente invención todas las otras formas de vectores que sirven para una función similar y los cuales son, o se vuelven, conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Pouwels, et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual. 1985 y Suplementos, Elsevier, N. Y., y Rodríguez et al. (eds. ), Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses. 1988, Buttersworth, Boston, MA. El término "sistema de expresión" significa una célula hospedera y un vector compatible el cual, bajo condiciones adecuadas, puede expresar una proteína o ácido nucleico el cual se lleva por el vector y se introduce en la célula hospedera. Los sistemas de expresión comunes incluyen células hospederas E. coli y vectores plasmídicos, células hospederas de insecto y vectores Baculovirus, y células hospederas y vectores de mamífero. La expresión de los ácidos nucleicos que codifican a los polipéptidos NPC1 L1 de esta invención se puede llevar a cabo mediante métodos convencionales ya sea en células procariontes o eucariontes. Aunque las células hospederas de E. coli se emplean más frecuentemente en sistemas procariontes, muchas otras bacterias, tales como diversas cepas de Pseudomonas y Bacillus, se conocen en la técnica y también se pueden utilizar. Las células hospederas adecuadas para expresar ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos NPC1L1 incluyen procariontes y eucariontes superiores. Los procariontes incluyen tanto organismos gram-negativos como gram-positivos, por ejemplo, E. coli y B. subtilis. Los eucariontes superiores incluyen líneas celulares establecidas de cultivos de tejidos a partir de células animales, tanto de origen no mamífero, por ejemplo, células de insecto, y de aves, como de origen de mamífero, por ejemplo, de humano, de primates, y de roedores. Los sistemas de vectores para hospederos procariontes incluyen una amplia variedad de vectores a partir de muchas especies diferentes. Un vector representativo para amplificar ADN es el pBR322 o muchos de sus derivados (por ejemplo, pUC18 ó 19). Los vectores que se pueden utilizar para expresar los polipéptidos NPC1L1 incluyen, pero no se limitan a, aquellos que contienen el promotor lac (series pUC); promotor trp (pBR322-trp); promotor Ipp (las series pIN); promotores lambda-pP o pR (pOTS); o promotores híbridos tales como pfac (pDR540). Véase Brosius et al., "Expression Vectors Employing Lambda-, trp-, lac-, and Ipp-derived Promoters", en Rodríguez y Denhardt (eds. ) Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses. 1988, Buttersworth, Boston, pp. 205-236.

Muchos polipéptidos se pueden expresar, a niveles altos, en un sistema de expresión de E. coli/T7 como se describe en las Patentes de E.U.A. Nos. 4,952,496, 5,693,489 y 5,869,320 y en Davanloo, P., et al., (1984) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81 : 2035- 2039; Studier, F. W., et al., (1986) J. Mol. Biol. 189: 113-130; Rosenberg, A. H., et al., (1987) Gene 56: 125-135; y Dunn, J. J., et al., (1988) Gene 68: 259. Las células de cultivo de tejidos de eucariontes superiores también se pueden utilizar para la producción recombinante de los polipéptidos NPC1 L1 de la invención. Aunque se pueden utilizar cualesquiera de las líneas celulares de cultivo de tejidos de eucariontes superiores, incluyendo sistemas de expresión de baculovirus de insecto, se prefieren las células de mamífero. La transformación o transfección y propagación de dichas células se ha vuelto un procedimiento de rutina. Los ejemplos de líneas celulares útiles incluyen células HeLa, lineas celulares de célula de ovario de hámster chino (CHO), células J774, células Caco2, líneas celulares de riñon de cría de rata (BRK), líneas celulares de insecto, líneas celulares de ave, y líneas celulares de mono (COS). Los vectores de expresión para dichas líneas celulares usualmente incluyen un origen de replicación, un promotor, un sitio de inicio de la traducción, sitios de procesamiento del ARN (si se utiliza ADN genómico), un sitio de poliadenilación, y un sitio de término de la transcripción. Estos vectores también contienen, usualmente, un gen para selección o un gen para amplificación. Los vectores para expresión adecuados pueden ser plásmidos, virus, o promotores que portan retrovirus derivados a partir de, por ejemplo, dichas fuentes tales como adenovirus, SV40, parvovirus, virus de vaccinia, o citomegalovirus. Los ejemplos de vectores para expresión incluyen pCR®3.1 , pCDNAl, pCD (Okayama, et al., (1985) Mol. Cell Biol. 5: 1136), pMCIneo Poli-A (Thomas, et al., (1987) Cell 51 : 503), pREP8, pSVSPORT y derivados de los mismos, y vectores tipo baculovirus tales como pAC373 o pAC610. Una modalidad de la invención incluye NPC1 L1 unido a la membrana. En esta modalidad, NPC1 L1 se puede expresar en la membrana celular de una célula eucarionte y la proteína unida a la membrana se puede aislar a partir de la célula mediante métodos convencionales los cuales se conocen en la técnica. La presente invención también incluye fusiones las cuales incluyen los polipéptidos NPC1 L1 y polinucleótidos NPC1L 1 de la presente invención y una segunda porción polipeptídica o polinucleotídica, la cual se puede referir como una "marca". Las fusiones de la presente invención pueden comprender cualesquiera de los polinucleótidos o polipéptidos establecidos en el cuadro 1 o cualquier subsecuencia o fragmento de los mismos (discutidos anteriormente). Los polipéptidos fusionados de la invención se pueden construir covenientemente, por ejemplo, mediante la inserción de un polinucleótido de la invención o fragmento del mismo dentro de un vector de expresión. Las fusiones de la invención pueden incluir marcas que facilitan la purificación o detección. Dichas marcas incluyen glutationa-S-transferasa (GST), marcas de hexahistidina (His6), marcas de prateína de unión a maltosa (MBP), marcas de hemaglutinina (HA), marcas de proteína de unión a celulosa (CBP) y marcas myc. Las marcas detectables tales como P, 35S, 3H, 99mTc, 23l, 111ln, 68Ga, 18F, 125l, 131l, 1 3mln, 76Br, 67Ga, 99mTc, 123ln, 111ln y 68Ga también se pueden utilizar para marcar a los polipéptidos y polinucleótidos de la invención. Los métodos para construir y utilizar dichas fusiones son muy convencionales y se conocen bien en la técnica. Las modificaciones (por ejemplo, modificaciones post-traduccionales) que se presentan en un polipéptido frecuentemente serán una función de cómo se elabora éste. Para los polipéptidos elaborados mediante la expresión de un gen clonado en un hospedero, por ejemplo, la naturaleza y grado de las modificaciones, en gran parte, se determinarán por la capacidad de modificación post-traduccional de la célula hospedera y las señales de modificación presentes en la secuencia de aminoácidos del polipéptido. Por ejemplo, como se conoce bien, la glucosilación frecuentemente no se presenta en células bacterianas tales como E. coli. Por consiguiente, cuando se desea la glucosilación, se puede expresar un polipéptido en un hospedero para glucosilación, generalmente una célula eucarionte. Las células de insecto frecuentemente llevan a cabo glucosilaciones post-traduccionales las cuales son similares a aquellas de las células de mamífero. Por esta razón, los sistemas de expresión de la célula de insecto se han desarrollado para expresar, eficientemente, proteínas de mamífero que tienen patrones nativos de glucosilación. Una célula de insecto la cual se puede utilizar en esta invención es cualquier célula derivada a partir de un organismo de la clase Insecta. Preferiblemente, el insecto es Spodoptera fruigiperda (Sf9 o Sf21 ) o Trichoplusia ni (High 5). Los ejemplos de sistemas de expresión de insecto que se pueden utilizar en la presente invención, por ejemplo para producir el polipéptido NPC1 L1 , incluyen Bac-To-Bac (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) o Gateway (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). Si se desea, las enzimas para desglucosilacion se pueden utilizar para remover carbohidratos unidos durante la producción en sistemas de expresión eucarionte. Otras modificaciones también pueden incluir la adición de ésteres alifáticos o amidas al polipéptido carboxilo terminal. La presente invención también incluye análogos de los polipéptidos NPC1L1 los cuales contienen modificaciones, tal como la incorporación de residuos de aminoácidos no naturales, o residuos de aminoácidos fosforilados tales como residuos de fosfotirosina, fosfoserina o fosfotreonina. Otras modificaciones potenciales incluyen sulfonación, biotinilación, o la adición de otras porciones. Por ejemplo, los polipéptidos NPC1L1 de la invención se pueden modificar en el extremo con un polímero el cual incrementa la vida media del péptido en el cuerpo de un sujeto. Los polímeros preferidos incluyen polietilenglicol (PEG) (por ejemplo, PEG con un peso molecular de 2 kDa, 5 kDa, 10 kDa, 12 kDa, 20 kDa, 30 kDa y 40 kDa), dextrán y monometoxipolietilenglicol (mPEG). Los péptidos de la invención también se pueden formar en ciclo. Específicamente, los residuos amino y carboxi terminales de un polipéptido NPC1 L1 o dos residuos internos de un polipéptido NPC1 L1 de la invención se pueden fusionar para crear un péptido en forma de ciclo. Los métodos para péptidos en forma de ciclo son convencionales y se conocen muy bien en la técnica; por ejemplo véase Gurrath, et al., (1992) Eur. J. Biochem. 210: 911-921. La presente invención contempla cualquier modificación superficial o ligera a las secuencias de aminoácidos o secuencias nucleotídicas las cuales corresponden a polipéptidos de la invención. En particular, la presente invención contempla variantes de las secuencias conservativas de los ácidos nucleicos las cuales codifican los polipéptidos de la invención. Las "variantes de secuencias conservativas" de una secuencia polinucleotídica son aquellas en las cuales un cambio de uno o más nucleótidos en un codón dado no produce ninguna alteración en el aminoácido codificado en esa posición. Las variantes de función conservativa de los polipéptidos de la invención también se contempla por la presente invención. Las "variantes de función conservativa" son aquellas en las cuales uno o más residuos de aminoácidos en una proteina o enzima han sido cambiados sin alterar la conformación general y función del polipéptido, incluyendo, pero, en ningún sentido, limitado al, reemplazo de un aminoácido con uno que tiene propiedades similares. Los aminoácidos con propiedades similares se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, los aminoácidos polares/hidrófilos que se pueden intercambiar incluyen asparagina, glutamina, serina, cisteína, treonina, lisina, arginina, histidina, ácido aspártico y ácido glutámico; los aminoácidos no polares/hidrófobos que se pueden intercambiar incluyen glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, tirosina, fenilalanina, triptofano y metionina; los aminoácidos ácidos que se pueden intercambiar incluyen ácido aspártico y ácido glutámico y los aminoácidos básicos que se pueden intercambiar incluyen histidina, lisina y arginina. La presente invención incluye polinucleótidos que codifican NPC1 L1 de rata o de ratón y fragmentos de los mismos así como ácidos nucleicos los cuales hibridan a los polinucleótidos. Preferiblemente, los ácidos nucleicos hibridan bajo condiciones de severidad baja, más preferiblemente bajo condiciones de severidad moderada y más preferiblemente bajo condiciones de severidad alta. Una molécula de ácido es "hibridable" a otra molécula de ácido nucleico, tal como un ADNc, ADN genómico, o ARN, cuando una forma de una sola cadena de la molécula de ácido nucleico se puede unir a la otra molécula de ácido nucleico bajo las condiciones apropiadas de temperatura y fuerza iónica de la solución (véase Sambrook, et al., anteriormente mencionado). Las condiciones de temperatura y fuerza iónica determinan la "severidad" de la hibridación. Las condiciones típicas de hibridación de severidad baja son 55°C, SSC 5X, SDS al 0.1%, 0.25% de leche, y sin formamida a 42°C; o 30% de formamida, SSC 5X, 0.5% de SDS a 42°C. Las condiciones típicas de hibridación de severidad moderada son similares a las condiciones de severidad baja excepto que la hibridación se lleva a cabo en 40% de formamida, con SSC 5X o 6X a 42°C. Las condiciones de severidad alta son similares a las condiciones de severidad baja excepto que las condiciones de hibridación se llevan a cabo en 50% de formamida, SSC 5X o 6X y, opcionalmente, a una temperatura superior (por ejemplo, mayor de 42°C: 57°C, 59°C, 60°C, 62°C, 63°C, 65°C o 68°C). En general, SSC es NaCI 0.15 y citrato de Na 0.015M. La hibridación requiere que los dos ácidos nucleicos contengan secuencias complementarias, sin embargo, dependiendo de la severidad de la hibridación, son posibles las inconsistencias entre las bases. La severidad apropiada para la hibridación de ácidos nucleicos depende de la longitud de los ácidos nucleicos y del grado de complementación, variables bien conocidas en la técnica. A mayor grado de similitud u homología entre las dos secuencias nucleotídicas, mayor la severidad bajo la cual los ácidos nucleicos pueden hibridar. Para los híbridos mayores de 100 nucleótidos en longitud, se han derivado las ecuaciones para el cálculo de la temperatura de fusión (véase Sambrook, et al., anteriormente mencionado, 9.50-9.51 ). Para la hibridación con ácidos nucleicos más cortos, por ejemplo, oligonucleótidos, la posición de las inconsistencias se vuelve más importante, y la longitud del oligonucleótido determina su especificidad (véase Sambrook, et al., anteriormente mencionado). También se incluyen en la presente invención polinucleótidos que comprenden secuencias nucleotídicas y polipéptidos que comprenden secuencias de aminoácidos las cuales son al menos aproximadamente 70% idénticas, preferiblemente al menos aproximadamente 80% idénticas, más preferiblemente al menos aproximadamente 90% idénticas y más preferiblemente al menos aproximadamente 95% idénticas (por ejemplo, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%) al nucleótido de referencia NPC1L1 de rata (por ejemplo, cualesquiera de SEQ ID NOs: 1 ó 5-10) y secuencias de aminoácidos (por ejemplo, SEQ ID NO: 2) o el nucleótido de NPC1L1 de ratón (por ejemplo, cualesquiera de SEQ ID NOs: 11 ó 13) y secuencias de aminoácidos (por ejemplo, SEQ ID NO: 12), cuando la comparación se lleva a cabo mediante un algoritmo BLAST en donde los parámetros del algoritmo se seleccionan para producir la coincidencia más grande entre las secuencias respectivas en la longitud total de las secuencias de referencia respectivas. También se incluyen en la presente invención los polipéptidos que comprenden secuencias de aminoácidos las cuales son al menos aproximadamente 70% similares, preferiblemente al menos aproximadamente 80% similares, más preferiblemente al menos aproximadamente 90% similares y más preferiblemente al menos aproximadamente 95% similares (por ejemplo, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%) a la secuencia de aminoácidos de referencia del NPC1L1 de rata de SEQ ID NO: 2 o a la secuencia de aminoácidos del NPC1 L1 de ratón de SEQ ID NO: 12, cuando la comparación se lleva a cabo con un algoritmo BLAST en donde los parámetros del algoritmo se seleccionan para producir la coincidencia mayor entre las secuencias respectivas en la longitud total de las secuencias de referencia respectivas. La identidad de secuencia se refiere a las coincidencias exactas entre los nucleótidos o aminoácidos de dos secuencias las cuales se comparan. La similitud de secuencia se refiere tanto a las coincidencias exactas entre los aminoácidos de dos polipéptidos los cuales se comparan en adición a las coincidencias entre los aminoácidos no idénticos, bioquímicamente relacionados. Los aminoácidos bioquímicamente relacionados los cuales comparten propiedades similares y pueden ser intercambiables se discutieron anteriormente. Las siguientes referencias con respecto al algoritmo BLAST se incorporan en la presente invención como referencias: BLAST ALGORITHMS: Altschul, S. F., et al., (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410; Gish, W., et al., (1993) Nature Genet. 3: 266-272; Madden, T. L., et al., (1996) Meth. Enzymol. 266:131-141 ; Altschul, S. F., et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402; Zhang, J., et al., (1997) Genome Res. 7: 649-656; Wootton, J. C., et al., (1993) Comput Chem. 17: 149-163; Hancock, J. M., et al., (1994) Comput. Appl. Biosci. 10: 67-70; ALIGNMENT SCORING SYSTEMS: Dayhoff, M. O., et al.,"A model of evolutionary change in proteins". en Atlas of Protein Sequence and Structure. (1978) volumen 5, suplemento 3. M. O. Dayhoff (ed. ), pp. 345-352, Nati. Biomed. Res. Found., Washington, DC; Schwartz, R. M., et al., "Matrices for detecting distant relationships". en Atlas of Protein Sequence and Structure. (1978) volumen 5, suplemento 3. "M. O. Dayhoff (ed.), pp. 353-358, Nati. Biomed. Res. Found., Washington, DC; Altschul, S. F., (1991 ) J. Mol. Biol. 219: 555-565; States, D. J., et al., (1991 ) Methods 3: 66-70; Henikoff, S., et al., (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919; Altschul, S. F., et al., (1993) J. Mol. Evol. 36: 290-300; ALIGNMENT STATISTICS: Karlin. S., et al., (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268; Karlin, S., et al., (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877; Dembo, A., et al., (1994) Ann. Prob. 22: 2022-2039; y Altschul, S. F. "Evaluating the statistical significance of múltiple distinct local alignments". en Theoretical and Computational Methods in Genome Research (S. Suhai, ed.), (1997) pp. 1-14, Plenum, New York.

Purificación de proteina Las proteínas, polipéptidos y fragmentos antigénicos de esta invención se pueden purificar mediante métodos estándares, incluyendo, pero no limitados a, precipitación mediante sal o alcohol, cromatografía por afinidad (por ejemplo, utilizado en conjunción con una purificación del polipéptido NPC1 L1 marcado como se discutió anteriormente), electroforesis preparativa en disco del gel, enfoque isoeléctrico, cromatografía líquida de alta presión (CLAR), CLAR de alta presión, filtración en gel, cromatografía de intercambio catiónico y aniónico y cromatografía de partición, y distribución a contracorriente. Dichos métodos de purificación se conocen bien en la técnica y se describen, por ejemplo, en "Guide to Protein Purification", Methods in Enzymology. Vol. 182, M. Deutscher, Ed., 1990, Academic Press, New York, NY. Los pasos de purificación se pueden seguir por la realización de ensayos para actividad de unión al receptor como se describe a continuación. Particularmente en donde un polipéptido NPC L1 ha sido aislado a partir de una fuente celular o tisular, es preferible que se incluyan uno o más inhibidores de enzimas proteolíticas en el sistema de ensayo, tales como fluoruro de fenilmetansulfonilo (P SF), Pefabloc SC, pepstatina, leupeptina, quimostatina y EDTA.

Moléculas de anticuerpo Los fragmentos antigénicos (incluyendo inmunogénicos) de los polipéptidos NPC1L1 de la invención están dentro del alcance de la presente invención (por ejemplo, 42 o más aminoácidos contiguos a partir de SEQ ID NO: 2, 4 ó 12). Los péptidos antigénicos pueden ser útiles, entre otros, para preparar moléculas de anticuerpo las cuales reconocen NPC1 L1. Las moléculas de anticuerpo anti-NPC1L1 son antagonistas de NPC1L1 útiles. Un antígeno es cualquier molécula que se puede unir específicamente a un anticuerpo. Algunos antígenos no pueden, por ellos mismos, inducir la producción del anticuerpo. Aquellos que pueden inducir la producción del anticuerpo son inmunógenos. Preferiblemente, los anticuerpos anti-NPC1L1 reconocen un péptido antigénico que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir de SEQ ID NOs: 39-42 (por ejemplo, un antígeno derivado a partir de NPC1 L1 de rata). Más preferiblemente, el anticuerpo es A0715, A0716, A0717, A0718, A0867, A0868, A1801 o A1802. El término "molécula de anticuerpo" incluye, pero no se limita a, anticuerpos y fragmentos (preferiblemente fragmento de unión al antígeno) de los mismos. El término incluye anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos bispecíficos, fragmentos del anticuerpo Fab, fragmentos del anticuerpo F(ab)2, fragmentos del anticuerpo Fv (por ejemplo, VH o VL), fragmentos del anticuerpo Fv de cadena sencilla y fragmentos del anticuerpo dsFv. Además, las moléculas del anticuerpo de la invención pueden ser anticuerpos completamente de humano, anticuerpos de ratón, anticuerpos de rata, anticuerpos de conejo, anticuerpos de cabra, anticuerpos de pollo, anticuerpos humanizados o anticuerpos quiméricos. Sin embargo no siempre es necesario, cuando se utilizan polipéptidos NPC1 L1 como antigenos el inducir la producción del anticuerpo en un hospedero inmunológicamente competente, los fragmentos antigénicos más pequeños, preferiblemente, se vuelven primero más inmunogénicos mediante entrecruzamiento o concatenación, o mediante acoplamiento a una molécula vehículo inmunogénica (por ejemplo, una macromolécula que tiene la propiedad de inducir independientemente una respuesta inmunológica en un animal hospedero, tal como toxina de difteria o tétanos). El entrecruzamiento o la conjugación a una molécula vehículo se puede requerir debido a que los fragmentos polipeptídicos pequeños actúan algunas veces como haptenos (moléculas que son capaces de unirse específicamente a un anticuerpo pero son incapaces de inducir la producción del anticuerpo, por ejemplo, no son ¡nmunogénicas). La conjugación de dichos fragmentos a una molécula vehículo inmunogénica los vuelve más inmunogénicos a través de los que se conoce comúnmente como el "efecto vehículo". Las moléculas vehículo incluyen, por ejemplo, proteínas y compuestos poliméricos naturales o sintéticos tales como polipéptidos, polisacáridos, lipopolisacáridos etc. Las moléculas vehículo de proteína se prefieren especialmente, incluyendo, pero no limitadas a, hemocianina de lapa cerradura y proteínas de suero de mamífero tales como la gammaglobulina de humano o de bovino, albúmina de suero de humano, bovino o de conejo, o metilados u otros derivados de dichas proteínas. Otros vehículos de proteína serán evidentes a aquellos expertos en la técnica. Preferiblemente, el vehículo de proteína será externo al animal hospedero en el cual se inducen los anticuerpos en contra de los fragmentos. El acoplamiento covalente a la molécula vehículo se puede lograr utilizando métodos bien conocidos en la técnica, la elección exacta de los cuales será determinada por la naturaleza de la molécula vehículo utilizada. Cuando la molécula vehículo inmunogénica es una proteína, los fragmentos de la invención se pueden acoplar, por ejemplo, utilizando carbodiimidas solubles en agua tales como diciclohexilcarbodiimida o glutaraldehido. Los agentes acopladores, tales como éstos, también se pueden utilizar para entrecruzar los fragmentos a sí mismos sin el uso de una molécula vehículo separada. Dichos entrecmzamientos hacia agregados también pueden incrementar la inmunogenicidad. La inmunogenicidad también se puede incrementar mediante el uso de adyuvantes conocidos, solos o en combinación con acoplamiento o agregación. Los adyuvantes para la vacunación de animales incluyen, pero no se limitan a, Adjuvante 65 (que contiene aceite de cacahuate, monooleato de manida y monoestearato de aluminio); adyuvante completo de Freund o adyuvante incompleto de Freund; geles minerales tales como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio y alumbre; agentes tensioactivos tales como hexadecilamina, octadecilamina, lisolecitina, bromuro de dimetildioctadecilamonio, N,N-dioctadecil-N',N'-bis(2- hidroximetil)propandiamina, metoxihexadecilglicerol y polioles plurónicos; polianiones tales como pirano, sulfato de dextrán, poli IC, ácido poliacrílico y carbopol; péptidos tales como dipéptido de muramilo, dimetilglicina y tuftsina; y emulsiones oleosas. Los polipéptidos también se pueden administrar después de la incorporación en liposomas o en otros microvehículos. La información con respecto a los adyuvantes y a diversos aspectos de los inmunoensayos se describe en, por ejemplo, las series por P. Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays. 3a Edición, 1987, Elsevier, New York. Otras referencias útiles que abarcan métodos para preparar antisuero policlonal incluyen Microbiology. 1969, Hoeber Medical División, Harper and Row; Landsteiner, Specificity of Serological Reactions. 1962, Dover Publications, New York, y Williams, et al., Methods in Immunoloqy and Immunochemistry. Vol. 1 , 1967, Academic Press, New York.

Las moléculas de anticuerpo anti-NPC1 L1 de la invención preferiblemente reconocen NPC1L1 de humano, de ratón o de rata; no obstante, la presente invención incluye moléculas de anticuerpo las cuales reconocen NPC1 L1 a partir de cualquier especie, preferiblemente mamíferos (por ejemplo, gato, oveja o caballo). La presente invención también incluye complejos que comprenden un polipéptido NPC1L1 de la invención y una molécula de anticuerpo anti-NPC1 L1. Dichos complejos se pueden elaborar mediante el contacto simplemente de la molécula del anticuerpo con su polipéptido cognado. Se pueden utilizar diversos métodos para elaborar las moléculas de anticuerpo de la invención. Los anticuerpos de humano se pueden elaborar, por ejemplo, mediante los métodos los cuales son similares a aquellos descritos en las Patentes de E.U.A. Nos. 5,625,126; 5,877,397; 6,255,458; 6,023,010 y 5,874,299. Las células de hibridoma las cuales producen los anticuerpos monoclonales anti-NPC1 L1 se pueden producir mediante los métodos que se conocen comúnmente en la técnica. Estos métodos incluyen, pero no se limitan a, la técnica de hibridoma originalmente desarrollada por Kohler, et al., (1975) (Nature 256: 495-497), así como la técnica de trioma (Hering, et al., (1988) Biomed. Biochim. Acta. 47: 211-216 y Hagiwara, et al., (1993) Hum. Antibod. Hybridomas 4: 15), la técnica de hibridoma de célula B (Kozbor, et al., (1983) Immunology Today 4: 72 y Cote, et al., (1983) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A 80: 2026-2030), y la técnica de hibridoma-EBV (Colé, et al., en onoclonal Antibodies and Cáncer Therapy. Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96,1985). El ELISA se puede utilizar para determinar si las células de hibridoma están expresando anticuerpos anti-NPC1L1. Las moléculas de anticuerpo anti-NPC1 L1 de la presente invención también se pueden producir de manera recombinante (por ejemplo, en un sistema de expresión de E. colil T7 como se discutió anteriormente). En esta modalidad, los ácidos nucleicos que codifican las moléculas de anticuerpo de la invención (por ejemplo, VM o VL) se pueden insertar dentro de un plásmido basado en pet y se pueden expresar en el sistema de E. colil 17. Existen diversos métodos por medio de los cuales se producen anticuerpos recombinantes los cuales se conocen en la técnica. Un ejemplo de un método para la producción recombinante de anticuerpos se describe en la Patente de E.U.A. No. 4,816,567. Véase también Skerra, A., et al., (1988) Science 240:1038-1041 ; Better, ., et al., (1988) Science 240: 1041-1043 y Bird, R. E., et al., (1988) Science 242: 423-426. El término "anticuerpo monoclonal", incluye un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, por ejemplo, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por mutaciones posibles, que se presentan de manera natural que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, siendo dirigidos en contra de un sitio antigénico particular. Los anticuerpos monoclonales son ventajosos puesto que se pueden sintetizar por un cultivo de hibridoma, esencialmente no contaminado por otras ¡nmunoglobulinas. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como se obtiene a partir de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se considera como una producción requerida del anticuerpo mediante un método particular. Los anticuerpos monoclonales a ser utilizados de conformidad con la presente invención se puede elaborar mediante el método de hibridoma como se describe por Kohler, et al., (1975) Nature 256: 495. El término "anticuerpo policlonal" incluye un anticuerpo el cual se produce entre o en la presencia de uno o más de otros anticuerpos, no idénticos. En general, los anticuerpos policlonales se producen a partir de un linfocito B en la presencia de diversos linfocitos B diferentes los cuales producen anticuerpos no idénticos. Típicamente, los anticuerpos policlonales se obtienen directamente a partir de un animal inmunizado (por ejemplo, un conejo). Un "anticuerpo biespecífico" comprende dos regiones diferentes para unión al antígeno que se unen a antígenos distintos. Los anticuerpos biespecíficos, así como los métodos de elaboración y uso de los anticuerpos, son convencionales y se conocen muy bien en la técnica. Los anticuerpos anti-idiotípicos o anti-idiotipos son anticuerpos dirigidos en contra de la región para combinación al antígeno o región variable (denominado el idiotipo) de otra molécula de anticuerpo. Como se describe por Jeme (Jeme, N. K., (1974) Ann. Immunol. (Paris) 125c: 373 y Jeme, N. K., et al., (1982) EMBO 1. 234), la inmunización con una molécula de anticuerpo que expresa un paratopo (sitio para combinación del antígeno) para un antígeno dado (por ejemplo, NPC1 L1 ) producirá un grupo de anti-anticuerpos, algunos de los cuales comparten, con el antígeno, una estructura complementaria al paratopo. La inmunización con una subpoblacion de los anticuerpos anti-idiotípicos producirá, a su vez, una subpoblacion de anticuerpos o subpoblaciones de células inmunes que son reactivas al antígeno inicial. El término "anticuerpo completamente de humano" se refiere a un anticuerpo el cual comprende solamente secuencias de inmunoglobulinas de humano. De manera similar, "anticuerpo de ratón" se refiere a un anticuerpo el cual comprende solamente secuencias de inmunoglobulina de ratón. "Anticuerpo quimérico de humano/ratón" se refiere a un anticuerpo el cual comprende una región variable de ratón (VH y VL) fusionada a una región constante de humano. Los anticuerpos anti-NPC1 L1 "humanizados" también están dentro del alcance de la presente invención. Las formas humanizadas de los anticuerpos no de humano (por ejemplo, de murino) son inmunoglobulinas quiméricas, las cuales contienen secuencias mínimas derivadas a partir de inmunoglobulina no de humano. Para la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas de humano (anticuerpo recipiente) en los cuales los residuos a partir de una región determinante de complementariedad del recipiente se reemplazan por residuos a partir de una región determinante de complementariedad de una especie no de humano (anticuerpo donante), tales como ratón, rata o conejo, que tienen una especificidad, afinidad y capacidad deseada. En ciertos casos, los residuos de la estructura Fv de la inmunoglobulina de humano también se reemplazan por residuos no de humano correspondientes. Los fragmentos de anticuerpo "Fv de cadena sencilla" o "sFv" incluyen los dominios VH y/o VL de un anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una cadena polipeptídica sencilla. Generalmente, el polipéptido sFv comprende adicionalmente un polipéptido enlazador entre los dominios VH y Vi_ lo cual permite que el sFv forme la estructura deseada para la unión al antígeno. Las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla (Patentes de E.U.A. Nos. 5,476,786; 5,132,405 y 4,946,778) se pueden adaptar para producir anticuerpos anti-NPC1 L1 específicos, de cadena sencilla. Para una revisión de sFv véase Pluckthun en The Pharmacoíogy of Monoclonal Antibodies. vol. 1 13, Rosenburg and oore eds. Springer-Verlag, N. Y., pp. 269-315 (1994). Los "Fragmentos Fv estabilizados con enlace disulfuro" y "dsFv" incluyen moléculas que tienen una cadena pesada variable (VH) y/o una cadena ligera variable (VL) las cuales están enlazadas mediante un enlace disulfuro. Los fragmentos de anticuerpo que están dentro del alcance de la presente invención también incluyen fragmentos F(ab)2 los cuales se pueden producir mediante escisión enzimática de una IgG mediante, por ejemplo, pepsina. Los fragmentos Fab se pueden producir mediante, por ejemplo, la reducción de F(ab)2 con ditiotreitol o mercaptoetilamina. Un fragmento Fv es una región VL o VH. Dependiendo de las secuencias de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas se pueden asignar a clases diferentes. Existen al menos cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas se pueden dividir adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo, lgG-1 , lgG-2, lgG-3 e lgG-4; lgA-1 e lgA-2. Las moléculas de anticuerpo anti-NPC1L1 de la invención también se pueden conjugar a una porción química. La porción química puede ser, entre otras, un polímero, un radionúclido o un factor citotóxico. 5 Preferiblemente, la porción química es un polímero que incrementa la vida media de la molécula de anticuerpo en el cuerpo de un sujeto. Los polímeros adecuados incluyen, pero no se limitan en ningún sentido a, polietilenglicol (PEG) (por ejemplo, PEG con un peso molecular de 2 kDa, 5 kDa, 10 kDa, 12 kDa, 20 kDa, 30 kDa o 40 kDa), dextrán y monometoxipolietilenglicol (mPEG). io Los métodos para producir anticuerpos anti-IL8 polietilenglicosilados los cuales se describen en la Patente de E.U.A. No. 6,133,426 se pueden aplicar a la producción de anticuerpos anti-NPC1 L1 polietilenglicosilados de la invención. Lee, et al., (1999) (Bioconj. Chem. 10: 973-981) describen PEG conjugated single-chain anticuerpos. Wen, et al., (2001 ) (Bioconj. Chem. 12: 545-553) describen anticuerpos conjugados con PEG el cual está unido a un radiometal quelante (ácido dietilentriaminpentaacético (DTPA)). Las moléculas de anticuerpo de la invención también se pueden conjugar con marcas tales como "Te, ^Y, 11ln, 32P, 14C, 125l, 3H, 131l, 11C, 50, 20 47Sc, 109Pd, 234Th, 40K, 157Gd, 55Mn, 52Tr o 56Fe Las moléculas de anticuerpo de la invención también se pueden conjugar con marcas fluorescentes o quimioluminiscentes, incluyendo fluoróforos tales como quelantes de tierras raras, fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, isotiocianato, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftalaldehído, fluorescamina, 52Eu, dansilo, umbeliferona, luciferina, marca lum'mal, marca isoluminal, una marca de éster de acridinio aromático, una marca de imidazol, una marca de sal de acridimio, una marca de éster de oxalato, una marca de acuorina, 2,3-dihidroftalazinedionas, biotina/avidina, marcas de giro y radicales libres estables. Las moléculas de anticuerpo también se pueden conjugar a un factor citotóxico tal como toxina de difteria, cadena A de la exotoxina de Pseudomonas aeruginosa, cadena A de la ricina, cadena A de la abrina, cadena A de la modeccina, alfa-sarcina, proteínas y compuestos de Aleurites fordii (por ejemplo, ácidos grasos), proteínas de diantina, proteínas PAPI, PAPII, y PAP-S de Playtoiacca americana, inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de la saponaria officinalis, mitogelina, restrictocina, fenomicina, y enomicina. Se puede emplear cualquier método conocido en la técnica para conjugar las moléculas de anticuerpo de la invención a las diversas porciones, incluyendo aquellos métodos descritos por Hunter, et al., (1962) Nature 144: 945; David, et al., (1974) Biochemistry 13: 1014; Pain, et al., (1981 ) J. Immunol. Meth. 40: 219; y Nygren, J., (1982) Histochem. and Cytochem. 30: 407. Los métodos para conjugar anticuerpos son convencionales y se conocen muy bien en la técnica.

Ensayos de selección La invención permite el descubrimiento de agonistas y antagonistas selectivos de NPC1L1 (por ejemplo, SEQ ID NO: 2, 4 ó 12) que pueden ser útiles en el tratamiento y manejo de una variedad de condiciones médicas incluyendo colesterol elevado en suero. Por lo tanto, NPC1 L1 de esta invención se puede emplear en sistemas de selección para identificar agonistas o antagonistas. Esencialmente, estos sistemas proveen métodos para poner juntos un ligando o agonista o antagonista apropiado conocido de NPC1L1 , que incluye colesterol, ezetimiba, BODIPY-ezetimiba (Altmann, et al., (2002) Biochim. Biophys. Acta 1580(1 ): 77-93) o 4",6"-bis[(2-fluorofenil)carbamoil]-beta-D-celobiosil derivado de 11-cetotigogenina como se describe en DeNinno, et al., (1997) (J. Med. C em. 40 (16): 2547-54) (Merck; L-166,143), y una muestra a ser probada para la presencia de un agonista o antagonista de NPC1L1. Un método conveniente por medio del cual se evalúa si una muestra contiene un agonista o antagonista de NPC1L1 es determinar si la muestra contiene una sustancia la cual compite por la unión entre el agonista o antagonista conocido (por ejemplo, ezetimiba) y NPC1 L1. La ezetimiba se puede preparar mediante una variedad de métodos bien conocidos por aquellos expertos en la técnica, por ejemplo tales como se describen en las Patentes de E.U.A. Nos. 5,631 ,365, 5,767,115, 5,846,966, 6,207,822, la Solicitud de Patente de E.U.A. No. de Publicación 2002/0193607 y la Solicitud de Patente PCT WO 93/02048, cada una de las cuales se incorpora en la presente invención como referencia en su totalidad.

La "muestra", "compuesto candidato" o "sustancia candidato" se refiere a una composición la cual se evalúa en una prueba o ensayo, por ejemplo, por su capacidad de agonizar o antagonizar un NPC1 L1 (por ejemplo, SEQ ID NO: 2, 4 ó 12) o un fragmento funcional de los mismos. La composición puede moléculas pequeñas, péptidos, nucleótidos, polinucleótidos, partículas subatómicas (por ejemplo, partículas a, partículas P) o anticuerpos. Se pueden utilizar dos tipos básicos de sistemas de selección, un ensayo de unión al ligando marcado (por ejemplo, ensayo de unión directa o ensayo de centelleo por proximidad (SPA)) y un ensayo de "toma de colesterol". Un ligando marcado para uso en el ensayo de unión se puede obtener mediante el marcado del colesterol o de un agonista o antagonista conocido de NPC1 L1 con un grupo que se puede medir (por ejemplo, 25l o 3H). Diversas formas marcadas de colesterol están disponibles comercialmente o se pueden generar utilizando técnicas estándares (por ejemplo, colesterol-[1 ,2-3H(N)j, colesterol-[1 ,2,6,7-3H(N)] o colesterol-[7-3H(N)]; American Radiolabeled Chemicals, Inc; St. Louis, MO). En una modalidad preferida, la ezetimiba está marcada de manera fluorescente con un grupo BODIPY (Altmann, et al., (2002) Biochim. Biophys. Acta 1580 (1 ): 77-93) o está marcada con un grupo detectable tal como 1251 o 3H.

Ensayo de unión directa. Típicamente, una cantidad dada de NPC1 L1 de la invención (por ejemplo, SEQ ID NO: 2, 4 ó 12) se pone en contacto con cantidades en incremento del ligando marcado o antagonista o agonista conocido (discutido anteriormente) y la cantidad del ligando marcado, unido o antagonista o agonista conocido se mide después de la remoción del ligando marcado, no unido o antagonista o agonista conocido mediante lavado. Puesto que se incrementa la cantidad del ligando marcado o agonista o antagonista conocido, eventualmente se alcanza un punto en el que todos los sitios para unión al receptor están ocupados o saturados. La unión específica al receptor del ligando marcado o agonista o antagonista conocido se elimina mediante un gran exceso de ligando marcado no marcado o agonista o antagonista conocido. Preferiblemente, se utiliza un sistema de ensayo en el cual la unión no específica del ligando marcado o antagonista o agonista conocido al receptor es mínima. La unión no específica típicamente es menor del 50%, preferiblemente menor del 15%, y más preferiblemente menor del 10% de la unión total del ligando marcado o antagonista o agonista conocido. Un ácido nucleico que codifica un polipéptido NPC1L1 de la invención (por ejemplo, SEQ ID NO: 2, 4 ó 12) se puede transfectar dentro de una célula hospedera apropiada, por medio del cual el receptor se incorporará dentro de la membrana de la célula. Posteriormente se puede aislar una fracción de membrana a partir de la célula y se puede utilizar como una fuente del receptor para ensayo. Alternativamente, la célula total que expresa el receptor en la superficie celular se puede utilizar en un ensayo. Preferiblemente, la unión específica del ligando marcado o antagonista o agonista conocido a una célula hospedera no transfectada/no transformada o a una fracción membranal a partir de una célula hospedera no transfectada/no transformada será insignificante. En principio, un ensayo de unión de la invención se puede llevar a cabo utilizando un polipéptido soluble NPC1 L1 de la invención, por ejemplo, después de la producción y replegamiento mediante métodos estándares a partir de un sistema de expresión de E. coli, y el complejo resultante del receptor-ligando marcado pudo ser precipitado, por ejemplo, utilizando un anticuerpo en contra del receptor. Posteriormente el precipitado se pudo lavar y se pudo medir la cantidad del ligando unido, marcado o del antagonista o agonista. En el ensayo de unión básica, el método para identificar un agonista o antagonista de NPC1 L1 incluye: (a) poner en contacto NPC1L1 (por ejemplo, SEQ ID NO: 2 ó 4 ó 12) o una subsecuencia del mismo, en la presencia de una cantidad conocida de colesterol marcado o antagonista o agonista conocido (por ejemplo, ezetimiba marcada o L-166,143 marcado) con una muestra a ser probada para la presencia de un agonista o antagonista de NPC1 L1 ; y (b) medir la cantidad de colesterol marcado o antagonista o agonista conocido unido al receptor. Un antagonista o agonista de NPC1L1 en la muestra se identifica mediante la medición de la unión sustancialmente reducida del colesterol marcado o antagonista o agonista conocido a NPC1 L1 , en comparación con lo que se podría medir en la ausencia de dicho antagonista o agonista. Por ejemplo, la unión reducida entre [3H]-colesterol y NPC1L1 en la presencia de una muestra puede sugerir que la muestra contiene una sustancia la cual compite en contra del [3H]-colesterol para la unión al NPC1L1. Alternativamente, una muestra se puede evaluar directamente para la unión al NPC1 L1 (por ejemplo, SEQ ID NO: 2, 4 ó 12). Un ensayo básico de este tipo puede incluir los siguientes pasos: (a) poner en contacto NPC1 L1 (por ejemplo, SEQ ID NO: 2 ó 4 ó 12) o una subsecuencia del mismo con un compuesto candidato marcado (por ejemplo, [3H]-ezetimiba); y (b) detectar la unión entre el compuesto candidato marcado y el NPC1 L1. Un compuesto candidato el cual se encuentra que se une al NPC1 L1 puede funcionar como un agonista o antagonista de NPC1 L1 (por ejemplo, mediante la inhibición de la toma de colesterol).

Ensayo SPA. Los antagonistas o agonistas de NPC1 L1 también se pueden medir utilizando ensayos de centelleo por proximidad (SPA). Los ensayos SPA son convencionales y se conocen muy bien en la técnica; véase, por ejemplo, la Patente de E.U.A. No. 4,568,649. En el SPA, el blanco de interés se moviliza en una microesfera pequeña de aproximadamente 5 mieras de diámetro. La microesfera, típicamente, incluye un núcleo sólido de centelleo el cual ha sido revestido con una película polihidroxi, la cual a su vez contiene moléculas para acoplamiento, las cuales permiten las uniones genéricas para el diseño del ensayo. Cuando una molécula marcada radioisotópicamente se une a la microesfera, el radioisótopo se pone en proximidad cercana con el elemento de centelleo y la transferencia de la energía efectiva a partir de los electrones emitidos por el isótopo tomará lugar resultando en la emisión de luz. Aunque el radioisótopo permanece en la solución libre, está demasiado distante a partir de elemento para centelleo y el electrón disipará la energía hacia el medio acuoso y por lo tanto permanecerá sin detectarse. El centelleo se puede detectar con un contador para centelleo. En general, las marcas 3H y 125l son adecuadas para SPA. Para el ensayo de los eventos de unión mediada por el receptor, la lectina de aglutinina de gérmen de trigo (WGA) se puede utilizar como la molécula para acoplamiento al lecho de SPA (Amersham Biosciences; Piscataway, NJ). Los lechos acoplados a WGA capturan las membranas celulares y glucoproteínas glucosiladas y se ha utilizado para una amplia variedad de fuentes de receptores y membranas celulares cultivadas. El receptor se inmoviliza sobre los lechos de WGA-SPA y se genera una señal sobre la unión de un ligando marcado isotópicamente. Otras moléculas para acoplamiento las cuales pueden ser útiles para los ensayos SPA de unión al receptor incluyen poli-L-lisina y WGA polietileneimina (Amersham Biosciences; Piscataway, NJ). Véase, Por ejemplo, Berry, J. A., et al., (1991 ) Cardiovascular Pharmacol. 17 (Suplemento 7): S143-S145; Hoffman, R., et al., (1992) Anal. Biochem. 203: 70-75; Kienhus, et al., (1992) J. Receptor Research 12: 389-399; Jing, S., et al., (1992) Neuron 9: 1067-1079. El centelleo cuantificado en los lechos de SPA puede incluir, por ejemplo, silicato de itrio (YSi), óxido de itrio (YOx), difeniloxazol o poliviniltolueno (PVT) el cuales actúa como un solvente sólido para la difenilantracina (DPA). Los ensayos SPA se pueden utilizar para analizar si una muestra es un antagonista o agonista de NPC1L1. En estos ensayos, una célula hospedera la cual expresa NPC1 L1 (por ejemplo, SEQ ID NO: 2 ó 4 ó 12) sobre la superficie celular o en una fracción membranal de la misma se incuba con lechos de SPA (por ejemplo, lechos de YOx revestidos con WGA o lechos de YSi revestidos con WGA) y un ligando conocido marcado, o agonista o antagonista (por ejemplo, 3H-colesterol, 3H-ezetimiba o 125l-ezetimiba). La mezcla del ensayo incluye adicionalmente ya sea la muestra a ser probada o un blanco (por ejemplo, agua). Después de una incubación opcional, el centelleo se mide utilizando un contador para centelleo. Un agonista o antagonista de NPC1L1 se puede identificar en la muestra mediante la medición de la fluorescencia sustancialmente reducida, en comparación con lo que se podría medir en la ausencia de dicho agonista o antagonista (blanco). La medición de la fluorescencia sustancialmente reducida puede sugerir que la muestra contiene una sustancia que compite para la unión al NPC1L1 con el ligando conocido, agonista o antagonista. Alternativamente, una muestra se puede identificar con un antagonista o agonista del NPC1 L1 mediante la detección directa de la unión en un ensayo SPA. En este ensayo, la versión marcada de un compuesto candidato a ser evaluado se puede poner en contacto con la célula hospedera que expresa NPC1 L1 o una fracción membranal de la misma la cual se une al lecho de SPA. Posteriormente la fluorescencia se puede ensayar para detectar la presencia de un complejo entre el compuesto candidato marcado y la célula hospedera o fracción membranal que expresa NPC1 L1. Un compuesto candidato el cual se une al NPC1 L1 puede poseer actividad agonista o antagonista al NPC1 L1. Las células hospederas que expresan NPC1 L1 se pueden preparar mediante la transformación o transfección de un ácido nucleico que codifica un NPC1L1 de la invención dentro de una célula hospedera apropiada, por medio del cual el receptor se incorpora dentro de la membrana de la célula. Posteriormente se puede aislar una fracción membranal a partir de la célula y se puede utilizar como una fuente del receptor para ensayo. Alternativamente, la célula total que expresa el receptor sobre la superficie celular se puede utilizar en un ensayo. Preferiblemente, la unión específica del ligando marcado o antagonista o agonista conocido a una célula hospedera no transfectada/no transformada o fracción membranal a partir de una célula hospedera no transfectada/no transformada será insignificante. Las células hospederas preferidas incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), células macrófago de murino J774 o cualquier otra línea celular de macrófago y células epiteliales intestinales de humano Caco2. Ensayo de toma de colesterol. El ensayo también se puede llevar a cabo para determinar si una muestra puede agonizar o antagonizar la toma de colesterol mediada por NPC1L1. En estos ensayos, una célula hospedera que expresa NPC1L1 (por ejemplo, SEQ ID NO: 2 ó 4 ó 12) sobre la superficie celular (discutido anteriormente) se puede poner en contacto con colesterol marcado de manera detectable (por ejemplo, 3H-colesterol o 125l-colesterol) junto con ya sea una muestra o un blanco. Después de una incubación opcional, las células se pueden lavar para remover el colesterol no absorbido. La toma de colesterol se puede determinar mediante la detección de la presencia de colesterol marcado en las células hospederas. Por ejemplo, las células ensayadas o lisados o fracciones de las mismas (por ejemplo, fracciones resueltas mediante cromatografía en capa fina) se pueden poner en contacto con un elemento líquido para centelleo y el centelleo se puede medir utilizando un contador para centelleo. En estos ensayos, un antagonista de NPC1L1 en la muestra se puede identificar mediante la medición sustancialmente reducida de la toma de colesterol marcado (por ejemplo, 3H-colesterol), en comparación con lo que se podría medir en la ausencia de dicho antagonista y un agonista se puede identificar mediante la medición sustancialmente incrementada de la toma de colesterol marcado (por ejemplo, 3H-colesterol), en comparación con lo que se podría medir en la ausencia de dicho agonista.

Composiciones farmacéuticas Los agonistas y antagonistas de NPC1L1 descubiertos, por ejemplo, mediante los métodos de selección descritos anteriormente se pueden utilizar terapéuticamente (por ejemplo, en una composición farmacéutica) para estimular o para bloquear la actividad del NPC1L1 y, por lo tanto, para tratar cualquier condición médica ocasionada o mediada por los receptores. Por ejemplo, las moléculas de anticuerpo de la invención también se pueden utilizar terapéuticamente (por ejemplo, en una composición farmacéutica) para unirse a NPC1 L1 y, de esta manera, bloquear la capacidad del receptor para unirse al colesterol. El bloqueo de la unión del colesterol puede prevenir la absorción de la molécula (por ejemplo, mediante las intestinal células tales como enterocitos). El bloqueo de la absorción del colesterol puede ser una forma útil para disminuir los niveles de colesterol en suero en un sujeto y, por lo tanto, para reducir la incidencia de, por ejemplo, hiperlipidemia, ateroesclerosis, enfermedades cardiacas coronarias, accidente cerebrovascular o arterioesclerosis. El término "sujeto" o "paciente" incluye cualquier organismo, preferiblemente animales, más preferiblemente mamíferos (por ejemplo, ratones, ratas, conejos, perros, caballos, primates, gatos) y más preferiblemente humanos. El término "composición farmacéutica" se refiere a una composición que incluye un ingrediente activo y un vehículo y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable.

Aunque las composiciones de esta invención se pueden administrar en una solución simple, éstas se utilizan más típicamente en combinación con otros materiales tales como vehículos, preferiblemente vehículos farmacéuticamente aceptables. Los vehículos útiles farmacéuticamente aceptables pueden ser cualesquiera sustancias no tóxicas, compatibles, adecuadas para administrar las composiciones de la invención a un sujeto. Agua estéril, alcohol, grasas, ceras, y sólidos inertes se pueden incluir en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los adyuvantes farmacéuticamente aceptables (agentes reguladores del pH, agentes para dispersión) también se pueden incorporar dentro de la composición farmacéutica. Preferiblemente, las composiciones farmacéuticas de la invención están en la forma de una pildora o cápsula. Los métodos para la formulación de pildoras y cápsulas se conocen muy bien en la técnica. Por ejemplo, para la administración oral en la forma de tabletas o de cápsulas, el componente del fármaco activo se puede combinar con cualquier vehículo inerte oral, no tóxico farmacéuticamente aceptable tales como lactosa, almidón, sacarosa, celulosa, estearato de magnesio, fosfato dicálcico, sulfato de calcio, talco, manitol, alcohol etílico (en formas líquidas) y los similares. Además, cuando se desea o cuando se necesita, también se pueden incorporar en la mezcla aglutinantes adecuados, lubricantes, agentes para desintegración y agentes colorantes. Los aglutinantes adecuados incluyen almidón, gelatina, azúcares naturales, edulcorantes de maíz, gomas naturales y sintéticas tales como acacia, alginato de sodio, carboximetilcelulosa, polietilenglicol y ceras. Entre los lubricantes se pueden mencionar para su uso en estas formas de dosis, ácido bórico, benzoato de sodio, acetato de sodio, cloruro de sodio, y los similares. Los desintegrantes incluyen almidón, metilcelulosa, goma guar y los similares. Los agentes edulcorantes y saboreantes y los conservadores también se pueden incluir cuando sea apropiado. Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden administrar en conjunción con una segunda composición farmacéutica o sustancia. En modalidades preferidas, la segunda composición incluye un fármaco que disminuye el colesterol. Cuando se utiliza una terapia de combinación, ambas composiciones se pueden formular hacia una composición particular para administración simultánea o se pueden formular separadamente en dos o más composiciones (por ejemplo, un equipo). Las formulaciones se pueden presentar de manera conveniente en una forma de dosis unitaria y se pueden preparar mediante cualesquiera métodos bien conocidos en la técnica de farmacia. Véase, por ejemplo, Gilman et al. (eds. ) (1990), The Pharmacological Bases of Therapeutics. 8a Ed., Pergamon Press; y Remington's Pharmaceutical Sciences, anteriormente mencionado, Easton, Penn.; Avis et al. (eds. ) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications Dekker, New York; Lieberman et al. (eds. ) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets Dekker, New York; y Lieberman et al. (eds.) (1990), Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems Dekker, New York. El régimen de dosis implicado en una aplicación terapéutica se puede determinar por un médico, considerando diversos factores los cuales pueden modificar la acción de la sustancia terapéutica, por ejemplo, la condición, peso corporal, sexo y dieta del paciente, la severidad de cualquier infección, tiempo de administración, y otros factores clínicos. Frecuentemente, las dosis para tratamiento se titulan hacia arriba a partir de un nivel bajo para optimizar la seguridad y eficiencia. Las dosis se pueden ajusfar para considerar los tamaños moleculares más pequeños y posiblemente disminuir las vidas medias (tiempo de eliminación) después de la administración. Una "cantidad efectiva" de un antagonista de la invención puede ser una cantidad que reducirá de manera detectable el nivel de absorción del colesterol intestinal o reduce de manera detectable el nivel de colesterol en suero en un sujeto al que se le administra la composición. Los protocolos típicos para administración terapéutica de dichas sustancias se conocen bien en la técnica. La composición farmacéutica de la invención se puede administrar, por ejemplo, mediante cualquier ruta parenteral o no parenteral. Las pildoras y cápsulas de la invención se pueden administrar oralmente. Las composiciones inyectables se pueden administrar con dispositivos médicos conocidos en la técnica; por ejemplo, mediante inyección con una aguja hipodérmica. Las composiciones farmacéuticas inyectables de la invención también se pueden administrar con un dispositivo para inyección hipodérmica sin aguja; tales como los dispositivos descritos en las Patentes de E.U.A. Nos. 5,399,163; 5,383,851 ; 5,312,335; 5,064,413; 4,941 ,880; 4,790,824 o 4,596,556.

Anti-sentido La presente invención también abarca oligonucleótidos antisentido capaces de hibridar específicamente al A Nm que codifica a NPC1 L1 (por ejemplo, cualesquiera de SEQ ID NOs:1 , 3, 5-11 ó 13) que tienen una secuencia de aminoácidos definida mediante, por ejemplo, SEQ ID NO: 2 6 4 ó 12 o una subsecuencia de los mismos de manera que previenen la traducción del ARNm. Adicionalmente, esta invención contempla oligonucleótidos anti-sentido capaces de hibridar específicamente a la molécula de ADN genómico que codifica al NPC1L1 , por ejemplo, que tiene una secuencia de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 2 ó 4 ó 12 o una subsecuencia de las mismas. Esta invención provee adicionalmente composiciones farmacéuticas que comprenden (a) una cantidad de un oíigonucleótido efectiva para reducir la absorción de colesterol mediada por NPC1L1 mediante el paso a través de una membrana celular y la unión específicamente con el ARNm que codifica el NPC1L1 en la célula de manera que se previene su traducción y (b) un vehículo farmacéuticamente aceptable capaz de pasar a través de una membrana celular. En una modalidad, el oligonucleótido se acopla a una sustancia que inactiva el ARNm. En otra modalidad, la sustancia que inactiva el ARNm es una ribozima.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se proveen para describir más claramente la presente invención y no deben considerarse como limitantes del alcance de la invención en ningún sentido.

EJEMPLO 1 Clonación y expresión de NPC1L1 de rata, ratón y humano NPC de rata, NPC1L1 de ratón o NPC1L1 de humano se pueden amplificar todos de manera conveniente utilizando reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En este método, el ADN a partir de una rata, la librería de ADNc de ratón o de humano se pueden amplificar utilizando iniciadores apropiados y condiciones estándares de PCR. El diseño de los iniciadores y las condiciones de amplificación óptimas constituyen técnicas estándares que se conocen comúnmente en la técnica. Un gen NPC1L1 amplificado se puede expresar de manera conveniente, de nuevo, utilizando los métodos que se producen comúnmente en la técnica. Por ejemplo, NPC1 L1 se puede insertar dentro de un plásmido basado en el vector pET (Stratagene; La Jolla, CA), hacia el extremo 3' del promotor de la ARN polimerasa T7. Posteriormente el plásmido se puede transformar dentro de un sistema de expresión T7 (por ejemplo, células E. coli BL21 DE3), se crecen en un cultivo líquido y se inducen (por ejemplo, mediante la adición de IPTG al cultivo bacteriano).

EJEMPLO 2 Ensayo para unión directa Preparación de la membrana: Las células Caco2 transfectadas con un vector de expresión que contenia un polinucleótido que codifica NPC1L1 (por ejemplo, SEQ ID NO: 2, 4 ó 12) se cosecharon mediante la incubación en EDTA 5 mM/solución salina con pH regulado con fosfato seguido por pipeteo repetido. Las células se centrifugaron 5 minutos a 1000 x g. El EDTA/PBS se decantó y se añadió un volumen igual de Tris-HCI 50 mM enfriado con hielo, pH 7.5 y las células se fragmentaron con un Polytron (punta PT10, establecido a 5,30 segundos). Los núcleos y las células no fragmentadas se sedimentaron a 1000 x g por 10 minutos y luego el sobrenadante se centrifugó a 50,000 x g por 10 minutos. El sobrenadante se decantó, el concentrado se resuspendió mediante Polytron, se tomó una muestra para el ensayo de proteína (bicinchoninic acid, Pierce), y el tejido se centrifugó de nuevo a 50,000 x g. Los concentrados se almacenaron congelados a -20°C.

Ensayo para unión: Para la unión por saturación, se incubaron cuatro concentraciones de [3H]-ezetimiba (15 Ci/milimoles) sin y con 10'5 de ezetimiba por triplicado con 50 µ9 de proteína membranal en un volumen total de 200 µ? de Tris-HCI 50 mM, pH 7.5, por 30 minutos a 30°C. Las muestras se filtraron sobre filtros GF/B y se lavaron tres veces con 2 mi de regulador de pH de Tris frío. Los filtros se secaron en un horno de mícroondas, se impregnaron con cera para centelleo Meltilex, y se contaron al 45% de eficiencia. Para los ensayos de unión por competencia, se incubaron cinco concentraciones de una muestra por triplicado con 18 nM de [3H]- ezetimiba y 70 g de proteína membranal bajo las condiciones descritas anteriormente. Las curvas se ajustaron a los datos con el programa para ajuste de curvas de mínimos cuadrados no linear Prism (GraphPad Software) y se derivaron los valores Ki a partir de los valores IC50 de conformidad con Cheng y Prusoff (Cheng, Y. C, et al., (1973) Biochem. Pharmacol. 22: 3099-3108).

EJEMPLO 3 Ensayo de SPA Para cada uno de los pozos de una placa de 96 pozos, se preparó una mezcla de reacción de 10 µ9 de membranas que sobreexpresan NPC1 L1-CHO de humano, de ratón o de rata (Biosignal) y 200 g pozo de lechos YSi-WGA-SPA (Amersham) en 100 µ? se preparó el regulador de pH para ensayo de NPC1 L1 (HEPES 25 mM, pH 7.8, CaCI2 2 mM, MgCI2 1 mM, NaCI 125 mM, 0.1% de BSA). Un ligando de almacenamiento de [125l]- ezetimiba 0.4 n se preparó en el regulador de pH para el ensayo del NPC1 L1. Las soluciones anteriormente mencionadas se añadieron a una placa para ensayo de 96 pozos como sigue: regulador de pH para ensayo de NPC1 L1 50 µ?, 100 µ? de la mezcla de reacción, 50 µ? de solución de almacenamiento del ligando (la concertación final del ligando es de 0.1 nM). Las placas de ensayo se agitan por 5 minutos en un agitador para placas, luego se incuban por 8 horas antes de determinar las cpm/pozo en un contador Microbeta Trilux (PerkinElmer). Estos ensayos indicarán que la [125l]-ezetimiba se une a las membranas celulares que expresan NPC1L1 de humano, ratón o rata. Los resultados similares se obtendrán si el mismo experimento se lleva a cabo con colesterol radiactivo (por ejemplo, 125l-colesterol).

EJEMPLO 4 Ensayo de toma de colesterol Las células CHO que expresan ya sea SR-B1 o tres clonas diferentes del NPC1 L1 de rata o una clona de NPC1L1 de ratón se privaron durante toda la noche en medio libre de colesterol, luego se dosificaron con [3H]-colesterol en una emulsión de micelas sintéticas mezcladas por 4 minutos, 8 minutos, 12 minutos o 24 minutos en la ausencia o presencia de ezetimiba 10 µ?. Las células se cosecharon y los lípidos se extrajeron de manera orgánica. Los lípidos extraídos fueron colocados sobre placas de cromatografía de capa fina (TLC) y se resolvieron dentro de una fase de vapor orgánico. Las bandas de colesterol libre para cada ensayo se aislaron y se contaron en un contador para centelleo. Las células que expresan SR-B1 exhibieron un incremento en la toma de [3H]-colesterol tan pronto como a los 4 minutos lo cual también se inhibió por la ezetimiba. Las tres clonas de rata y una clona de ratón parecieron proporcionar niveles de fondo de toma de [3H]-colesterol los cuales fueron similares a aquellos de las células CHO no transformadas. Estos datos producirán datos que demuestran que las células CHO pueden llevar a cabo toma de [3H]-colesterol dependiente de NPC1L1 de ratón, de rata y de humano cuando se desarrollan condiciones experimentales más óptimas.

EJEMPLO 5 Expresión de NPC1 L1 de rata en tejido de rata Wistar En estos experimentos, se evaluó la expresión del ARNm de NPC1L1 de rata, en diversos tejidos de rata. Los tejidos evaluados fueron esófago, estómago, duodeno, duodeno, íleon, colon proximal, colon distal, hígado, páncreas, corazón, aorta, bazo, pulmón, riñon, cerebro, músculo, testículos, ovario, útero, glándula adrenal y glándula tiroidea. Las muestras de ARN total se aislaron a partir de al menos 3 animales macho y 3 animales hembras y se agruparon. Posteriormente las muestras se sometieron a PCR cuantitativo en tiempo real utilizando análisis Taqman empleando sondas de oligonucleótidos fluorogénicos estándares duales. Los diseños típicos de sondas incorporan un colorante reportero hacia 5' (por ejemplo, 6FAM (6-carboxifluoresceína) o VIC) y un eliminador de colorante hacia 3' (por ejemplo, TAMRA (6-carboxitetrametil-rodamina)). NPC1L1 de rata: Hacia adelante: TCTTCACCCTTGCTCTTTGC (SEQ ID NO: 14) Reverso: AATGATGGAGAGTAGGTTGAGGAT (SEQ ID NO: 15) Sonda: [6FA ] . TGCCCACCTTTGTTGTCTGCTACC [TAMRA] (SEQ ID NO: 16) ß-actina de rata: Hacia adelante: ATCGCTGACAGGATGCAGAAG (SEQ ID NO: 17) Reverso: TCAGGAGGAGCAATGATCTTGA (SEQ ID NO: 18) Sonda: [VIC] AGATTACTGCCCTGGCTCCTAGCACCAT [TAMRA] (SEQ ID NO: 19) Las reacciones de PCR se corrieron en un formato de 96 pozos con 25 µ? de la mezcla de reacción en cada pozo que contenía: Platinum SuperMix (12.5 µ?), Colorante de referencia ROX (0.5 ul), cloruro de magnesio 50 mM (2 µ?), ADNc a partir de la reacción RT (0.2 µ?). Las reacciones del Multiplex contenían iniciadores específicos del gen a 200 nM cada uno y la sonda marcada FAM a 100 nM y los iniciadores específicos del gen a 100 nM cada uno y la sonda marcada VIC a 50 nM. Las reacciones se corrieron con un programa estándar en ciclo de 2-pasos, 95°C por 15 segundos y 60°C por 1 minuto, por 40 ciclos. Los niveles de expresión más altos se observaron en el tejido de duodeno, duodeno e ¡león. Estos datos indican que NPC1 L1 desempeña un papel en la absorción del colesterol en el intestino.

EJEMPLO 6 Expresión de NPC1L1 de ratón en tejidos de ratón En estos experimentos, se evaluó la expresión del ARNm de NPC1L 1 de ratón, en diversos tejidos. Los tejidos evaluados fueron glándula adrenal, BM, cerebro, corazón, isletas de Langerhans, Ll, intestino delgado, riñón, hígado, pulmón, MLN, PLN, músculo, ovario, glándula pituitaria, placenta, placa de Peyer, piel, bazo, estómago, testículos, timo, glándula tiroidea, útero y tráquea. Las muestras de ARN total se aislaron a partir de al menos 3 animales macho y 3 animales hembra y se agruparon. Posteriormente las muestras se sometieron a PCR cuantitativo en tiempo real utilizando análisis de Taqman utilizando los siguientes iniciadores y sondas: NPC1L 1 de ratón: Hacia adelante: ATCCTCATCCTGGGCTTTGC (SEQ ID NO: 20) Reverso: GCAAGGTGATCAGGAGGTTGA (SEQ ID NO: 21 ) Sonda: [6FAM]CCCAGCTTATCCAGATTTTCTTCTTCCGC [TAMRA] (SEQ ID NO: 22) Los niveles de expresión más altos se observaron en el tejido de la placa de Peyer, intestino delgado, vesícula biliar y estómago. Estos datos son consistentes con un papel en la absorción del colesterol para NPC1 L1 el cual toma lugar en el sistema digestivo.

EJEMPLO 7 Expresión de NPC1L1 de humano en tejido de humano En estos experimentos, el nivel de expresión del ARNm de NPC1L 1 de humano se evaluó en 2045 muestras que representan 46 tejidos normales. El análisis de expresión del gen basado en microarreglo se llevó a cabo en el GeneChip Affymetrix HG-U95 utilizando una sonda de ARNc que corresponde a los pares de bases 4192-51 17 (SEQ ID NO: 43) en estricta conformidad con los protocolos establecidos en Affymetrix. Los Gene Chips se examinaron bajo un tubo multiplicador de bajos fotones (PMT), y los datos se normalizaron utilizando ya sea los algoritmos Affymetrix MAS 4.0 o MAS 5.0. Además se utilizaron "espigas de inserción" para las mayorías de las muestras para construir una curva estándar y obtener valores de concentración de ARN de conformidad con los algoritmos y procedimientos de Gene Logic. Un resumen de estos resultados se indica, a continuación, en el cuadro 2. CUADRO 2 Nivel de expresión del ARNm de NPC1L1 en diversos tejidos de humano Tejido Presente Ausente Menor del Medio Mayor del 25% 75% Adiposo 2 de 32 30 de 32 -2.45 1.16 12.23 Glándula O de 12 12 de 12 -23.54 -4.47 10.51 ad renal Apéndice 0 de 3 3 de 3 -8.02 -6.69 38.19 Arteria O de 3 3 de 3 -6.59 -4.67 9.68 Vesícula 1 de 5 4 de 5 -22 -7.95 -1.99 biliar Hueso O de 3 3 de 3 -1.64 3.3 19.53 Mama 4 de 80 76 de 80 -4.07 3.13 14.67 Cerebelo O de 5 5 de 5 -3.04 3.24 15.38 Cervix 3 de 101 91 de 101 -7.56 -0.07 20.89 Colon 9 de 151 142 de -10.19 0.31 18.36 151 Lóbulo de O de 7 7 de 7 1.4 8.46 11.75 la corteza frontal Lóbulo de O de 3 3 de 3 7.1 8.5 15.87 la corteza temporal Duodeno 50 de 61 2 de 61 519.23 827.43 1101.67 Endometri O de 21 21 de 21 -14.43 -6.39 2.79 o Esófago 1 de 27 26 de 27 -10.93 -4.97 12.48 Trompa de 3 de 51 48 de 51 5.02 13.24 26.77 Falopio Vesícula 8 de 8 O de 8 105.76 273.39 422.8 biliar Corazón O de 3 3 de 3 3.33 11.19 11.66 Hipocamp O de 5 5 de 5 8.25 9.11 19.83 0 Riñon 4 de 86 82 de 86 -8.36 3.41 16.46 Laringe O de 4 4 de 4 -13.76 -0.81 8.54 Atrio 2 de 141 139 de -19.8 -4.58 6.84 izquierda 141 Tejido Presente Ausente Menor del Medio Mayor del 25% 75% Ventrículo 0 de 15 15 de 15 -21.19 -9.59 17.7 izquierdo Hígado 32 de 34 2 de 34 325.74 427.77 540.1 Pulmón 2 de 93 91 de 93 -3.47 1.03 22.34 Nodulo O de 11 11 de 11 -1.78 -0.19 1.34 linfático Músculos 0 de 39 39 de 39 -21.57 8.75 26.73 Miometrio 8 de 106 98 de 106 -3.98 4.87 17.55 Omentum 0 de 15 15 de 15 -14.25 -1.6 19.58 Ovario 1 de 74 73 de 74 0.5 17.51 38.28 Páncreas O de 34 34 de 34 -87.08 -53.2 -24.14 Placenta O de 5 5 de 5 -20.4 -3.44 16.91 Próstata O de 32 32 de 32 1.08 15.56 27.24 Recto 1 de 43 42 de 43 -9.26 -1.49 9.8 Atrio 4 de 169 165 de -19.32 -6.58 7.72 derecho 169 Ventrículo 1 de 160 159 de -24.01 -6.49 10.06 derecho 160 Piel O de 59 59 de 59 -12.68 1.5 22.77 Intestino 46 de 68 22 de 68 21.21 493.93 939.2 delgado Tejidos 1 de 6 5 de 6 -1.99 2.6 5.32 blandos Bazo O de 31 31 de 31 -9.41 -0.31 9.5 Estómago 7 de 47 40 de 47 19.02 52.29 117.09 Testículos O de 5 5 de 5 -4.51 1.22 11.2 Timo 1 de 71 70 de 71 -6.26 2.51 11.67 Glándula 1 de 18 17 de 18 -12.22 2.84 17.86 tiroide Utero O de 58 58 de 58 -10.67 1.59 16.01 WBC 3 de 40 37 de 40 -16.45 -0.72 25.18 Los datos sombreados corresponden a los tejidos en donde se detectaron los niveles más altos de ARNm de NPC1L1. La columna "presente" indica la proporción de muestras de tejido específico evaluadas en donde se detctó el ARNm de NPC1L1. La columna "ausente" indica la proporción de muestras de tejido específico evaluadas en donde no se detectó el ARN de NPC1L1. Las columnas "menor del 25%", "medio" y "mayor del 75%" indican distribuciones estadísticas de las intensidades de la señal relativa del NPC1L1 observadas para cada serie de tejido evaluado.

EJEMPLO 8 Distribución del ARNm de NPC1L1 de rata. IBATde rata o SR-B1 de rata en intestino delgado de rata En estos experimentos, se evaluó la distribución del ARNm de NPC1L1 de rata a lo largo del eje proxímal-distal de los intestinos delgados de rata. Los intestinos se aislaron a partir de cinco animales independientes y se dividieron en 10 secciones de longitud aproximadamente igual. El ARN total se aisló y se analizó, mediante PCR cuantitativo en tiempo real utilizando análisis Taqman, para los niveles de expresión localizada del ARNm de NPC1L1 de rata, IBAT de rata (transportador del ácido biliar en el íleon) o SR-B1 de rata. Los iniciadores y sondas utilizados en el análisis fueron: NPC1L1 de rata: Hacia adelante: TCTTCACCCTTGCTCTTTGC (SEQ ID NO: 23) Reverso: AATGATGGAGAGTAGGTTGAGGAT (SEQ ID NO: 24) Sonda: [6FAMJTGCCCACCTTTGTTGTCTGCTACC [TA RA] (SEQID NO: 25) Vilina de rata: Hacia adelante: AGCACCTGTCCACTGAAGATTTC (SEQ ID NO: 26) Reverso: TGGACGCTGAGCTTCAGTTCT (SEQ ID NO: 27) Sonda: [VIC] CTTCTCTGCGCTGCCTCGATGGAA [TAMRA] (SEQ ID NO: 28) SR-B1 de rata: Hacia adelante: AGTAAAAAGGGCTCGCAGGAT (SEQ ID NO: 29) Reverso: GGCAGCTGGTGACATCAGAGA (SEQ ID NO: 30) Sonda: [6FAM] AGGAGGCCATGCAGGCCTACTCTGA [TAMRA] (SEQ ID NO: 31 ) IBA T de rata: Hacia adelante: GAGTCCACGGTCAGTCCATGT (SEQ ID NO: 32) Reverso: TTATGAACAACAATGCCAAGCAA (SEQ ID NO: 33) Sonda: [6FAM] AGTCCTTAGGTAGTGGCTTAGTCCCTGGAAGCTC [TAMRA] (SEQ ID NO: 34) Los niveles de expresión de ARNm de cada sección intestinal de animal se analizaron separadamente, luego el nivel de expresión observado se normalizó al nivel observado de ARNm de vilina en esa sección intestinal. Luego los niveles de expresión de ARNm observados, normalizados para cada sección fueron promediados. El nivel de expresión del NPC1L1 y de SR-B1 fueron más altos en el duodeno (secciones 2-5) en comparación con las secciones más distales del íleon. Puesto que se cree que el duodeno es el sitio de absorción del colesterol, estos datos sugieren dicho papel para el NPC1L1 de rata. La distribución del IBAT que favorece al íleon está bien documentada y sirvió como un control para el experimento.

EJEMPLO 9 Análisis in situ del ARNm de NPC1L1 de rata en tejido de yeyuno de rata La localización del ARNm de NPC1L1 de rata se caracterizó por análisis de hibridación in situ o en secciones seriales de duodeno de rata. Las sondas utilizadas en este análisis fueron: Sonda T7-sentido: GTAATACGACTCACTATAGGGCCCTGACGGTCCTTCCTGAGGGAATCTTC AC (SEQ ID NO: 35) Sonda T7-antisentido: GTAATACGACTCACTATAGGGCCTGGGAAGTTGGTCATGGCCACTCCAG C (SEQ ID NO: 36) Las sondas de ARN se sintetizaron utilizando amplificación por ARN polimerasa T7 de un fragmento de ADN amplificado mediante PCR que corresponde a los nucleótidos 3318 a 3672 de NPC1L1 de rata (SEO. ID NO 1 ). Las sondas de ARNc sentido y anti-sentido marcadas con digoxigenina-UTP se generaron a partir del promotor T7 utilizando el equipo de marcado de ARN DIG siguiendo las instrucciones del fabricante. Las criosecciones seriales de duodeno de rata se hibridaron con las sondas sentido y anti-sentido. El marcado con digoxigenina se detectó con el equipo para detección de DIG en ácido nucleico basado en los métodos previos. Una señal positiva se caracteriza por la depositación de un producto de reacción rojo en el sitio de hibridación. La sonda anti-sentido mostró una tinción fuerte a lo largo del eje cripta-vellocidades bajo una amplificación baja (40X). Los niveles de expresión del ARNm de NPC1L1 de rata observados pueden ser de alguna manera mayores en las criptas que en las puntas de las vellocidades. Bajo amplificación alta (200X), la tinción se observó en los enterocitos pero no en las células en forma de copa. Una ausencia de tinción que se observó con la sonda sentido (control) confirmó la alta especificidad de la señal anti-sentido de NPC1L1. Estos datos proveen evidencia adicional del papel del NPC1L1 de rata en la absorción intestinal del colesterol.

EJEMPLO 10 Análisis FACS de la unión de ezetimiba marcada fluorescentemente a células CHO transfectadas de manera transitoria En estos experimentos, se evaluó la capacidad de la ezetimiba marcada con BODIPY (Altmann, et al., (2002) Biochim. Biophys. Acta 1580 (1 ): 77-93) para unirse al NPC1 L1 y SR-B1. "BODIPY" es un grupo fluorescente el cual se utilizó para detectar a la BODIPY-ezetimiba. Las células de ovario de hámster chino (CHO) se transfectaron de manera transitoria con ADN de NPC1 L1 de rata (rNPC1 L1/CHO), ADN de NPC1L1 de ratón (mNPC1L1/CHO), ADN de SR-B1 de ratón (mSRB1/CHO) o ADN de EGFP (EGFP/CHO). La EGFP es la proteína fluorescente verde mejorada la cual se utilizó como un control positivo. Luego las células CHO transfectadas o células CHO no transfectadas se tiñeron con ezetimiba marcada con 100 nM de BODIPY y se analizaron mediante FACS. Los experimentos control también se llevaron a cabo en donde las células no se marcaron con la BODIPY-ezetimiba y en donde las células CHO no transfectadas no se marcaron con la BODIPY-ezetimiba. No se observó tinción en las células CHO, rNPC1 L1/CHO o mNPC1 L1/CHO no transfectadas. La fluorescencia se detectó en las células control positivo EGFP/CHO. La tinción también se detectó en las células SR-B1/CHO de ratón. Estos datos muestran que, bajo las condiciones evaluadas, la BODIPY-ezetimiba es capaz de unirse al SR-B1 y que dicha unión no se elimina por la presencia del grupo fluorescente BODIPY. Cuando se determinan las condiciones óptimas, se mostrará que la BODIPY-ezetimiba marca a las células rNPC1 L1/CHO y mNPC1L1/CHO.

EJEMPL0 11 Análisis FACS de las células CHO transfectadas de manera transitoria marcadas con anticuerpo M2 antiFLAG En estos experimentos, se evaluó la expresión de NPC1 L1 marcado con FLAG sobre las células CHO. Las células CHO se transfectaron de manera transitoria con ADN de NPC1L1 de ratón, ADN de NPC1L1 de rata, ADN de NPC1L1 de rata marcado con FLAG o ADN de NPC1 L1 de ratón marcado con FLAG. Se utilizó la marca FLAG de 8 aminoácidos DYKDDDDK (SEQ ID NO: 37) la cual se insertó en el asa extracelular amino-terminal justo después de la secuencia señal para secreción. Las células se incubaron con monoclonal anticuerpo M2 anti-FLAG de ratón, comercialmente disponible seguido por un anticuerpo secundario anti-ratón marcado con BODIPY. Posteriormente las células tratadas se analizaron con FACS. El anticuerpo M2 tiñó las células CHO transfectadas teñidas con ADN de NPC1L1 de rata marcado con FLAG y con NPC L1 de ratón marcado con FLAG. No se observó tinción en las CHO células transfectadas con ADN de NPC1 L1 de ratón y con ADN de NPC1 L1 rata. Estos datos mostraron que NPC1 L1 de rata y NPC1L1 de ratón no poseen una fluorescencia significativa inherente y no se unen al anticuerpo anti-FLAG. El marcado observado de las células dependiente de FLAG indicó que las proteínas NPC1L1 de ratón marcada con FLAG y NPC1 L1 de rata marcada con FLAG se localizan en la membrana celular de las células CHO.

EJEMPLO 12 Análisis FACS de la quimera NPC1 L1-EGFP de rata marcada con FLAG en células CHO transfectadas de manera transitoria En estos experimentos, se evaluó la localización superficial y citoplásmica de NPC1 L1 de rata en células CHO. Las células CHO se transfectaron de manera transitoria con ADN de NPC1 L1 de rata marcado con FLAG o con ADN de NPC1 L1-EGFP de rata marcado con FLAG. En estas fusiones, la marca FLAG se encuentra en el amino-terminal de NPC1 L1 de rata y la EGFP de fusión se encuentra en el carboxi-terminal de NPC1 L1 de rata. Luego las células se tiñeron con el anticuerpo (primario) M2 anti-FLAG de ratón seguido por una tinción secundaria con un anti-anticuerpo de ratón marcado con BODIPY. En los experimentos control, las células se tiñeron solamente con el anticuerpo secundario y no con el anticuerpo primario (M2). Las células teñidas se analizaron mediante FACS. En los experimentos control, las células transfectadas con NPC1 L1 de rata marcado con FLAG se tiñeron con el anticuerpo secundario anti-ratón marcado con BODIPY pero no con el anticuerpo primario. Los datos mostraron que el anti-anticuerpo secundario de ratón no posee especificidad significativa para NPC1 L1 de rata marcado con FLAG y que el NPC1L1 de rata marcado con FLAG, mismo, no posee fluorescencia significativa. En otro experimento control, las células NPC1 L1-EGFP de rata no marcadas con FLAG se analizaron mediante FACS. En estos experimentos, se detectó la autofluorescencia de la proteína fluorescente verde mejorada (EGFP). Las células NPC1L1 de rata marcadas con FLAG se tiñeron con anticuerpo de ratón M2 anti-FLAG y con el anticuerpo secundario anti-ratón marcado con BODIPY y se analizaron mediante FACS. Los datos a partir de este análisis mostraron que las células no se marcaron con el anticuerpo secundario marcado con BODIPY lo cual indica la expresión de la proteína NPC1 L1 de rata marcada con FLAG en la superficie de las células CHO. Las células NPC1L1-EGFP de rata marcadas con FLAG se tiñeron con anticuerpo de ratón M2 anti-FLAG y con el anticuerpo secundario anti-ratón marcado con BODIPY y se analizaron mediante FACS. Los datos a partir de este análisis mostraron que ambos marcadores (BODIPY y EGFP) estaban presentes indicando la expresión superficial de la proteína quimérica. Estos datos también indican que una porción de la proteína se localizó dentro de las células y que se puede asociar con las vesículas de transporte. Estos datos apoyan un papel para el NPC1 L1 de rata en el transporte vesicular del colesterol o de la proteína expresada en organelos subcelulares tales como el retículo endoplásmico rugoso.

EJEMPLO 13 Análisis FACS y microscopía por fluorescencia de la quimera NPC1L1- EGFP de rata marcada con FLAG en una línea celular CHO clonada En estos experimentos, se evaluó la localización celular del NPC1 L1 de rata mediante análisis FACS y mediante inmunohistoquímica. Las células CHO se transfectaron con ADN de NPC1 L1-EGFP marcado con FLAG y se tiñeron con anticuerpo de ratón M2 anti-FLAG y luego con un anticuerpo secundario anti-ratón marcado con BODIPY. En la fusión, la marca FLAG se encuentra en el amino-terminal del NPC1 L1 de rata y la marca de la proteína fluorescente verde mejorada (EGFP) se localizan en el carboxi-terminal del NPC1 L1 de rata. Luego las células teñidas se analizaron mediante FACS y mediante microscopía por fluorescencia. Las células transfectadas con ADN de NPC1 L1-EGFP de rata marcado con FLAG se tiñeron con el anticuerpo de ratón 2 anti-FLAG y luego con el anticuerpo secundario anti-ratón marcado con BODIPY. El análisis FACS de las células detectó ambos marcadores indicando la expresión superficial de la proteína quimérica. Las células transfectadas con NPC1L1-EGFP de rata marcadas con FLAG se analizaron mediante microscopía por fluorescencia a una amplificación de 63X. El análisis de microscopía por fluorescencia de las células indicó una tinción no nuclear con tinción significativa en los organelos perinucleares. La resolución de la imagen no pudo confirmar la presencia de proteína asociada a las vesículas. Estos datos indican que la proteína de fusión se expresó sobre la membrana celular de las células CHO.

EJEMPLO 14 Generación de anticuerpos policlonales de conejo anti-NPC1L1 de rata Los péptidos sintéticos (SEQ ID NO: 39-42) que contienen un residuo de cisteína amino o carboxi terminal se acoplaron a la proteína vehículo hemocianína de lapa cerradura (KLH) a través de un enlace disulfuro y se utilizaron como un antígeno para generar antisuero policlonal en conejos New Zealand blancos (intervalo de 3-9 meses de edad). El KLH-péptido se emulsificó mediante mezclado con un volumen igual de adyuvante de Freund, y se inyectó en tres sitios dorsales subcutáneos. Antes del programa de 16 semanas de inmunización se recolectó una muestra de suero pre-inmune la cual se siguió por una inyección primaria de 0.25 mg de KLH-péptido y 3 inyecciones de refuerzo programadas de 0.1 mg de KLH-péptido. Los animales se sangraron a partir de la arteria auricular y la sangre se dejó coagular y el suero se recolectó mediante centrifugación. El título del anticuerpo anti-péptido se determinó con un ensayo inmunoabsorbente asociado a enzima (ELISA) con péptido libre unido en la fase sólida (1 µg/pozo). Los resultados se expresan como la recíproca de la dilución de suero que produjo una D045o de 0.2. La detección se obtuvo utilizando la IgG anti-conejo biotinilada, el conjugado de peroxidasa de rábano-estreptavidina (HRP-SA), y ABTS.

EJEMPLO 15 Análisis FACS de la expresión de NPC1L1 de rata en células CHO transfectadas de manera transitoria con ADN de NPC1L1 de rata utilizando antisuero de conejo anti-NPC1 L1 de rata En estos experimentos, se evaluó la expresión del NPC1L1 de rata en la superficie de las células CHO. Las células CHO de transfectaron con ADN de NPC1L1 de rata, luego se incubaron ya sea con suero preinmune de conejo o con suero de 10 semanas de NPC1 L1 anti-rata descrito, anteriormente, en el ejemplo 14 (por ejemplo, A0715, A0716, A0867 o A0868). Las células marcadas con el antisuero primario se tiñeron posteriormente con un anticuerpo secundario anti-conejo modificado marcado con BODIPY seguido por análisis de FACS. No se observó marcado en la superficie por el anticuerpo para ninguna de las muestras de suero pre-inmune. El marcado específico de la superficie celular de las células transfectadas con NPC1L1 de rata se observó tanto para A0715 como para A0868. Los antisueros A0716 y A0867 no reconocen la expresión en superficie del NPC1L1 de rata en este formato de ensayo. Esto indica que la proteína NPC1L1 de rata nativa, no fusionada se expresa en las células CHO y se localiza en las membranas celulares CHO. La expresión en la superficie celular de NPC1L1 es consistente con un papel en la absorción intestinal del colesterol.

EJEMPLO 16 Análisis FACS de las células CHO transfectadas de manera transitoria con ADN de NPC1 L1 de ratón marcado con FLAG o ADN de NPC1 L1 de rata marcado con FLAG o CHO células no transfectadas utilizando antisuero de conejo anti-NPC1 L1 de rata En estos experimentos, se evaluó la expresión de NPC1L1 de ratón marcado con FLAG y de NPC1 L1 de rata marcado con FLAG en células CHO. Las células CHO se transfectaron de manera transitoria con ADN de NPC1 L1 de ratón marcado con FLAG o con ADN de NPC1 L1 de rata marcado con FLAG. Las células transfectadas con NPC1 L1 de ratón marcado con FLAG y con NPC1L1 de rata marcado con FLAG se marcaron ya sea con suero ?080? , A0802, A0715 o A0868 (véase el ejemplo 14) o con anticuerpo M2 anti-FLAG. Luego las células marcadas se tiñeron con anticuerpo secundario anti-conejo marcado con BODIPY y se analizaron mediante FACS. Las células CHO no transfectadas se analizaron de la misma manera que las líneas celulares transfectadas. La tinción positiva de las células CHO no transfectadas no se observó para ninguno de los antisueros probados. Se observaron las células transfectadas con NPC1L1 de rata marcadas con FLAG cuyo marcado es dependiente del suero A0801 pero no se observó dicho marcado de las células transfectadas con NPC1 L1 de ratón marcado con FLAG. No se observaron las células transfectadas con NPC1 L1 de ratón marcado con FLAG o con NPC1L1 de rata marcado con FLAG cuyo marcado es dependiente del suero A0802. Se observaron las células transfectadas con NPC1 L1 de rata marcado con FLAG cuyo marcado es dependiente del suero fuerte A0715 y se observaron células transfectadas con NPC1L1 de ratón marcado con FLAG cuyo marcado es dependiente del suero débil A0715. Se observaron las células transfectadas con NPC1L1 de rata y NPC1L1 de ratón con marcado dependiente del suero débil A0868. Se observaron las células transfectadas con NPC1 L1 de rata marcado con FLAG y NPC1L1 de ratón marcado con FLAG cuyo marcado es dependiente del anticuerpo fuerte anti-FLAG M2. La tinción fuerte con M2 probablemente se debe al hecho de que M2 es un anticuerpo monoclonal purificado mediante afinidad, de concentración conocida. En contraste, los antisueros respectivos son policlonales, no purificados y contienen una concentración desconocida de anticuerpo anti-NPC1 L1 de rata. Estos datos proveen evidencia adicional de que las proteínas NPC1 L1 de ratón marcada con FLAG y NPC1 L1 de rata marcada con FLAG se expresan en las células CHO y se localizan en las membranas celulares de CHO. La expresión en superficie celular de NPC1 L1 es consistente con un papel en la absorción intestinal del colesterol.

EJEMPLO 17 Análisis inmunohistoquímico de tejido de yeyuno de rata con antisuero A0715 de conejo Anti-NPC1L1 de rata En estos experimentos, se analizó la localización de NPC1 L1 de rata en el yeyuno de rata mediante inmunohistoquímica. El yeyuno de rata se removió, inmediátamente se embebió en el compuesto O.C.T. y se congeló en nitrógeno liquido. Se cortaron secciones (6 µ??) con un microtomo criostato y se montaron en portaobjetos de vidrio. Las secciones se secaron al aire a temperatura ambiente y luego se fijaron en fijador de Bouin. Se llevó a cabo inmunotinción con estreptavidina-biotina-peroxidasa utilizando el equipo Histostain-SP. La actividad de la peroxidasa del tejido endógeno se bloqueó con una incubación de 10 minutos en 3% de H2O2 en metanol, y se minimizó la unión no específica del anticuerpo mediante una incubación de 45 minutos en 10% de suero de conejo no inmune. Las secciones se incubaron con un antisuero de conejo anti-NPC1 L1 de rata A0715 o A0868 a una dilución de 1 :500 a 4°C, seguido por incubación con IgG de cabra anti-conejo biotinilada y con estreptavidina-peroxidasa. Subsecuentemente, las secciones se desarrollaron en un sistema de tinción de aminoetil carbazol (AEC)-H202 y se contratiñeron con hematoxilina y se examinaron mediante microscopía. Una reacción positiva utilizando este protocolo se caracteriza por la depositación de un producto de reacción rojo en el sitio de la reacción antígeno-anticuerpo. Los núcleos aparecieron el color azul a partir de la contratinción con hematoxilina. Los controles se llevaron a cabo de manera simultánea en las secciones vecinas a partir del mismo bloque de tejido. Los procedimientos control consisten de lo siguiente: (1 ) sustituir el anticuerpo primario con el suero pre-inmune, (2) sustituir el anticuerpo primario con el suero de conejo no inmune, (3) sustituir el anticuerpo primario con PBS, (4) sustituir el anticuerpo secundario con PBS. El ejemplo que muestra el tejido teñido con suero A0715 de NPC1 L1 anti-rata o con el suero preinmune se analizó a una amplificación baja (40X) y a una amplificación alta (200X). El tejido teñido con A0715, a una baja amplificación, mostró tinción positiva, fuerte de la capa epitelial de las vellocidades (enterocitos). El tejido teñido con A0715 a una alta amplificación mostró tinción positiva, fuerte de las membranas del apicales del enterocito. No se observó tinción en el tejido tratado solamente con suero preinmune. Se obtuvieron resultados similares con el suero A0868. Estos datos indican que NPC1 L1 de rata se expresa en el yeyuno de rata lo cual es consistente con un papel en la absorción intestinal del colesterol.

EJEMPLO 18 Ensayo de toma de colesterol marcado En este ejemplo, se evaluó la capacidad de las células CHO transfectadas de manera estable con NPC1L1 de rata o SR-B1 de ratón para toma del colesterol. En estos ensayos, se evaluó la toma de colesterol, a una concentración particular, en un experimento de pulso-caza. Los datos generados en estos experimentos se establecen, a continuación, en el cuadro 3. Células: A. Células CHO transfectadas de manera estable con ADNc de NPC1L1 de rata B. CHO de fondo (sin transfección) Las células se sembraron a 500,000 células/pozo (mL) en placas de 12-pozos.

Procedimiento: Todos los cultivos y placas de cultivos se mantuvieron a 37°C a menos que se mencione de otra manera. Deprivación. El medio de mantenimiento (F12 HAMS, 1% de penicilina/estreptomicina, 10% de FCS) se removió y las células se enjuagaron con medio HAMS libre de suero. Luego el medio libre de suero se reemplazó con 1 mL de medio de "deprivación" (F12 HAMS, penicilina/estreptomicina, 5% de suero deficiente de lipoproteína (LPDS). Una placa de cada linea celular se deprivó durante toda la noche. Las 2 placas remanentes se designaron como "sin deprivación" (véase a continuación). Preincubación. El medio se removió a partir de todas las placas, se enjuagó a partir de HAMS libre de suero y se reemplazó con medio de deprivación por 30 minutos. Pulso de 3H-colesterol. Los siguientes se añadieron directamente a cada pozo. 0.5 µ?? 3H-colesterol (-1.1 X 108 dpm/pozo) en 50 µ? de una micela de sal biliar mezclada. Taurocolato de sodio 4.8 mM (2.581 mg/mL) Oleato de sodio 0.6 mM (0.183 mg/mL) Colesterol 0.25 mM (0.1 mg/mL) Se dispensa en medio de "deprivación" mediante vibración ultrasónica Concentración final media de colesterol = 5 µ/mL Los puntos de tiempo de pulsos de colesterol marcado fueron 0, 4, 12 y 24 minutos. Se prepararon los pozos por triplicado para cada tratamiento. Lavado. A los tiempos designados, el medio se aspiró y las células se lavaron una vez con regulador de pH Hobbs A (Tris 50 mM, 0.9% de NaCI, 0.2% de BSA, pH 7.4) y una vez con regulador de pH Hobbs B (Tris 50 mM, 0.9% de NaCI, pH 7.4 (sin BSA)) a 37°C.

Procesamiento/análisis. Las células se digirieron durante toda la noche con NaOH 0.2N, 2 mL/pozo a temperatura ambiente. Una alícuota de 1.5 mL se removió a partir de cada pozo, se neutralizó y se contó para radioactividad mediante conteo por centelleo. Dos alícuotas adicionales de 50 µ? a partir de todos los pozos se ensayaron para proteína total mediante el método de Pierce micro BCA. La cantidad de colesterol marcado observada en las células se normalizó mediante la cantidad de proteína en las células.

CUADRO 3 Toma de 3H-colesterol por células CHO transfectadas con NPC1L1 de rata o SRB1 de ratón o células CHO no transfectadas Colesterol total, dmp de Colesterol total, dmp/mg de proteína ± sem proteína ± sem Tiemp NPC1 L1 CHO NPC1 L1 CHO o, minut os Desp Sin ués dep de riva 3H- ció colest n erol 0 2067 +46 4568 ±1937 10754 ±166 2288 ±9230 1 4 2619 ±130 2868 +193 15366 ±938 1563 ±1471 6 12 2868 ±193 4459 ±170 15636 ±1471 2462 ±966 2 24 7010 ±89 7204 +173 4 129 +685 3936 ±1207 1 0 1937 +273 1440 ±299 De 10909 ±1847 1242 ±1673 priv 9 aci ón 4 3023 +308 2759 ±105 17278 ±1650 1430 +781 7 Colesterol total, dmp de Colesterol total, dmp/mg de proteína ± sem proteína ± sem Tiemp NPC1 L1 CHO NPC1L1 CHO 0, minut os Desp De ués priv de aci 3H- ón colest erol 12 2759 +105 4857 +186 14307 ±781 2627 +1473 0 24 6966 ±72 7344 ±65 39196 ±174 3838 ±161 1 dpm = desintegraciones por minuto sem = error estándar de la media EJEMPLO 19 Efecto de la Ezetimiba sobre la toma de colesterol El efecto de la ezetimiba sobre la capacidad de las células CHO transfectadas de manera estable con NPC1L1 de ratón o de rata o SR-B1 de ratón para tomar 3H-colesterol marcado se evaluó en experimentos de pulso-caza. Una clona de ADNc de NPC1L1 de ratón (C7) y se evaluaron tres clonas de NPC1L1 de rata (C7, C17 y C21 ). La capacidad de las células CHO transfectadas de manera estable con SR-B1 de ratón, NPC1L1 de ratón y NPC1L 1 de rata para tomar colesterol marcado, en la ausencia de ezetimiba, también se evaluó en los experimentos de pulso-caza. Los datos generados en estos experimentos se establecen, a continuación, en los cuadros 4 y 5. Adicionalmente, también se evaluó la cantidad de colesterol total tomada por las células CHO transfectadas y no transfectadas en la presencia de cuatro diferentes concentraciones de colesterol no marcado. Los datos a partir de estos experimentos se establecen, a continuación, en el cuadro 6.

Células: A. Células CHO transfectadas de manera estable con ADNc de NPC1L1 de rata o de ratón B. CHO de fondo (no transfección) C. células CHO transfectadas con SR-B1 Las células se sembraron a 500,000 células/pozo (mL) en placas de 12-pozos.

Procedimiento: Todos los cultivos y placas de cultivos se mantuvieron a 37°C a menos que se mencione de otra manera.

Deprivación. El medio de mantenimiento (F12 HA S, 1 % de penicilina/estreptomicina, 10% de FCS) se removió y las células se enjuagaron con medio HAMS libre de suero. Luego el medio libre de suero se reemplazó con 1 mL de medio de "deprivación" (F12 HAMS, penicilina/estreptomicina, 5% de suero deficiente de lipoproteína (LPDS).

Luego las células se deprivaron durante toda la noche.

Pre-incu bación/pre-dosis . El medio se removió a partir de todas las placas y se reemplazó con media de deprivación recientemente preparado y se preincubó por 30 minutos. La mitad de los pozos recibieron medio que contenía ezetimiba (solución de almacenamiento en EtOH; concentración final = 10 µ?).

Pulso de 3H-colesterol. Los siguientes se añadieron directamente a cada pozo: 0.5 µ?? 3H-colesterol (-1.1 X 106 dpm/pozo) en 50 µ? de una micela de sal biliar mezclada. Taurocolato de sodio 4.8 mM (2.581 mg/mL) Oleato de sodio 0.6 mM (0.183 mg/mL) Colesterol 0.25 mM (0.1 mg/mL) Se dispensa en medio de "deprivación" mediante vibración ultrasónica Concentración final media de colesterol = 5 µ?/mL Los puntos de tiempo de pulsos de colesterol marcado fueron 4, 12, 24 minutos y 4 horas. Se prepararon pozos por triplicado para cada tratamiento. Lavado. A tiempos designados, el medio se aspiró y las células se lavaron una vez con regulador de pH Hobbs A (Tris 50 mM, NaCI 0.9%, 0.2% de albúmina de suero de bovino (BSA), pH 7.4) y una vez con regulador de pH Hobbs B (Tris 50 mM, NaCI 0.9%, pH 7.4 (sin BSA)) a 37°C.

Procesamiento/análisis. A. Puntos de tiempo de 4. 12. 24 minutos: Las células se digirieron durante toda la noche con NaOH 0.2N, 2 mL/pozo, temperatura ambiente. Una alícuota de 1.5 mL se removió a partir de cada pozo, se neutralizó y se contó para radioactividad mediante conteo por centelleo. B. Punto de tiempo de 4 horas: Las células digeridas se analizaron mediante cromatografía en capa fina para determinar el contenido de éster de colesterol en las células. Los extractos se colocaron sobre placas de TLC y se corrieron por 30 minutos en 2 mi de fase móvil de hexano:isopropanol (3:2), seguido por una segunda corrida en 1 mi de fase móvil de hexano:isopropanol (3:2) por 15 minutos. C. Determinación de proteína de extractos celulares. Las placas que contienen una muestra de los extractos celulares se colocaron sobre un agitador orbital a 120 rpm por tiempos indicados y luego los extractos se agrupan en tubos de 12 X 75. Las placas se secaron y se añadió NAOH (2 ml/pozo). Se determinó el contenido de proteína en las muestras. Dos alícuotas adicionales de 50 µ? a partir de todos los pozos se ensayaron para proteína total mediante el método de Pierce micro BCA. La cantidad de colesterol marcado observada en las células se normalizó a la cantidad de proteína en las células.

CUADRO 4 Colesterol total en células CHO transfectadas en la presencia y ausencia de ezetimiba EZ = esetimiba CUADRO 5 Ester de colesterol en células CHO en la presencia o ausencia de ezetimiba EZ = ezetimiba CUADRO 6 Toma de colesterol marcado en la presencia de cantidades en incremento de colesterol no marcado Colesterol total, dpm ± sem Colesterol total, dpm/mg de proteína + sem Colestero Pulso de Ifrío 24 3 pQlmL 12271 ± 49603 ± 142501 10656± minutos 108936 ± 541562 ± 140764 + 94945 + 430 2428 1628 1233 54 3 13785 14433 2916 10 Q/mL 16282 ± 79967 ± 25465 ± 13225 + 151283 + 880224 ± 250985 ± 123433 + 2438 8151 3037 4556 23345 82254 27481 34092 30 µQlmL· 14758 ± 71925 ± 19001 ± 13218 + 135109 + 796236 + 180436 + 111522 + 1607 3863 1530 1149 12106 18952 12112 6941 100 16458 ± 58185 ± 15973 ± 11560 + 149559 + 630143 + 147717 + 101328 ± 1614 4548 1665 1132 17977 3718 1261 7191 Ester de colesterilo, dpm ± sem Ester de colesterilo, dpm/mg de proteína ± sem CHO SR-B1 mNPCIL rNPC1L1 Pulso de CHO SR-B1 mNPCIL rNPC1L1 control 1 (C7) (C21) 4 horas control 1 (C7) (C21) 3 µ?/???_ 2737 ± 39596 ± 1561 ±1 4015 ± 22050 ± 382641 ± 3684 + 32020 + 114 1241 47 978 5955 217 611 10 µglmL 1646 + 17292 ± 998 ± 36 1866± 13323± 157914 + 8917 + 14849 + 76 362 33 606 3400 467 27 30 µglmL· 970 ± 46 6642 ± 537 ± 82 970 ±9 7627 + 63547 + 4885 7741 ± 153 325 1760 ±748 100 100 895 ± 4777 ± 405 ±7 777 + 16 7135 ± 45088 ± 3663 + 6005 + ug/mL 156 27 1230 1526 68 98 Colesterol libre, dpm ± sem Colesterol libre, dpm/mg de proteína ± sem CHO SR-B1 mNPCIL rNPC1L1 Pulso de CHO SR-B1 mNPCIL rNPC1L1 control 1 (C7) (C21) 4 horas control 1 (C7) (C21) 3 µ?/?t?? 89013 ± 2117831 104343 + 922441 717308 + 2047695 914107 + 735498 + 3724 3268 2112 987 14130 i 16213 5869 11209 10 g/mL 136396 ± 278216 + 1971731 125144 + 1105118 2540130 1753072 9958141 1566 10901 4721 877 + 76074 ± 92471 i 86578 77850 30 µg/mL 131745 ± 224429 i 1491721 117143 + 1036195 2149315 1357136 9347721 2922 2556 19619 4976 + 21142 ± 78068 +180264 43202 100 79336 ± 2314701 114599 + 93538 ± 632965 ± 2182022 1035979 7232251 gmL 4011 4221 2803 1588 29756 i 36793 130329 21694 Ester de colesterilo, dpm ± sem Ester de colesterilo, dpm/mg de proteina ± sem CHO SR-B1 mNPCIL rNPC1L1 Pulso de CHO SR-B1 mNPCIL rNPC1L1 control 1 (C7) (C21) 24 horas control 1 (C7) (C21) 3 µg/mL· 57373 ± 1622961 22986 ± 593771 357629 + 1248900 160328 + 401315 + 2704 1644 940 953 14639 + 18565 6565 5557 10 µ?/?t??- 33730 ± 112815 + 14836 + 31797 + 2150041 830231 ± 98594 i 2004511 1296 373 522 525 5942 12764 4105 5239 30 µg mL 19193 ± 58668 ± 8878 + 189631 2220711 4465811 59091 1197281 100 1413 355 380 1271 3472 +2697 2131 100 16761 ± 31280 + 8784 + 14933 + 103235 i 272796 ± 606701 962151 g mL 398 1279 946 311 1739 13392 4597 1023 EJEMPLO 20 Ensayo de toma de colesterol marcado En este ejemplo, se evaluó la capacidad de las células CHO transfectadas de manera transitoria con NPC1L1 de rata o SR-B1 de ratón para tomar colesterol marcado. También se evaluó la capacidad de NPC1 L1 de rata para potenciar la capacidad de las células CHO transfectadas con S ?-B1 de ratón para toma de colesterol marcado. En estos ensayos, la toma de colesterol, a una concentración particular, se evaluó en experimentos pulso-caza. Los datos generados en estos experimentos se establecen, a continuación, en el cuadro 7.

Células: A. Células CHO de fondo (sin transfección). B. Células CHO transfectadas de manera transitoria con SR-B1 de ratón. C. CHO transfectadas de manera transitoria con ADNc de NPC1L1 de rata (n=8 clonas). Las células transfectadas de manera transitoria se sembraron a 300,000 células/pozo (mL) en placas de 12-pozos.

Deprivación. El medio de mantenimiento (F12 HAMS, 1 % de penicilina/estreptomicina, 10% de FCS) se removió a partir de las células y se reemplazó con 1 mL de medio de "deprivación" (F12 HAMS, penicilina/estreptomicina, 5% de suero deficiente de lipoproteína (LPDS). Las células se depri varón por 1 hora.

Pulso con 3H-colesterol. Los siguientes se añadieron directamente a cada pozo. 0.5 ?? 3H-colesterol (-1.1 X 106 dpm/pozo) en 50 µ? de una micela de sal biliar mezclada. Taurocolato de sodio 4.8 mM (2.581 mg/mL) Oleato de sodio 0.6 mM (0.183 mg/mL) Colesterol 0.25 mM (0.1 mg/mL) Se dispensa en medio de "deprivación" mediante vibración ultrasónica Concentración final media de colesterol = 5 µg/mL Los puntos de tiempo de pulsos de colesterol marcado fueron 24 minutos y 4 horas. Se prepararon pozos por triplicado para cada tratamiento.

Lavado. A los tiempos designados, el medio se aspiró y las células se lavaron una vez con regulador de pH Hobbs A (Tris 50 mM, NaCI 0.9%, BSA al 0.2%, pH 7.4) y una vez con regulador de pH Hobbs B (Tris 50 mM, NaCI 0.9%, pH 7.4 (sin BSA)) a 37°C.

Procesamiento/análisis A. Puntos de tiempo de 24 minutos: Las células se digirieron durante toda la noche con NaOH 0.2N, 2 mL/pozo a temperatura ambiente. Una alícuota de 1.5 mL se removió a partir de cada pozo, se neutralizó y se contó para radioactividad mediante conteo por centelleo. B. Punto de tiempo de 4 horas: Las células digeridas se analizaron mediante cromatografía en capa fina para determinar el contenido de éster de colesterol en las células. Los extractos se colocaron sobre placas de cromatografía de capa fina y se corrieron en 2 mi de fase móvil de hexano:isopropanol (3:2) por 30 minutos, seguido por una segunda corrida en 1 mi de fase móvil de hexano:isopropanol (3:2) por 15 minutos. C. Determinación de proteína de extractos celulares. Las placas que contienen una muestra de los extractos celulares se colocaron sobre un agitador orbital a 120 rpm por tiempos indicados y luego los extractos se agrupan en tubos de 12 X 75. Las placas se secaron y se añadió NAOH (2 ml/pozo). Se determinó el contenido de proteína en las muestras. Dos alícuotas adicionales de 50 µ? a partir de todos los pozos se ensayaron para proteína total mediante el método de Pierce micro BCA. La cantidad de colesterol marcado observada en las células se normalizó a la cantidad de proteína en las células.

CUADRO 7 Toma de colesterol marcado en células CHO transfectadas de manera transitoria Colesterol total, ± sem dpm dpm/mg de proteina Transfección Pulso de 24 min CHO control (sin 4721 + 436 49024 ± 4328 tratamiento) SR-B1 5842 ± 82 59445 ± 1099 (transitorio) NPC1 L1 4092 ± 377 47026 + 2658 (transitorio) SR-B1/NPC1 L1 3833 ± 158 52132 ± 3071 (transitorio) Ester de colesterol, ± sem dpm dpm/mg de proteína Pulso de 4 hr CHO control (sin 2132 + 40 20497 ± 640 tratamiento) SR-B1 5918 ± 237 51812 ± 1417 (transitorio) NPC1L1 1944 ± 93 19788 ± 642 (transitorio) SR-B1/NPC1 L1 4747 ± 39 58603 ± 1156 (transitorio) Colesterol libre, ± sem dpm dpm/mg de proteína Pulso de 4 hr CHO control (sin 45729 + 328 439346 ± 5389 tratamiento) SR-B1 50820 ± 2369 444551 ± 9785 (transitorio) Colesterol libre, ± sem dpm dpm/mg de proteína Pulso de 4 hr NPC1 L1 39913 ± 1211 406615 ± 6820 (transitorio) SR-B1/NPC1 L1 37269 + 1225 459509 ± 6195 (transitorio) EJEMPLO 21 Expresión de NPC1L1 de rata, ratón y humano En este ejemplo, NPC1L1 se introdujo dentro de las células y se expresó. Las especies de las construcciones de expresión especificas de NPC1 L1 se clonaron dentro del plásmido pCADN3 utilizando iniciadores de PCR específicos de clona para generar el ORF flanqueado por sitios de restricción apropiados compatibles con el polienlazador del vector. Para las tres especies de ARN total de NPC1 L1 , el tejido de intestino delgado se utilizó como un molde para transcriptasa reversa-reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) utilizando oligo dT como el iniciador molde. El NPC1L1 de rata se clonó como un fragmento de EcoRI, el NPC1L1 de humano se clonó como un fragmento de Xbal/Notl y el NPC1L1 de ratón se clonó como un fragmento de EcoRI. La secuencia de las cadenas hacia adelante y reversa de cada clona se llevó a cabo para confirmar la integridad de secuencia. Los procedimientos de transfección transitoria estándar se utilizaron con células CHO. En una placa de 6-pozos se sembraron células CHO 1 día antes de la transfección a una densidad de sembrado de 2 X105 células/pozo. El siguiente día, las células se incubaron con 2 µg de ADN plasmídico y 6 µ?_ de Lipofectamina por 5 horas seguido de un cambio de medio recientemente preparado. Cuarenta y ocho horas después, las células se analizaron para expresión de NPC1L1 utilizando antisuero anti-NPC1L1 ya sea mediante FACS o western biot. Para establecer líneas celulares estables a largo plazo que expresan NPC1L1 , las células CHO transfectadas se seleccionaron en la presencia de geneticina (G418, 0.8 mg/ml) como se recomienda por el fabricante (Life Technologies). Siguiendo a un mes de selección en cultivo, la población celular se tiñó con antisuero anti-NPC1 L1 y se clasificó mediante FACS. Las células teñidas positivamente se clonaron después del aislamiento mediante dilución limitante y luego se mantuvieron en medio para selección que contiene geneticina (0.5mg/ml). Se han generado otros tipos celulares menos susceptibles al procedimiento de transfección utilizando sistemas de vector adenoviral. Este sistema que se utilizó para expresar NPC1 L1 se derivó a partir de un adenovirus tipo C Ad 5. Este vector adenoviral defectuoso en replicación recombinante se hace defectuoso a través de modificaciones de las regiones E1 , E2 y E4. El vector también tiene modificaciones adicionales a la región E3 que generalmente afecta la región E3b de los genes RIDa y RIDb. La expresión de NPC1 L1 se dirigió utilizando el promotor CMV como un cassette de expresión sustituido en la región E3 del adenovirus. El NPC1L1 de rata y de ratón se amplificaron utilizando iniciadores específicos de la clona flanqueados por sitios de restricción compatibles con el vector adenovirus. Las partículas infecciosas de adenovirus se produjeron a partir de células 293-D22 en títulos de 5 X1010 P/mL. Los lisados vírales se utilizaron para infectar a las células resistentes a las metodologías estándares de transfección. En las células Caco2, las cuales son altamente resistenten a la expresión de la proteína heteróloga, la expresión de NPC1L1 mediada por adenovirus se ha mostrado mediante análisis de western blot para persistir por al menos 21 días post-infección.

EJEMPLO 22 Knock-Out de NPC1L1 en ratón transqénico Los ratones knockout de NPC1L1 se construyeron mediante mutagénesis dirigida. Esta metodología utilizó un diseño de construcción dirigida para deletar una región específica del ratón gen de NPC1L1. Durante el procedimiento de direccionamiento el gen reportero lacZ de E. coli se insertó bajo el control del promotor NPC1L1 endógeno. La región en NPC1L1 (SEQ ID NO: 45) a ser deletada es a partir del nucleótido 790 al nucleótido 998. El vector de direccionamiento contiene el cassette LacZ-Neo flanqueado por el brazo de 1.9 kb hacia 5' que termina con el nucleótido 789 y un brazo de 3.2 kb hacia 3* que inicia con el nucleótido 999. El ADN genómico a partir de la línea de célula madre embrionaria recombinante se ensayó para recombinación homologa utilizando PCR. Los fragmentos de ADN amplificados se visualizaron mediante electroforesis en gel de agarosa. Las pruebas de PCRs emplearon un iniciador específico del gen, el cual yace fuera y adyacente al brazo del vector de direccionamiento, apareado con uno de tres iniciadores específicos a la secuencia del cassette LacZ-Neo. Para la reconfirmación del PCR hacia 5', se utilizó el oligonucleótido específico al NPC1L1 ATGTTAGGTGAGTCTGAACCTACCC (SEQ ID NO: 46) y para la reconfirmación del PCR hacia 3" se utilizó el oligonucleótido específico al NPC1L 1 GGATTGCATTTCCTTCAA GAAAGCC (SEQ ID NO: 47). La genotipificación de los ratones F2 se llevó a cabo mediante PCR múltiplex utilizando el iniciador hacia adelante específico a NPC1L 1 TATGGCTCTGCCC TCTGCAATGCTC (SEQ ID NO: 48) el iniciador hacia adelante específico al cassette LacZ-Neo TCAGCAGCCTCTGTTCCACATACACTTC (SEQ ID NO: 49) en combinación con el iniciador reverso específico al gen NPC1L1 GTTCCACAGGGTCTGTGGTGAGTTC (SEQ ID NO: 50) permitieron la determinación de ambos alelos dirigidos y endógenos. El análisis de los productos de PCR mediante electroforesis en gel de agarosa distinguieron entre sí al ratón de tipo silvestre, heterocigoto y homocigoto sin afección. La presente invención no se limita en su alcance por las modalidades específicas descritas en la presente invención. De hecho, serán evidentes a aquellos expertos en la técnica diversas modificaciones de la invención además de aquellas descritas en la presente invención a partir de la descripción precedente. Se pretende que dichas modificaciones caigan dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. Las patentes, solicitudes de patente, publicaciones, descripciones del producto, número de acceso del Genbank y protocolos se citan a lo largo de esta solicitud, la descripción de las cuales se incorpora en la presente invención como referencia en su totalidad para todos los propósitos.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> Schering Corporation PC1L1 (NPC3) Y METODOS DE USO DEL MISMO JB01603-K-WI <160> 50 <170> Patentln versión 3.1 <210> 1 <211> 3996 <212> AD <213> Rattus sp. <220> <221> CDS <222> (1)..13996) <223> <400> 1 atg gca gct gcc tgg ctg gga tgg ctg ctc tgg gcc ctg ctc ctg age 48 Met Ala Ala Ala Trp Leu Gly Trp Leu Leu Trp Ala Leu Leu Leu Ser 1 5 10 15 gcg gcc cag ggt gag cta tac acá ecc aaa cac gaa gct ggg gtc tgc 96 Ala Ala Gln Gly Glu Leu Tyr Thr Pro Lys His Glu Ala Gly Val Cys 20 25 30 acc ttt tac gaa gag tgc ggg aaa aac cea gag ctc tct gga ggc ctc 144 Thr Phe Tyr Glu Glu Cys Gly Lys Asn Pro Glu leu Ser Gly Gly Leu 35 40 45 acg tea cta tcc aat gta tcc tgc ctg tct aac acc ccg gcc cgc cac 192 Thr Ser Leu Ser Asn Val Ser Cys Leu Ser Asn Thr Pro Ala Arg His 50 55 60 gtc acg ggt gaa cac ctg gct ctt ctc cag cgc atc tgt ccc cgc ctg 240 Val Thr Gly Glu His Leu Ala Leu Leu Gln Arg lie Cys Pro Arg Leu 65 70 75 80 tac aac ggc ccc aat acc act ttt gcc tgt tgc tct acc aag cag ctg 288 Tyr Asn Gly Pro Asn Thr Thr Phe Ala Cys Cys Ser Thr Lys Gln Leu 85 90 95 ctg tcc tta gaa age age atg tec atc acc aag gcc ctt ctc acg cgc 33>i Leu Ser Leu Glu Ser Ser Met Ser lie Thr Lys Ala Leu Leu Thr Arg 100 105 110 tgc ceg gcc tgc tct gac aat ttt gtg age tta cac tgc cac aac act 384 Cys Pro Ala Cys Ser Asp Asn Phe Val Ser Leu His Cys His Asn Thr 115 120 125 tgc age ect gac cag age ctc ttc atc aac gtc acc cgg gtg gtt gag 432 Cys Ser Pro Asp Gln Ser Leu Phe lie Asn Val Thr Arg Val Val Glu 130 135 140 cgg ggc gct gga gag ect ect gcc gtg gtg gcc tat gag gcc ttt tat 480 Arg Gly Ala Gly Glu Pro Pro Ala Val Val Ala Tyr Glu Ala Phe Tyr 145 150 155 160 cag cgc age ttt gct gag aag gcc tat gag tcc tgc age cag gtg cgc 523 Gln Arg Ser Phe Ala Glu Lys Ala Tyr Glu Ser Cys Ser Gln Val Arg 165 170 175 atc ect gcg gcc gct tcc ttg gcc gtg ggc age atg tgt gga gtg tat 576 lie Pro Ala Ala Ala Ser Leu Ala Val Gly Ser Met Cys Gly Val Tyr 180 185 190 ggc tcc gcc ctc tgc aat gct cag cgc tgg ctc aac 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aac aag gca gaa ggc ccc cag 960 Leu Arg Val Val Ser Asn Arg Asn Lys Asn Lys Ala Glu Gly Pro Gln 305 310 315 320 gaa gcc ccc aaa ctc cct cat aag cae aaa ctc tea ecc cat acc acc 1008 Glu Ala Pro Lys Leu Pro His Lys His Lys Leu Ser Pro His Thr lie 325 330 335 ctg ggc cgg ttc ttc cag aac tgg ggc acá agg gtg gcc teg tgg cea 1056 Leu Gly Arg Phe P ie Gln Asn Trp Gly Thr Arg Val Ala Ser Trp Pro 340 345 350 ctc acc gtc tta gca ctg tec ttc ate gtt gtg ata gcc tta gca gca 1104 Leu Thr Val Leu Ala Leu Ser Phe lie Val Val lie Ala Leu Ala Ala 355 360 365 ggc ctg acc ttt att gaa ctc acc acá gac cct gtg gaa ctg tgg tcg 1152 Gly Leu Thr Pha lie Glu Leu Thr Thr Asp Pro Val Glu Leu Trp Ser 370 375 380 gcc ccc aag age cag gcc cgg aaa gag aag tet ttc cat gat gag cat 1200 Ala Pro Lys Ser Gln Ala Arg Lys Glu Lys Ser Phe His Asp Glu His 385 390 395 400 ttc ggc ccc ttc ttt cga acc aac cag att ttc gtg ac gct cgg aac 1248 Phe Gly Pro Phe Phe Arg Thr Asn Gln lie Phe Val Thr Ala Arg Asn 405 410 415 agg tec age tac aag tac gac tec cta ctg cta ggg tec aag aac ttc 1296 Arg Ser Ser Tyr Lys Tyr Asp Ser Leu Leu Leu Gly Ser Lys Asn Phe 420 425 430 agt ggg ate ctg tec ctg gac ttc ctg ctg gag ctg ctg gag ctt cag 1344 Ser Gly lie Leu Ser Leu Asp Phe Leu Leu Glu Leu Leu Glu Leu Gln 435 440 445 gag agg ctt cga cae ctg caá gtg tgg tec cct gag gca gag cgc aac 1392 Glu Arg Leu Arg His Leu GLn Val Trp Ser Pro Glu Ala Glu Arg Asn 450 455 460 ate tec ctc cag gac ate tgc tat gcc ccc ctc aac cea tat aac acc 1440 lie Ser Leu Gln Asp lie Cys Tyr Ala Pro Leu Asn Pro Tyr Asn Thr 465 470 475 480 age ctc tec gac tgc tgt gtc aac age ctc ctt cag tac ttc cag aac 1488 Ser Leu Ser Asp Cys Cys Val Asn Ser Leu Leu Gln Tyr Phe Gln Asn 485 490 495 aac cgc acc ctc ctg atg ctc acg gcc aac cag act ctg aat ggc cag 1536 Asn Arg Thr Leu Leu Met Leu Thr Ala Asn Gln Thr Leu Asn Gly Gln 500 505 510 acc tec ctg gtg gac tgg aag gac cat ttc ctc tac tgt gca aat gcc 1584 Thr Ser Leu Val Asp Trp Lys Asp His Phe Leu Tyr Cya Ala Asn Ala 515 520 525 cct ote acg ttc aaa gat ggc acg tet ctg gcc ctg age tgc atg gct 1632 Pro Leu Thr Phe Lys Asp Gly Thr Ser Leu Ala Leu Ser Cys Met Ala 530 535 540 gac tac ggg gct cct gtc ttc ccc ttc ctt gct gtt ggg gga tac caá 16T0 Asp Tyr Gly Ala Pro Val Phe Pro Phe Leu Ala Val Gly Gly Tyr Gln 545 550 555 560 ggc acg gac tat tcc gag gca gaa gcg ctg ate ata acc ttc tct ctc 1728 Gly Thr Aap Tyr Ser Glu Ala Glu Ala Leu lie lie Thr Phe Ser Leu 565 570 575 aat aac tac ecc gct gat gat ecc cgc atg gee cag gee aag ctc tgg 1776 Asn Asn Tyr Pro Ala Asp Asp Pro Arg Met Ala Gln Ala Lys Leu Trp 580 585 590 gag gag gct ttc ttg aag gaa atg gaa tcc ttc cag agg aac acá agt 1824 Glu Glu Ala Phe Leu Lys Glu Met Glu Ser Phe Gln Arg Asn Thr Ser 595 600 605 gac aag ttc cag gtt gcg ttc tea gct gag cgc tct ctg gag gat gag 1872 Asp Lys Phe Gln Val Ala Phe Ser Ala Glu Arg Ser Leu Glu Asp Glu 610 615 620 ate aac cgc acc acc ate cag gac ctg ect gtc ttt gee gtc age tac 1920 lie Asn Arg Thr Thr lie Gln Asp Leu Pro Val Phe Ala Val Ser Tyr 625 630 63S 640 att ate gtc ttc ctg tac ate tcc ctg gee ctg ggc age tac tcc aga 1968 lie lie Val Phe Leu Tyr lie Ser Leu Ala Leu Gly Ser Tyr Ser Arg 645 650 655 tgc age cga gta gcg gtg gag tcc aag gct act ctg ggc cta ggt ggg 2016 Cys Ser Arg Val Ala Val Glu Ser Lys Ala Thr Leu Gly Leu Gly Gly 660 665 670 gtg att gtt gtg ctg gga gca gtt ctg gct gee atg ggc ttc tac tcc 2064 Val lie Val Val Leu Gly Ala Val Leu Ala Ala Met Gly Phe Tyr Ser 675 680 685 tac ctg ggt gtc ecc tct tct ctg gtt ate ate caá gtg gta ect ttc 2112 Tyr Leu Gly Val Pro Ser Ser Leu Val lie lie Gln Val Val Pro Phe 690 69S 700 ctg gtg cta gct gtg gga gct gac aac ate ttc ate ttt gtt ctt gag 2160 Leu Val Leu Ala Val Gly Ala Aap Asn lie Phe lie Phe Val Leu Glu 705 710 71S 720 tac cag agg cta ect agg atg ect ggg gaa cag cga gag gct cae att 2208 Tyr Gln Arg Leu Pro Arg Met Pro Gly Glu Gln Arg Glu Ala Hia lie 725 730 735 ggc cgc acc ctg ggc agt gtg gee ecc age atg ctg ctg tgc age ctc 2256 Gly Arg Thr Leu Gly Ser val Ala Pro Ser Met Leu Leu Cys Ser Leu 740 745 750 tct gag gee ate tgc ttc ttt cta ggg gee ctg acc ecc atg cea gct 2304 Ser Glu Ala lie Cys Phe Phe Leu Gly Ala Leu Thr Pro Met Pro Ala 755 760 765 gtg agg acc ttc gee ttg acc tct ggc tta gca att ate ctc gac ttc 2352 Val Arg Thr Phe Ala Leu Thr Ser Gly Leu Ala lie lie Leu Asp Phe 770 775 780 ctg ctc cag atg act gee ttt gtg gee ctg ctc tcc ctg gat age aag 2400 Leu Leu Gln Met Thr Ala Phe Val Ala Leu Leu Ser Leu Asp Ser Lys 785 790 795 800 IOS a g cag gag gcc tct cgc ccg gat gtc tta tgc tgc ttt tea acc cgg 2448 Az-g Gln Glu Ala Ser Arg Pro Asp Val Leu Cys Cys Phe Ser Thr Arg SOS 810 815 aag ctg ecc cea ect aaa gaa aaa gaa ggc ctc tta ctc cgc ttc tt 2496 Lys Leu Pro Pro Pro Lys Glu Lys Glu Gly Leu Leu Leu Arg Phe Phe 820 825 930 cgc aag ata tac gct ect ttc ctg ctg cae aga ttc ate cgc ect gtt 2544 Arg Lys lie Tyr Ala Pro Phe Leu Leu His Arg Phe lie Arg Pro Val 835 840 845 gtg atg ctg ctg ttt ctg acc ctg ttt gga gca aat ctc tac tta atg 2592 Val Met Leu Leu Phe Leu Thr Leu Phe Gly Ala Asn Leu Tyr Leu Met 850 855 860 tgc aac ate aac gtg ggg cta gac cag gag ctg gct ctg ecc aag gac 2640 Cys Aan lie Asn Val Gly Leu Asp Gln Glu Leu Ala Leu Pro Lys Asp 865 870 875 880 teg tac ttg ata gac tac ttc ctc ttt ctg aac cga tac ctt gaa gtg 2688 Ser Tyr Leu lie Asp Tyr Phe Leu Phe Leu Asn Arg Tyr Leu Glu Val 885 890 895 ggg ect cea gtg tac ttt gtc acc acc teg ggc ttc aac ttc tec age 2736 Gly Pro Pro Val Tyr Phe Val Thr Thr Ser Gly Phe Asn Phe Ser Ser 900 905 910 gag gca ggc atg aac gcc act tgc tct age gca ggc tgt aag age ttc 2784 Glu Ala Gly Met Asn Ala Thr Cys Ser Ser Ala Gly Cys Lys Ser Phe 915 920 925 tec cta acc cag aaa ate cag tat gcc agt gaa ttc ect gac cag tct 2832 Ser Leu Thr Gln Lys lie Gln Tyr Ala Ser Glu Phe Pro Asp Gln Ser 930 935 940 tac gtg gct att gct gca tec tec tgg gta gat gac ttc ate gac tgg 2880 Tyr Val Ala lie Ala Ala Ser Ser Trp Val Asp Asp Phe lie Asp Trp 945 950 955 960 ctg acc ccg tec tec tec tgc tgt cgc ctt tat 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Val Gly Met Ser Val Glu Phe Val Ser His lie Thr Arg 1175 1130 1185 tec ttt gct gta age acc aag ect acc cgg ctg gag agg gct aaa 3609 Ser Phe Ala Val Ser Thr Lys Pro Thr Arg Leu Glu Arg Ala Lys 1190 1135 1200 gat gct ace gtc tec acg ggc agt gcg gtg tet gct gga gtg gee 3654 Asp Ala Thr Val Phe Mee Gly Ser Ala Val Phe Ala Gly Val Ala 1205 1210 1215 atg acc aac ttc cea ggc ate etc ate ttg ggc ttt gee caá gee 3699 Met Thr Asn Phe Pro Gly lie Leu lie Leu Gly Phe Ala Gln Ala 1220 1225 1230 cag ctt att cag ate etc ttc ttc cgc etc aac ctt ctg ate acc 3744 Gln Leu lie Gln lie Phe Phe Phe Axg Leu Asn Leu Leu lie Thr 1235 1240 1245 ttg ctg ggt ctg ctg cat ggc etg gtc ttc ctg ceg gtt gtc etc 3789 Leu Leu Gly Leu Leu His Gly Leu Val Phe Leu Pro Val Val Leu 1250 1255 1260 age tat ctg gga cea gac gtt aac caá gct ctg gta cag gag gag 3834 Ser Tyr Leu Gly Ero Asp Val Asn Gln Ala Leu Val Gln Glu Glu 1265 1270 1275 aaa cta gcc age gag gca g a gtg gcc cea gag ect tcC tgc cea Lys Leu Ala Ser Glu Ala Ala Val Ala Pro Glu Pro Ser Cys Pro 1280 12B5 1290 cag tac ccc tec ect gct gat gcg gat gcc aat gtt aac tac ggc Gln Tyr Pro Ser Pro Ala Asp Ala Asp Ala Asn Val Asn Tyr Gly 1295 1300 1305 ttt gcc cea gaa ctt gcc cae gga gct aat gct gct aga age tet Phe Ala Pro Glu Leu Ala His Gly Ala Asn Ala Ala Arg Ser Ser 1310 1315 1320 ttg ccc aaa agt gac caá ttc taa 3996 Leu Pro Lys Ser Asp Gln Phe 1325 <210> 2 <211> 1331 <212> PRT <213> atCus sp. <400> 2 Met Ala Ala Ala Trp Leu Gly Trp Leu Leu Trp Ala Leu Leu Leu Ser 1 5 10 15 Ala Ala Gln Gly Glu Leu Tyr Thr Pro Lys His Glu Ala Gly Val Cys 20 25 30 Thr Phe Tyr Glu Glu Cys Gly Lys Asn Pro Glu Leu Ser Gly Gly Leu 35 40 45 Thr Ser Leu Ser Asn Val Ser Cys Leu Ser Asn Thr Pro Ala Arg Hia 50 55 60 Val Thr Gly Glu His Leu Ala Leu Leu Gln Arg lie Cys Pro Arg Leu 65 70 75 80 Tyr Asn Gly Pro Asn Thr Thr Phe Ala Cys Cys Ser Thr Lys Gln Leu 85 90 95 Leu Ser Leu Glu Ser Ser Met Ser lie Thr Lys Ala Leu Leu Thr Arg 100 105 110 Cys Pro Ala Cys Ser Asp Asn Phe Val Ser Leu His Cys His Asn Thr 11 I 115 120 125 Cys Ser Pro Asp Gln Ser Leu Phe lie Asn Val Thr Arg Val Val Glu 130 135 140 Arg Gly Ala Gly Glu Pro Pro Ala Val Val Ala Tyr Glu Ala Phe Tyr 145 150 155 160 Gln Arg Ser Phe Ala Glu Lys Ala Tyr Glu Ser Cys Ser Gln Val Arg 165 170 175 lie Pro Ala Ala Ala Ser Leu Ala Val Gly Ser Met Cys Gly Val Tyr 180 185 190 Gly Ser Ala Leu Cys Asn Ala Gln Arg Trp Leu Asn Phe Gln Gly Asp 195 200 205 Thr Gly Asn Gly Leu Ala Pra Leu Asp lie Thr Phe His Leu Leu Glu 210 215 220 Pro Gly Gln Ala Leu Pro Asp Gly lie Gln Pro Leu Asn Gly Lys lie 225 230 235 240 Ala Pro Cys Asn Glu Ser Gln Gly Asp Asp Ser Ala Val Cys Ser Cys 245 250 255 Gln Asp Cys Ala Ala Ser Cys Pro Val lie Pro Pro Pro Glu Ala Leu 260 265 270 Arg Pro Ser Phe Tyr Mee Gly Arg Met Pro Gly Trp Leu Ala Leu lie 275 280 285 lie lie Phe Thr Ala Val Phe Val Leu Leu Ser Ala Val Leu Val Arg 290 295 300 Leu Arg Val Val Ser Asn Arg Asn Lys Asn Lys Ala Glu Gly Pro Gln 305 310 315 320 Glu Ala Pro Lys Leu Pro His Lys His Lys 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Ala Ser Cys Pro 1280 12B5 1290 aat cae ccc tcc cga gtc tcc acá gct gac aac ate tat gtc aac 3924 Asn His Pro Ser Arg Val Ser Thr Ala Asp Asn lie Tyr Val Asn 1295 1300 130S cae age ttt gaa ggt tet ate aaa ggt gct ggt gcc ate age aac 3969 His Ser Phe Glu Gly Ser lie Lys Gly Ala Gly Ala lie Ser Asn 1310 1315 1320 ttc ttg ccc aac aat ggg cgg cag ttc tga 3999 Phe Leu Pro Asn Asn Gly Arg Gln Phe 1325 1330 <211> 1332 <212> PRT < 13> Homo sapiens <400> 4 Met Ala Glu Ala Gly Leu Arg Gly Trp Leu Leu Trp Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 Axg Leu Ala Gln Ser Glu Pro Tyr Thr Thr lie His Gln Pro Gly Tyr 20 25 30 Cys Ala Phe Tyr Asp Glu Cys Gly Lys Asn Pro Glu Leu Ser Gly Ser 35 40 45 Leu Met Thr Leu Ser Asn Val Ser Cys Leu Ser Asn Thr Pro Ala Arg 50 55 60 Lys lie Thr Gly Asp His Leu lie Leu Leu Gln Lys lie Cys Pro Arg 65 70 75 80 Leu Tyr Thr Gly Pro Asn Thr Gln Ala Cys Cys Ser Ala Lys Gln Leu 85 90 « Val Ser Leu Glu Ala Ser Leu Ser lie Thx Lys Ala Leu Leu Thx Arg 100 105 110 Cys Pro Ala Cys Ser Asp Asn Phe Val Asn Leu His Cys His Asn Thr 115 120 125" Cys Ser Pro Asn Gln Ser Leu Phe lie Asn Val Thr Arg Val Ala Gln 130 135 140 Leu Gly Ala Gly Gln Leu Pro Ala Val Val Ala Tyr Glu Ala Phe Tyr 145 150 155 160 Gln His Ser Phe Ala Glu Gln Ser Tyr Asp Ser Cys Ser Arg Val Arg 165 170 175 Val Pro Alo Ala Ala Thr Leu Ala Val Gly Thr Met Cys Gly Val Tyr 180 185 190 Gly Ser Ala Leu Cys Asn Ala Gln Arg Trp Leu Asn Phe Gln Gly Asp 195 200 205 Thr Gly Asn Gly Leu Ala Pro Leu Asp lie Thr Phe His Leu Leu Glu 210 215 220 Pro Gly Gln Ala Val Gly Ser Gly lie Gln Pro Leu Asn Glu Oly Val 225 230 235 240 Ala Arg Cys Asn Glu Ser Gln Gly Asp Asp Val Ala Thr Cys Ser Cys 245 250 255 Gln Asp Cys Ala Ala Ser Cys Pro Ala lie Ala Arg Pro Gln Ala Leu 260 265 270 Asp Ser Thr Phe Tyr Leu Gly Gln Met Pro Gly Ser Leu Val Leu lie 275 280 285 lie ríe Leu Cys Ser Val Phe Ala Val Val Thr lie Leu Leu Val Gly 290 295 300 Phe Arg Val Ala Pro Ala Arg Asp Lys Ser Lys Mee Val Asp Pro Lys 305 310 315 320 Lys Gly Thr Ser Leu Ser Asp Lys Leu Ser Phe Ser Thr His Thr Leu 325 330 335 Leu Gly Gln Phe Phe Gln Gly Trp Gly Thr Trp Val Ala Ser Trp Pro 340 345 350 Leu Thr lie Leu Val Leu Ser Val lie Pro Val Val Ala Leu Ala Ala 355 360 365 Gly Leu Val Phe Thr Glu Leu Thr Thr Asp Pro Val Glu Leu Trp Ser 370 375 380 Ala Pro Asn Ser Gln Ala Arg Ser Glu Lys Ala Phe His Asp Gln Hia 385 390 395 400 Phe Gly Pro Phe Phe Arg Thr Asn Gln Val lie Leu Thr Ala Pro Asn 405 410 415 Arg Ser Ser Tyr Arg Tyr Asp Ser Leu Leu Leu Gly Pro Lys Asn Phe 420 425 430 Ser Gly lie Leu Asp Leu Asp Leu Leu Leu Glu Leu Leu Glu Leu Gln 435 440 445 Glu Arg Leu Arg His Leu Gln Val Trp Ser Pro Glu Ala Gln Arg Asn 450 455 460 lie Ser Leu Gln Asp lie Cys Tyr Ala Pro Leu Asn Pro Asp Asn Thr 465 470 475 480 Ser Leu Tyr Asp Cys Cys lie Asn Ser Leu Leu Gln Tyr Phe Gln Asn 485 490 495 Asn Arg Thr Leu Leu Leu Leu Thr Ala Asn Gln Thr Leu Met Gly Gln 500 505 510 Thr Ser Gln Val Asp Trp Lys Asp His Phe Leu Tyr Cys Ala Asn Ala 515 520 525 Pro Leu Thr Phe Lys Asp Gly Thr Ala Leu Ala Leu Ser Cys Met Ala 530 535 540 Asp Tyr Gly Ala Pro Val Phe Pro Phe Leu Ala lie Gly Gly Tyr Lys 545 550 555 560 Gly Lys Asp Tyr Ser Glu Ala Glu Ala Leu lie Met Thr Phe Ser Leu 565 570 575 Asn Asn Tyr Pro Ala Gly Asp Pro Arg Leu Ala Gln Ala Lys Leu Trp 580 585 590 Glu Glu Ala Phe Leu Glu Glu Met Arg Ala Phe Gln Arg Arg Met Ala 595 600 605 Gly Met Phe Gln Val Thx Phe Thr Ala Glu Arg Ser Leu Glu Asp Glu 610 615 620 lie Asn Arg Thr Thr Ala Glu Asp Leu Pro lie Phe Ala Thr Ser Tyr 625 630 635 640 al lie Phe Leu Tyr lie Ser Leu Ala Leu Gly Ser Tyr Ser Ser 645 650 655 Trp Ser Arg Val Met Val Asp Ser Lys Ala Thr Leu Gly Leu Gly Gly 660 665 670 Val Ala Val Val Leu Gly Ala Val Met Ala Ala Met Gly Phe Phe Ser Tyr Leu Gly lie Arg Ser Ser Leu Val lie Leu Gln Val Val Pro Phe 690 695 700 Leu Val Leu Ser Val Gly Ala Asp Asn lie Phe lie Phe Val Leu Glu 705 710 715 720 Tyr Gln Arg Leu Pro Arg Arg Pro Gly Glu Pro Arg Glu Val His lie 725 730 735 Gly Arg Ala Leu Gly Arg Val Ala Pro Ser Met Leu Leu 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acatctgcta tgcccccctc aacccatata acaccagcct ctccgactgc tgtgtcaaca 120 gcctccttca gtacttccag aacaaccgca ccctcctgat gctcacggcc aaccagactc 180 tgaatggcca gacctccctg gtggactgga aggaccattt cctctactgt gcaaatgccc 240 ctctcacgtt caaagatggc acgtctctgg ccctgagctg catggctgac tacggggctc 300 ctgtcttccc cttccttgct gttgggggat accaaggcac ggactattcc gaggcagaag 360 ^ cgctgatcat aaccttctct ctcaataact accccgctga tgatccccgc atggcccagg 420 ccaagctctg ggaggaggct tc gaagg aaatggaatc cttccagagg aacacaagtg 180 acaagt cca ggttgcgttc tcagctgagc gctctctgga ggacgagatc aaccgcacca 540 ccatccagga cctgcctgtc tttgccgtca gctacattat cgtcttcctg tacatctccc 600 tggccctggg cagctactcc agatgcagcc gagtagcggt ggagtccaag gctactctgg 660 gcctaggtgg ggtgatagtg tgctgggagc agttctggct tgcatggggc ttctaactcc 720 tacctgggtg tcccctcttc tctggttatc atccaagtgg tacctttcct ggtgcttaag 780 ctgtgggagc tggacacatc tacatcctag acttgagtac cagaggtacc taggaagccg 840 cggaacagcg aaaaggacac attgggcgca ccctgggcat gtggc 885 <210> 6 <211> 458 <212> ADN <213> Rattus <400> 6 gaccagatgt taaccaagct ctggtacagg aggagaaact agccagcgag gcagcagtgg 60 ccccagagcc ttcttgccca cagtacccct cccctgctga tgcggatgcc aatgttaact 120 acggctttgc cccagaactt gcccacggag ctaatgctgc tagaagctct ttgcccaaaa 180 gtgaccaaaa gttctaatgg agtaggagct tgtccatgct tctgctgatg agggatcatg 240 aaggtcttcc ctctggttgt cctcaaggcc tggggggagg ctgttcagag aaaaatggct 300 ggcattcctg ccacgaggca accggcagct tggcactgac tccttggtct cataggtccc 360 taaggcttgg tcagattact cctcatggag agactatctt aagtatctaa gctatcgatt 420 gggatgcatc gctgttcatc aaaaaggcta tggctatg 458 <210> 7 211> 896 212> AEW 213> Rattus sp. <4O0> 7 ccacgcgtcc gcagtttcat aagtacctgc cctggttcct gaatgacccg cccaatatca 60 gaCgtcccaa agggggtcta gcagcgtata gaacgtctgt gaatttgagc tcagatggcc 120 aggttatagc ctcccagttc atggcctacc acaagcectt aaggaactca caggac tca 1S0 cagaagctct ccgggcgtcc cggttgctag cagccaacat cacagctgac ctacggaagg 240 tgcctgggac agatccaaac tttgaggtct tcccttacac gatctccaac gtgttctacc 300 agcaataccc gacggtcctt cctgagggaa tcttcaccct tgctctttgc tttgtgccca 360 cctttgttgc ctgctacctc ctactgggcc tggacatgtg ctcagggatc ctcaacctac 420 tctccatcat tatgattctc gtggacacca ttggcctcat ggctgtgtgg ggtatcagct 480 ataatgcggt atccctcatc aacc tgtca cggcagtggg catgtctgtg gagtttgtgt 540 cccacatcac tcggtccttt gcttgtaagc accaagccca cccggctgga gagggctaaa 600 agatgctact gtcttcatgg gcagtgcggt gtttgctgga gtggccatga ccaacttccc 660 aggcatcctc atcttggggg ctttgcccca agcccaggct tattcagatc ttcttcttcc 720 gcctcaaccC tctgatcacc tttgctgggg tctgctgcat ggctggtctt cctgcccggt 780 ttgtcctcag ctatctggga ccagatgtaa ccaaggctct gctacccgga ggagaaacta 840 gccagcgagg gcagcagtgg ccccagagac ttcttgccca caagtaccct tccctg 896 <210> 8 <211> 3124 <212> ADN <213> Rattus sp. <400> 8 tgcaagtgtg gtcccctgag gcagagcgca acatctccct ccaggacatc tgctatgccc 60 ccctcaaccc atataacacc agcctctccg actgctgtgt caacagcctc cttcagtact 120 tccagaacaa ccgcaccctc ctgatgctca cggccaacca gactctgaat ggccagacct 180 ccctggtgga ctggaaggac catttcctct actgtgcaaa tgcccctctc acgttcaaag 240 atggcacgtc 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cctaaagaaa aagaaggcct cttactccgc ttcttccgca 1140 agatatacgc tcctttcctg ctgcacagat tcatccgccc tgttgtgatg ctgctgtttc 1200 tgaccctgtt tggagcaaat ctctacttaa tgtgcaacat caacgtgggg ctagaccagg 1260 agctggctct gcccaaggac tcgtacttga tagactactt cctctttctg aaccgatacc 1320 ttgaagtggg gcctccagtg tactttgtca ccacc cggg cttcaacttc tccagcgagg 1380 caggcatgaa cgccacttgc t agcgcag gctgtaagag cttctcccta acccagaaaa 1440 tccagtatgc cagtgaattc cctgaccagt c tacgtggc tattgctgca tcctcctggg 1500 tagatgactt catcgactgg ctgaccccgt cctcctcctg ctgtcgcctt tatatacgtg 1560 gcccccataa ggatgagttc tgtccctcaa cggatacttc cttcaactgc ttaaaaaact 1620 gcatgaaccg cactctgggt cctgtgaggc ccacagcgga acagtttcat aagtacctgc 1680 cctggttcct gaatgatccg cccaatatca gatgtcccaa agggggtcta gcagcgtata 1740 gaacgtctgt gaatttgagc tcagatggcc aggttatagc ctcccagttc atggcctacc 1800 acaagccctc aaggaactca caggacttca cagaagc c ccgggcgtcc cggttgctag 1860 cagccaacat cacagctgac ctacggaagg tgcctgggac agatccaaac tttgaggtct 1920 tcccttacac gatctccaac gtgttctacc agcaatacct gacggtcctt cctgagggaa 1980 tcttcaccct tgctctttgc tttgtgccca cccttgttgt ctgctacctc ctactgggcc 2040 tggacatgtg ctcagggatc ctcaacctac tctccatcat tatgattctc gtggacacca 2100 ttggcctcat ggctgtgtgg ggtatcagct ataatgcggt atccctcatc aaccttgtca 2160 cggcagtggg catgtctgtg gagtttgtgt cccacatcac tcggtccttt gctgtaagca 2220 ccaagcctac ccggctggag agggctaaag atgctactgt cttcatgggc agtgcggtgt 2280 ttgctggagt ggccatgacc aacttcccag gcatcctcat cttgggcttt gcccaagccc 2340 agcttattca gatcttcttc ttccgcctca accttctgat caccttgctg ggtctgctgc 2400 atggcctggt cttcctgccg gttgtcctca gctatctggg accagatgtt aaccaagctc 2460 ^ tggtacagga ggagaaacta gccagcgagg cagcagtggc cccagagcct tcttgcccac 2520 agcacccctc ccctgctgat gcggatgcca atgttaacta cggctttgcc ccagaacttg 2580 cccacggagc taatgctgct agaagctctt tgcccaaaag tgaccaaaag ttctaatgga 2640 gtaggagctt gtccatgctt cttgctgatg agggatcatg aaggtcttcc ctctggttgt 2700 ccCcaaggcc tggggggagg ttgtttcaga gaaaaatggc tggcattcct gccacgaggc 2760 aaccggcagc attggcactg 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(4002) <223> <40O> 11 atg gca gct gee tgg cag gga Cgg ctg etc tgg gee ctg etc ctg aat 48 Met Ala Ala Ala Trp Gln Gly Trp Leu Leu Trp Ala Leu Leu Leu Asn 1 5 10 15 tcg gcc cag ggt gag ctc tac acá ccc act cae aaa gct ggc ttc tgc 96 Ser Ala Gln Gly Glu Leu Tyr Thr Pro Thr His Lys Ala Gly Phe Cys 20 25 30 acc ttt tat gaa gag tgt ggg aag aac cea gag ctt tet gga ggc tc 144 Thr Phe Tyr Glu Glu Cys Gly Lys Asn Pro Glu Leu Ser Gly Gly Leu 35 40 45 ^ acá tea cta tec aat ate tec tgc ttg tet aat acc cea gcc cgc cat 192 Thr Ser Leu Ser Asn lie Ser Cys Leu Ser Asn Thr Pro Ala Arg His 50 55 60 gtc acá ggt gac cae ctg gct ctt ctc cag cgc gtc tgt ccc cgc cta 240 Val Thr Gly Asp His Leu Ala Leu Leu Gln Arg Val Cys Pro Axg Leu 65 70 75 80 tac aat ggc ccc aat gac acc tat gcc tgt tgc tet acc aag cag ctg 288 Tyr Asn Gly Pro Asn Asp Thr Tyr Ala Cys Cys Ser Thr Lys Gln Leu 85 90 95 9C9 tca cta 9ac a9c a9c cc9 Cct atc acc aaCT occ ctc ctt aca C9C 336 Val Ser Leu Asp Ser Ser Leu Ser lie Thr Lys Ala Leu Leu Thr 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Leu Ser Leu Asp Leu Leu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Gln 435 440 415 gag aga ctt cga cae ctg caá gtg tgg tcc cat gag gca cag cgc aac 1392 Glu Arg Leu Arg His Leu Gln Val Trp Ser His Glu Ala Gln Arg Asn 450 455 460 ate tcc etc cag gac atc tgc tat gct ccc etc aac ccg cat aac acc 1440 lie Ser Leu Gln Asp lie Cys Tyr Ala Pro Leu Asn Pro His Asn Thr 465 470 475 480 age etc act gac tgc tgt gtc aac age etc ctt caá tac ttc cag aac 1488 Ser Leu Thr Asp Cys Cys Val Asn Ser Leu Leu Gln Tyr Phe Gln Asn 485 490 495 \40 ggc cgc acc ccg ggt agt gtg gcc ccc age atg ctg ctg tgc age etc Gly Arg Thr Leu Gly Ser Val Ala Pro Ser Met Leu Leu Cys Ser Leu 740 745 750 tet gag gcc ate tgc ttc ttt cta ggg gcc ctg acc tec atg cea gct Ser Glu Ala lie Cys Phe Phe Leu Gly Ala Leu Thr Ser Met Pro Ala 755 760 765 gtg agg acc ttt gcc ttg acc tet ggc tta gca ate ate ttt gac ttc Val Arg Thr Phe Ala Leu Thr Ser Gly Leu Ala lie lie Phe Asp Phe 770 775 790 ctg etc cag atg acá gcc ttt gtg gcc ctg etc tec ctg gat age aag Leu Leu 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cngcnaayca racnytnaay ggncaracnw snytngtnga ytggaargay 1560 cayttyytnt aytgygcnaa ygcnccnytn acntayaarg ayggnacngc nytngcnytn 1620 wsntgyathg cngaytaygg ngcnccngtn ttyccnttyy tngcngtngg nggntaycar 16B0 ggnacngayt aywsngargc ngargcnytn athathacnt tywsnathaa yaaytayccn 1740 gcngaygayc cnmgnatggc ncaygcnaar ytntgggarg argcnttyyt naargaratg 1800 carwsnttyc armgnwanac ngcngayaar ttycarathg cnttywsngc ngamgnwsn 1860 ytngargayg arathaaymg nacnacnath cargayytnc cngtnttygc nathwsntay 1920 ytnathgtnt tyytntayat hwsnytngcn ytnggnwsnt aywsmngntg g Bnmgngtn 1980 gcngtngayw snaargcnac nytnggnytn ggnggngtng cngtngtnyt nggngcngtn 2040 gtngcngcna tgggnttyta ywsntayytn. ggngtnccnw snwsnytngt natbathcar 2100 gtngtnccnt tyytngtnyt ngcngtnggn gcngayaaya t ttyathtt ygtnytngar 2160 taycanngny tnccnmgnat gccnggngar canngngarg cncayathgg nmgnacnytn 2220 ggnwangtng cnccnwanat gytnytntgy wsnytnwsng argcnathtg yttyttyytn 2280 ggngcnytna cnwsnatgcc ngcngtnmgn acnttygcny tnacnwsngg nytngcnath 2340 athttygayt tyytnytnca ratgacngcn ttygtngcny tnytnwsnyt ngaywsaaar 2400 mgncargarg cnwsnmgncc ngaygtngtn tgytgyttyw snwsnmgnaa yytnccnccn 2460 ccnaarcara argarggnyt nytnytntgy ttyttywgna arathtayac nccnttyytn 2520 ytncaymgnt tyathmgncc ngtngtnytn ytnytnttyy tngtnytntt yggngcnaay 2580 ytntayytna tgtgyaayat hwsngtnggn ytngaycarg ayytngcnyt nccnaargay 2640 wsntayytna thgaytaytt yytnttyytn aaymgntayy tngargtngg nccnccngtn 2700 tayttygaya cnacnwsngg ntayaaytty wsnacngarg cnggnatgaa ygcnathtgy 2760 wsnwsngcng gntgygarws nttywsnytn acncaraara thcartaygc nwsngart y 2820 ccnaaycarw sntaygtngc nathgcngcn wsnwsntggg tngaygayt yathgaytgg 2880 ytnacnccnw snwsnwsntg ytgymgnath. tayacnmgng gncci cayaa rgaygartty 2940 tgyccnwsna cngayacnws nttyaaytgy ytnaaraayt gyatgaaymg nacnytnggn 3000 ccngtnmgnc cnacnacnga rcarttycay aartayytnc cntggttyyt naaygayacn 3060 ccnaayathm gntgyccnaa rggnggnytn gcngcntaym gnacnwsngt naayy nwsn 3120 wsngayggnc arathathgc nwsncartty atggcntayc ayaarccnyt nmgnaaywsn 3180 cargaytty cngargcnyt nmgngcnwsn mgnytnytng cngcnaayat bacngcngar 3240 ytnmgnaarg tnccnggnac ngayccnaay ttygargtnt tyccntayac nathwsnaay 3300 gtnttytayc arcartayyt nacngtnytn ccngarggna thttyacnyt ngcnytntgy 3360 ygtnccna cnttygtngt ntgytayytn ytnytnggny tngayathmg nwsnggnath 3420 ytnaayytny tnwsnathat hatgathytn gtngayacna thggnytnat ggcngtntgg 3480 ggna hwsnt ayaaygcngt nwsnytnath aayytngtna cngcngtngg natgwsngtn 3540 gar ygtnw sncayat ac nzngnwsntty gcngtnwsna cnaarccnac nmgnytngar 3600 mgngcnaarg aygcnacnat httyatgggn wsngcngtnt tygcnggngt ngcnatgacn 3660 aay yccng gn thytnat hytnggntty gcncargcnc arytnathca ra httytty 3720 ttymgnytna ayytny nat hacnytnytn ggnytnytnc ayggnytngt nttyytnccn 3780 gtngtnytnw sntayytngg nccngaygtn aaycargcny tngtnytnga rgaraarytn 3840 gcnacngarg cngcnatggt nwsngarccn wsntgyccnc artayccntt ycc gcngay 3900 gcnaayacnw sngaytaygt naaytayggn t tyaayccng artt athcc ngara haay 3960 gcngcnwsnw snwsnytncc naarwsngay caraartty 3999 <210> 14 <211> 20 <212> ftEN <213> Secuencia artificial <220> 223 iniciador <400> 14 tctecaccct tgctctttgc 20 <210> 15 <211> 24 <212» ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> iniciador <400> 15 aatgacggag agCaggCtga ggat <210> 16 <211> 26 <212» ADN •=213> Secuencia Artificial <220> <223> iniciador <400> 16 tgcccacctt tgttgtctgc taccta <210> 17 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> iniciador <400> 17 atcgctgaca ggacgcagaa g <210> 18 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220» <223> iniciador <400> 18 tcaggaggag caatgatctt ga 22 <210> 19 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> iniciador <400> 19 agattactgc cccggctcct agcaccatta 30 <210> 20 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> iniciador <400 20 atcctcatcc tgggctttgc <210> 21 <211> 21 <212> AO <213> Secuencia Artificial <223> iniciador <400> 21 gcaaggtgac caggaggf.g a <210> 22 <211> 29 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> iniciador <400> 22 cccagcCtat ccagactttc tccttccgc ¦c210> 23 <211> 20 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Pro Glu Leu Ser Gly Ser Leu 35 40 45 atg acá ctc tec aac gtg tec tgc ctg tec aac acg ceg gcc cgc aag 251 Met Thr Leu Ser Asn Val Ser Cys Leu Ser Asn Thr Pro Ala Arg Lys 50 55 60 65 ate acá ggt gat cae ctg ate cta tta cag aag ate tgc ecc cgc ctc 299 lie Thr Gly Asp His Leu lie Leu Leu Gln Lys lie Cys Pro Arg Leu 70 75 80 tac acc ggc ecc aac acc caá gcc tgc tgc tec gcc aag cag ctg gta 347 Tyr Thr Gly Pro Asn Thr Gln Ala Cys Cys Ser Ala Lys Gln Leu Val 85 90 95 tea ctg gaa gcg agt ctg teg ate acc aag gcc ctc ctc acc cgc tgc 395 Ser Leu Glu Ala Ser Leu Ser lie Thr Lys Ala Leu Leu Thr Arg Cys 100 105 110 cea gcc tgc tet gac aat ttt gtg aac ctg cae tgc cae aac acg tgc 443 Pro Ala Cys Ser Asp Asn Phe Val Asn Leu His Cys His Asn Thr Cys 115 120 125 age cce aat cag age ctc ttc ate aat gtg acc cgc gtg gcc cag cta 491 Ser Pro Asn Gln Ser Leu Phe lie Asn Val Thr Arg Val Ala Gln Leu 130 135 140 145 ggg get gga caá ctc cea gct gtg gtg gcc tat gag gcc ttc tac cag 539 Gly Ala Gly Gln Leu Pro Ala Val Val Ala Tyr Glu Ala Phe Tyr Gln 150 155 160 cat age ttt gcc gag cag age tat gac tec tgc age cgt gtg cgc gtc 587 His Ser Phe Ala Glu Gln Ser Tyr Asp Ser Cys Ser Arg Val Arg Val 165 170 175 cct gca gct gcc acg ctg get gtg ggc acc atg tgt ggc gtg tat ggc 635 Pro Ala Ala Ala Thr Leu Ala Val Gly Thr Met Cys Gly Val Tyr Gly 1B0 185 190 tec gcc ctt tgc aat gcc cag cgc tgg ctc aac ttc cag gga gac acá 683 Ser Ala Leu Cys Asn Ala Gln Arg Trp Leu Asn Phe Gln Gly Asp Thr 195 200 205 ggc aat ggt ctg gcc cea ctg gac ate acc ttc cae ctc ttg gag cct 731 Gly Asn Gly Leu Ala Pro Leu Asp lie Thr Phe His Leu Leu Glu Pro 210 215 220 225 ggc cag gcc gtg ggg agt ggg att cag cct ctg aat gag ggg gtc gca 779 Gly Gln Ala Val Gly Ser Gly lie Gln Pro Leu Asn Glu Gly Val Ala 230 235 240 cgt tgc aat gag tcc ca ggt gac gac gtg gcg acc tgc tcc tgc caá 827 Are? Cys Asn Glu Ser Gln Gly Asp Asp Val Ala Thr Cys Ser Cys Gln 245 250 255 gac tgt gct gca tcc tgt cct gcc ata gcc cgc ccc cag gcc etc gac 875 Asp Cys Ala Ala Ser Cys Pro Ala lie Ala Arg Pro Gln Ala Leu Asp 260 265 270 tcc acc ttc tac ctg ggc cag atg ccg ggc agt ctg gtc etc ate ate 923 Ser Thr Phe yr Leu Gly Gln et Pro Gly Ser Leu Val Leu lie lie 275 280 285 ate etc tgc tet gtc ttc gct gtg gtc acc ate ctg tt gtg gga ttc 971 lie Leu Cys Ser Val Phe Ala Val Val Thr lie Leu Leu Val Gly Phe 290 295 300 305 cgt gtg gcc ccc gcc agg gac aaa age aag aCg. gtg gac ccc aag aag 1019 Arg Val Ala Pro Ala Arg Asp Lys Ser Lyg Het Val Asp Pro Lys Lys 310 315 320 ggc acc age etc tet gac aag etc age ttc tcc acc cae acc etc ctt 1067 Gly Thr Ser Leu Ser Asp Lys Leu Ser Phe Ser Thr His Thr Leu Leu 325 330 335 ggc cag ttc ttc cag ggc tgg ggc acg tgg gtg gct teg tgg cct ctg 1115 Gly Gln Phe Phe Gln Gly Trp Gly Thr Trp Val Ala Ser Trp Pro Leu 340 345 350 acc ate ttg gtg cta tet gtc ate ceg gtg gtg gcc ttg gca gcg 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gac ccc cgt ctg gcc cag gcc aag ctg tgg gag 1835 Asn Tyr Pro Ala Gly Asp Pro Axg Leu Ala Gln Ala Lys Leu Trp Glu 580 585 590 gag gcc ttc tta gag gaa atg cga gcc ttc cag cgt cgg atg gct ggc 18B3 Glu Ala Phe Leu Glu Glu Met Arg Ala Phe Gln Arg Arg Met Ala Gly 595 600 605 atg ttc cag gtc acg ttc atg gct gag cgc tet ctg gaa gac gag ate 1931 Met Phe Gln Val Thr Phe Met Ala Glu Arg Ser Leu Glu Asp Glu lie 610 615 620 625 aat cgc acc acá gct gaa sac ctg ccc ate ttt gcc acc age tac att 1979 Asn Arg Thr Thr Ala Olu Asp Leu Pro lie Phe Ala Thr Ser Tyr lie 630 635 640 gtc ata ttc ctg tac ate tet ctg gcc ctg ggc age tat tcc age tgg 2027 Val lie Phe Leu Tyr lie Ser Leu Ala Leu Gly Ser Tyr Ser Ser Trp 645 650 655 age cga gtg atg gtg gac tcc aag gcc acg ctg ggc ctc ggc ggg gtg 2075 Ser Arg Val Met Val Asp Ser Lys Ala Thr Leu Gly Leu Gly Gly Val 660 665 670 gcc gtg gtc ctg gga gca gtc atg gct gcc atg ggc ttc ttc tcc tac 2123 Ala Val Val Leu Gly Ala Val Met Ala Ala Met Gly Phe Phe Ser Tyr 675 680 6B5 ctg ggt ate cgc tcc tcc ctg gtc ate ctg caá gtg gtt ect ttc ctg 2171 Leu Gly lie Arg Ser Ser Leu Val lie Leu Gln Val Val Pro Phe Leu 690 695 700 705 gtg ctg tcc gtg ggg gct gat aac ate ttc ate ttt gtt ctc gag tac 2219 Val Leu Ser Val Gly Ala Asp Asn lie Phe lie Phe Val Leu Glu yx 710 715 720 cag agg ctg ecc cgg agg ect ggg gag cea cga gag gtc cae att ggg 2267 Gln Arg Leu Pro Arg Arg Pro Gly Glu Pro Arg Glu Val His lle Gly 725 730 735 :ga gee cta ggc agg gtg gct ecc age atg ctg ttg tgc age ctc tet 2315 Arg Ala Leu Gly Arg Val Ala Pro Ser Met Leu Leu Cys Ser Leu Ser 740 745 750 gag gee ate tgc ttc ttc cta ggg gee ctg acc ecc atg cea gct gtg 2363 Glu Ala lie Cys Phe Phe Leu Gly Ala Leu Thr Pro Mee Pro Ala Val 755 760 765 cgg acc ttt gee ctg acc tet ggc ctt gca gtg ate ctt gac ttc ctc 2411 Arg Thx Phe Ala Leu Thr Ser Gly Leu Ala Val lie Leu Asp Phe Leu 770 775 780 785 ctg cag atg tea gee ttt gtg gee ctg ctc tcc ctg gac age aag agg 2459 Leu Gln Met Ser Ala Phe Val Ala Leu Leu Ser Leu Asp 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Ala Leu Trp Gly lie 1175 1180 1185 Ser Tyr Asn Ala Val Ser Leu lie Asn Leu Val Ser Ala Val Gly 1190 1195 1200 Met Ser Val Glu Phe Val Ser His lie Thr Arg Ser Phe Ala lie 1205 1210 1215 Ser Thr Lys Pro Thr Trp Leu Glu Arg Ala Lys Glu Ala Thr lie 1220 1225 1230 Ser Met Gly Ser Ala Val Phe Ala Gly Val Ala Met Thr Asn Leu 1235 1240 1245 Pro Gly lie Leu Val Leu Gly Leu Ala Lys Ala Gln Leu lie Gln 1250 1255 1260 Phe phe Phe Arg Leu Asn Leu Leu lie Thr Leu Leu Gly Leu 1265 1270 1275 Leu His Gly Leu Val Phe Leu Pro Val lie Leu Ser Tyr Val Gly 1280 1285 1290 Pro Asp Val Asn Pro Ala Leu Ala Leu Glu Gln Lys Arg Ala Glu 1295 1300 1305 Glu Ala Val Ala Ala Val Met Val Ala Ser Cys Pro Asn His Pro 1310 1315 1320 Ser Arg Val Ser Tíir Ala Asp Asn lie Tyr Val Asn His Ser Phe 1325 1330 1335 Glu Gly Ser lie Lys Gly Ala Gly Ala lie Ser Asn Phe Leu Pro 1340 1345 1350 Asn Asn Gly Arg Gln Phe 1355 <210> 45 <211> 4471 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 45 ggaccacttc ctggctctgg gatggcagct gcccggcagg gatggctgct ctgggccctg 60 ctcctgaatt cggcccaggg tgagccccac acacccactc acaaagcCgg cttctgcacc 120 ttttatgaag agtgtgggaa gaacccagag cttcctggag gcctcacatc actatccaat 180 acctcctgct tgcctaatac cccagccccg ccatgtcaca ggtgaccacc tggctcttct 240 ccagcgcgtc tgtccccgcc tatacaatgg ccccaatgac acctatgcct gtcgctctac 300 caagcagctg gtgtcattag acagtagcct gtctatcacc aaggccctcc ttacacgctg 360 cccggcatgc tctgaaaact ttgtgagcat acactgtcat aatacctgca gccctgacca 420 gagcctcttc atcaatgtta ctcgcgtggt tcagcgggac cctggacagc ttcctgctgt 480 ggtggcctat gaggcctttt atcaacgcag ttttgcagag aaggcctatg agtcctgtag 540 ccgggtgcgc atccctgcag ctgcctcgct ggctgtgggc agcatgtgtg gagtgtatgg 600 ctctgccctc cgcaatgctc agcgcctggc tcaacttcca aggagacaca gggaatggcc 660 tggctccgct ggacatcacc ttccacctct tggagcctgg ccaggccctg gcagatggga 720 tgaagccact ggatgggaag atcaaaccct gcaatgagtc ccagggtgaa gactcggcag 780 cctgctcctg ccaggactgt gcagcatcct gccctgtcat ccctccgccc ccggccctgc S40 gcccttcttt ctacatgggt cgaatgccag gctggctggc tctcatcatc atcttcactg 900 ccgtctttgt attgctctct gttgtccttg tgtatctccg agtggcttcc aacaggaaca 960 agaacaagac agcaggctcc caggaagccc ccaacctccc tcgtaagcgc agattctcac 1020 cccacaccgt ccctggccgg tcctccgaga gctggggaac aatggtggcc tcatggccac 1080 ccactgtctt ggcactgtcc ttcatagttg tgatagcctt gtcagtaggc ctgaccttta 1140 tagaactcac cacagaccct gtggaactgt ggtcggcccc taaaagccaa gcccggaaag 1200 aaaaggcttt ccatgacgag catttcggcc ccttcttccg aaccaaccag atttttgtga 1260 cagctaagaa caggtccagc tacaagtacg actccctgct gctagggccc aagaacttca 1320 gtgggatcct atccctggac ttgctgcagg agctgttgga gctacaggag agacttcgac 1360 acctgcaagt gtggtcccat gaggcacagc gcaacatctc cctccaggac atctgctatg 1440 CCcccctcaa accgcataac accagcctca ctgactgctg tgtcaacagc ctccttcaat 1500 acttccagaa caaccacaca ctcctgctgc tcacagccaa ccagactctg aa ggccaga 1560 cctccctggt ggactggaag gaccatttcc tctactgtgc caatgcccct ctcacgtaca 1620 aagatggcac agccctggcc ctgagctgca tagctgacta cggggcgcct gtcttcccct 1680 tccttgctgt tgggggctac caagggacgg actactcgga ggcagaagcc ctgatcataa 1740 ccttccctat caataactac cccgctgatg atccccgcat ggcccacgcc aagctctggg 1800 aggaggcttt cttgaaggaa atgcaatcct tccagagaag cacagctgac aagttccaga 1360 ttgcgttctc agctgagcgt tctctggagg acgagatcaa tcgcactacc atccaggacc 1920 tgcctgtctt tgccatcagc taccttatcg tcttcctgta catctccctg gccctgggca 1380 gctactccag atggagccga gttgcggtgg attccaaggc tactctgggc ctaggtgggg 2040 tggctgttgt g tgggagca gtcgtggctg ccatgggctt ctactcctac ctgggtgtcc 2100 cctcctctct ggtcatcatt caagtggtac ctttcctggt gctggctgtg ggagctgaca 2160 acatcttcat ctttgttctt gagtaccaga ggctgcctag gatgcccggg gagcagcgag 2220 aggcccacat tggccycacc etgggtagtg tggcccccag catgctgctg tgcagcctct 2260 ctgaggccac ctgcttcttt ctaggggccc tgacctccat gccagctgtg aggacctttg 2340 ccttgacctc tggcttagca atcatctttg acttcctgct ccagatgaca gcctttgtgg 2400 ccctgctctc cctggatagc aagaggcagg aggcctctcg ccccgacgtc gtgtgctgct 2460 tttcaagccg aaatctgccc ccaccgaaac aaaaagaagg cctcttactt tgcttcttcc 2520 gcaagatata cactcccttc ctgctgcaca gattcatccg ccccgttgtg ctgctgctct 25B0 ttctggtcct gtctggagca aacctctacc taatgtgcaa ca cagcgtg gggctggacc 2640 aggatctggc tctgcccaag gattcctacc tgatagacta cttcctcttt c gaaccggt 2700 acttggaagc ggggcctcca gtgtactttg acaccacctc aggctacaac ttttccaccg 2760 aggcaggcat gaacgccatt Cgctctagtg caggctgtga gagcttctcc ctaacccaga 2820 aaatccagta tgccagtgaa ttccctaatc agtcttatgt ggctattgct gcatcctcct 2880 gggtagatga cttcatcgac tggctgaccc catcctcctc: ctgctgccgc atttataccc 2940 gtggccccca taaagatgag ttctgtccct caacggatac ttccttcaac tgtctcaaaa 3000 aetgcatgaa ccgcactctg ggtcccgtga gacccacaac agaacag t cataagtacc 3060 tgccctggtt cctgaatgat acgcccaaca tcagatgtct taaagggggc ctagcagcgt 3120 atagaacctc tgtgaatttg atctcagatg gccagattat agcctcccag ttcatggcct 3180 accacaagcc cttacggaac tcacaggact ttacagaagc tctccgggca tcccggttgc 3240 tagcagccaa catcacagct gaactacgga aggtgcctgg gacagatccc aact tgagg 3300 tcttccctca cacgatctcc aatgtgttct accagcaata c gacggtt ctccctgagg 3360 gaatcttcac tcttgctctc tgcttcgtgc ccacctttgt ggtc gctac ctcctactgg 3420 gcctggacat acgctcaggc atcctcaacc tgctctccat cattatgatc ctcgtggaca 3480 ccatcggcct catggctgtg tggggtatca gctacaatgc tgtgtccctc atcaaccttg 3540 tcacggcagt gggcatgtct gtggagttcg tgtcccacat tacccggtcc tttgctgtaa 3600 gcaccaagcc tacccggctg gagagagcca aagatgctac tatcttcatg ggcagtgcgg 3660 tgtttgctgg agtggccatg accaacttcc cgggcatcct catcctgggc tttgctcagg 3720 cccagcttat ccagattttc ttcttccgcc tcaacctcct gatcaccttg ctgggtctgc 3780 tacacggcct ggtcttcctg cccgttgtcc tcagctatct ggggCCagat gttaaccaag 3840 ctctggtacc ggaggagaaa ctagccactg aggcagccat ggtctcagag ccttcttgcc 3900 cacagtaccc cttcccggct gatgcaaaca ccagtgacct atgttaacta aggctttaat 3960 ccagaattta tccctgaaat taatgctgct agcagctctc tgcccaaaag tgaccaaaag 4020 ttctaatgga gtaggagctt gtccaggctc catggttctt gc gataagg ggccacgagg 4080 gtcttccctc tggttgtttc caaggcctgg ggaaagttgt tccagaaaaa aattgc ggc 4140 attc gtcc tgaggcagcc agcactggcc actttgttgt cataggtcec cgaggcca g 4200 atcagattac ctcctctgta aagagaa a cttgagtatt gtatgggatg tatcacatgt 4260 caattaaaaa ggccatggcc tatggcttag gcaggaaata gggtgtggaa catccaggag 4320 aagaaaggat tctgggataa aggacacttg ggaacgtgtg gcagtggtac ctgagcacag 43T0 gtaattagcc atgtggcgaa atgtagatta atataaatgc atatctaagt tatgattcta 4440 gtctagctat atggccaagg tatttataaa t 4471 <210> 46 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia Artificial «220> <223> iniciador <400> 46 acgtcaggcg agCccgaacc Cacee <210> 47 <211> 25 <212> ADN Secuencia Artificial <220> <223> iniciador <400> 47 ggaCtgcatt CccCCcaaga aagee <210> 48 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> iniciador <400> 4B tatggcccCg ccctc gcaa Cgctc <210> 49 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> iniciador «:400> 49 tcagcagocc ctgctccaca tacacttc <210> 50 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <22Q> <223> iniciador <400> 50 gCtccacagg gtctgtggtg agttc

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1.- Un polipéptido aislado que comprende 42 o más aminoácidos contiguos a partir de una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir de SEQ ID Os: 2 y 12. 2 - Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir de SEQ ID NOs: 2, 4 y 12. 3 - Un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido de conformidad con la reivindicación 1. 4. - Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia nucleotídica seleccionada a partir de SEQ ID NOs: 1 , 3 y 1 1. 5. - Un vector recombinante que comprende el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 3. 6 - Una célula hospedera que comprende el vector de conformidad con la reivindicación 5. 7. - Un anticuerpo el cual se une específicamente a un polipéptido de conformidad con la reivindicación 1. 8. - Un anticuerpo el cual se une específicamente a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir de SEQ ID NOs: 39^2. 9 - Un método para elaborar un polipéptido que comprende cultivar una célula hospedera de conformidad con la reivindicación 6 bajo condiciones en las cuales se expresa el ácido nucleico. 10.- El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque el polipéptido se aisla a partir del cultivo. 11.- Un método para identificar un antagonista de NPC1 L1 que comprende: (a) poner en contacto a una célula hospedera que expresa un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir de SEQ ID NOs: 2, 4 y 12 o un fragmento funcional del mismo en una superficie celular, en la presencia de una cantidad conocida de ezetimiba marcada de manera detectable, con una muestra a ser probada para la presencia del antagonista; y (b) medir la cantidad de ezetimiba unida de manera detectable específicamente unida al polipéptido; en donde un antagonista de NPC1 L1 en la muestra se identifica mediante la medición de la unión sustancialmente reducida de la ezetimiba marcada de manera detectable al polipéptido, en comparación con lo que se podría medir en la ausencia de dicho antagonista. 12.- Un método para identificar un antagonista de NPC1L1 que comprende: (a) colocar, en una suspensión acuosa, una pluralidad de partículas de soporte, impregnadas con un elemento fluorescente, al cual está unida una célula hospedera que expresa un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir de SEQ ID NOs: 2, 4 y 12 o un fragmento funcional del mismo en una superficie celular; (b) añadir, a la suspensión, ezetimiba radiomarcada y una muestra a ser probada para la presencia del antagonista, en donde la radiomarca emite energía de radiación capaz de activar el elemento fluorescente después de la unión de la ezetimiba al polipéptido para producir energía luminosa, mientras que la ezetimiba radiomarcada que no se une al polipéptido, generalmente, se remueve demasiado lejos a partir de las partículas de soporte para permitir que la energía radioactiva active el elemento fluorescente; y (c) medir la energía luminosa emitida por el elemento fluorescente en la suspensión; en donde un antagonista de NPC1 L1 en la muestra se identifica mediante la medición sustancialmente reducida de la emisión de la energía luminosa, en comparación con lo que se podría medir en la ausencia de dicho antagonista. 13. - El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque el elemento fluorescente se selecciona a partir de silicato de itrio, óxido de itrio, difeniloxazol y poliviniltolueno. 14. - El método de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque la ezetimiba se marca con una radiomarca seleccionada a partir de 3H y 1251. 15 - El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque la ezetimiba se marca con una radiomarca seleccionada a partir de 3H y 12SI. 16.- Un método para identificar un antagonista de NPC1 L1 que comprende: (a) poner en contacto a una célula hospedera que expresa un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir de SEQ ID NOs: 2, 4 y 12 o un fragmento funcional del mismo en una superficie celular con colesterol marcado de manera detectable y con una muestra a ser probada para la presencia del antagonista; y (b) medir la cantidad de colesterol marcado de manera detectable en la célula; en donde un antagonista de NPC1 L1 en la muestra se identifica al medir el colesterol sustancialmente reducido marcado de manera detectable dentro de la célula hospedera, en comparación con lo que se podría medir en la ausencia de dicho antagonista. 17. - El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque el colesterol está marcado de manera detectable con una radiomarca seleccionada a partir de 3H y 125l. 18. - El método de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque la célula hospedera se selecciona a partir de una célula de ovario de hámster chino (CHO), una célula J774, una célula macrófago y una célula Caco2. 19 - El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque la célula hospedera se selecciona a partir de una célula de ovario de hámster chino (CHO), una célula J774, una célula macrófago y una célula Caco2. 20 - El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque la célula hospedera se selecciona a partir de una célula de ovario de hámster chino (CHO), una célula J774, una célula macrófago y una célula Caco2. 21.- Un ratón mutante que comprende una alteración homocigota del NPC1L 1 cromosomal, endógeno en donde el ratón no produce ninguna proteína functional NPC1 L1.