CN106434655B

CN106434655B - 一种长链非编码rna及其血液定量检测方法

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Publication number: CN106434655B
Application number: CN201610817327.7A
Authority: CN
Inventors: 刘晓冬; 侯雨菲; 于飞飞; 马淑梅
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2016-09-12
Filing date: 2016-09-12
Publication date: 2019-11-05
Anticipated expiration: 2036-09-12
Also published as: CN106434655A

Abstract

本发明涉及长链非编码RNA、与其对应的分离的多核苷酸、特异性结合的寡核苷酸引物对、lncRNA芯片、试剂盒，还涉及实时定量检测血液中对应长链非编码RNA的方法。

Description

一种长链非编码RNA及其血液定量检测方法

技术领域

本发明属于分子生物学长链非编码RNA的应用领域。具体地说，本发明涉及长链非编码RNA(lncRNA)、与其对应的分离的多核苷酸、与其特异性结合的寡核苷酸引物对、lncRNA芯片、试剂盒，还涉及用所述试剂盒定量检测血液中对应长链非编码RNA的方法。

背景技术

宫颈癌是发生在宫颈阴道部位或移行带的鳞状上皮细胞及宫颈管内膜的柱状上皮细胞交界处的恶性肿瘤，发病率在女性恶性肿瘤中居第二位，仅次于乳腺癌。近年国外研究报道：在普通人群中宫颈癌的发病率有所下降，但在发展中国家，宫颈癌的发病率和死亡率反而增加并有年轻化倾向。在中国，每年有13万个新发宫颈癌病例，且发病年龄呈年轻化趋势。目前，治疗宫颈癌的方法主要有手术治疗、放射治疗和化学治疗，根据2010年NCCN宫颈癌临床实践指南，放疗是治疗宫颈癌的重要手段之一，其适应症广泛，除严重的肝肾功能，造血功能障碍外，I～IV期患者均可进行放射治疗，尤其对于晚期、复发或者无法手术的患者，放射治疗是治疗的重要方法。然而宫颈癌是目前能通过早期诊断而完全治愈的妇科肿瘤，因此，早期发现并予以积极预防和及时治疗，对提高宫颈癌的生存率，降低死亡率有重要意义。有创性检查虽然能够达到增高疾病诊断的正确率，但同时也增加了患者的痛苦。同时在对癌组织进行活检的过程中，也增加了人为导致癌细胞转移的可能。长期以来研究人员一直期望能够找到一种早期检测出恶性肿瘤的指标，不仅能减轻患者痛苦，还能对肿瘤的诊断、分类、预后及治疗发挥指导作用，因此有学者提出了肿瘤标志物这一概念。

肿瘤标志物(tumor marker，TM)是指在恶性肿瘤的发生和增殖过程中，因肿瘤细胞的相关基因表达或机体对肿瘤产生反应而异常变化的一类物质。其随着肿瘤的发生和发展进行变化，主要表现为体液中某种正常活性物质的异常增多或者异常物质的出现。随着肿瘤标志物种类的不断发现，和人们对肿瘤标志物认识的不断加深，更多的肿瘤标志物已被应用于临床。肿瘤标志物的主要用途有：肿瘤的早期发现、肿瘤的普查及筛查、肿瘤的诊断及分期、肿瘤治疗效果监测、肿瘤的复发检测、肿瘤治疗的预后和肿瘤原发灶的寻找。宫颈上皮内癌变和早期宫颈癌往往没有任何临床症状，有些患者在发生阴道流血或疼痛等临床症状时才来就诊，错过了最佳的诊断时机。此外，有研究显示早期宫颈癌患者的5年生存率可达66％-95％，而中晚期患者的5年生存率仅为9％-64％，因此早期发现宫颈癌的肿瘤标志物对于患者的早期诊断、治疗有重要意义。

LncRNA是指长度大于200个核苷酸的非编码RNA，现已研究证实lncRNA在蛋白编码基因的调控、干细胞的增殖和老化中发挥重要的作用。近年来随着基因芯片技术的迅速发展，研究者已经通过lncRNA芯片和lncRNA测序技术发现大量在肿瘤中差异表达的lncRNA。LncRNA的作用在多种肿瘤中已证实，但是lncRNA在肿瘤的筛查中是否具有特异性还有待研究。而且目前关于lncRNA的研究主要集中于肿瘤与正常组织的比较，对于治疗后lncRNA水平变化是否对癌症预后以及治疗方案的确定有指示作用仍有待研究，尤其是在放疗后宫颈癌的lncRNA的变化尚未见报道。

发明内容

本发明人利用生物信息学的方法筛选出宫颈癌发生发展过程中差异性表达的lncRNA，并与放疗后的lncRNA芯片相结合，从而筛选出与宫颈癌发生发展相关的lncRNA作为肿瘤标记物，通过血液中lncRNA的定量检测辅助进行计算，为宫颈癌放疗效果的预后以及后续治疗方案的确定提供参考。

为此，本发明包括下述技术方案：

第一方面的技术方案提供了一种lncRNA，所述的lncRNA具有如SEQ ID NO:3所示的序列。

另外，还提供了第一方面技术方案所述的lncRNA的用途，用于制备用于定量检测血液样本中具有如SEQ ID NO:3所示的序列的lncRNA的寡核苷酸引物对、lncRNA芯片或试剂盒。

第二方面的技术方案提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸能转录成第一方面技术方案所述的具有如SEQ ID NO:3所示的序列的lncRNA。

第三方面的技术方案提供了寡核苷酸引物对，所述的寡核苷酸引物对特异性地结合于第一方面技术方案所述的具有SEQ ID NO:3所示的序列的lncRNA。

优选地，所述的寡核苷酸引物对具有如SEQ ID NO:1-2所示的序列。所述SEQ IDNO:1-2分别对应为SEQ ID NO:3所示的lncRNA的上游和下游引物的序列。

第四方面的技术方案提供了一种lncRNA芯片，所述的lncRNA芯片包括：固相载体；以及固定在所述固相载体上的第三方面技术方案所述的寡核苷酸引物对。优选地，所述的寡核苷酸引物对具有如SEQ ID NO:1-2所示的序列。

另外，还提供了所述lncRNA芯片的用途，用于制备用于定量检测血液样本中具有如SEQ ID NO:3所示的序列的lncRNA的试剂盒。

第五方面的技术方案提供了一种用于定量检测血液样本中具有如SEQ ID NO:3所示的序列的lncRNA的试剂盒，所述的试剂盒中含有第三方面技术方案所述的寡核苷酸引物对或第四方面技术方案所述的lncRNA芯片。优选地，所述的寡核苷酸引物对具有如SEQ IDNO:1-2所示的序列。

第六方面的技术方案提供了一种定量检测血液样本中具有如SEQ ID NO:3所示的序列的lncRNA的方法，使用第三方面技术方案所述的寡核苷酸引物对、第四方面技术方案所述的lncRNA芯片、或第五方面技术方案所述的试剂盒。优选地，所述的寡核苷酸引物对具有如SEQ ID NO:1-2所示的序列。

在本发明中，筛选lncRNA的研究步骤简述为在取得宫颈癌样本数据进行宫颈癌原始数据预处理后，筛选宫颈癌发生发展过程中差异表达的lncRNA，从中筛选放疗后差异表达并且有治疗价值的lncRNA，再通过绘制ROC曲线评价lncRNA作为肿瘤标志物的能力。

另外，本发明针对上述筛选出的lncRNA NONHSAG006570，设计了可与其特异性结合的具有SEQ ID NO:1-2的序列的群的寡核苷酸引物对，进而获得包括固相载体以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸引物对的lncRNA芯片、含有上述寡核苷酸引物对或上述lncRNA芯片的试剂盒。

通过使用上述的寡核苷酸引物对、lncRNA芯片、或试剂盒，本发明通过对血液样本提取的RNA进行逆转录PCR和PCR，提供了一种定量检测血液样本中上述lncRNANONHSAG006570表达水平改变的便捷方法。此方法可用于放疗后迅速检测宫颈癌预后以及后续治疗方案的辅助确定，具体参见下文介绍。

附图说明

图1为lncRNA NONHSAG006570的ROC曲线，其相应具体数据参见表4。

具体实施方式

对于现有技术中存在的治疗后lncRNA水平变化是否对癌症预后有指示作用仍少有研究，尤其是在放疗后宫颈癌的lncRNA的变化尚未见报道的问题，本研究通过对24例宫颈正常组织样本和28例宫颈癌样本，通过芯片差异显著性分析筛选宫颈癌发生过程中差异表达的lncRNA，将其与放疗后的lncRNA芯片相结合，筛选出有治疗价值的lncRNANONHSAG006570，对该lncRNA进行功能研究分析发现，NONHSAG006570参与有丝分裂细胞周期、DNA复制、有丝分裂细胞周期的G2/M期、染色体分离等生物学过程，KEGG信号通路分析发现它在癌症、细胞周期、MAPK等信号通路中发挥作用。

通过使用上述定量检测血液样本中的lncRNA NONHSAG006570的方法，可对临床采集血样进行lncRNA的高通量检测，分别采集放疗前、放疗3次后、放疗6次后血样进行lncRNANONHSAG006570的高通量分析。然后将放疗3次后与放疗6次后的样本分别与放疗前的样本进行比较，筛选出比值变化上调大于1.5倍以上的样本，可视为放疗后宫颈癌预后差的对象，建议结合其他诊断方法，并建议进行放疗之外的其它治疗方案。

此方法方便简捷，通过对定量检测出的患病个体在放疗前后血液样本中上述的lncRNA的表达进行比较，利于在放疗后早期判断预后并予以积极预防和及时治疗，对提高宫颈癌的生存率，降低死亡率有重要意义。并且，定量检测血液样本中上述的lncRNA的表达比较有创性检查，减少了患者的痛苦，也避免了对癌组织进行活检的过程中会增加了人为导致的癌细胞转移的可能。

具体地，本发明包括下述技术方案：

另外，还提供了第一方面技术方案所述的lncRNA的用途，用于制备用于定量检测血液样本中具有如SEQ ID NO:3所示的序列的lncRNA的寡核苷酸引物对、lncRNA芯片或试剂盒。进一步地，也可用于制备放疗后宫颈癌预后评估的芯片或试剂盒。

另外，还提供了所述lncRNA芯片的用途，用于制备用于定量检测血液样本中具有如SEQ ID NO:3所示的序列的lncRNA的试剂盒。进一步地，也用于制备放疗后宫颈癌预后评估的试剂盒。

第五方面的技术方案提供了一种用于定量检测血液样本中具有如SEQ ID NO:3所示的序列的lncRNA的试剂盒，所述的试剂盒中含有第三方面技术方案所述的寡核苷酸引物对或第四方面技术方案所述的lncRNA芯片。优选地，所述的寡核苷酸引物对具有如SEQ IDNO:1-2所示的序列。所述试剂盒具体可用于放疗后宫颈癌的预后评估。

通过提取新鲜血液中的RNA，经逆转录生成cDNA后，通过实时PCR进行具有如SEQID NO:3所示的序列的lncRNA的相对定量。

以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步的描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。本发明属于分子生物学领域，在实施例中，包括了很多常用试剂、常规方法，故实施例中出现的试剂不仅限于列出的试剂供应商品牌。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为本领域的常规方法，或按照制造厂商所建议的条件与实验步骤。

筛选lncRNA作为肿瘤标志物主要通过如下步骤：

1.取得宫颈癌样本数据

从GEO数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)的主页面选择编码是GSE63514的样本集，此样本集中共包含128个样本芯片，根据本实验目的最终选用24例正常宫颈组织和28例宫颈癌组织纳入后续分析。

2.预处理宫颈癌原始数据

经过ncFANs在线服务器的处理后重新注释共10914个探针，其中编码基因9196个，lncRNA共1718个。

3.筛选宫颈癌发生发展过程中差异表达的lncRNA

进行差异表达基因和lncRNA筛选，首先对28例宫颈癌组织和24例正常宫颈组织的样本数据进行统计学分析，P＜0.05认为差异有统计学意义，将有统计学意义的lncRNA纳入后续分析；然后将宫颈癌组织表达均值与宫颈正常组织表达均值进行比较，将符合宫颈癌组织表达均值/宫颈正常组织表达均值≥2或者≤0.5的lncRNA纳入后续分析；对于发生改变的样本数少于总样本数20％的基因剔除，通过三次筛选后将剩余的lncRNA做进一步的分析。本研究中共有54个lncRNA差异性表达，其中上调23个，下调31个(结果见表1，表2)。

表1宫颈癌中上调的lncRNA

表2宫颈癌中下调的lncRNA

4.筛选放疗后差异表达的lncRNA

临床采集血样进行lncRNA的高通量检测，分别采集放疗前、放疗3次后、放疗6次后血样进行lncRNA的高通量分析。为扩大lncRNA的筛选范围，保证lncRNA不被漏选，将差异变化的标准降低为1.5倍，即将放疗3次后与放疗6次后的样本分别与放疗前的样本进行比较，比值变化大于1.5倍以上或小于0.666倍以下的lncRNA保留，纳入后续的筛选范畴。

5.筛选有治疗价值的lncRNA

将上述步骤3中筛选出来的lncRNA与步骤4中筛选出来的lncRNA比对，筛选出在肿瘤发展过程中上调的同时在放疗后下调的lncRNA，或者是在肿瘤发展过程中下调的而在放疗后上调的lncRNA，最终筛选出NONHSAG006570(见实施例中的表3)。

评价lncRNA作为肿瘤标志物的能力是通过绘制ROC曲线来进行的。

本文所用术语“ROC曲线”又称为受试者工作特征曲线(receiver operatingcharacteristic curve)，是反映敏感性和特异性连续变量的综合指标，是用构图法揭示敏感性和特异性的相互关系。它通过将连续变量设定出多个不同的临界值，从而计算出一系列敏感性和特异性，再以灵敏性为纵坐标、特异度为横坐标绘制成曲线，曲线下面积(AUC)越大，诊断准确性越高。在ROC曲线上，最靠近坐标图左上方的点为敏感性和特异性均较高的临界值。

使用Medcalc软件绘制ROC曲线，根据灵敏度、特异度及曲线下面积AUC判断NONHSAG006570作为肿瘤标志物的能力。ROC分析结果显示：NONHSAG006570的曲线下面积AUC为0.893，灵敏度82.1％，特异度为79.2％，提示NONHSAG006570作为肿瘤标志物的能力较强(具体见实施例中的表4和说明书附图1)。

将在以下通过实施例更具体地描述本发明。不应被解释为本发明限于这些实施例或受这些实施例限制。本领域的技术人员可在本发明的技术概念内进行各种方式的修改和改进。

<实施例1>筛选lncRNA作为肿瘤标志物

(一)初步筛选

1.宫颈癌样本数据下载

进入GEO数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)的主页面，输入关键词“cervical cancer progress”，根据实验目的最终选择编码是GSE63514的样本集，此样本集中共包含128个样本芯片，根据本实验目的最终选用24例正常宫颈组织和28例宫颈癌组织纳入后续分析。

2.宫颈癌原始数据的预处理

下载的宫颈癌的原始数据为.CEL为存储格式的，需要将数据上传到ncFANs在线服务器，实现对原始芯片数据的重新注释。经过ncFANs的处理后共有10914个探针被重新注释，其中编码基因9196个，lncRNA共1718个。

3.宫颈癌发生发展过程中差异表达lncRNA的筛选

进行差异表达基因和lncRNA筛选，首先需要对28例宫颈癌组织和24例正常宫颈组织的样本数据进行统计学分析，P＜0.05认为差异有统计学意义，将有统计学意义的lncRNA纳入后续分析；然后将宫颈癌组织表达均值与宫颈正常组织表达均值进行比较，宫颈癌组织表达均值/宫颈正常组织表达均值≥2或者≤0.5，符合上述要求的lncRNA纳入后续分析；对于发生改变的样本数少于总样本数20％的基因剔除，通过三次筛选后将剩余的lncRNA做进一步的分析。本研究中共有54个lncRNA差异性表达，其中上调23个，下调31个。

(二)筛选lncRNA的实验

1.RNA抽提实验步骤：

细胞、组织(包含miRNA)总RNA提取试验步骤如下：

1)细胞收集

细胞数量在10²-10⁷之间，悬浮细胞，低速离心收集10²-10⁷细胞；贴壁细胞，小心倒出培养液。加入300μl(少量细胞几百)/600μl(几千以上)裂解/结合缓冲液，震荡或反复抽打，以至细胞裂解。

2)组织制备

组织在0.5-250mg之间，从活体上取下的组织应在15分钟内用液氮浸没迅速降温，液氮运输。体积较小的组织最好用RNA保存，干冰运输。

3)用mirVana^TM RNA Isolation Kit分离试剂盒(Applied Biosystem p/nAM1556)提取总RNA

3.1)加入10倍体积的裂解/结合缓冲液(1ml裂解/结合缓冲液/0.1g组织)匀浆器彻底混匀。

3.2)加入1/10体积的均质添加剂，涡旋混匀，冰上放置10分钟。以上操作均在冰上。

3.3)加入与裂解(不计均质添加剂)相同体积的酸化的酚-氯仿(acid-phenol:chloroform)(300μl裂解/300μl酸化的酚-氯仿)，涡旋30-60秒，室温10,000g离心5分钟，分相若不好，则需重新离心。取上清置一新管中，记体积。

3.4)加入1.25倍体积100％乙醇，涡旋混匀，反复过纯化柱，体积不超过700μl，10,000g离心15秒。

3.5)加入350μl洗液1，离心5～10秒，清洗纯化拄，10,000g离心15秒，弃过滤液。3.6DNase I 10μl和缓冲液RDD 70μl加入膜上(QIAGEN#79254)，20-30℃放置15分钟。

3.7)加入350μl洗液1，离心5～10秒，清洗纯化拄，10,000g离心15秒，弃过滤液。

3.8)加入500μl洗液2/3，离心5～10秒，清洗纯化柱二次，10,000g离心15秒，弃过滤液，离心1分钟。

3.9)将离心柱放置到新的收集管中，柱中心加入100μL 95℃预热的洗脱液或无核酸酶水，室温最高转速离心20-30秒，收集管中液体即为提取的总RNA，可放置在-70℃保存。

2.高通量检测：

A.实验主要试剂及仪器：

主要试剂：

主要仪器耗材：

B.实验步骤:

1.总RNA的纯化(QIAGENMini Kit)

如果总RNA的纯度不高，会影响探针的标记效率和芯片杂交结果。所以使用QIAGENKit纯化总RNA，详细操作原理和方法见RNeasy Mini Protocol。

1)取总RNA≤100μg溶解于100μl无RNase水中，加入350μl缓冲液RLT并充分混匀。

2)加入250μl无水乙醇，加样枪枪头充分混匀。

3)将共计700μl含总RNA的溶液转入套在2ml离心管内的RNeasy柱子内，≥8000g离心30秒，弃去滤过液。

4)吸取500μl缓冲液RPE到RNeasy mini柱子内，≥8000g离心洗涤30秒，弃去滤过液，再用500μl缓冲液RPE在≥8000g离心洗涤2min，弃去滤过液和2ml的套管，将RNeasymini柱子转入一新的1.5ml Eppendorf管中。

5)吸取40μl无RNase的水，≥8000g离心洗脱1min。

6)重复步骤5一次。

2.cDNA第一链和第二链一步法合成

1)取0.2μg RNA于0.2ml离心管中，如下配置反应溶液：

2)65℃保温10分钟，冰浴5分钟

注意：提前把5×第一链缓冲液在80℃预热3-4分钟

3)配置如下cDNA合成体系：

4)将上述4.7μl混合物加入变性后冰浴的RNA中。

5)用枪头混匀，之后离心。

6)PCR：40℃2小时；70℃15分钟；冰浴5分钟

3.荧光标记cRNA合成

1)如下配置转录混合物：

2)加入6μl转录混合物并混匀

3)PCR：40℃2小时

4.cRNA纯化(QIAGENMini Kit)

QIAGEN RNeasy Mini kit纯化cRNA，具体方法可参见QIAGEN公司随试剂盒提供的操作手册。

1)加入84μl无RNase水，加入350μl缓冲液RLT并充分混匀。

2)加入250μl无水乙醇，加样枪枪头充分混匀。

3)将共计700μl含总RNA的溶液转入套在2ml离心管内的RNeasy柱子内，≥8000g离心15-30sec，弃去滤过液。

4)吸取500μl缓冲液RPE到RNeasy mini柱子内，≥8000g离心洗涤15-30sec，弃去滤过液，再用500μl缓冲液RPE在≥8000g离心洗涤2min，弃去滤过液和2ml的套管，将RNeasymini柱子转入一新的1.5ml Eppendorf管中。

5)吸取30μl无RNase的水，静置1min，≥8000g离心洗脱1min。

6)重复步骤5一次。

5.cRNA浓度测定

1)cRNA质控

用分光光度计分析RNA浓度。

需要在260和280nm测定吸光度来确定样品的浓度和纯度。确定RNA的A260/A280在1.9-2.1以确定其纯度较纯。

2)按下面的计算公式确定调整cRNA的含量：

调整cRNA含量＝RNAm-(总RNAi)

(y)RNAm＝体内试验(IVT)后测得cRNA量(μg)

总RNAi＝开始总RNA的量(μg)

y＝在IVT过程中加入的双链cDNA产物占全部cDNA产物的百分数

6.荧光分子浓度及掺入率计算

Cy3-浓度(pmol/μl)＝A552/0.15

Cy3-掺入率(pmol/μg)＝Cy3-浓度/cRNA浓度(μg/μl)

7.cRNA样品片段化和芯片杂交

1)按下表配制片段化混合液，然后在60℃温浴30min进行片段化，冰浴1min

2)加入2×GEx杂交缓冲液混匀

3)上芯片，65℃17小时，10rpm滚动杂交

8.芯片洗涤及扫描

取出芯片于洗液1中洗涤1分钟，再将芯片放入洗液2中洗涤1分钟(37℃)。

在安捷伦扫描仪中扫描，分辨率为3μm/5μm，扫描仪自动以100％扫描一次。

(三)最终筛选作为肿瘤标记物的lncRNA

1.放疗后差异表达lncRNA的筛选

对临床采集血样进行上述lncRNA的高通量检测，分别采集放疗前、放疗3次后、放疗6次后血样进行lncRNA的高通量分析。为扩大lncRNA的筛选范围，保证lncRNA不被漏选，将差异变化的标准降低为1.5倍，即将放疗3次后与放疗6次后的样本分别与放疗前的样本进行比较，比值变化大于1.5倍以上或小于0.666倍以下的lncRNA保留，纳入后续的筛选范畴。

2.血液检测用有治疗价值lncRNA的筛选

将初步筛选的步骤3中从组织中筛选出来的lncRNA与在最终筛选步骤1中从血液中筛选出来的lncRNA进行比对，筛选出在肿瘤发展过程中上调的同时在放疗后下调的lncRNA，或者是在肿瘤发展过程中下调的而在放疗后上调的lncRNA，最终筛选出NONHSAG006570(表3)，它在肿瘤发展过程中上调，可有效用于有效及时地筛查出宫颈癌患者。

表3 lncRNA在肿瘤发生过程中和放疗后的比值变化

注：T-肿瘤；N-正常；R-放疗；C-放疗前对照

(四)评价lncRNA作为肿瘤标志物的能力

使用Medcalc软件绘制ROC曲线，根据灵敏度、特异度及曲线下面积AUC判断NONHSAG006570作为肿瘤标志物的能力。ROC分析结果显示：NONHSAG006570的曲线下面积AUC为0.893，灵敏度82.1％，特异度为79.2％。

上述结果提示，NONHSAG006570作为肿瘤标志物的能力较强，适合用作血液检测用的lncRNA以预测宫颈癌放疗预后(具体见表4和说明书图1)。

表4 NONHSAG006570在宫颈癌中的ROC分析

<实施例2>对放疗后血液样本的实时PCR定量检测

对接受常规放疗的宫颈癌患者17例(均为鳞状细胞癌，47％为III期，53％为II期)，取其放疗前、放疗后1～6周血液样本，进行NONHSAG006570的实时PCR定量检测。

实验步骤具体为：

(一)在血液中提取RNA

1、新鲜采集的血样放入EDTA抗凝的采血管中，4℃离心机3000rpm离心10min，使血细胞与血浆分离，将上层血浆收集-20℃分装保存。

2、按照采血样体积1:3加入红细胞裂解液，轻轻上下颠倒混匀，静置至液体呈现红色透明状态提示红细胞裂解完成。

3、3000rpm离心10min，弃上清，再加入3ml红细胞裂解液，用移液器轻轻混匀，静置10min将未裂解的红细胞继续裂解。

4、3000rpm离心10min，弃上清，用移液器吸去多余裂解液。

5、加1ml TRIZOL试剂，轻轻吹打直至沉淀彻底消失，全程冰上操作。

6、加入TRIZOL五分之一体积的预冷的三氯甲烷，剧烈震荡15秒，室温静置5min。

7、使用低温高速离心机在4℃条件下，12000rpm离心15分钟，小心吸取上层水相，加入新的EP管中。

8、上层水相加入等体积的预冷异丙醇后，立刻颠倒混匀，使水相和异丙醇充分接触，室温静置10min或-20冰箱过夜沉淀RNA。

9、低温高速离心机12000rpm离心10分钟，弃上清，可以看见沉淀到管底的RNA沉淀，缓缓加入1ml 75％乙醇，轻轻颠倒几次，4℃，7500rpm离心5分钟，沉淀变乳白色。

10、沉淀室温干燥至透明状，加入20-50微升DEPC处理水(或高压2h的双蒸水)进行溶解，于57℃水浴锅中溶解10min，分装，-80℃保存。

(二)cDNA合成

按照大连Takara逆转录试剂盒Primereagent Kit Perfect(m RNA)说明书，将提取的总RNA逆转录成cDNA，并以此为模板进行实时PCR检测。

配制逆转录反应体系如下：

混合液共10μl体系，反应液的配置全程在冰上进行

反转录反应条件如下:

37℃ 15min(反转录反应)

85℃ 5sec(反转录酶的失活反应)

4℃ -----

(三)Real-time PCR检测

1.标准曲线的制作：

先对逆转录cDNA产物进行梯度稀释，共稀释成4、16、64、256倍共四个梯度，每个稀释倍数平行三副孔上样。

配制PCR反应体系如下：

全程冰上混合操作。

采用两步法进行PCR反应，反应条件如下：

95℃预变性，酶激活30s

95℃变性20s

60℃退火20s

变性退火共45循环。

完成后进入PCR仪自带的标准曲线程序，完成标准曲线的绘制。

根据标准曲线提供的扩增曲线和融解曲线判断引物的特异性以及通过标准曲线的斜率确定反应的扩增效率。融解曲线为单一峰，扩增效率指标为：0.8＜E＜1.2，越接近1越好，在扩增效率范围内，才可利用比较阈值法，即目的基因的量＝2^-△△CT进行计算。

2.PCR检测

在满足引物特异性好，扩增效率高之后进行PCR检测，使用管家基因GAPDH作为内参进行RNA量的校正。

使用上述标准曲线制作时所用PCR反应体系以及两步法PCR反应，反应条件同上。

3.结果计算

采用比较阈值法计算结果，即目的基因的量＝2^-△△Ct，在该公式中，Ct指的是热循环仪检测到反应体系中荧光信号的强度值，△△Ct＝(Ct目的基因–Ct管家基因)实验组–(Ct目的基因–Ct管家基因)对照，或△△Ct＝[Ct GI(未知样品)–Ct GAPDH(未知样品)]–[Ct GI(校正样品)–Ct GAPDH(校正样品)]。GI是目的基因，校正样品是任何被选做代表1倍目的基因表达量的样品。

经计算，NONHSAG006570在放疗后与放疗前相比显著下降，放疗第三～六周达到基本稳态浓度，与放疗前相比，其比值的阈值为0.522[0.396-0.6](95％可信区间)，结果与表3有较好的一致性，表明血液样本可用于替代组织活检样本作为灵敏度和特异性均较高的宫颈癌无损性检测标志物，而且减轻患者痛苦并减少人为导致癌细胞转移的可能。

另外，NONHSAG006570在放疗后预后较好的患者体内下调明显，在放疗后预后较差的患者体内下调则不明显，表明还可有效用于预测宫颈癌患者的放疗预后情况。具体结果显示，放疗好转的患者指标降低，与放疗前相比为0.655(0.5979,0.7121)。放疗未好转的患者指标无显著性变化，与放疗前相比为0.9518(0.7268,1.1767)。

另外，放疗第三～六周的时间点可及时有利地帮助确定是否患者预后较好，并且辅助判断患者是否需要进一步放疗疗程，为临床总体治疗方案的确定提供可靠的辅助参考。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims

1.一种寡核苷酸引物对在制备宫颈癌放疗预后检测试剂盒中的用途，所述寡核苷酸引物对特异性地结合于具有SEQ ID NO:3所示的序列的lncRNA，所述寡核苷酸引物具有如SEQID NO:1-2所示的序列，其特征在于，

所述宫颈癌放疗预后检测试剂盒在检测到受试者的所述lncRNA在放疗后的浓度与放疗前的浓度的比值小于等于0.7121时判断该受试者放疗预后好，在比值高于0.7121时判断该受试者放疗预后不好。

2.一种lncRNA芯片在制备宫颈癌放疗预后检测试剂盒中的用途，所述的lncRNA芯片包括固相载体以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸引物对，所述寡核苷酸引物对特异性地结合于具有SEQ ID NO:3所示的序列的lncRNA，所述寡核苷酸引物具有如SEQ ID NO:1-2所示的序列，其特征在于，