CN106167824A - 与老年性骨质疏松相关微小rna的寡核苷酸化合物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与老年性骨质疏松相关微小RNA的寡核苷酸化合物的应用，用于弥补基于微小RNA的寡核苷酸在制备促进成骨细胞功能、抑制老年性骨质疏松症化合物应用中的空缺。技术方案是筛选获得与老年性骨质疏松相关的微小RNA，通过合成基于与老年性骨质疏松相关微小RNA的寡核苷酸并转染至前成骨细胞和老年骨质疏松小鼠体内，结果显示可促进成骨细胞功能，并抑制老年性骨质疏松症的进展。本发明制备的基于与老年性骨质疏松相关微小RNA的寡核苷酸，可通过促进成骨细胞功能，抑制老年性骨质疏松症的程度，弥补了基于微小RNA的寡核苷酸在制备促进成骨细胞功能、抑制老年性骨质疏松化合物应用中的空缺。

Description

与老年性骨质疏松相关微小RNA的寡核苷酸化合物的应用

技术领域

本发明属于生物医药工程领域，特别涉及一种与老年性骨质疏松相关微小RNA的寡核苷酸化合物的应用。

背景技术

老年性骨质疏松是指随着年龄的增大，骨骼系统由于机能降低而引发的疾病，常表现为骨密度、骨量下降，骨微结构破坏，骨脆性增加易发骨折等。我国目前处于人口老龄化加速进程，2000年人口普查结果显示有50岁以上人口约2.6亿，占总人口的20.68％；而根据2010年的普查结果，50岁以上人口总数上升至约3.4亿，10年间增长了30.8％(国务院人口普查办公室.中国2010年人口普查资料[M].北京：中国统计出版社)。

微小RNA是一类内源性的非编码RNA，可参与包括骨代谢在内的多种生理和病理学过程。众多研究表明微小RNA的表达水平与年龄和骨质疏松紧密相关，基于微小RNA核苷酸序列的寡核苷酸化合物可通过调控微小RNA的表达，促进成骨细胞功能、改善骨骼微结构并抑制骨质疏松程度，因此是潜在的骨质疏松症治疗药物靶点。

第三军医大学窦策等发明了miR-18a-5p抑制剂在制备防治骨质疏松药物中的应用。该发明通过合成并转染miR-18a-5p的抑制剂miRNA inhibitor，下调破骨细胞分化过程中miR-18a-5p的表达，解除对LXR-b基因的靶向抑制作用，抑制破骨细胞分化，从而实现防治骨质疏松的目的。但是，该发明一方面未提供基于miR-18a-5p的抑制剂在成骨细胞中的数据，另一方面未对此抑制剂进行体内动物实验的验证(窦策，许建中，董世武.miR-18a-5p抑制剂在制备防治骨质疏松药物中的应用[P].北京：CN105288658A，20160203.)。

第四军医大学杨安钢等发明了基于miR-494的抑制剂在制备抗骨钙丢失、促骨生成制剂中的应用。该发明通过在模拟失重条件下诱导C2C12成肌细胞为成骨细胞，并将miR-494的抑制剂转染至C2C12细胞后诱导为成骨细胞，发现ALP、OPG、Runx2的表达和活性上调，表明miR-494的抑制剂可促进成骨分化。但是，该发明仅使用了成肌细胞进行成骨诱导，并未使用骨源系的细胞如MC3T3-E1前成骨细胞作为研究对象，且同样缺乏动物实验的数据支持。

综上所述，基于现有的技术和方法，一方面缺乏可促进成骨细胞功能和骨形成的微小RNA寡核苷酸，另一方面，在实际应用的过程中，更多的骨质疏松症发生在老年阶段，目前缺乏可抑制老年性骨质疏松的微小RNA寡核苷酸。

发明内容

为了弥补基于微小RNA的寡核苷酸在制备促进成骨细胞功能、抑制老年性骨质疏松症化合物应用中的空缺，本发明提供一种与老年性骨质疏松相关微小RNA的寡核苷酸化合物的应用。筛选获得与老年性骨质疏松相关的微小RNA，通过合成基于与老年性骨质疏松相关微小RNA的寡核苷酸并转染至前成骨细胞和老年骨质疏松小鼠体内，结果显示可促进成骨细胞功能，并抑制老年性骨质疏松症的进展。由于制备的基于与老年性骨质疏松相关微小RNA的寡核苷酸，可通过促进成骨细胞功能，抑制老年性骨质疏松症的程度，弥补了基于微小RNA的寡核苷酸在制备促进成骨细胞功能、抑制老年性骨质疏松化合物应用中的空缺。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种与老年性骨质疏松相关微小RNA的寡核苷酸化合物的应用，其特点是包括以下步骤：

步骤一、收集老年性骨折患者术中移除的骨组织，提取组织总RNA，微小RNA表达普微阵列实验及生物信息学方法获得与非老年组差异表达的微小RNA；

步骤二、qPCR法验证差异表达微小RNA在不同年龄患者骨组织中的实际表达水平，获得在老年性骨质疏松骨组织中下调表达的微小RNA为hsa-miR-182-5p、hsa-miR-574-5p、hsa-miR-125b-2-3p、hsa-miR-152-3p、hsa-miR-204-3p和hsa-miR-181c-5p；

步骤三、依据从miRBase获得的下调表达的微小RNA成熟体核苷酸序列，使用固相亚磷酰胺三酯法合成寡核苷酸单链，5’-3’序列依次分别为uuuggcaaugguagaacucacacu、ugagugugugugugugagugugu、ucacaagucaggcucuugggac、ucagugcaugacagaacuugg、gcugggaaggcaaagggacgu和aacauucaaccugucggugagu；然后合成互补的双链；

步骤四、高效液相色谱法纯化获得的产物；

步骤五、产物进行全链甲基化、前后2’-4’位点硫代磷酸化骨架修饰以及3’末端胆固醇标记；

步骤六、以上合成的微小RNA双链寡核苷酸，转染至体外培养的MC3T3-E1前成骨细胞，转染48小时后收取细胞样品进行成骨细胞标志基因及细胞矿化能力检测；

步骤七、qPCR法验证步骤一中差异表达微小RNA在不同年龄患者骨组织中的实际表达水平，获得在老年性骨质疏松骨组织中上调表达的微小RNA为hsa-miR-1290、hsa-miR-486-3p、hsa-miR-20b-5p、hsa-miR-210-3p、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-4299、hsa-miR-320a、hsa-miR-497-5p、hsa-miR-100-5p和hsa-miR-138-5p；

步骤八、依据从miRBase获得的上调表达的微小RNA成熟体核苷酸序列，使用固相亚磷酰胺三酯法合成寡核苷酸单链，5’-3’序列依次分别为ucccugauccaaaaaucca、auccuguacugagcugccccg、cuaccugcacuaugagcacuuug、ucagccgcugucacacgcacag、cucggggcagcucaguacagga、gccucucaugucaccagc、ucgcccucucaacccagcuuuu、acaaaccacagugugcugcug、cacaaguucggaucuacggguu和cggccugauucacaacaccagcu；

步骤九、高效液相色谱法纯化获得的产物；

步骤十、产物进行全链2’甲基化、5’两个硫代磷酸位点修饰、3’四个硫代磷酸位点修饰以及3’末端胆固醇标记；

步骤十一、以上合成的微小RNA单链寡核苷酸，经三次尾静脉注射至老龄小鼠体内，注射完成两周以后处死小鼠，收取骨组织进行骨密度、骨微结构检测。

本发明的有益效果是：本发明筛选获得与老年性骨质疏松相关的微小RNA，通过合成基于与老年性骨质疏松相关微小RNA的寡核苷酸并转染至前成骨细胞和老年骨质疏松小鼠体内，结果显示可促进成骨细胞功能，并抑制老年性骨质疏松症的进展。由于制备的基于与老年性骨质疏松相关微小RNA的寡核苷酸，可通过促进成骨细胞功能，抑制老年性骨质疏松症的程度，弥补了基于微小RNA的寡核苷酸在制备促进成骨细胞功能、抑制老年性骨质疏松化合物应用中的空缺。

以下结合附图和实施例详细说明本发明。

附图说明

图1是本发明实施例1获得的与老年性骨质疏松相关微小RNA在不同年龄患者骨组织中的表达水平。

图2是实施例1制备的miR-20b-5p引物检测miR-20b-5p在老年卧床骨质疏松患者骨组织中的表达水平。

图3是实施例2制备的miR-138-5p激动剂在转染MC3T3-E1前成骨细胞后qPCR法检测细胞碱性磷酸酶(左)和Runx2基因(右)的相对表达水平。

图4是实施例2制备的miR-138-5p激动剂在转染MC3T3-E1前成骨细胞后细胞碱性磷酸酶染色(上)和茜素红染色显示的矿化结节(下)。

图5是实施例3制备的miR-138-5p抑制剂在注射20月龄小鼠后小鼠股骨远端骨小梁矿物密度。

具体实施方式

以下实施例参照图1-5。

实施例1：与老年性骨质疏松相关微小RNA在老年患者骨组织中的表达。

(1)骨组织总RNA提取。

收取临床手术中弃除的骨组织，分为60岁和90岁年龄组，以及非卧床和老年卧床>24月组。组织收取后立即冻存于-80℃冰箱。提取RNA时，取出-80℃冻存的骨组织，置于液氮预冷的研钵中，加入适量液氮速冻后迅速研磨成粉末。将粉末转移至试剂，氯仿抽提、异丙醇沉淀，75％乙醇洗涤挥干后，加入RNase free无菌水溶解RNA，使用紫外分光光度计对RNA样品进行质检，确保所有样本的A260/280≥1.80，RNA总量≥1μg；经1％琼脂糖电泳、70V、25min检测，确保电泳条带清晰，28S：18S rRNA条带亮度大于或接近1：1。

(2)RNA样品反转录及real time PCR。

取出-80℃冻存的质检合格的骨组织总RNA样品，采用PrimeScript^TM RT reagentKit(Perfect Real Time)反转录试剂盒，以1μg total RNA/20μL反应体系，依照试剂盒说明书反转录合成cDNA。反转录合成的cDNA使用如表1所示引物序列，在95℃、30s，变性：95℃、10s；60℃、30s，44个循环的条件下，以U6为内参，使用Bio-Rad CFX96 PCR仪检测与老年性骨质疏松相关微小RNA的表达水平。

表1 real time PCR法检测微小RNA表达水平的引物序列

(3)实验结果。

参照图1和图2，通过real time PCR法检测不同年龄骨质疏松患者骨组织中与老年性骨质疏松相关微小RNA的表达，发现与60岁对照组相比，hsa-miR-1290、hsa-miR-486-3p、hsa-miR-20b-5p、hsa-miR-210-3p、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-4299、hsa-miR-320a、hsa-miR-497-5p、hsa-miR-100-5p和hsa-miR-138-5p的表达水平升高，hsa-miR-182-5p、hsa-miR-574-5p、hsa-miR-125b-2-3p、hsa-miR-152-3p、hsa-miR-204-3p和hsa-miR-181c-5p的表达水平下调。另外与非卧床组相比，老年女性和老年男性卧床患者骨组织中miR-20b-5p均表达上调。

实施例2：miR-138-5p激动剂促进MC3T3-E1前成骨细胞功能。

(1)miR-138-5p激动剂Agomir-138-5p的化学合成。

从miRBase获得miR-138-5p成熟体的核苷酸序列，合成与成熟体序列相同的寡核苷酸单链以及互补的双链，经高效液相色谱法纯化，并进行全链甲基化、前后2’-4’位点硫代磷酸化骨架修饰、以及3’末端胆固醇标记，最终获得序列为5’-agcugguguugugaaucaggccg-3’，5’-gccugauucacaacaccagcuuu-3’的miR-138-5p双链寡核苷酸激动剂。同时合成随机阴性对照，序列为5’-guccgaaggugcgcguagaguuu-3’，5’-acucuacgcgcaccuucggacuu-3’。合成的寡核苷酸化合物使用RNase free水配成20μM存储液，于-80℃冻存。

(2)Agomir-138-5p转染MC3T3-E1前成骨细胞。

转染前一天，6孔板每孔接种1×10⁵个MC3T3-E1前成骨细胞，加入2000μLα-MEM完全培养基，使转染前细胞融合度达到约70％。转染MC3T3-E1前成骨细胞时，6孔板每孔加入200nM Agomir-138-5p，再补加2000μL空白培养基，轻微摇晃使细胞培养板中的液体混合均匀。空白组仅加入培养基，阴性对照组加入等量阴性对照激动剂，其余与上述条件相同。转染后的细胞转入37℃5％CO₂培养箱中培养；培养6小时后弃去培养基，更换为完全培养基，继续于37℃5％CO₂培养箱中培养。

(3)细胞总RNA提取、碱性磷酸酶显色及茜素红染色反应。

MC3T3-E1细胞转染后培养至24、36、48h时分别取出，试剂充分裂解细胞后，采用氯仿异丙醇法提取细胞总RNA。总RNA质检合格后，将细胞总RNA反转录为cDNA。利用real time PCR法检测细胞中碱性磷酸酶(Alp)、和Runx2等成骨分化相关基因的表达水平。使用的引物如表3所示。

表3：成骨分化基因的引物信息

细胞转染后培养至24、36、48h时分别取出，使用BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒，按照说明书配制BCIP/NBT染色工作液；室温下使用10％多聚甲醛固定15min，然后PBS洗涤3次，弃去洗涤液，每孔加入500μL BCIP/NBT染色工作液，室温下避光孵育，直至显色至预期深浅；弃去BCIP/NBT染色工作液，蒸馏水洗涤2次使显色反应终止，使用扫描仪扫描细胞被碱性磷酸酶显色反应的结果。茜素红染色时，使用0.1M的Tris-HCl(PH8.3)配成0.1％的茜素红染色液。染色时，使用PBS冲洗细胞3次，95％酒精固定15min；加入染色液染色5min，用蒸馏水冲洗终止染色，干燥后使用扫描仪扫描染色结果。

(4)研究结果。

参照图3，通过real time PCR法检测转染miR-138-5p的激动剂Agomir-138-5p后MC3T3-E1前成骨细胞分化相关基因的表达，发现转染miR-138-5p激动剂后，体外培养的MC3T3-E1前成骨细胞其碱性磷酸酶(Alp)和Runx2的基因表达均显著降低，提示成骨细胞功能被抑制。

参照图4，通过碱性磷酸酶显色试剂盒和茜素红对转染miR-138-5p的激动剂的MC3T3-E1前成骨细胞碱性磷酸酶及矿化结节形成情况进行染色，发现转染miR-138-5p的激动剂后MC3T3-E1前成骨细胞表达的碱性磷酸酶减少，同时矿化结节形成减少，亦提示成骨细胞功能被抑制。

实施例3：miR-138-5p抑制剂改善老年性骨质疏松程度。

(1)miR-138-5p抑制剂Antagomir-138-5p的化学合成。

从miRBase获得miR-138-5p成熟体的核苷酸序列，合成与成熟体序列互补的寡核苷酸单链，经高效液相色谱法纯化，并进行全链2’甲基化、5’两个硫代磷酸位点修饰、3’四个硫代磷酸位点修饰、以及3’末端胆固醇标记，最终获得序列为5’–cggccugauucacaacaccagcu-3’的miR-138-5p单链寡核苷酸抑制剂。同时合成随机阴性对照，序列为5’–uuguacuacacaaaaguacug-3’。合成的寡核苷酸化合物使用RNase free水配成20μM存储液，于-80℃冻存。

(2)Antagomir-138-5p抑制老年性骨质疏松。

选50只健康的20月龄C57BL/6雄性小鼠，随机平均分为5组，分别为基线组、对照组、空白对照组、阴性对照组和miR-138-5p抑制剂组。合成的Antagomir-138-5p，使用靶向成骨细胞表面的递送系统(DSS)₆-liposome，经尾静脉分别注射入小鼠体内(递送系统2000mg/kg+寡核苷酸10mg/kg)，每两周注射一次，连续注射3次；基线组、对照组不注射任何试剂；空白对照组注射递送系统；阴性对照组注射递送系统和阴性对照抑制剂。

第3次尾静脉注射结束后的第15天，断颈法处死小鼠，分离取出双侧股骨。对分离获得的股骨，4％多聚甲醛固定48h后进行股骨远端显微CT扫描。

三、实验结果。

参照图5，经3次miR-138-5p抑制剂尾静脉注射老年小鼠后，对小鼠的股骨进行显微CT扫描。结果显示，与阴性对照组相比，注射miR-138-5p寡核苷酸抑制剂显著提高了小鼠股骨骨小梁的骨矿物含量。

Claims (1)

1.一种与老年性骨质疏松相关微小RNA的寡核苷酸化合物的应用，其特征在于包括以下步骤：

步骤一、收集老年性骨折患者术中移除的骨组织，提取组织总RNA，微小RNA表达普微阵列实验及生物信息学方法获得与非老年组差异表达的微小RNA；

步骤二、qPCR法验证差异表达微小RNA在不同年龄患者骨组织中的实际表达水平，获得在老年性骨质疏松骨组织中下调表达的微小RNA为hsa-miR-182-5p、hsa-miR-574-5p、hsa-miR-125b-2-3p、hsa-miR-152-3p、hsa-miR-204-3p和hsa-miR-181c-5p；

步骤三、依据从miRBase获得的下调表达的微小RNA成熟体核苷酸序列，使用固相亚磷酰胺三酯法合成寡核苷酸单链，5’-3’序列依次分别为uuuggcaaugguagaacucacacu、ugagugugugugugugagugugu、ucacaagucaggcucuugggac、ucagugcaugacagaacuugg、gcugggaaggcaaagggacgu和aacauucaaccugucggugagu；然后合成互补的双链；

步骤四、高效液相色谱法纯化获得的产物；

步骤五、产物进行全链甲基化、前后2’-4’位点硫代磷酸化骨架修饰以及3’末端胆固醇标记；

步骤六、以上合成的微小RNA双链寡核苷酸，转染至体外培养的MC3T3-E1前成骨细胞，转染48小时后收取细胞样品进行成骨细胞标志基因及细胞矿化能力检测；

步骤七、qPCR法验证步骤一中差异表达微小RNA在不同年龄患者骨组织中的实际表达水平，获得在老年性骨质疏松骨组织中上调表达的微小RNA为hsa-miR-1290、hsa-miR-486-3p、hsa-miR-20b-5p、hsa-miR-210-3p、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-4299、hsa-miR-320a、hsa-miR-497-5p、hsa-miR-100-5p和hsa-miR-138-5p；

步骤八、依据从miRBase获得的上调表达的微小RNA成熟体核苷酸序列，使用固相亚磷酰胺三酯法合成寡核苷酸单链，5’-3’序列依次分别为ucccugauccaaaaaucca、auccuguacugagcugccccg、cuaccugcacuaugagcacuuug、ucagccgcugucacacgcacag、cucggggcagcucaguacagga、gccucucaugucaccagc、ucgcccucucaacccagcuuuu、acaaaccacagugugcugcug、cacaaguucggaucuacggguu和cggccugauucacaacaccagcu；

步骤九、高效液相色谱法纯化获得的产物；

步骤十、产物进行全链2’甲基化、5’两个硫代磷酸位点修饰、3’四个硫代磷酸位点修饰以及3’末端胆固醇标记；

步骤十一、以上合成的微小RNA单链寡核苷酸，经三次尾静脉注射至老龄小鼠体内，注射完成两周以后处死小鼠，收取骨组织进行骨密度、骨微结构检测。