CN101543502B - 红景天苷防治骨质疏松的新用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及红景天植物的有效成分在防治骨质疏松中的新用途，实验研究表明，所说化合物在一种促骨成形蛋白bmp-2表达的抗骨质疏松药物筛选模型中，能够显著上调bmp-2的表达效应；上调人成骨细胞中bmp-2基因的mRNA表达水平和蛋白质表达水平；明显促进人成骨细胞增殖、碱性磷酸酶活性和胶原合成，增加成骨性的骨形成，从而具有制备防治骨质疏松药物的应用前景。
Description
技术领域：
本发明涉及红景天植物的有效成分在防治骨质疏松中的新用途。
背景技术：
骨质疏松是一种以骨量减少和骨微结构的破坏为特征，导致骨脆性增加和易于发生骨折的代谢性骨病。随着全球人口的老龄化，骨质疏松在全世界常见病、多发病中的位置逐渐上升至第7位，患病人数超过2亿，其中50～60岁发病率为21％，60～70岁发病率为58％，70岁以上几乎是100％，尤其是绝经后妇女的发病率更高。目前我国已有骨质疏松患者约9000万人。
在骨的形成过程中，以清除受损碎片，形成骨洞为主要作用的破骨细胞(osteoclasts，ocs)和以沉积钙质，填充骨洞为主要作用的成骨细胞(osteoblasts，obs)相互协调，使骨质的形成与溶解处于一种动态平衡，维持骨质的不断更新。当此动态平衡被打破，骨溶解超过骨形成时，即导致骨质疏松。因此，任何能够直接或间接作用于成骨细胞和/或破骨细胞，有助于保持其动态平衡的物质，均可能具有防治骨质疏松的作用。目前常用的治疗骨质疏松症方案有两种：针对破骨细胞控制骨质的损失；增强成骨细胞沉积钙质填充骨洞的作用。大量临床病例证明，单纯通过抑制骨吸收而保留的骨质远远不能弥补骨质疏松过程中的骨量丢失，因此，通过改善骨质形成的代谢，增强成骨细胞的作用，最终达到恢复患者骨水平为目的的治疗方案日益受到人们的重视。
大量研究已经发现，骨成形蛋白BMP-2(bone morphogenetic protin-2，BMP-2)可增加成骨细胞分化标志碱性磷酸酶、I型胶原和骨钙蛋白等基因的表达，促进软骨和骨的形成。进一步的研究还表明，不表达bmp-2的成骨细胞不具备分化能力，但若对这种细胞加入外源性的重组BMP-2蛋白或将bmp-2基因的cDNA导入这种细胞后，可促进它的分化，表明bmp-2基因的表达对于成骨细胞是必不可少的。1999年，Mundy等报道，他们利用转基因鼠成骨细胞建立了一种可筛选促BMP-2表达的活性物质的模型，并用此模型筛选促成骨细胞分化的活性物质，证明lovastatin、simvastatin等药物具有促成骨细胞分化作用(Science286：1946-1949，1999)。随后，很多研究者利用其它方法，也发现Statins类药物可促进bmp-2mRNA和蛋白的表达。
高山红景天是景天科红景天属的多年生草本植物，分布于俄罗斯西伯利亚及我国东北等高纬度寒冷地区，具有类似中医扶正固本、滋补强身的“适应原样”的作用。红景天苷(salidroside，C14H20O7)是高山红景天的主要成分之一。目前红景天苷的来源可以是天然提取，亦可人工合成。现代药理学研究证明，红景天对人体免疫系统、内分泌系统及代谢系统具有良好的调理作用，主要功能有抗疲劳、强心、抗炎、抑制血糖升高、抗氧化和抗微波辐射等作用。但是，本发明所涉及红景天有效成分红景天苷在抗骨质疏松方面的作用与功效，迄今为止，尚未见有相关的报道。
本发明的目的是提供红景天有效成分在抗骨质疏松方面的新用途，具体而言，是提供红景天苷在制备抗骨质疏松药物中的应用。
发明内容：
本发明采用两步树脂法工艺(专利公开号：CN1880326A)制备了红景天苷，进行了系列生物学实验研究，为开拓红景天苷防治骨质疏松的新用途提供了依据。
生物学实验研究结果表明：
1.采用促骨成形蛋白bmp-2表达的抗骨质疏松药物筛选模型，能够显著上调bmp-2的表达效应。
2.采用红景天苷处理成骨细胞，能够显著上调成骨细胞中bmp-2的mRNA水平。
3.采用红景天苷处理成骨细胞能够显著上调成骨细胞中BMP-2蛋白水平。
4.体外药理实验结果证明，红景天苷能够促进成骨细胞增殖，上调碱性磷酸酶活性和促进胶原合成，显著增加成骨性的骨形成。
发明效果：
本发明的优点和积极效果在于，通过系统生物学研究发现并证明，红景天苷能上调人成骨细胞中bmp-2基因的mRNA表达水平和蛋白质表达水平，能显著促进成骨细胞增殖、碱性磷酸酶活性和胶原合成，增加成骨性的骨形成，有望将其开发成为防治骨质疏松疾病的药物。
附图说明：
图1：含小鼠bmp-2基因启动子的转染质粒pYJ2的构建
图2：红景天苷上调模型中bmp-2表达效应
其中：纵坐标-bmp-2表达效应上调率(％)
横坐标-红景天苷浓度(μg/ml)
图3：红景天苷上调成骨细胞中bmp-2的mRNA水平
其中：1-空白对照
2-红景天苷(2μg/ml)作用24小时
3-Marker
图4：红景天苷上调成骨细胞中BMP-2蛋白水平
其中：纵坐标-BMP-2蛋白上调率(％)
横坐标-A-空白对照
B-红景天苷(1μg/ml)作用24小时
C-红景天苷(1μg/ml)作用48小时
实施方式：
以下所列实施例，仅为帮助本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
<实施例1>红景天苷的制备
取市售红景天初提取物500克，加水5000ml溶解，加热至30℃，搅拌保温2.5小时。过滤得到澄清滤液。滤液调节pH至3，常温下流过HZ-816吸附树脂(上海华震科技有限公司)柱，然后通入30％的乙醇1200ml，收集流出液。流出液浓缩至糖浆状，加入HZ-816吸附树脂混合均匀并烘干。按照烘干的吸附树脂∶已装柱的吸附树脂＝1∶6的比例，将烘干的树脂加入已填充了HZ-816吸附树脂的层析柱，常温下通入15％的乙醇溶液进行层析。收集层析液，浓缩至干。加入乙醇溶解，加热至50℃，趁热过滤。浓缩滤液，冷却至0℃，析出结晶，滤液回收套用。红景天苷结晶用乙醇清洗后，60℃真空干燥，得到红景天苷白色粉末，经HPLC测定，纯度为97.2％。
<实施例2>红景天苷对模型中bmp-2表达效应的影响
实验方法：采用一种促骨成形蛋白bmp-2表达的新型抗骨质疏松药物筛选模型(专利公开号：CN1441060A)，通过模型构建、细胞瞬时转染和荧光检测等步骤，观察红景天苷对模型中bmp-2表达效应的影响。操作如下：
模型构建：取含小鼠bmp-2基因启动子区的氯霉素乙酰化酶报告质粒pCAT4.5X(来自Melissa B.Rogers，University of South Florida)，用Xba1和Xho1双酶切后，取带启动子区片段-3365至-1658bp与用Xba1和Xho1双酶切后纯化的质粒pSK(美国Stratagene公司)以3∶1(摩尔比)的比例进行粘性末端连接，再转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取克隆，鉴定后得到重组质粒PYJ1。然后用pSK酶切位点中的Sac I和Xho1将PYJ1中的启动子区切出并克隆到不含启动子的荧光素酶表达质粒pGL3-Basic(美国Promega公司)得到PYJ2，完成了启动子与报告基因的相连，从而完成PYJ2荧光素酶检测模型的构建(图1)。
细胞瞬时转染：
采用LipofectAMINETM2000Reagent转染试剂盒(Invitrogen公司)来完成。
操作如下：
1)将100μl/孔适量浓度的MC3T3E1(小鼠颅骨细胞)细胞在96孔无菌塑料培养板内培养8小时；
2)用25μl/孔无血清无双抗DMEM培养基稀释适量PYJ2质粒DNA于无菌离心管中；
3)在另一个无菌离心管中用25μl/孔无血清无双抗DMEM培养基稀释0.5μl/孔LF2000Reagent；
4)在5分钟之内，将上述两管合并混匀，室温下再孵育20分钟；
5)将混合后的转染悬液加到上述96孔板内，每孔50μl；
6)充分混匀后将96孔板置于37℃二氧化碳培养箱内，培养24小时后，进行荧光检测或加入适量浓度的红景天苷作用细胞48小时后再进行荧光检测。
荧光检测：
细胞荧光素酶表达活性的测定，采用荧光检测试剂盒(Luciferase AssaySystem)。操作步骤如下：
1)弃去96孔板中的培养基，注意：不要刮掉孔底贴壁的细胞；
2)用200μl/孔的PBS(pH 7.0)轻轻漂洗细胞后，完全弃去PBS；
3)加入25μl/孔的1×PLB(细胞裂解液)，室温下振摇15分钟，使细胞完全裂解；
4)将裂解液完全吸出到荧光分析用96孔白板相应孔内，注意：将细胞裂解液彻底转移，转移前将细胞裂解液吹吸均匀。
5)加入70μl/孔的分析试剂LARII于分析用白板内后，立即(5分钟内)将分析用白板置于Galaxy分光光度计内，读数并记录。
实验结果：红景天苷在0.1～5.0μg/ml范围内剂量依赖性上调模型中bmp-2的表达效应，在0.625μg/ml处上调率达22％左右，于2.5μg/ml达到最佳效果，上调率达26％左右(图2)。
<实施例3>红景天苷上调人成骨细胞中bmp-2的mRNA水平
实验方法：接种MG63细胞(人成骨样细胞)于6孔板，约1×106个/孔，待细胞贴壁后，换无血清DMEM，同时加入红景天苷(2μg/ml)作用24小时后，使用TRIZOL(一种常用的RNA提取试剂，购自Invitrogen公司)提取总RNA。进而采用人bmp-2的cDNA序列引物进行RT-PCR，选择持家基因3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为内参。最后将RT-PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测目的条带。具体操作如下：
1.总RNA的提取
1)加入1ml/每孔(6孔板)的TRIZOL溶解细胞；
2)细胞裂解液在15～30℃孵育5分钟，以使核蛋白体完全分解；
3)每1ml TRIZOL加0.2ml氯仿。盖紧样品管盖，剧烈振摇15秒，再在30℃下孵育2～3分钟；
4)在2～8℃下以不超过12,000g的离心力高速冷冻离心15分钟。离心后混合物分成三层：下层红色的苯酚-氯仿层，中间层，上层无色的水样层，RNA存在于水样层当中；
5)将水样层转移到一干净的离心管中，加入每1ml TRIZOL对应的0.5ml异丙醇沉淀RNA；
6)将混合的样品在15-30℃孵育10分钟，并在2～8℃下以不超过12,000g的离心力高速冷冻离心10分钟。RNA沉淀形成一胶片状沉淀附着于管壁和管底；
7)弃上清后用75％的乙醇洗涤RNA沉淀一次，每1ml的TRIZOL至少加1ml的75％乙醇。旋涡振荡混合样品并在2～8℃下以不超过7,500g的离心力高速冷冻离心5分钟；
的8)简单干燥RNA沉淀(空气干燥或真空干燥5～10分钟)；
的9)用移液管尖分几次移取100μl不含RNase的水溶解RNA，并在55～60℃孵育10分钟；
10)分装后-70℃保存备用。
引物的设计
人bmp-2的cDNA片段扩增引物，
引物1：5’-GGTCCTGAGCGAGTTCGA-3’
引物2：3’-ACACTACGCCACCTGACG-5’
GAPDH的扩增引物：
引物1：5’-GGGCTCTCCAGAACATCATC-3’
引物2：3’-ACGGGAGTTGCTGGTGAAAC-5
RT-PCR
的根据两步法RT-PCR试剂盒使用说明，以总RNA为模板、Oigo dT20为引物逆转录合成cDNA。
(1)cDNA的合成：
1)混合1μl引物(50μM Oigo(dT)20)、4μl RNA模板、2μl10mM dNTPMix、5μl DEPC处理水，总体积12μl。
2)65℃5分钟使RNA、primer变性，取出置于冰上。
3)混摇5×cDNA Synthesis Buffer 5秒备用。
4)冰上配制如下混合液，并轻轻振摇(1个反应体系)：4μl 5×cDNASynthesis Buffer、1μl 0.1M DTT、1μl RNase OUTTM(40U/μl)、1μlDEPC-处理水、1μl Thermo ScriptTMRT(15U/μl)。
5)取8μl上述混合液于2)内已经冰浴的EP管。
6)轻轻混匀后于50℃孵育30～60分钟。
7)在85℃孵育5分钟以终止反应。
8)加1μl RNase H并于37℃孵育20分钟。
9)将上述产物分装后置于-20℃保存，或进行随后的PCR。
(2)以cDNA为模板进行PCR
反应体系：(50μl)
cDNA模板 4.0/μl
10μM BMP-2引物1 1.5/μl
10μM BMP-2引物2 1.5/μl
10mM dNTP 1.0μl
50mM Mg2+ 1.0μl
platinumTaqDNA酶(1U/μl) 1.0μl
10×PCR Buffer 5.0μl
ddH2O 33.0μl
扩增条件：
94℃，5min
94℃，1min 
58℃，40sec 30个循环
72℃，50sec 」
72℃，10 min
4℃，可长久保存
扩增到10个循环后立即暂停扩增，取出PCR管置于冰上，每管加入内参GAPDH的扩增引物各0.5μl/管，混匀后再置于扩增仪内继续扩增。
(3)琼脂糖凝胶电泳：
将PCR扩增产物与DNA电泳上样缓冲液按5∶1比例混合，在含0.5μg/ml EB的1％琼脂糖凝胶上电泳(恒压100V，1小时)。紫外灯下观察电泳结果。
实验结果：实验设计的bmp-2的cDNA序列片断为500bp，于500bp处，红景天苷处理的样品较空白对照的条带显著，表明红景天苷能显著上调人成骨细胞中bmp-2的mRNA水平(图3)。
<实施例4>红景天苷上调人成骨细胞中BMP2蛋白水平
实验方法：接种1.0×107个MG63细胞于6孔板12小时待细胞贴壁后，换为无血清DMEM，同时加入1μg/ml红景天苷分别作用24小时、48小时。用适量0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA(1∶1)溶液消化收集细胞，用冷的PBS洗涤细胞3次，800rpm，5分钟离心。多聚甲醛4％(配制时65℃水浴，不断摇动，直到溶解，两周内使用)2ml室温固定细胞，40分钟后，800rpm，5分钟离心，PBS 2ml重悬细胞，再次800rpm，5分钟离心。每个样品分出部分细胞用作无一抗阴性对照后，加入山羊抗人BMP-2的多克隆抗体1∶40稀释，饱和剂量(100～200μl)加入，冰上放置40分钟，800rpm，5分钟离心，用冷PBS 2ml重悬细胞，再次800rpm，5分钟离心，如此洗涤2次，洗去未结合的一抗。加入FITC(异硫氰酸荧光素)标记的二抗(1∶100稀释)，冰上避光放置40分钟后，800rpm，5分钟离心，去上清，PBS洗涤2次，洗去未结合的二抗。加入PBS 0.5ml重悬细胞，流式细胞仪检测，每管计数10000个细胞。按下式计算BMP-2的表达值上调率：上调率＝(实验组平均荧光强度-无一抗阴性对照组平均荧光强度)/空白对照组平均荧光强度×100％。
实验结果：流式细胞术是灵敏度较高的检测蛋白表达水平的一种方法，实验发现，1μg/ml红景天苷作用24和48小时后，MG63细胞内BMP-2的表达值上调率均明显高于空白对照组(图4)，均高于20％，说明红景天苷可上调MG63细胞BMP-2蛋白的表达。
<实施例5>红景天苷对人成骨细胞MG63增殖、碱性磷酸酶活性和胶原合成的促进作用
实验方法：MG63细胞培养于含10％胎牛血清的DMEM培养基中，传代后进行下列试验。
MTT试验测定细胞增殖活力：将细胞悬浮在含10％胎牛血清的DMEM培养基中，调整细胞浓度为3×104个/ml，接种于96孔培养板，每孔100μl，于37℃，CO2的培养箱中培养，24小时后，换含不同浓度红景天苷的DMEM培养液，继续培养72小时，在培养结束前4小时，每孔加入20μl MTT(5mg/ml)，培养结束后，弃上清液，每孔加入150μl DMSO，摇振使紫色结晶颗粒完全溶解，于570nm处测吸收值(OD570)。
碱性磷酸酶的活性测定：将细胞悬浮在含10％胎牛血清的DMEM培养基中，调整细胞浓度为1×105个/ml，接种于24孔培养板，每孔1ml，培养24小时，细胞贴壁后，换含不同浓度红景天苷的DMEM培养基，继续培养。红景天苷作用6天后，用PBS洗涤细胞3次，加入50mmol/L的二乙醇胺200μl及2.5mmol/L的对硝基苯酚磷酸二钠100μl，37℃反应30分钟后，用0.3mol/L的NaOH 100μl终止反应，取150μl加入96孔板，于405nm处测其吸光度。标准曲线为不同浓度的对硝基苯酚溶液在405nm处的吸收值与浓度所作的标准曲线。
3H-proline(3H-脯氨酸)掺入试验：将细胞用含10％胎牛血清的DMEM培养基悬浮，调整细胞浓度为3×104个/ml，接种于96孔培养板，每孔100μl，培养24小时后，换含不同浓度红景天苷和10％胎牛血清的DMEM培养基，继续培养48小时，并于结束培养前12小时，每孔加入1μci的3H-proline，培养结束时，弃上清液，用0.25％的胰蛋白酶消化细胞，使其脱壁。用自动细胞收集器收集细胞于玻璃纤维素滤纸上。用液体闪烁计数仪测定其放射性。
统计分析：数据以均数±标准差(X±SD)表示，两组均数比较采用两样本t检验，P＜0.05为差别具有显著意义，P＜0.01为差别有非常显著意义。
实验结果：
1.红景天苷对成骨细胞增殖的影响，结果见表1。
表1红景天苷对成骨细胞增殖的影响(n＝6，X±SD)
与空白对照组比较**P＜0.01
在骨代谢过程中，成骨细胞主要参与骨质的形成。由表1可见红景天苷在10-8～10-6mol/L浓度下培养72小时，对人成骨细胞的增殖具有显著的促进作用，说明该化合物可通过增加成骨细胞的数目促进骨形成。
2.红景天苷对成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响，结果见表2。
表2红景天苷对成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响(n＝6，X±SD)
与空白对照组比较**P＜0.01
碱性磷酸酶是参与骨代谢的重要蛋白质，通过分解磷酸脂的无机磷，增加其局部浓度，促使类骨质迅速钙化。由表2可见，红景天苷在10-7～10-6mol/L浓度下，培养6天能显著促进人成骨细胞的碱性磷酸酶活性，说明该化合物可以通过增加碱性磷酸酶的活性，促进成骨细胞的成骨作用。
3.红景天苷对成骨细胞胶原合成的影响，结果见表3。
表3红景天苷对成骨细胞胶原合成的影响(n＝6，X±SD)
与空白对照组比较**P＜0.01
胶原是骨细胞外最丰富的基质蛋白，在维持纤维连接组织的结构及功能上具有重要作用。由表3可见，红景天苷在10-8～10-6mol/L浓度下，作用48小时对人成骨细胞的骨胶原合成具有显著的促进作用，说明该化合物可以促进骨形成过程中骨基质的形成。
Claims (2)
1.红景天苷作为唯一活性成分在制备防治骨质疏松药物中的应用。
2.含红景天苷为唯一活性成分的药物组合物在制备防治骨质疏松药物中的应用。
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| 刘剑梅等.红景天壮骨丸治疗骨质疏松症的实验研究.《中国临床康复》.2004,第8卷(第27期),1摘要，第5911-5912页第2、3节. |
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| Date | Code | Title | Description |
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant |