CN104606210A - 红景天苷在制备促进骨折骨修复药物的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了红景天苷在制备促进骨折骨修复药物的用途，本发明通过小鼠胫骨骨折模型，观察红景天苷的促进骨再生骨修复作用，结果表明红景天苷对骨再生过程中骨生成和血管生成有显著的促进作用，从而具有良好的临床应用前景。

Description

红景天苷在制备促进骨折骨修复药物的用途

技术领域

本发明涉及一种药物的用途，特别是涉及一种红景天苷在制备促进骨折骨修复药物的用途。

背景技术：

在骨发育和骨修复过程中，骨组织的血管化具有十分重要的作用。骨组织血供丰富，其血流量约占心输出量的10％。机体主要靠红细胞携带氧来供给组织细胞的生长发育和代谢，人体正常组织氧浓度波动在5％～12％，从骨髓捐献志愿者中得到的证据表明，骨髓腔氧浓度波动在6.2％～6.6％之间。低氧常出现在血流中断或者减少的地方，在骨折血流中断时，伤口中央处氧分压甚至降低到0％～2％。目前大量的研究表明，骨形成与血管发生密切相关，许多局部或全身缺血性疾病，如骨折、关节炎、感染、糖尿病引起的下肢缺血、动脉粥样硬化引起的慢性血供减少、肿瘤、衰老、慢性呼吸功能衰竭或大气中氧含量下降，均会引起骨代谢的改变，导致骨量丢失。

近年研究表明，低氧引起骨折延迟愈合或不愈合、骨密度减低，使骨质疏松、骨折等疾病的发病率升高。例如在高原地区，由于受低气压、低氧等环境因素的影响，骨延迟愈合或骨不连已成为高原创伤性骨折最常见的并发症，其发生率高达30.0％～52.9％。同时，有研究显示，随着海拔的增高，骨密度逐步降低，特别是年轻人、初上高原地区人群尤为显著。我国是世界上高原居住人群最大的国家，随着开发大西北进度加快和青藏铁路线开通，去高原参加建设及旅游人群日益增多，受低氧环境影响的人群也日趋庞大。因此，研究低氧对骨代谢和骨再生的影响有着非常重要的社会意义和医学意义。

藏药红景天(Rhodiola)系景天科红景天属多年生草本或亚灌木植物，多分布在北半球的高寒地带，具有类似中医扶正固本、滋补强身的“适应原样作用”。据现代药理学研究，红景天对人体免疫系统、内分泌系统及代谢系统具有良好的调理作用，还具有抗缺氧、抗疲劳、抗微波辐射、抗癌、抗寒冷、促血管新生及抗骨质疏松等多种药理作用。多项研究表明其主要活性成分红景天苷(salidroside,SAL)具有肝保护和神经保护功效，这种保护作用主要得益于该化合物的抗氧化活性。同时，有研究显示SAL可能通过促进胰岛素分泌和提高胰岛素敏感性，来加强血浆瘦素对骨代谢的外周正性作用；长期大量应用还可能通过作用于血脑屏障而抑制瘦素对骨代谢的中枢负性影响，从而对糖尿病骨质疏松症起治疗作用。目前有关SAL在骨折的骨再生过程中作用的研究尚未见报道。

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发明内容

本发明的目的是提供红景天苷在制备促进骨折骨修复药物的用途。

本发明的技术方案概述如下：

红景天苷在制备促进骨折骨修复药物的用途。

本发明通过小鼠胫骨骨折模型，观察红景天苷的促进骨再生作用，结果表明红景天苷对骨再生过程中骨生成和血管生成有显著的促进作用，从而具有良好的临床应用前景。

附图说明

图1 SAL对小鼠胫骨骨折愈合的影响。

图2 小鼠胫骨骨折端形态学观察(HE染色，×400)。

图3 小鼠胫骨形态计量学检测，其中：与FM组相比较*P<0.05,**P<0.01；与SAL-L组相比较^△△P<0.01。

图4骨痂组织中Hypoxyprobe-1的免疫组织化学检测(×400)其中：两个时间点的FM组相比较+P<0.001；与FM组相比较**P<0.01；与SAL-L组相比较^△△P<0.01。

图5骨痂组织中HIF-1α的免疫组织化学检测(×400)；两个时间点的FM组相比较+P<0.001；与FM组相比较**P<0.01；与SAL-L组相比较^△P<0.05,^△△P<0.01。

图6骨痂组织中VEGF的免疫组织化学检测(×400)；两个时间点的FM组相比较+P<0.001；与FM组相比较**P<0.01；与SAL-L组相比较^△P<0.05,^△△P<0.01。

图7骨痂组织中CD31的免疫组织化学检测(×400)；两个时间点的FM组相比较+P<0.001；与FM组相比较*P<0.05,**P<0.01；与SAL-L组相比较^△P<0.05,^△△P<0.01。

具体实施方式

本发明的实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，不对本发明作任何限制。

红景天苷(salidroside,SAL)购自中国药品生物制品鉴定所(纯度99.9％)，去铁胺(desferoxamine,DFO)购自美国Sigma公司(纯度≥92.5％)。以下是红景天苷在骨折中促进骨再生作用的实验说明：

实施例1

1.方法

1.1 小鼠胫骨骨折模型的建立

本研究以Choi P等描述的不稳定骨折动物模型制作方法为基础进行改良(Cellular andmolecular characterization of a murine non-union model.J Orthop Res,2004,22:1100-7)。选用6～8周龄清洁级野生型雄性昆明白小鼠，体重22～28g，2.5％Avertin(阿弗丁)0.012～0.018ml/g(体重)腹腔内注射麻醉。待小鼠完全麻醉后，备皮、消毒小鼠右下肢，在小鼠右侧膝关节下切开约8mm纵行切口，分离肌肉筋膜后，于胫骨中上1/3处用眼科剪剪断胫骨，无菌PBS冲洗，逐层缝合切口。小鼠单笼饲养，室温22～24℃，提供标准饲料，自由饮食饮水及自由活动。骨折小鼠术后每周定期行X线摄片检查，了解骨折及其愈合情况。

1.2 动物分组

将符合标准的实验动物随机分为骨折模型组(FM组)、红景天苷低剂量组(SAL-L组)、红景天苷高剂量组(SAL-H组)和阳性药物去铁胺组(DFO组)，同时设Sham(手术对照)组，每组16只，又分为17和31天2个时相点，每个时相点8只。

1.3 给药方法及四环素双标记

手术后7～17天之间骨折模型局部隔日注射一次，DFO组200μM，SAL-H组和SAL-L组分别为800μM和200μM，Sham组和FM组给予等体积溶剂(DMSO)。小鼠分别于处死前1天，以30mg/kg体重，腹腔注射盐酸哌莫硝唑(hypoxyprobe-1)标记。

1.4 X线片检查

于骨折第17天和第31天拍摄X线片，评价骨折愈合情况。

1.5 骨组织形态计量学指标的测定

分别于骨折17天和31天以颈椎脱臼法处死小鼠。处死小鼠后剪开右下肢皮肤暴露膝关节及胫骨，于骨折断端上下约0.5cm处剪断胫骨，用PBS漂洗数次后，置于4％多聚甲醛中4℃固定过夜。PBS漂洗后用15％EDTA(pH7.2～7.4)室温下脱钙2周。常规脱蜡、包埋、切片(厚度5μm)。HE染色，光镜下观察。骨痂标本组织形态学测量，测定的骨痂参数如下：骨组织占整个骨痂组织量的比例，即骨小梁面积百分率(％)、骨小梁间隔(μm)、骨小梁厚度(μm)及骨小梁的数目(个/mm)。采用MPIAS-500彩色病理图像仪、使用IPP软件进行骨组织形态计量学参数测定。

1.6 骨组织缺氧及HIF-1α通路激活的检测

采用免疫组化技术于骨折后第17天和第31天分别应用盐酸哌莫硝唑(Hypoxyprobe-1)、HIF-1α及VEGF抗体检测骨折局部组织缺氧情况及HIF-1α、VEGF表达水平，应用CD31抗体检测血管密度。采用MPIAS-500彩色病理图像仪、使用IPP软件进行骨免疫组化结果测定。免疫组化具体操作步骤如下：1)小鼠胫骨石蜡包埋，5μm切片；2)切片60℃烤8小时；3)切片脱蜡二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10min；4)放入无水酒精Ⅰ、Ⅱ，95％、85％、75％酒精各1min，自来水冲洗，蒸馏水浸泡；5)3％过氧化氢(蒸馏水稀释)封闭37℃30min，PBS洗3次，每次5min；6)0.1％胰酶(用前半个小时预温)滴加在组织切片，37℃孵育30min，PBS洗3次，每次5min；7)滴加一抗CD31(1:100)、VEGF(1:100)、HIF-1α(1:100)、缺氧探针盐酸哌莫硝唑(Hypoxyprobe-1)(1:100)，以PBS替代一抗作空白对照，4℃过夜，PBS洗3次，每次5min；8)滴加二抗(生物素标记的兔抗小鼠IgG)，37℃孵育30min，PBS洗3次，每次5min；9)DAB显色5min，自来水冲洗终止；10)苏木素复染1min，自来水冲洗、分化、返蓝；11)酒精梯度脱水，75％1min、85％2min、95％3min、无水Ⅰ5min、无水Ⅱ5min；12)透明二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10min，中性树脂封片封片。

1.7 统计学方法

结果用表示，用SPSS统计软件进行单因素方差分析。

2.结果

2.1 SAL对小鼠胫骨骨折愈合的影响

X片检查结果显示，骨折第17d，DFO、SAL-H组小鼠左侧胫骨可见明显的骨痂形成并且可见点状、片状高密度影，显示了阳性药物和SAL的作用；SAL-L组也可见骨痂形成但依稀可见骨折线影，也可见点状、片状高密度影，显示了药物的促进骨折愈合作用，但作用不如SAL-H组；FM组可见少量骨痂形成，骨折线影明显，骨折断端移位高密度影不明显(图1A至1D)。骨折第31d，DFO、SAL-H和SAL-L组骨折线消失，高密度影明显，成骨面积增大，钙化明显，部分接近小鼠右侧胫骨皮质骨密度，FM组骨折线模糊，可见点状、片状高密度影面积，有较多钙化，但钙化程度小于DFO、SAL-H和SAL-L组(图1E至1H)。

2.2 小鼠胫骨骨折端形态学观察

HE染色结果显示，骨折第17d，FM组可见软骨组织及骨样组织，软骨组织中形成原始骨髓腔和骨髓，无成熟小梁状骨；DFO、SAL-H和SAL-L组均可见较成熟小梁状骨，交织成网状，伴骨髓腔和骨髓组织，成骨细胞排列于骨组织表面，更趋于成熟(图2A至2D)。骨折第31d，FM组可见较成熟小梁状骨，伴骨髓腔和骨髓组织，骨细胞更趋向于成熟。DFO、SAL-H和SAL-L组骨小梁进一步成熟，骨小梁沿长轴排列，骨陷窝清晰可见，板层状结构依次明显，且有大量活跃的成骨细胞排列于骨表面(图2E至2H)。

2.3 小鼠胫骨形态计量学结果

胫骨形态计量学结果显示，骨折第17天，DFO、SAL-H和SAL-L组的骨体积和骨小梁厚度明显高于FM组，骨小梁间隙明显低于FM组；DFO和SAL-H组的骨小梁数目明显高于FM组，SAL-L趋势高于FM组，但没统计学差异；与SAL-L组DFO和SAL-H组的骨体积、骨小梁厚度和骨小梁数目明显增高，骨小梁间隙明显减小(P<0.05或P<0.01，见图3A，3C，3E，3G)。骨折第31天，DFO、SAL-H和SAL-L组骨体积、骨小梁厚度和骨小梁数显高于FM组，骨小梁间隙明显低于FM组；与SAL-L组DFO和SAL-H组的骨体积、骨小梁厚度和骨小梁数目明显增高，骨小梁间隙明显减小(P<0.05或P<0.01，见图3B，3D，3F，3H)。

2.4 骨组织缺氧及HIF-1α通路激活的检测结果

免疫组化结果显示，骨折第17天，FM组骨痂组织中hypoxyprobe-1染色强阳性(图4A)，提示骨折部位确实存在缺氧情况，DFO组、SAL-H组和SAL-L组染色强度明显减弱(图4B至4D)。定量分析显示，3个药物处理组骨痂组织中hypoxyprobe-1的积分光密度值(IOD)均明显低于FM组(P<0.01，图4E)，提示低、高剂量的SAL均可显著改善由骨折所导致的局部缺氧状况，其中高剂量组效果与阳性药物DFO相似。骨折第31天，FM组hypoxyprobe-1的IOD值明显低于骨折第17天FM组(P<0.001，图4A，4F，4E和4J)，提示由于机体的修复使缺氧状况有所改善；与FM组相比，DFO组和SAL-H组hypoxyprobe-1染色明显减弱(P<0.01)，而SAL-L组不明显(P>0.05)(图4F至4J)。

在证实骨折部位确实存在缺氧状况后，我们继而对HIF-1α信号通路进行了检测。结果显示，骨折第17天，FM组HIF-1α染色阳性(图5A)，提示骨折所致的局部缺氧可诱导HIF-1α稳定性表达，SAL-H组(图5C)和DFO组(图5D)HIF-1α表达水平显著增加(P<0.01，图5E)，而SAL-L组(图5B)增加不明显(P>0.05，图5E)；骨折第31天，FM组HIF-1α表达水平较骨折第17天有所降低(P<0.001，图5A，5F，5E和5J)，3个药物处理组HIF-1α表达水平较其FM组明显降低，SAL-H组和DFO组较SAL-L组更低(P<0.01，图5F至5J)。

VEGF为HIF-1α的下游靶基因，应用抗VEGF抗体染色发现，骨折第17天，FM组VEGF染色阳性(图6A)，提示HIF-1α激活了下游靶基因VEGF的表达，SAL-H组(图6C)和DFO组(图6D)VEGF表达水平明显增加(P<0.01，图6E)，而SAL-L组(图6B)增加不明显(P>0.05，图6E)；骨折第31天，FM组VEGF表达水平较骨折第17天有所降低(P<0.001，图6A，6F，6E和6J)，SAL-H组(图6H)和DFO组(图6I)VEGF表达水平较其FM组显著降低(P<0.01，图6E)，而SAL-L组(图6G)降低不明显(P>0.05，图6J)。

VEGF可促进血管内皮细胞生长，CD31为血管内皮标记物。应用抗CD31抗体染色发现，骨折第17天，3个药物处理组CD31表达水平较其FM组显著增加，其中SAL-H组和DFO组表达水平明显高于SAL-L组(P<0.01，图7A至7E)，提示低、高剂量的SAL均可显著增加骨折局部组织的微血管密度，其中高剂量组效果与阳性药物DFO相似，其机制可能与其调控HIF-1α表达，进而上调其下游靶基因VEGF表达来实现的。骨折第31天，FM组CD31表达水平较骨折第17天有所降低(P<0.001，图7A，7F，7E和7J)，SAL-H组(图7H)和DFO组(图7I)CD31表达水平较其FM组降低明显(P<0.01，图7E)，而SAL-L组(图7G)降低不明显(P>0.05，图7J)，提示骨折早期SAL通过调控HIF-1信号通路介导骨折部位血管生成和骨生成耦联，进而促进骨再生过程；骨折后期由于骨折部位血供不断恢复，HIF-1α也因局部氧浓度升高而逐渐被降解，VEGF和CD31表达水平也随之降低，从而维持适度的血管密度；SAL-H组和DFO组通过调控HIF-1信号通路介导的血管生成，缩短血供恢复时间，故二者HIF-1α、VEGF和CD31表达水平较FM组和SAL-L组降低更显著。

综上所述，SAL通过调控调感应信号通路介导介导骨折部位血管生成和骨生成耦联，进而促进骨再生和骨修复过程。

Claims (1)

1.红景天苷在制备促进骨折骨修复药物的用途。