CN109988202B

CN109988202B - 用于在预防和/或治疗糖尿病足病中使用的治疗剂

Info

Publication number: CN109988202B
Application number: CN201910375667.2A
Authority: CN
Inventors: 张建革; 林国强; 田平; 冯陈国; 詹常森; 周俊杰
Original assignee: Shanghai Hutchison Pharmaceuticals Co ltd
Current assignee: Shanghai Hutchison Pharmaceuticals Co ltd
Priority date: 2018-06-27
Filing date: 2019-05-07
Publication date: 2021-08-24
Anticipated expiration: 2039-05-07
Also published as: CN109988201B; CN109988200B; CN111658659B; CN109988200A; CN109988202A; CN109988201A; US20210115082A1; CN111004297A; JP7248707B2; CN111004297B; WO2020001166A1; JP2023085345A; EP3819303A1; EP3819303A4; JP7442712B2; US11325937B2; CN111658659A; JP2021519341A

Abstract

本发明涉及一种如式III所示的糖苷类化合物及其盐用于配制药物组合物的用途，其可用于预防和/或治疗缺血性疾病，尤其是糖尿病足坏疽。

Description

用于在预防和/或治疗糖尿病足病中使用的治疗剂

技术领域

本发明涉及含有糖苷类化合物的治疗剂，其用于在预防和/或治疗下肢缺血性微循环障碍疾病中的使用。

背景技术

下肢缺血性微循环障碍最常见是糖尿病足坏疽病(简称DF)，其是由于糖尿病患者血糖长期居高不下，脂代谢紊乱从而导致动脉管腔狭窄闭塞不通引起肢端坏疽的一种慢性疾病。临床表现以手足麻木、肢端缺血、感染、化脓、溃烂为主。若糖尿病患者出现血管腔狭窄或阻塞，易发生周围神经损伤与末梢血管病变，肢端供血不足，足部负重大，易受伤，再加上自身免疫力低下，毛细血管内皮细胞出现损伤与增生，易引起微生物侵袭与感染，且糖尿病患者本身的高糖环境易于细菌的生长繁殖。

伤口修复对人体来说是一个有条不紊、循序渐进的过程，它包括一系列相互交联的阶段,分别有炎症、细胞增生、基质沉积和组织重建等。这是一个对受伤组织修复重建的应答过程，并且需要结缔组织修复、上皮再生和血管生成精确的协调。糖尿病人延迟的伤口愈合涉及到诸多复杂的动态因素如伤口凝固、炎症、肉芽组织形成、上皮新生、血管再生、新血管形成、胶原合成和伤口收合等。而上皮再生和肉芽组织形成在一定程度上受到了生长因子和细胞因子的影响，它们在这些过程中被释放到损伤部位。但详细机理仍不完全清楚。

创伤发生后，伤口组织最先进入凝血止血期，止血期过后，伤口组织进入炎症期，炎症期一般在伤口产生后24-48h，作用是为创伤组织提供一个隔绝外界环境中微生物侵袭的免疫屏障。炎性期可以分为两个不同阶段：早期炎性反应阶段和晚期炎性反应阶段。早期的炎症反应主要作用是清理创口，该时期中性粒细胞浸润到伤口组织，防止发生感染。在炎症期后期，巨噬细胞起主要作用，主要为一些重要调节伤口愈合的生长因子提供存储环境。

炎症期过后，伤口组织进入增殖期，在增殖期组织修复速度加快，在这一时期发生胶原蛋白合成、新生肉芽组织及血管产生等生理活动。胶原蛋白由成纤维细胞分泌，它是细胞外基质(ECM)的主要成分，正常皮肤中含有80％胶原蛋白I型和20％的胶原蛋白 III型，而创伤组织中含有40％的III型胶原蛋白。血管再生是创伤愈合过程中的重要环节，伴随整个增生期。凝血止血期分泌的很多有促血管生成作用的细胞因子不但能够在炎性期吸引中性粒细胞和巨噬细胞，在增生期还会发挥促进血管生成的重要作用。创伤部位的内皮细胞能够对多种促血管生成的因子做出应答反应，比如，成纤维细胞生长因子(FGF)，血管内皮生长因子(VEGF)，血小板衍生因子(PDGF)，血管生成素(Ang)，转化生长因子-α(TGF-α)以及转化生长因子-β(TGF-β)。这些细胞因子在血管抑制素和类固醇的抑制作用下维持着良好的动态平衡，直接或间接地影响内皮细胞有丝分裂，促进细胞迁移并促使内皮细胞分泌内皮生长因子。由于创伤部位没有相互联系的血管，所以创伤边缘的正常组织通过散布的正常血管和正常血管间隙建立联系。创伤边缘正常组织的毛细血管形成血管芽伸入创伤部位的血凝块，几天之内，就可以在创伤部位形成许多新的毛细血管，建立创伤部位毛细血管网。伤口愈合的最后时期为重塑期，在这一时期形成新的上皮组织与瘢痕组织。

增殖期和重塑期，细胞外基质开始合成，肉芽组织形成。重塑期会持续1-2年甚至更长时间。严重创伤的愈合过程中，为了保证创伤正常愈合，重塑期通过调控机制的严格调节，保持微妙的合成-降解平衡。随着细胞内基质的成熟，胶原纤维束直径增加，而透明质酸和纤连蛋白逐步降解。创伤发生三周之后，胶原蛋白的合成和分解及细胞外基质的重塑都趋向平衡，达到稳定状态，中性粒细胞、巨噬细胞和纤维母细胞在愈合过程中产生的基质金属蛋白酶调控胶原蛋白的降解。基质金属蛋白酶的活性严格受到抑制因子的调控。当基质金属蛋白酶的组织抑制因子水平逐渐上升到达峰值时，基质金属蛋白酶活性下降，创伤部位组织即开始形成新的细胞外基质。创伤愈合的重塑过程中，需要很多重要的细胞因子进行调控，包括血小板衍生因子(PDGF)，转化生长因子(TGF-β) 以及成纤维细胞生长因子(FGF)等。

成纤维细胞(FB)是参与创伤修复的主要细胞，创伤修复的“高级工程师”，它涉及创伤愈合的多个关键时期，如，打破纤维蛋白凝块、创造新的细胞外基质和胶原蛋白的形成、支持其他伤口愈合的相关细胞的生理活动等。成纤维细胞不仅细胞数量增殖，而且还会产生一些细胞外基质蛋白和生长因子。从伤口炎症期后期一直到上皮再生完成一直存在于伤口组织，具有合成分泌胶原、打破纤维蛋白凝块、纤维粘连蛋白及透明质酸等细胞外基质的功能，并构成肉芽组织的主要成分。同时还可分泌多种生长因子如胰岛素样生长因子、血小板衍生生长因子、转化生长因子-β1(TGF-β1)、表皮生长因子 (EGF)等，调控修复过程。

在创伤愈合的过程中，巨噬细胞对于伤口从炎症期到增殖期的转变起到非常重要的作用；炎症初期，单核细胞随中性粒细胞、淋巴细胞浸润伤口组织，清理因创伤而坏死的细胞和入侵的病原体，随后中性粒细胞、淋巴细胞数量迅速减少，单核细胞转变为巨噬细胞表型成为创伤处主要的免疫细胞；创伤约3天后，巨噬细胞逐渐转变为M2表型并释放多种细胞因子，促进了血管新生和纤维组织生成，从而促进了伤口愈合过程向增殖期的转变。增殖期的主要特征是肉芽组织形成，伤口显著缩小，主要的生理过程便是血管新生和纤维组织生成；巨噬细胞通过释放多种因子调节内皮细胞，促进其增殖、迁移，形成管腔样结构，同样，也促进了成纤维细胞的增殖、迁移以及胶原蛋白的合成，进而促进了肉芽组织的形成。

本发明的糖苷类物质能够促进VEGF-A mRNA的表达，从而促进下肢缺血性微循环障碍的治疗。

发明内容

发明人意外地发现，特定结构的糖苷类化合物，其互变异构体、光学异构体、溶剂化物、多晶型物、药学上可接受的盐、酯、药学上可接受的前体药物或衍生物可以预防和/或治疗下肢缺血性微循环障碍疾病。

本发明的实施方案可以应用于涉及糖尿病患者由于下肢血管壁病变、血液成分改变和/或血流动力学变化等微循环障碍导致的肢端病变的初期至晚期所有症状和/或病理变化。

因此，本发明提供了一种如下式III所示的糖苷类化合物，其互变异因此，本发明提供了一种如下式III所示的糖苷类化合物，其互变异构体、光学异构体、溶剂化物、多晶型物、药学上可接受的盐、酯、药学上可接受的前体药物或衍生物：

其用于在预防和/或治疗下肢缺血性微循环障碍性疾病中使用；R¹、R²、R³、R⁴和 R⁵各自独立地选自氢、羟基、巯基、取代或未取代的C₁～C₂₀烷氧基、硝基或卤素；

或者R¹、R²、R³、R⁴和R⁵中任意相邻两个与其苯环上相连的碳原子形成5-7元杂环，所述杂环的杂原子为O或S；所述杂原子的数目为1个或多个；当杂原子数目多个时，所述杂原子相同或不同；

所述取代或未取代的C₁～C₂₀烷氧基中的取代基选自C₃-C₂₀环烷基、C₁-C₂₀烯烃基、取代或未取代的C₆-C₂₀芳基、卤素、取代或未取代的C₂-C₂₀杂芳基、C₃-C₆的环烷氧基、 C₁～C₂₀的烷氧基或C₁～C₂₀烷基；

所述取代或未取代的C₆-C₂₀的芳基和取代或未取代的C₂-C₂₀杂芳基中的取代基各自独立地为卤素或卤素取代的C₁～C₂₀烷基；

X为CH₂、NR⁷、O或S；

Y为CH₂、NR⁸、O或S；

Z为O或S；

R⁷和R⁸各自独立地为氢、芳基取代的C₁-C₆烷氧羰基，或C₁-C₆烷氧羰基；

每个R⁶各自独立地为氢或糖基；

n为2，3或4；

优选地：

当X为CH₂，Y为CH₂，n＝2，3或4时，R¹-R⁵不同时是H；

当n＝2，R¹、R⁴和R⁵是H时，R²和R³不同时是OCH₃和OH；

当n＝2，R¹、R²和R⁵是H时，R³和R⁴不同时是OH和OCH₃；

当n＝2，R²、R⁴和R⁵是H时，R¹和R³不同时是OH；

当n＝2，R¹、R²和R⁴是H时，R³和R⁵不同时是OH。

本发明提供了一种如下式I所示的糖苷类化合物，其互变异构体、光学异构体、溶剂化物、多晶型物、药学上可接受的盐、酯、药学上可接受的前体药物或衍生物：

其用于在预防和/或治疗下肢缺血性微循环障碍性疾病中使用，R¹、R²、R³、R⁴和 R⁵各自独立地选自氢、羟基、巯基、取代或未取代的C₁～C₂₀烷氧基(例如取代或未取代的C₁～C₁₀烷氧基，例如取代或未取代的C₁～C₆烷氧基，)、硝基或卤素；

或者R¹、R²、R³、R⁴和R⁵中任意相邻两个相与其苯环上相连的碳原子形成5-7元杂环(例如所述R²和R³形成5-7元杂环)，所述杂环的杂原子为O或S(例如O)；所述杂原子的数目为1个或多个(例如两个)；当杂原子数目多个时，所述杂原子相同或不同；

所述取代或未取代的C₁～C₂₀烷氧基中的取代基选自C₃-C₂₀环烷基(例如C₃-C₁₀环烷基，再例如为C₃-C₆环烷基)、C₂-C₂₀烯烃基(例如C₂-C₆烯烃基，例如C₂-C₄烯烃基，再例如

)、取代或未取代的C₆-C₂₀芳基(例如取代或未取代的C₆-C₁₀芳基，再例如取代或未取代的芳基或萘基)、卤素(例如氟、氯、溴或碘)、取代或未取代的C₂-C₂₀杂芳基所述取代或未取代的C₂-C₂₀杂芳基中的杂原子可选自N、S和O中的一个或多个， (例如杂原子数目为1个；再例如所述杂原子为N；例如，所述取代或未取代的C₂-C₂₀杂芳基中可为仅有一个环的芳杂基)。

例如取代或未取代的C₂-C₁₀杂芳基，再例如取代或未取代的C₂-C₆杂芳基)、C₃-C₆的环烷氧基(例如

))、C₁～C₂₀的烷氧基(例如C₁～C₁₀烷氧基，例如C₁～C₆烷氧基，再例如甲氧基、乙氧基或丙氧基)或C₁～C₂₀烷基(例如C₁～C₁₀烷基；例如C₁～C₆烷基；再例如C₁～C₃烷基)；

所述取代或未取代的C₁-C₂₀的芳基和取代或未取代的C₂-C₂₀杂芳基中的取代基各自独立地选自卤素(例如氟、氯、溴或碘)或卤素(例如氟、氯、溴或碘)取代的C₁～C₂₀烷基(所述卤素取代的C₁～C₂₀烷基中的取代基的个数可为1个或多个，当为多个取代基时，各取代基可相同或不同；例如为卤素取代的C₁～C₁₀烷基；例如卤素取代的C₁～C₆烷基；例如卤素取代的C₁～C₃烷基；再例如-CF₃、-CHF₂或-CH₂F)；

X为CH₂、NR⁷、O或S；

Y为CH₂、NR⁸、O或S；

Z为O或S；

R⁷和R⁸各自独立地为氢、芳基取代的C₁-C₆烷氧羰基(例如苄氧羰基)或C₁-C₆烷氧羰基(例如叔丁氧羰基)；

R⁶为氢或

n为2，3或4。

优选地：

当X为CH₂，Y为CH₂，n＝2，3或4时，R¹-R⁵不同时是H；

当n＝2，R¹、R⁴和R⁵是H时，R²和R³不同时是OCH₃和OH；

当n＝2，R¹、R²和R⁵是H时，R³和R⁴不同时是OH和OCH₃。

本发明中，所述取代或未取代的C₂-C₂₀杂芳基可为取代或未取代的吡咯，取代或未取代的呋喃，取代或未取代的噻吩，取代或未取代的吡唑，取代或未取代的咪唑，取代或未取代的噁唑，取代或未取代的噻唑，取代或未取代的异噁唑，取代或未取代的吡啶，取代或未取代的哒嗪，取代或未取代的嘧啶，或取代或未取代的吡嗪，例如取代或取代的吡啶基。

本发明中，所述未取代的C₁～C₂₀烷氧基可为

本发明中，所述C₃-C₂₀环烷基可为环丙基、环丁基、环戊基或环己基。

本发明中，所述取代的C₆-C₂₀的芳基可为

本发明中，所述的取代的C₁～C₂₀烷氧基可为

本发明中，所述未取代的C₂-C₂₀杂芳基可为

本发明中，所述5-7元杂环可为

本发明中，所述R¹可为氢。

本发明中，所述R²可为氢，取代或未取代的C₁～C₂₀烷氧基，或所述R²和R³形成

所述取代或未取代的C₁～C₂₀烷氧基及其取代基的定义如前所述。

本发明中，所述R³可为氢、羟基、巯基、取代或未取代的C₁～C₂₀烷氧基、羟基、硝基或卤素；所述取代或未取代的C₁～C₂₀烷氧基及其取代基、和所述卤素的定义如前所述。

本发明中，所述R⁴可为氢，或取代或未取代的C₁～C₂₀烷氧基；所述取代或未取代的C₁～C₂₀烷氧基及其取代基的定义如前所述。

本发明中，所述R⁵可为氢。

本发明一实施例方式中，各基团定义如下所述(未提及的基团定义如前所述)：所述 X为CH₂，所述Y为CH₂、NR⁸、S或O；所述R⁸为氢、芳基取代的烷氧羰基或烷氧羰基。

本发明一实施例方式中，各基团定义如下所述(未提及的基团定义如前所述)：所述 X为NR⁷，所述Y为CH₂；所述R⁷为氢、芳基取代的烷氧羰基或烷氧羰基。

本发明一实施例方式中，各基团定义如下所述(未提及的基团定义如前所述)：所述 X为O或S，所述Y为CH₂。

本发明中，当所述R¹、R²、R³、R⁴和R⁵各自独立地选自氢、羟基、巯基、取代或未取代的C₁～C₂₀烷氧基、硝基或卤素时，所述取代或未取代的C₁～C₂₀烷氧基的个数可为一个或多个(例如1个，2个，或3个；再例如1个)。

本发明中，所述

可为以下任一结构：

本发明中，较佳地，所述n＝2。

本发明中，较佳地，所述R¹、R²、R³、R⁴和R⁵各自独立地选自氢、取代或未取代的C₁～C₂₀烷氧基、硝基或卤素。

本发明中，较佳地，所述R⁶为氢。

本发明中，较佳地，所述式I所示的化合物中的

的光学异构体可为：

更佳地为

在本发明某一实施方式中，所述式I所述的化合物的取代基可为以下情况(未提及的取代基的定义如前所述)：

所述n为2，3或4；

所述X为CH₂、NR⁷、O或S。

所述n为2，3或4；

Y为CH₂、NR⁸、O或S。

所述R¹为氢；

所述R²为氢，取代或未取代的C₁～C₂₀烷氧基，或所述R²和R³形成

所述取代或未取代的C₁～C₂₀烷氧基及其取代基的定义如前所述；

所述R³为氢、羟基、巯基、取代或未取代的C₁～C₂₀烷氧基、羟基、硝基或卤素；所述取代或未取代的C₁～C₂₀烷氧基及其取代基、和所述卤素的定义如前所述；

所述R⁴为氢，或取代或未取代的C₁～C₂₀烷氧基；所述取代或未取代的C₁～C₂₀烷氧基及其取代基的定义如前所述；

所述R⁵为氢。

所述n为2；

所述X为CH₂时，所述Y为CH₂、NR⁸、S或O；

所述所述X为NR⁷时，所述Y为CH₂；

所述X为O或S时，所述Y为CH₂。

本发明还提供了以下任一结构的化合物：

优选地，这些化合物是：

本发明还进一步提供了用于预防和/或治疗下肢缺血性微循环障碍性疾病中使用的提供了糖苷类化合物的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：溶剂中，将式V所示化合物进行还原反应，得到式VI所示化合物；

R^9’，R^10’和R^11’各自独立地为氢或Ac，且其中至少一个为Ac；R^6’为氢、Ac或者

R^12’,R^13’,R^14’,和R^15’各自独立地为氢、Bz或Ac；n,X，Y，Z， R¹，R²，R³，R⁴，R⁵和R⁶的定义如上任一项中所述；当R^6’为氢或Ac时，R⁶为氢；当 R^6’为

时，R⁶为

本发明还提供了式I所示化合物的制备方法，其包含以下步骤：溶剂中，将式II所示化合物进行还原反应，得到式I所示化合物，即可；

R^12’,R^13’,R^14’,和R^15’各自独立地为氢、Bz或Ac；n,X，Y，Z，R¹， R²，R³，R⁴，R⁵和R⁶的定义如前所述；当R^6’为氢或Ac时,R⁶为氢；当R^6’为

时，R⁶为

本发明还提供了上述所示的糖苷类化合物，或如下所示化合物，其互变异构体、光学异构体、溶剂化物、多晶型物、药学上可接受的盐、酯、药学上可接受的前体药物或衍生物，在制备预防和/或治疗下肢缺血性微循环障碍性疾病中应用；

本发明还提供了式I所示的糖苷类化合物，化合物TG-052、化合物TG-053、化合物TG-054或TG-058，其互变异构体、光学异构体、溶剂化物、多晶型物、药学上可接受的盐、酯、药学上可接受的前体药物或衍生物在制备预防和/或治疗下肢缺血性微循环障碍性疾病中应用；

本发明还提供了上述所示的糖苷类化合物，下式所示化合物，其互变异构体、光学异构体、溶剂化物、多晶型物、药学上可接受的盐、酯、药学上可接受的前体药物或衍生物，在制备治疗下肢缺血性微循环障碍性疾病的药物中的应用；

本发明还提供了式I所示的糖苷类化合物，化合物TG-052、化合物TG-053或化合物TG-054，其互变异构体、光学异构体、溶剂化物、多晶型物、药学上可接受的盐、酯、药学上可接受的前体药物或衍生物在制备治疗下肢缺血性微循环障碍性疾病的药物中的应用；

所述下肢缺血性微循环障碍性疾病涉及血管壁病变、血液成分改变和/或血流动力学变化导致的血管病变引发的下肢组织缺血的初期至晚期所有症状和/或病理变化，例如糖尿病足病。

本发明还提供了上述所示糖苷类化合物的中间体化合物：

本发明还提供了式I所示糖苷类化合物的中间体化合物：

本发明进一步提供上述糖苷类化合物，其互变异构体、光学异构体、溶剂化物、多晶型物、药学上可接受的盐、酯、药学上可接受的前体药物或衍生物，其用于在预防和/ 或治疗促血管生成的药物中的应用，优选在缺血性血管病中使用，进一步优选在下肢缺血性微循环障碍性疾病如糖尿病足病中使用。这一方面可以表达为上述糖苷类化合物，其互变异构体、光学异构体、溶剂化物、多晶型物、药学上可接受的盐、酯、药学上可接受的前体药物或衍生物用于制备药物的用途，所述药物通过促血管生成用于预防和/或治疗哺乳动物(包括人)的下肢缺血性微循环障碍性疾病。进一步优选在下肢缺血性微循环障碍性疾病尤其是糖尿病足病中使用。另一方面还可以表达为促进有需要的患者血管生成的方法，优选为治疗和/或预防包括患有或易于患有下肢缺血性微循环障碍性疾病的哺乳动物(包括人)的方法，进一步是指患有下肢缺血性微循环障碍性疾病尤其是糖尿病足病的哺乳动物(包括人)的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的本发明上述糖苷类化合物，其互变异构体、光学异构体、溶剂化物、多晶型物、药学上可接受的盐、酯、药学上可接受的前体药物或衍生物，连同药用赋形剂或载体。

进一步本发明的上述糖苷类化合物，其互变异构体、光学异构体、溶剂化物、多晶型物、药学上可接受的盐、酯、药学上可接受的前体药物或衍生物用于预防和/或治疗下肢缺血性微循环障碍性疾病的用途。下肢缺血性微循环障碍性疾病的实例包括：糖尿病足病，糖尿病足坏疽，肢端坏疽，湿性坏疽、干性坏疽、混合坏疽等。

在一个优选的实施方案中，湿性坏疽临床表现为肢端伴有皮肤溃烂、感染、化脓、疼痛，出现神经障碍及微循环障碍，动、脉受到阻塞。严重时多伴有全身不适或毒血症、菌血症等表现。灶轻重不一、浅表溃疡或严重坏疽。

在另一个优选的实施方案中，干性坏疽临床表现为血管腔狭窄、阻塞，引起血流中断。局部出现不同程度的缺血性坏疽。组织液减少，皮肤变黑、干枯、疼痛消失。多见于肢端动脉粥样硬化。

在另一个优选的实施方案中，混合性坏疽临床表现为患者同一肢端不同部位出现干或湿性坏疽，常涉及肢端大部或全足坏疽。一般病情较重、坏疽面积较大

在另一个优选的实施方案中，糖尿病足坏疽病是由于糖尿病患者血糖长期居高不下，脂代谢紊乱从而导致动脉管腔狭窄闭塞不通引起肢端坏疽的一种慢性疾病。临床表现以手足麻木、肢端缺血、感染、化脓、溃烂为主。若糖尿病患者出现血管腔狭窄或阻塞，易发生周围神经损伤与末梢血管病变，肢端供血不足，足部负重大，易受伤，再加上自身免疫力低下，毛细血管内皮细胞出现损伤与增生，易引起微生物侵袭与感染。

优选地将治疗有效量的本发明上述糖苷类化合物，其互变异构体、光学异构体、溶剂化物、多晶型物、药学上可接受的盐、酯、药学上可接受的前体药物或衍生物根据通常给药途径并且根据本领域已知方法以常规药物组合物(该药物组合物包含有效量的活性成分和合适的药用载体)和剂型配制而施用至需要这样治疗的患者。

“治疗有效量”是指这样的活性成分的量，当施用时，其足以防止所针对的疾病的一种或多种症状的发展，或在某种程度上缓解所述一种或多种症状。根据本发明施用的化合物的具体剂量将由围绕该病例的具体情况确定，所述情况包括所施用的化合物、给药途径、治疗的具体病况以及类似的考虑因素。特别地，“治疗有效量的化合物”是指足以防止或在某种程度上缓解一种或多种下肢缺血性微循环障碍疾病的化合物的量。

取决于待治疗的下肢缺血性微循环障碍疾病的类型和严重性以及具体患者对药物治疗的反应，单个剂量以及日剂量不同。因此，将根据在医生的指导下的标准医学原理来确定准确的单个剂量。

用于在治疗下肢缺血性微循环障碍疾病中使用本发明糖苷类化合物的有效日剂量为 1至10000mg/天。在一个特别的实施方案中，用于在治疗糖尿病足坏疽中使用的有效日剂量为1至6000mg/天；优选1至3000mg天；更优选1至600mg/天，进一步优选1至200mg/天。

用于在治疗下肢缺血性微循环障碍疾病中使用本发明糖苷类化合物的有效日剂量为 0.01mg至约1000mg、约1mg至约500mg、或约10mg至约200mg以及可选的约0.01mg 至约2000mg、约10mg至约1000mg、约100mg至约800mg、或约200mg至约600mg 的其他活性剂的口服剂型。

本发明的上述糖苷类化合物，其互变异构体、光学异构体、溶剂化物、多晶型物、药学上可接受的盐、酯、药学上可接受的前体药物或衍生物可以单独使用或组合使用或与其他治疗剂的联合疗法使用。

在本发明的一个实施方案中，上述糖苷类化合物，其互变异构体、光学异构体、溶剂化物、多晶型物、药学上可接受的盐、酯、药学上可接受的前体药物或衍生物用于在预防和/或治疗下肢缺血性微循环障碍疾病中使用，其中所述预防或治疗包括施用作为唯一活性成分使用。

在本发明的另一个实施方案中，上述糖苷类化合物，其互变异构体、光学异构体、溶剂化物、多晶型物、药学上可接受的盐、酯、药学上可接受的前体药物或衍生物用于在预防和/或治疗下肢缺血性微循环障碍疾病中使用，其中所述预防或治疗包括以与选自由以下各项组成的组中的治疗剂的联合疗法施用：另一种本发明糖苷类化合物，其互变异构体、光学异构体、溶剂化物、多晶型物、药学上可接受的盐、酯、药学上可接受的前体药物或衍生物、降血糖药物、抗感染药物、降低血脂的药物、溶解血栓的药物、抗血小板聚集的药物、抗凝药物、神经保护药物、钙离子拮抗剂、谷氨酸拮抗剂、谷氨酸释放抑制剂、GABA受体激动剂、自由基清除剂、细胞膜稳定剂。在一个优选的实施方案中，另外的治疗剂选自由以下各项组成的组：式III或式I的另一种化合物、抗生素类药物、胰岛素、瑞替普酶、兰替普酶、孟替普酶、豆豉纤溶酶、新型蚯蚓纤溶酶、纳豆激酶、蛇毒纤溶酶原激活剂、阿司匹林、噻氯匹定、氯吡格雷、普拉格雷、替卡格雷、坎格雷洛、盐酸沙格雷酯、vorapaxar、atopaxar、肝素、低分子肝素、华法林、利伐沙班、比法卢定、达比加群酯、依达拉奉、他汀类药物。

如对于本领域技术人员将明显的是，包含本发明糖苷类化合物，其互变异构体、光学异构体、溶剂化物、多晶型物、药学上可接受的盐、酯、药学上可接受的前体药物或衍生物与另外的治疗剂的本发明的组合不仅在这些活性成分以单一组合物使用时是有效的，而且在以两个不同组合物(同时、依次或在一段时间之后分开地施用)使用时也是有效的。此外，本领域技术人员将理解，本发明糖苷类化合物，其互变异构体、光学异构体、溶剂化物、多晶型物、药学上可接受的盐、酯、药学上可接受的前体药物或衍生物、可以开处方为与联合疗法中的其他活性成分一起使用，以预防和/或治疗下肢缺血性微循环障碍疾病。

在一个特别的实施方案中，联合疗法包括向受试者同时、依次或分开地施用本发明的糖苷类化合物，其互变异构体、光学异构体、溶剂化物、多晶型物、药学上可接受的盐、酯、药学上可接受的前体药物或衍生物和另外的治疗剂。备选地，联合疗法包括向受试者施用在单一组合物中的本发明糖苷类化合物，其互变异构体、光学异构体、溶剂化物、多晶型物、药学上可接受的盐、酯、药学上可接受的前体药物或衍生物和另外的治疗剂。

在本发明的一个实施方案中，本发明的糖苷类化合物，其互变异构体、光学异构体、溶剂化物、多晶型物、药学上可接受的盐、酯、药学上可接受的前体药物或衍生物可以方便地施用至患者。因此，用于本发明的用途的化合物可以为包含与药用赋形剂或载体组合的有效量的本发明的糖苷类化合物，其互变异构体、光学异构体、溶剂化物、多晶型物、药学上可接受的盐、酯、药学上可接受的前体药物或衍生物的药物组合物的形式。这一方面也可以表达为，包含与药用赋形剂或载体组合的有效量的本发明的糖苷类化合物，其互变异构体、光学异构体、溶剂化物、多晶型物、药学上可接受的盐、酯、药学上可接受的前体药物或衍生物的组合物用于在预防和/或治疗：下肢缺血性

微循环障碍疾病如糖尿病足病，糖尿病足坏疽、肢端坏疽，湿性坏疽、干性坏疽、混合坏疽等。

在本发明的一个实施方案中，使用的化合物可以以包含常规药用载体的剂量单位制剂通过口腔、注射、皮下、呼吸道、透皮、非肠道、直肠、局部外用、静脉、肌肉或通过其它方式来给予。可以将药物组合物配制成任何药用形式，如：片剂、颗粒剂、注射剂、凝胶剂、丸剂、胶囊剂、栓剂、植入剂、纳米制剂、粉针剂。诸如片剂和胶囊剂的一些剂型可以再分成包含诸如达到期望目的的有效量的适当量活性组分的适当剂量单位剂型。

在另一个实施方案中，用于本发明的用途的本发明的糖苷类化合物，其互变异构体、光学异构体、溶剂化物、多晶型物、药学上可接受的盐、酯、药学上可接受的前体药物或衍生物为待施用至要治疗的患者的注射制剂，适用于本发明的注射剂是指药物与适宜的溶剂或分散介质制成供注入人体内的灭菌或无菌溶液、乳状液或悬浮液，以及供使用前配制成溶液或悬浮液的粉末无菌制剂。所述注射剂包括注射液(其中供静脉滴注用的大体积注射液也称静脉输液)、注射用无菌粉末与注射用浓溶液。

载体包括赋形剂和稀释剂，并且必须具有足够高的纯度和十分低的毒性以使它们适于被给予待治疗的患者。载体可以是惰性的或其可以本身具有药用益处。

载体的种类包括但不限于：稀释剂如填料和疏松剂、粘合剂、润滑剂、抗结块剂、崩解剂、增甜剂、缓冲剂、防腐剂、增溶剂、等张剂、悬浮剂和分散剂、润湿剂或乳化剂、调味剂和芳香剂、增稠剂和媒介物。一些载体可以列在多于一种的类别中，如：植物油可以在一些制剂中用作滑润剂并在其他制剂中用作稀释剂。示例性药用载体包括糖、淀粉、纤维素、麦芽、明胶、滑石和植物油。可选的活性剂可以包括在药物组合物中，其基本上不影响本发明的化合物的活性。

本申请的化合物或盐可以是被给予的唯一活性剂或可以连同其他活性剂被给予。

术语约定：

“立体异构体”、“光学异构体”或“旋光异构体”是具有相同化学组成但原子或基团在空间中的排布不同的化合物。其包括“非对映异构体”和“对映异构体”

“非对映异构体”是具有两个或更多手性中心并且其分子不是彼此的镜像的立体异构体。非对映异构体具有不同物理性能，例如：熔点、沸点、谱特性和反应活性。在拆分剂或色谱存在的情况下，使用诸如手性HPLC柱，可以在诸如电泳、结晶的高分辨分析步骤下分离非对映异构体的混合物。

“对映异构体”指代彼此无重叠镜像的一种化合物的两个立体异构体。对映异构体的50:50的混合称为外消旋混合物或外消旋体，其在化学反应或处理过程中可以出现在已经没有立体选择性或立体定向性的情况下。

“烷基”包括支链和直链饱和脂肪族烃基两者，并具有指定数量的碳原子数量，一般1至约12个碳原子。如在本文中使用的术语C1-C6烷基表示具有1至约6个碳原子的烷基。当本文中结合另一基团使用C0-Cn烷基时，以(苯基)C0-C4烷基为例，指定的基团，在这种情况下，苯基是通过单个共价键(C0)直接键合或通过具有指定的碳原子数(在这种情况下，1至约4个碳原子)的烷基链连接。烷基的实例包括但不限于：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、3-甲基丁基、叔丁基、正戊基、和仲戊基。

“烯基”或“烯烃基”指包括一个或多个不饱和的碳-碳键的直链和支链烃链，碳-碳键可以出现在沿着链的任一稳定点。本文中所述的烯基通常具有2至约12个碳原子。优选烯基是低级烯基，那些烯基具有2至约8个碳原子，如：C₂-C₈、C₂-C₆、和C₂-C₄烯基。烯基的实例包括乙烯基、丙烯基、和丁烯基。

“烷氧基”是指具有通过氧桥连接的指定数量的碳原子的如上所定义的烷基。烷氧基的实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、3-己氧基、和3-甲基戊氧基。

术语“杂环”表示5-至8-元饱和环、部分不饱和环、或包含选自N、O和S的1至约4 个杂原子且剩余的环原子是碳的芳族环，或是7至11元饱和环、部分不饱和环、或芳族杂环系统和10至15-元三环系统，该系统包含选自N、O和S的多环系统中的至少1个杂原子并且在多环系统中的各环中包含独立地选自N、O和S的至多约4个杂原子。除非另外指明，否则杂环可以连接至它在任何杂原子和碳原子处取代并且产生稳定结构的基团。当指明时，本文中所述的杂环可以在碳或氮原子上被取代，只要得到的化合物是稳定的。可以可选地季铵化杂环中的氮原子。优选杂环基中杂原子的总数不大于4而且优选杂环基中S和O原子的总数不大于2，更优选不大于1。杂环基的实例包括：吡啶基、吲哚基、嘧啶基、哒嗪基(pyridizinyl)、吡嗪基、咪唑基、噁唑基、呋喃基、苯硫基、噻唑基、三唑基、四唑基、异噁唑基、喹啉基、吡咯基、吡唑基、苯并[b]苯硫基 (benz[b]thiophenyl)、异喹啉基、喹唑啉基、喹喔啉基、噻吩基、异吲哚基、二氢异吲哚基、5,6,7,8-四氢异喹啉、吡啶基、嘧啶基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡唑基、吡咯烷基、吗啉基、哌嗪基、哌啶基、和吡咯烷基。

“芳基”或“杂芳基”表示包含选自N、O和S的1至4个、或优选1至3个杂原子并且剩余环原子为碳的稳定的5-或6-元单环或多环。当杂芳基中S和O原子的总数超过 1时，这些杂原子不彼此邻近。优选杂芳基中S和O原子的总数不大于2。尤其优选杂芳基中S和O原子的总数不大于1。可以可选地季铵化杂环中的氮原子。当指明时，这些杂芳基还可以用碳或非碳原子或基团取代。这种取代可以包括与可选地包含独立地选自N、O和S的1或2个杂原子的5至7-元饱和的环基的稠合，从而形成例如[1,3]二噁唑并[4,5-c]吡啶基。杂芳基的实例包括但不限于：吡啶基、吲哚基、嘧啶基、哒嗪基、吡嗪基、咪唑基、噁唑基、呋喃基、苯硫基、噻唑基、三唑基、四唑基、异噁唑基、喹啉基、吡咯基、吡唑基、苯并[b]苯硫基、异喹啉基、喹唑啉基、喹喔啉基、噻吩基、异吲哚基、和5,6,7,8-四氢异喹啉。

“药学上可接受的盐”或“化合物的盐”是所公开的化合物的衍生物，其中，母体化合物通过制备无毒的酸或其碱加成盐改性，并且还指这些化合物和这些盐的药用溶剂化物，包括水合物。药用盐的实例包括但不限于：碱性残基如胺类的无机或有机酸加成盐；酸性残基如羧酸的碱或有机加成盐；等等，以及包括一种或多种上述盐的组合。药用盐包括诸如从无毒无机或有机酸形成的母体化合物的无毒盐和季铵盐。例如，无毒酸性盐包括衍生自无机酸的那些，例如：盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等；其他可接受的无机盐包括金属盐如：钠盐、钾盐、铯盐等；碱土金属盐如：钙盐、镁盐等，以及包括一种或多种上述盐的组合。

化合物的有机盐包括由诸如乙酸、三氟乙酸、丙酸、丁二酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、扑酸、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、对氨基苯磺酸、2-乙酸基苯酸、富马酸、对甲苯磺酸、甲磺酸、乙烷二磺酸、草酸、羟乙磺酸、HOOC-(CH2)n-COOH(其中 n为0至4)等的有机酸制备的盐；有机胺盐，如：三乙胺盐、吡啶盐、甲基吡啶盐、乙醇胺盐、三乙醇胺盐、二环己基胺盐、N,N'-二苄基乙二胺盐等；和氨基酸盐，如：精氨酸盐、天冬氨酸盐、谷氨酸盐等，以及包括一种或多种上述盐的组合。

“糖基”包括单糖基、双糖基、寡糖基、多糖基等，其中单糖基包括但不限于赤藓糖基、苏力糖基、阿拉伯糖基、核糖基、木糖基、来苏糖基、葡萄糖基、甘露糖基、果糖基、半乳糖基等。双糖基包括但不限于蔗糖基、麦芽糖基、纤维二糖基、异麦芽糖基、龙胆二糖基、海藻糖基和乳糖基等。

“前药”是指在宿主中代谢，如水解或氧化成本发明化合物的化合物，前药典型的例子包括在活性化合物的官能团上具有生物不稳定保护基团的化合物。前药包括可被氧化、还原、胺化、脱胺化、羟基化、脱羟基化、水解、脱水、烷基化、脱烷基化、酰基化、脱酰基、磷酸化、脱磷酸化以产生活性化合物的化合物。

“衍生物”是指化合物的氢原子或原子团被其他原子或原子团取代而衍生的较复杂的产物。

附图说明

图1为海绵植入动物模型上化合物促进VEGF-A mRNA表达作用的示意图。

图2为糖尿病模型小鼠给药组、未给药组以及正常小鼠皮肤损伤愈合图。

图3为糖尿病模型小鼠给药组、未给药组以及正常小鼠皮肤损伤的愈合量化结果。

图4为糖尿病模型小鼠给药组、未给药组以及正常小鼠体重变化结果。

图5为糖尿病模型小鼠给药组、未给药组的葡萄糖测定值变化结果。

图6为糖尿病模型小鼠给药组、未给药组在第6天的VEGF-A mRNA表达量变化结果。

图7为糖尿病模型小鼠给药组、未给药组在第6天的TGF-β 1mRNA表达量变化结果。

图8为糖尿病模型小鼠给药组、未给药组以及正常小鼠皮肤损伤处组织HE染色图。

图9为糖尿病模型小鼠给药组、未给药组以及正常小鼠损皮肤伤处组织Masson染色图。

图10为糖尿病模型小鼠给药组、未给药组以及正常小鼠皮肤损伤处组织CD31染色图。

图11为糖尿病模型小鼠给药组、未给药组以及正常小鼠皮肤损伤处组织愈合结果数据量化图。

图12为TG-028对小鼠成纤维细胞增殖的影响。

图13为TG-028对小鼠成纤维细胞迁移的划痕实验结果。

图14为TG-028对小鼠成纤维细胞迁移的影响

图15为TG-028对小鼠成纤维细胞胶原生产的影响。

图16为效果实施例4中各组样品的划痕实验结果。

图17为效果实施例4中各组样品对HUVEC-12细胞小管生成的影响的倒置显微镜图。

图18为效果实施例4中各组样品对HUVEC-12细胞小管生成的影响。

图19为TG-028作用巨噬细胞24h后的上清对内皮细胞小管形成的影响。

图20为TG-028作用巨噬细胞24h后的上清对内皮细胞小管形成的影响。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

路线A：化合物TG-001，TG-002，TG-003，TG-004，TG-005，TG-006，TG-007，TG-008，TG-057 的合成

路线a实验操作：

将化合物4a(1eq)、Pd(PPh₃)₂Cl₂(2mol％)、CuI(2mol％)加入到反应瓶中，在N₂保护下，向体系中依次加入THF(0.2M)、化合物5(1.2eq)、Et₃N(9.6eq)，然后在室温下反应20h。用硅藻土(上海大合化学品有限公司分析纯AR)过滤后直接旋干过柱 (石油醚/乙酸乙酯＝2：1)，得化合物6a(yield 89％)。将化合物6a(1eq)、Pd/C(10％) 加入MeOH(0.1M)中，在60atm的H₂条件下，室温反应20h。硅藻土过滤后，减压浓缩，硅胶柱层析提纯，得化合物7a(yield 94％)。

向化合物8a(1eq)中滴加33％的HBr/AcOH(4eq)溶液，在室温条件下反应4h。直接旋干，用Et₂O和正己烷重结晶，得化合物9a(76g,yield 98％)。

将化合物7a(1eq)、9a(1.2eq)加入到反应瓶中，在N₂保护下，向体系中加入二氯甲烷(0.3M)，室温条件下反应30min。再向体系中加入Ag₂CO₃(1.2eq)，室温条件下反应20h，过滤后直接旋干过柱(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝4：1)，得化合物10a(yield 40％)。将化合物10a(1eq)加入到反应瓶中，分别加入MeOH(4M)、H₂O(4M)、 Et₃N(2eq)，室温条件下反应20h，减压浓缩，硅胶柱过柱提纯(洗脱剂：二氯甲烷: 甲醇＝9:1)，得化合物TG-001(yield70％)。

化合物TG-002,TG-003,TG-004,TG-005,TG-006,TG-007,TG-008,TG-057的合成使用与化合物TG-001类似的合成路线，其结构如下。

化合物TG-001，TG-002,TG-003,TG-004,TG-005,TG-006,TG-007,TG-008，TG-057的结构鉴定数据如下：

TG-001的鉴定数据：

¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ(ppm)7.17–7.06(m,2H),6.88(d,J＝8.0Hz,1H),6.82(td,J＝7.4,0.9Hz,1H),4.23(d,J＝7.8Hz,1H),3.91(m,1H),3.85(dd,J＝11.9,2.0Hz,1H), 3.80(s,3H),3.66(dd,J＝11.9,5.3Hz,1H),3.55(m,1H),3.37–3.21(m,3H),3.19–3.12(m, 1H),2.61(t,J＝7.0Hz,2H),1.64(m,4H).

LRMS(ESI):[M+Na]⁺365.1；HRMS(ESI):[M+H]⁺计算值C₁₇H₂₇O₇ ⁺343.1751，实测值为343.1748。

TG-002的数据：

¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ(ppm)6.35(d,J＝2.2Hz,2H),6.28(t,J＝2.2Hz,1H),4.24(d,J＝7.8Hz,1H),3.96–3.91(m,1H),3.85(dd,J＝11.8,1.7Hz,1H),3.74(s,6H),3.66(dd,J＝11.9,5.2Hz,1H),3.58-3.53(m,1H),3.38–3.21(m,3H),3.19–3.11(m,1H),2.57(t,J＝7.3Hz,2H),1.75–1.58(m,4H).

LRMS(ESI):[M+Na]⁺395.1；HRMS(ESI):[M+NH₄]⁺计算值为C₁₈H₃₂O₈N⁺390.2122，实测值为390.2122。

TG-003的数据：

¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ(ppm)6.84(d,J＝8.2Hz,1H),6.79(d,J＝1.9Hz,1H),6.72(dd,J＝8.1,1.9Hz,1H),4.24(d,J＝7.8Hz,1H),3.98-3.88(m,1H),3.86(dd,J＝11.9,1.9Hz,1H),3.81(s,3H),3.79(s,1H),3.66(dd,J＝11.9,5.3Hz,1H),3.61–3.51(m,1H),3.38–3.21(m,3H),3.20–3.12(m,1H),2.58(t,J＝7.2Hz,2H),1.75–1.56(m,4H).

LRMS(ESI):[M+Na]⁺395.1；HRMS(ESI):[M+NH₄]⁺计算值为C₁₈H₃₂O₈N⁺390.2122，实测值为390.2118。

TG-005的数据：

¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ(ppm)7.07(d,J＝8.8Hz,2H),6.80(d,J＝8.8Hz,2H),4.23(d,J＝7.8Hz,1H),3.93–3.82(m,2H),3.75(s,3H),3.66(dd,J＝11.9,5.3Hz,1H),3.52(dt,J＝9.5,6.7Hz,1H),3.38–3.22(m,3H),3.20–3.12(m,1H),2.54(t,J＝7.6Hz,2H),1.68-1.61(m,4H),1.47–1.31(m,2H).

LRMS(ESI):[M+Na]⁺375.1；HRMS(ESI):[M+H]⁺计算值为C₁₈H₂₉O₇ ⁺357.1908，实测值为357.1906。

TG-006的数据：

¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ(ppm)7.06(d,J＝8.6Hz,2H),6.84–6.80(d,J＝8.6 Hz,2H),4.23(d,J＝7.8Hz,1H),3.93–3.82(m,2H),3.75(s,3H),3.66(dd,J＝11.9,5.2Hz,1H),3.52(dt,J＝9.5,6.7Hz,1H),3.38–3.21(m,3H),3.20–3.11(m,1H),2.53(t,J＝7.6Hz,2H),1.68–1.50(m,4H),1.47–1.25(m,4H).

LRMS(ESI):[M+Na]⁺393.1；HRMS(ESI):[M+NH₄]⁺计算值C₁₉H₃₄O₇N⁺388.2330, 实测值为388.2327。

终产物TG-004的数据：

¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ(ppm)7.15(t,J＝7.8Hz,1H),6.79–6.67(m,3H),4.24 (d,J＝7.8Hz,1H),3.92(dt,J＝9.4,6.4Hz,1H),3.85(dd,J＝11.9,1.8Hz,1H),3.76(s,3H),3.66(dd,J＝11.9,5.2Hz,1H),3.60–3.51(m,1H),3.39–3.21(m,3H),3.19–3.12(m,1H),2.60(t,J＝7.3Hz,2H),1.78–1.56(m,4H).

LRMS(ESI):[M+Na]⁺365.1；HRMS(ESI):[M+NH₄]⁺计算值C₁₇H₃₀O₇N⁺360.2017,实测值为为360.2016。

TG-007的数据：

¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ(ppm)6.49(s,2H),4.24(d,J＝7.8Hz,1H),3.97–3.83 (m,2H),3.81(s,6H),3.72(s,3H),3.69–3.52(m,2H),3.37–3.21(m,3H),3.20–3.13(m, 1H),2.59(t,J＝7.3Hz,2H),1.79–1.55(m,4H).

LRMS(ESI):[M+Na]⁺425.1；HRMS(ESI):[M+NH₄]⁺计算值C₁₉H₃₄O₉N⁺420.2228，实测值为为420.2226。

TG-008的数据：

¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ(ppm)6.71-6.67(m,2H),6.65-6.61(m,1H),5.87(s,2H),4.23(d,J＝7.8Hz,1H),3.95-3.88(m,1H),3.85(m,1H),3.66(dd,J＝11.8,5.2Hz,1H),3.60–3.48(m,1H),3.38–3.20(m,3H),3.19–3.12(m,1H),2.55(t,J＝7.1Hz,2H),1.73–1.53 (m,4H).

LRMS(ESI):[M+Na]⁺379.0；HRMS(ESI):[M+Na]⁺计算值C₁₇H₂₄O₈Na⁺379.1374,实测值为379.1362。

TG-057的数据：

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ(ppm)6.83(d,1H,J＝7.6Hz),6.70–6.64(m,2H),6.26(br,1H),4.83(br,8H),4.00(s,1H),3.88(s,3H),3.74(t,2H,J＝6.4Hz),3.55(s,2H),2.58(t, 2H,J＝7.2Hz),1.69–1.62(m,4H).

LRMS(ESI):[M+Na]⁺381.2。

该实验过程中的各反应中间体的结构如下：

上述中间体10a-10h的鉴定数据为：

10a:

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ6.32(d,J＝2.2Hz,2H),6.29(t,J＝2.2Hz,1H),5.20(t,J＝9.5Hz,1H),5.08(t,J＝9.7Hz,1H),4.98(dd,J＝9.6,8.0Hz,1H),4.48(d,J＝8.0Hz,1H),4.26(dd,J＝12.3,4.7Hz,1H),4.13(dd,J＝12.3,2.3Hz,1H),3.89(d,J＝9.5Hz,1H),3.78(s,6H),3.68(dd,J＝9.9,2.2Hz,1H),3.49(d,J＝9.4Hz,1H),2.55(t,J＝6.6Hz,2H),2.08(s, 3H),2.05–1.97(m,9H),1.63(dd,J＝11.5,4.3Hz,4H).

LRMS(ESI):[M+Na]⁺533.5。

10b：

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ6.34–6.28(m,3H),5.20(t,J＝9.5Hz,1H),5.08(t,J＝9.7Hz,1H),4.98(dd,J＝9.6,8.0Hz,1H),4.48(d,J＝8.0Hz,1H),4.26(dd,J＝12.3,4.7Hz,1H),4.13(dd,J＝12.3,2.3Hz,1H),3.89(d,J＝9.5Hz,1H),3.78(s,6H),3.68(dd,J＝9.9,2.2Hz,1H),3.49(d,J＝9.4Hz,1H),2.55(t,J＝6.6Hz,2H),2.10–2.07(s,3H),2.03(s,3H),2.00(m,6H),1.63(dd,J＝11.5,4.3Hz,4H).

LRMS(ESI):[M+Na]⁺563.5。

10c：

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ6.82–6.59(m,3H),5.27–4.83(m,3H),4.46(d,J＝7.9 Hz,1H),4.32–3.99(m,2H),3.83(m,7H),3.74–3.35(m,2H),2.53(m,2H),1.99(m,12H), 1.59(m,4H).

LRMS(ESI):[M+Na]⁺563.5。

10d：

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ7.19(t,J＝8.1Hz,1H),6.81–6.65(m,3H),5.28–4.88 (m,3H),4.48(d,J＝8.0Hz,1H),4.32–4.06(m,2H),3.88(m,1H),3.80(s,3H),3.68(d,J＝8.2Hz,1H),3.51(m,1H),2.59(m,2H),2.03(m,12H),1.64(m,4H).

LRMS(ESI):[M+Na]⁺533.5。

10e：

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ7.08(d,J＝6.9Hz,2H),6.82(d,J＝6.8Hz,2H),5.69(d, J＝4.2Hz,1H),5.19(m,1H),4.91(d,J＝9.3Hz,1H),4.30(m,1H),4.20(m,2H),3.96(m, 1H),3.79(s,3H),3.46(t,J＝5.7Hz,2H),2.55(t,J＝7.0Hz,2H),2.09(m,9H),1.71(s,3H),1.66–1.48(m,4H),1.36(d,J＝6.7Hz,2H).

LRMS(ESI):[M+Na]⁺547.5。

10f：

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.08(d,J＝8.6Hz,2H),6.83(t,J＝5.7Hz,2H),5.20(t,J＝9.5Hz,1H),5.08(t,J＝9.7Hz,1H),4.98(dd,J＝9.6,8.0Hz,1H),4.48(d,J＝8.0Hz,1H),4.26(dd,J＝12.3,4.7Hz,1H),4.12(m,1H),3.86(dt,J＝9.6,6.3Hz,1H),3.79(s,3H),3.68(ddd,J＝9.9,4.6,2.4Hz,1H),3.46(dt,J＝9.5,6.8Hz,1H),2.58–2.49(m,2H),2.08(s,3H), 2.02(m,9H),1.62–1.49(m,4H),1.36–1.28(m,4H).

LRMS(ESI):[M+Na]⁺561.5。

10g:

LRMS(ESI):[M+Na]⁺593.5。

10h：

LRMS(ESI):[M+Na]⁺547.5。

路线B：化合物TG-009,TG-010,TG-011,TG-012的合成

路线B实验操作：

将化合物12i(1eq)溶于THF(0.2M)中，0℃下向体系中缓慢加入LiAlH₄(2eq)，室温条件下反应2～20h。0℃下依次向体系中缓慢加入H₂O(1倍THF溶剂体积)、15％ NaOH溶液(1倍THF溶剂体积)、H₂O(3倍THF溶剂体积)。以乙酸乙酯萃取，萃取液合并后，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。减压蒸除溶剂后，硅胶柱过柱提纯(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝4:1)，得化合物7i(yield 98％)。

将化合物7i(1eq)、9a(1.2eq)加入到反应瓶中，在N₂保护下，向体系中加入二氯甲烷(0.3M)，室温条件下反应30min。再向体系中加入Ag₂CO₃(1.2eq)，室温条件下反应20h。硅藻土过滤后，减压浓缩，硅胶柱层析提纯，得化合物10i(yield 26％)。将化合物10i(1eq)加入到反应瓶中，分别加入MeOH(4M)、H₂O(4M)、Et₃N(2eq)，室温条件下反应20h，硅胶柱过柱提纯(洗脱剂：二氯甲烷:甲醇＝9:1)，得化合物TG-009 (yield 75％)。

化合物TG-010,TG-011,TG-012的合成使用与化合物TG-009类似的合成路线。化合物TG-009、TG-010,TG-011和TG-012的结构及鉴定数据如下所示：

TG-009的数据：

¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ(ppm)4.24(d,J＝7.8Hz,1H),3.95–3.81(m,2H),3.66(dd,J＝11.9,5.2Hz,1H),3.53(dt,J＝9.5,6.7Hz,1H),3.38–3.21(m,3H),3.20–3.11(m,1H),1.81–1.51(m,7H),1.46–1.08(m,8H),0.95–0.80(m,2H).

LRMS(ESI):[M+Na]⁺341.1；HRMS(ESI):[M+Na]⁺计算值C₁₆H₃₀O₆Na⁺341.1946,实测值为341.1934。

TG-012的数据：

¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ(ppm)7.38(d,J＝8.3Hz,2H),7.12(d,J＝8.3Hz,2H),4.24(d,J＝7.8Hz,1H),3.92(dt,J＝9.5,6.4Hz,1H),3.85(dd,J＝11.9,1.6Hz,1H),3.66(dd,J＝11.8,5.2Hz,1H),3.56(dt,J＝9.6,6.3Hz,1H),3.31(m,3H),3.19–3.11(m,1H),2.61(t,J＝7.4Hz,2H),1.77–1.55(m,4H).

LRMS(ESI):[M+Na]⁺414.9；HRMS(ESI):[M+Na]⁺计算值C₁₆H₂₃O₆BrNa⁺413.0570, 实测值为413.0568。

TG-011的数据：

¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ(ppm)8.14(d,J＝8.7Hz,2H),7.45(d,J＝8.7Hz,2H),4.25(d,J＝7.8Hz,1H),4.00–3.82(m,2H),3.70–3.50(m,2H),3.37–3.22(m,3H),3.21–3.12(m,1H),2.78(t,J＝7.6Hz,2H),1.85–1.57(m,4H).

LRMS(ESI):[M+Na]⁺380.0；HRMS(ESI):[M+Na]⁺计算值C₁₆H₂₃O₈NNa⁺380.1327, 实测值为380.1314。

TG-010的数据：

¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ(ppm)7.18(dd,J＝8.5,5.6Hz,2H),7.00–6.91(m,2H),4.24(d,J＝7.8Hz,1H),3.92(dt,J＝9.6,6.3Hz,1H),3.87-3.82(m,1H),3.66(dd,J＝11.8,5.2Hz,1H),3.56(dt,J＝9.5,6.3Hz,1H),3.37–3.22(m,3H),3.20–3.11(m,1H),2.62(t,J＝7.3Hz,2H),1.78–1.54(m,4H).

LRMS(ESI):[M+COOH]^-375.0；HRMS(ESI):[M+Cl]^-计算值C₁₆H₂₃O₆FCl^-365.1173, 实测值为365.1173。

该实验过程中的各反应中间体的结构如下：

上述中间体10i-10l的鉴定数据为：

10i：

LRMS(ESI):[M+Na]⁺509.5。

10j：

LRMS(ESI):[M+Na]⁺521.5。

10k：

LRMS(ESI):[M+Na]⁺548.5。

10l：

LRMS(ESI):[M+Na]⁺582.4。

路线C:化合物TG-013,TG-014，TG-015,TG-016,TG-017,TG-018,TG-019,TG-020,TG-021,TG-022,TG-024,TG-025,TG-026，TG-027，TG-049、TG-050、TG-051和 TG-023的合成

路线C实验操作：

将化合物13(1eq)、Et₃N(1.5eq)加入二氯甲烷(0.5M)中，在0℃的条件下滴加Ac₂O(1.2eq)，0℃至室温条件下反应20h后，分别用饱和NH₄Cl、NaCl溶液洗涤，无水Na₂SO4干燥后减压浓缩，得化合物14(16g,yield 92％)。

将化合物14(1eq)加入二氯甲烷(0.5M)中，在-78℃的条件下缓慢滴加1M的BBr₃/二氯甲烷(2.5eq)，0℃下反应5h，用饱和NaHCO₃溶液淬灭，再用二氯甲烷萃取，无水Na₂SO4干燥后减压浓缩，硅胶柱过柱提纯(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝2:1)，得化合物15(8.7g,yield 78％)。

将化合物15(1eq)加入MeOH(0.5M)中，向体系中加入1M的NaOH溶液(3eq)，室温条件下反应2h，2N HCl溶液调节PH至3，再用乙酸乙酯萃取，无水Na₂SO4干燥后减压浓缩，硅胶柱过柱提纯(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝1:1)，得化合物16(6g,yield 85％)。

将化合物16(1eq)、9a(1.2eq)加入到反应瓶中，在N₂保护下，向体系中加入二氯甲烷(0.3M)，室温条件下反应30min。再向体系中加入Ag₂CO₃(2.2eq)，室温条件下反应20h。硅藻土过滤后，减压浓缩，硅胶柱过柱提纯(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝1:2)，得化合物17(7.6g,yield 32％)。

将化合物17(1eq)、PPh₃(1.5eq)加入到反应瓶中，室温下向体系中缓慢滴加DIAD(1.5eq)，继续反应30min后向体系中滴加R^3’OH(1.2eq)，65℃条件下反应2～10h。减压浓缩，硅胶柱过柱提纯，得化合物18a～j(yield 55～90％)。

将化合物18a或17(1eq)加入到反应瓶中，分别加入MeOH(4M)、H₂O(4M)、 Et₃N(2eq)，室温条件下反应20h。减压浓缩，硅胶柱过柱提纯(洗脱剂：二氯甲烷: 甲醇＝9:1)，分别得化合物TG-013(yield 59％)和TG-023(yield 13％)。

化合物TG-014,TG-015,TG-016,TG-017,TG-018,TG-019,TG-020,TG-021, TG-022,TG-024,TG-025,TG-026,TG-027、TG-049、TG-050、TG-051和TG-023的合成使用与化合物TG-013类似的合成路线。

化合物TG-013，TG-014,TG-015,TG-016,TG-017,TG-018,TG-019,TG-020, TG-021,TG-022,TG-024,TG-025,TG-026,TG-027、TG-049、TG-050、TG-051和TG-023 结构及鉴定数据如下所示：

TG-013的数据：

¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ(ppm)7.34(m,5H),7.09(d,J＝8.3Hz,2H),6.88(d,J ＝8.4Hz,2H),5.03(s,2H),4.23(d,J＝7.8Hz,1H),4.01–3.82(m,2H),3.66(dd,J＝11.8,5.0Hz,1H),3.59–3.47(m,1H),3.39–3.22(m,3H),3.16(t,J＝8.3Hz,1H),2.56(t,J＝6.9Hz,2H),1.65(d,J＝4.1Hz,4H).

LRMS(ESI):[M+Na]⁺441.1；HRMS(ESI):[M+Na]⁺计算值C₂₃H₃₀O₇Na⁺441.1884,实测值为441.1880。

TG-015的数据：

¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ(ppm)7.08(d,J＝8.6Hz,2H),6.82(d,J＝8.6Hz,2H),6.12–5.96(m,1H),5.37(dd,J＝17.3,1.6Hz,1H),5.22(dd,J＝10.6,1.4Hz,1H),4.55–4.44(m,2H),4.23(d,J＝7.8Hz,1H),3.97–3.80(m,2H),3.66(dd,J＝11.9,5.2Hz,1H), 3.60–3.50(m,1H),3.38–3.21(m,3H),3.20–3.12(m,1H),2.56(t,J＝7.1Hz,2H),1.73– 1.55(m,4H).

LRMS(ESI):[M+Na]⁺391.0；HRMS(ESI):[M+Na]⁺计算值C₁₉H₂₈O₇Na⁺391.1727,实测值为391.1726。

TG-016的数据：

¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ(ppm)7.06(d,J＝8.5Hz,2H),6.78(d,J＝8.6Hz,2H),4.23(d,J＝7.8Hz,1H),3.95–3.82(m,2H),3.72(d,J＝6.4Hz,2H),3.66(dd,J＝11.9,5.2Hz,1H),3.59–3.50(m,1H),3.37–3.20(m,3H),3.19–3.12(m,1H),2.56(t,J＝7.1Hz, 2H),1.86(d,J＝13.1Hz,2H),1.81–1.57(m,8H),1.38–1.16(m,3H),1.09(m,2H).

LRMS(ESI):[M+Na]⁺447.2；HRMS(ESI):[M+Na]⁺计算值C₂₃H₃₆O₇Na⁺447.2353,实测值为447.2352。

TG-017的数据：

¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ(ppm)8.65(d,J＝1.2Hz,1H),8.52(dd,J＝4.9,1.2Hz,1H),7.96(d,J＝7.9Hz,1H),7.48(dd,J＝7.8,5.0Hz,1H),7.14(d,J＝8.5Hz,2H),6.94(d,J＝8.6Hz,2H),5.14(s,2H),4.27(d,J＝7.8Hz,1H),3.99–3.85(m,2H),3.69(dd,J＝11.9,5.2Hz,1H),3.58(dt,J＝9.4,6.2Hz,1H),3.43–3.24(m,3H),3.23–3.16(m,1H),2.60(t,J＝7.1Hz,2H),1.76–1.60(m,4H).

LRMS(ESI):[M+Na]⁺442.1；HRMS(ESI):[M+Na]⁺计算值C₂₂H₂₉O₇NNa⁺442.1836, 实测值为442.1834。

TG-018的数据：

¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ(ppm)7.10(d,J＝8.5Hz,2H),6.82(d,J＝8.6Hz,2H),4.27(d,J＝7.8Hz,1H),3.99–3.86(m,2H),3.83(d,J＝6.9Hz,2H),3.69(dd,J＝11.8,5.2Hz,1H),3.62–3.54(m,1H),3.41–3.24(m,3H),3.21-3.17(m,1H),2.59(t,J＝7.0Hz,2H),2.40-2.30(m,1H),1.93-1.78(m,2H),1.76–1.57(m,8H),1.47–1.35(m,2H).

LRMS(ESI):[M+Na]⁺433.2；HRMS(ESI):[M+Na]⁺计算值C₂₂H₃₄O₇Na⁺433.2197，实测值为433.2192。

TG-019的数据：

¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ(ppm)8.66–8.44(m,2H),7.54(d,J＝5.9Hz,2H),7.15 (d,J＝8.6Hz,2H),6.93(d,J＝8.6Hz,2H),5.18(s,2H),4.26(d,J＝7.8Hz,1H),3.95(dt,J ＝9.5,6.3Hz,1H),3.89(dd,J＝11.9,1.9Hz,1H),3.69(dd,J＝11.8,5.2Hz,1H),3.62–3.54(m,1H),3.41–3.24(m,3H),3.23–3.16(m,1H),2.61(t,J＝7.1Hz,2H),1.77–1.58(m, 4H).

LRMS(ESI):[M+H]⁺420.2；HRMS(ESI):[M+H]⁺计算值C₂₂H₃₀O₇N⁺420.2017，实测值为420.2014。

TG-020的数据：

¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ(ppm)7.11(d,J＝8.5Hz,2H),6.83(d,J＝8.5Hz,2H),4.27(d,J＝7.8Hz,1H),4.05–3.86(m,4H),3.82(d,J＝6.3Hz,2H),3.69(dd,J＝11.8,5.2Hz,1H),3.58(dt,J＝9.5,6.2Hz,1H),3.49(td,J＝12.0,1.7Hz,2H),3.40–3.24(m,3H),3.19(t,J＝8.4Hz,1H),2.60(t,J＝7.1Hz,2H),2.14–1.98(m,1H),1.85–1.60(m,6H),1.47(qd,J＝12.3,4.5Hz,2H).

LRMS(ESI):[M+Na]⁺449.2；HRMS(ESI):[M+H]⁺计算值C₂₂H₃₅O₈ ⁺427.2326,实测值为427.2323。

TG-021的数据：

¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ(ppm)7.10(d,J＝8.5Hz,2H),6.83(d,J＝8.5Hz,2H),4.27(d,J＝7.8Hz,1H),3.99–3.85(m,4H),3.69(dd,J＝11.8,5.2Hz,1H),3.58(dt,J＝9.4,6.2Hz,1H),3.41–3.24(m,3H),3.19(t,J＝8.4Hz,1H),2.85–2.71(m,1H),2.59(t,J＝7.1Hz,2H),2.24–2.08(m,2H),2.08–1.85(m,4H),1.70(m,4H).

LRMS(ESI):[M+Na]⁺419.2。

TG-014的数据：

¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ(ppm)7.07(d,J＝8.5Hz,2H),6.79(d,J＝8.6Hz,2H),4.23(d,J＝7.8Hz,1H),3.96–3.80(m,4H),3.66(dd,J＝11.9,5.2Hz,1H),3.59–3.49(m,1H),3.38–3.21(m,3H),3.20–3.11(m,1H),2.56(t,J＝7.1Hz,2H),1.75(m,2H),1.70– 1.57(m,4H),1.02(t,J＝7.4Hz,3H).

LRMS(ESI):[M+Na]⁺393.1；HRMS(ESI):[M+Na]⁺计算值C₁₉H₃₀O₇Na⁺393.1884,实测值为393.1880。

TG-022的数据：

¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ8.53(d,J＝4.4Hz,1H),7.86(td,J＝7.8,1.6Hz,1H),7.59(d,J＝7.9Hz,1H),7.36(dd,J＝7.0,5.4Hz,1H),7.10(d,J＝8.6Hz,2H),6.90(d,J＝8.6Hz,2H),5.13(s,2H),4.23(d,J＝7.8Hz,1H),3.95–3.88(m,1H),3.85(dd,J＝11.9,1.7Hz,1H),3.66(dd,J＝11.9,5.2Hz,1H),3.59–3.51(m,1H),3.35-3.12(m,4H),2.57(t,J＝7.1Hz,2H),1.81–1.52(m,4H)。

LRMS(ESI):[M+Na]⁺442.0；HRMS(ESI):[M+Na]⁺计算值C₂₂H₂₉O₇NNa⁺442.1836, 实测值为442.1834。

TG-024的数据：

¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ7.10(d,J＝8.5Hz,2H),6.82(d,J＝8.6Hz,2H),4.27(d, J＝7.8Hz,1H),4.02(q,J＝7.0Hz,2H),3.98–3.92(m,1H),3.89(dd,J＝11.8,1.6Hz,1H),3.69(dd,J＝11.8,5.2Hz,1H),3.58(dt,J＝9.5,6.2Hz,1H),3.41–3.29(m,3H),3.23–3.13(m,1H),2.59(t,J＝7.1Hz,2H),1.78–1.56(m,4H),1.39(t,J＝7.0Hz,3H).

LRMS(ESI):[M+Na]⁺379.1。

TG-025的数据：

¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ7.13(d,J＝8.5Hz,2H),6.88(d,J＝8.6Hz,2H),4.97–4.83(m,2H),4.62(t,J＝6.0Hz,2H),4.27(d,J＝7.8Hz,1H),4.19(d,J＝6.4Hz,2H),3.95(dt,J＝6.3,3.3Hz,1H),3.89(dd,J＝11.8,1.7Hz,1H),3.69(dd,J＝11.8,5.2Hz,1H),3.63– 3.54(m,1H),3.52–3.41(m,1H),3.41–3.24(m,3H),3.23–3.15(m,1H),2.61(t,J＝7.1Hz, 2H),1.81–1.57(m,4H).

LRMS(ESI):[M+Na]⁺421.1。

TG-026的数据：

¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ7.68(dd,J＝18.9,8.3Hz,4H),7.14(d,J＝8.6Hz,2H),6.93(d,J＝8.6Hz,2H),5.17(s,2H),4.27(d,J＝7.8Hz,1H),3.95(dt,J＝6.3,3.3Hz,1H),3.89(dd,J＝11.8,1.7Hz,1H),3.69(dd,J＝11.8,5.2Hz,1H),3.62–3.54(m,1H),3.42–3.24(m,3H),3.23–3.15(m,1H),2.61(t,J＝7.1Hz,2H),1.83–1.52(m,4H).

LRMS(ESI):[M+Na]⁺509.2。

TG-027的数据：

H NMR(400MHz,CD₃OD)δ7.40(dt,J＝7.9,5.9Hz,1H),7.26(d,J＝7.7Hz,1H),7.20(d,J＝9.9Hz,1H),7.13(d,J＝8.6Hz,2H),7.05(td,J＝8.5,2.3Hz,1H),6.91(d,J＝8.6Hz,2H),5.09(s,2H),4.27(d,J＝7.8Hz,1H),3.95(dt,J＝9.4,6.3Hz,1H),3.89(dd,J＝11.9,1.8Hz,1H),3.69(dd,J＝11.9,5.2Hz,1H),3.62–3.54(m,1H),3.41–3.24(m,3H),3.23–3.15(m,1H),2.60(t,J＝7.1Hz,2H),1.90–1.55(m,4H).

LRMS(ESI):[M+Na]⁺459.2。

TG-049的鉴定数据

¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ7.74(s,1H),7.69(d,J＝7.4Hz,1H),7.62-7.53(m,2H),7.11(d,J＝8.6Hz,2H),6.91(d,J＝8.6Hz,2H),5.13(s,2H),4.23(d,J＝7.8Hz,1H),3.92(dt,J＝9.4,6.3Hz,1H),3.85(dd,J＝11.9,1.7Hz,1H),3.66(dd,J＝11.8,5.2Hz,1H),3.55(dt,J＝9.6,6.2Hz,1H),3.37-3.32(m,1H),3.26(t,J＝5.9Hz,2H),3.20–3.11(m,1H),2.57(t,J＝7.1Hz,2H),1.80-1.49(m,4H).

LRMS(ESI):[M+Na]⁺509.20

TG-050的鉴定数据

¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ7.53(td,J＝7.5,1.3Hz,1H),7.42-7.34(m,1H),7.21(td,J＝7.5,1.0Hz,1H),7.18-7.10(m,1H),7.14(d,J＝8.6Hz,2H),6.92(d,J＝8.6Hz,2H),5.12(s,2H),4.27(d,J＝7.8Hz,1H),3.95(dt,J＝9.4,6.3Hz,1H),3.89(dd,J＝11.9,1.8Hz,1H), 3.69(dd,J＝11.9,5.2Hz,1H),3.58(dt,J＝9.5,6.3Hz,1H),3.39-3.25(m,3H),3.24-3.16(m, 1H),2.61(t,J＝7.1Hz,2H),1.78-1.59(m,4H).

LRMS(ESI):[M+Na]⁺459.20

TG-051的数据

¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ7.47(dd,J＝8.5,5.5Hz,2H),7.13(d,J＝8.6Hz,4H),7.14-7.09(m,1H),6.91(d,J＝8.6Hz,2H),5.04(s,2H),4.27(d,J＝7.8Hz,1H),3.95(dt,J＝9.3,6.2Hz,1H),3.89(dd,J＝11.8,1.7Hz,1H),3.69(dd,J＝11.8,5.2Hz,1H),3.58(dt,J＝ 9.4,6.2Hz,1H),3.-3.24(m,3H),3.23-3.14(m,1H),2.60(t,J＝7.1Hz,2H),1.91-1.56(m, 4H).

LRMS(ESI):[M+Na]⁺459.2

TG-023的数据：

¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ6.99(d,J＝8.5Hz,2H),6.70–6.63(m,2H),4.23(d,J＝7.8Hz,1H),3.96–3.82(m,2H),3.66(dd,J＝11.9,5.2Hz,1H),3.54(dt,J＝9.5,6.1Hz,1H),3.38–3.21(m,3H),3.16(dd,1H),2.53(t,J＝7.0Hz,2H),1.70–1.56(m,4H).

LRMS(ESI):[M+Na]⁺351.1；HRMS(ESI):[M+NH₄]⁺计算值C₁₆H₂₈O₇N⁺346.1860, 实测值为346.1857。

该实验过程中的各反应中间体的结构如下：

上述中间体18a-18q的鉴定数据为：

18a：

LRMS(ESI):[M+Na]⁺609.6。

18b：

LRMS(ESI):[M+Na]⁺561.5。

18c：

LRMS(ESI):[M+Na]⁺559.5。

18d：

LRMS(ESI):[M+Na]⁺615.6。

18e：

LRMS(ESI):[M+Na]⁺610.6。

18f：

LRMS(ESI):[M+Na]⁺601.6。

18g：

LRMS(ESI):[M+Na]⁺610.6。

18h：

LRMS(ESI):[M+Na]⁺617.6。

18i：

LRMS(ESI):[M+Na]⁺587.6。

18j：

LRMS(ESI):[M+Na]⁺610.2。

18k：

LRMS(ESI):[M+Na]⁺547.2。

18l：

LRMS(ESI):[M+Na]⁺589.2。

18m：

LRMS(ESI):[M+Na]⁺677.2。

18n：

LRMS(ESI):[M+Na]⁺627.2。

18o：

LRMS(ESI):[M+Na]⁺677.23。

18p：

LRMS(ESI):[M+Na]⁺654.23。

18q：

LRMS(ESI):[M+Na]⁺654.23。

路线D：终产物TG-028,TG-029,TG-030的合成

路线D实验操作：

将20a(3g，16.7mmol)加入40ml吡啶中，滴加Ac₂O，反应3天。减压浓缩，硅胶柱层析提纯(洗脱剂：酸乙酯：石油醚＝1：4)得产品8a，产率95％。向化合物8a中滴加33％的HBr/AcOH(4eq)溶液，在室温条件下反应4h。减压浓缩，粗产物以Et₂O 和正己烷重结晶，得化合物9a。将9a(1eq)加入三颈瓶，加入4A 分子筛和无水二氯甲烷/Et₂O混合溶液。混合液搅拌均匀后，加入原料13(0.95eq)。继续搅拌30min后加入 Ag₂CO₃(1.2eq)，反应过夜。硅藻土过滤，减压浓缩，硅胶柱层析提纯得产品22a(19％ yield)。

将化合物22a(1eq)加入到反应瓶中，分别加入MeOH(4M)、H₂O(4M)、Et₃N (2eq)，室温条件下反应20h。硅藻土过滤后，减压浓缩，硅胶柱层析提纯，得化合物 TG-028(64％yield)。

化合物TG-029和TG-030的合成使用与化合物TG-028类似的合成路线。

化合物TG-028、TG-029和TG-030的结构及鉴定数据如下所示：

TG-028的数据：

H NMR(400MHz,DMSO)δ7.10(d,J＝8.5Hz,2H),6.83(d,J＝8.5Hz,2H),5.10– 4.78(m,3H),4.45(t,J＝5.9Hz,1H),4.09(d,J＝7.8Hz,1H),3.77(m,J＝12.5,6.4Hz,1H), 3.71(s,3H),3.65(dd,J＝10.8,6.0Hz,1H),3.49–3.37(m,2H),3.17–2.98(m,3H),2.92(td, J＝8.3,5.1Hz,1H),2.55-2.5(m,2H)1.69–1.41(m,4H).

LRMS(ESI):[M+Na]⁺365.0；HRMS(ESI):[M+Na]⁺计算值C₁₇H₂₆O₇Na⁺365.1571, 实测值为365.1569。

TG-029的数据

¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ7.08(d,J＝8.5Hz,2H),6.80(d,J＝8.6Hz,2H),4.23(d, J＝7.8Hz,1H),3.91(m,1H),3.85(dd,J＝11.9,1.7Hz,1H),3.76(s,3H),3.66(dd,J＝11.8,5.2Hz,1H),3.55(dt,J＝9.5,6.1Hz,1H),3.37–3.1(m,4H),2.56(t,J＝7.1Hz,2H),1.78–1.53(m,4H).

LRMS(ESI):[M+Na]⁺365.0；HRMS(ESI):[M+Na]⁺计算值C₁₇H₂₆O₇Na⁺365.1571,实测值为365.1570。

TG-030的数据

¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ7.12(d,J＝8.3Hz,2H),6.83(d,J＝8.4Hz,2H),4.22(d, J＝7.3Hz,1H),3.95(dd,J＝10.9,4.9Hz,1H),3.85(d,J＝2.4Hz,1H),3.83–3.71(m,5H),3.64–3.44(m,4H),2.59(t,J＝6.9Hz,2H),1.68(d,J＝3.7Hz,4H).

LRMS(ESI):[M+Na]⁺365.1；HRMS(ESI):[M+NH₄]⁺计算值C₁₇H₃₀O₇N⁺360.2017,实测值为360.2015。

该实验过程中的各反应中间体的结构如下：

上述中间体22a-22c的鉴定数据为：

22a：

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.07(d,J＝8.6Hz,2H),6.82(t,J＝5.7Hz,2H),5.20(t,J＝9.5Hz,1H),5.08(t,J＝9.7Hz,1H),4.98(t,J＝9.6,8.0Hz,1H),4.48(d,J＝8.0Hz,1H),4.26(dd,J＝12.3,4.7Hz,1H),4.16–4.07(m,1H),3.89(dd,J＝5.8,3.7Hz,1H),3.78(s,3H),3.68(m,J＝9.9,4.6,2.4Hz,1H),3.49(dt,J＝9.4,6.1Hz,1H),2.55(t,J＝6.6Hz,2H),2.08(s,3H),2.05–1.96(m,9H),1.68–1.52(m,4H).

LRMS(ESI):[M+Na]⁺533.2。

22b：

LRMS(ESI):[M+Na]⁺533.2。

22c：

LRMS(ESI):[M+Na]⁺533.2。

路线E：化合物TG-031TG-032TG-033TG-034TG-035TG-036TG-037 的合成

其中片段24a～e的合成如下所示：

路线E实验操作：

片段24a：将化合物28(2.48g,0.02mol)和29(3.336g，0.024mol)分别加入DMF(30mL) 中，室温加K₂CO₃(13.8g,0.1mol)，室温搅拌48小时。加水用乙酸乙酯萃取，萃取液合并水洗，以无水硫酸钠干燥。砂芯漏斗过滤，减压浓缩。以乙酸乙酯和石油醚混合液重结晶得24a：3.1g 85％yield。

片段24b：将31(3.72g，60mmol)加入THF中，分批加入NaH(0.624g，26mmol) 依次加入30(3.132g，20mmol)Bu₄NI(738mg，2mmol)加热到70℃，搅拌5h。反应液降低到室温，用饱和氯化铵洗涤一次，减压浓缩。硅胶柱层析提纯，得到24b：2.9g， 80％yield。

片段24c：将33(6.1g，0.1mol)加入MeOH中，室温下32(13.6g，0.1mol)加热到70℃，搅拌过夜。冷却到室温，分批加入NaBH₄(3.8g,0.1mol)，然后加热到70℃，搅拌2h。冷却到室温，采用乙酸乙酯萃取。萃取液合并后用水洗，无水硫酸钠干燥。砂芯漏斗过滤，减压浓缩，硅胶柱层析提纯得34(13.4g，88％yield)。

将34(3.6g，23.8mmol)加入二氯甲烷中，冰浴滴加Boc₂O(6.23g，28.6mmol)。滴加完毕后，室温搅拌反应过夜，减压浓缩，硅胶柱层析提纯得24c(4.9g，73％yield)。

片段24d：将34(3.6g，23.8mmol)加入二氯甲烷中，冰浴依次滴加CbzCl(6.63g，0.39mmol)和Et₃N(4.5g，0.45mmol)搅拌5h。反应液依次以水、NaHCO₃饱和液、饱和食盐水洗涤一次。无水硫酸钠干燥，减压浓缩，硅胶柱层析提纯得24d(6g，63.5％yield)。

片段24e：将35(6.15g，50mmol)，29(13.9g,100mol),和K₂CO₃(13.8g，100mmol) 依次加入正丁醇(40mL)中，加碘(50mg),回流反应30h。减压浓缩，硅胶柱层析提纯得产品368.5g，93％yield。将36(3.3g，18.2mmol)加入二氯甲烷,加K₂CO₃(4.9g，36mmol)，冰浴滴加Cbz-Cl(4g，23.7mmol)室温搅拌过夜。依次以水、饱和食盐水洗涤一次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，硅胶柱层析提纯得24e(3g，72％yield)。

将9a(1eq)和24a～e(0.95mmol)，4A分子筛依次加入反应瓶。加干燥的二氯甲烷(0.25mol/L),搅拌30min。氩气氛保护下加Ag₂CO₃(1.2eq)，室温搅拌过夜，硅藻土过滤。滤液减压浓缩，以硅胶柱层析提纯得产品25a～e。将25a～e(1eq)各自加入单颈瓶，向各单颈瓶中均加入MeOH(6eq)，H₂O(6eq)，Et₃N(3eq)，搅拌过夜，减压浓缩，硅胶柱层析提纯(洗脱剂：甲醇/二氯甲烷＝1:15)得产品TG-031(产率24％),TG-032(产率26％),TG-033(产率24％),TG-034(产率20％),TG-035(产率12％)。

将TG-033(1g，2.25mmol)和2,6-Lutidine(481mg，4.5mmol)加入二氯甲烷,冰浴下滴加TBDMSOTf(893mg，3,38mmol)，0℃搅拌2小时，TLC显示反应完全。用0.5M 的HCl将PH调到5，旋干，过柱(甲醇/二氯甲烷＝1:20)，得TG-036 400mg，产率：46.8％。

将TG-035(700mg，1.46mmol)，加入MeOH(30ml)加Pd/C，用氢气抽气换气，40 个大气压常温搅拌过夜。硅藻土过滤，减压浓缩，硅胶柱层析提纯(洗脱剂：甲醇/二氯甲烷＝1:12)得产品TG-037(320mg，63％yield)。

化合物TG-031，TG-032，TG-033，TG-034，TG-035，TG-036和TG-037的结构及鉴定数据如下所示：

TG-031的数据：

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ6.89–6.81(m,1H),4.90(s,1H),4.46(s,1H),4.46(s,1H),4.13(d,J＝7.8Hz,1H),3.99(t,J＝6.4Hz,1H),3.90(dt,J＝9.9,6.3Hz,1H),3.66–3.55(m,1H),3.43(dd,J＝11.8,5.5Hz,1H),3.08(dq,J＝23.5,8.9Hz,1H),2.94(t,J＝8.3Hz,1H),1.94(q,J＝6.6Hz,1H).

LRMS(ESI):[M+Na]⁺367.1；HRMS(ESI):[M+NH₄]⁺计算值C₁₆H₂₈O₈N⁺362.1809,实测值为362.1807。

TG-032的数据：

¹H NMR(300MHz,CD₃OD)δ7.25(d,J＝8.3Hz,2H),6.86(d,J＝8.4Hz,2H),4.46(s,2H),4.25(d,J＝7.7Hz,1H),4.06–3.91(m,1H),3.87–3.54(m,7H),3.36–3.10(m,4H).

LRMS(ESI):[M+Na]⁺367.1；HRMS(ESI):[M+NH₄]⁺计算值C₁₆H₂₈O₈N⁺362.1809,实测值为362.1806。

TG-033的数据：

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ7.18(d,J＝8.4Hz,2H),6.90(d,J＝8.1Hz,2H),5.02(bs,2H),4.59–4.28(m,3H),4.11(t,1H),3.73(s,4H),3.66(d,J＝11.6Hz,1H),3.61–3.50(m,1H),3.44(dd,J＝11.6,4.7Hz,1H),3.39–3.00(m,6H),2.94(t,J＝8.3Hz,1H),1.41(d,J＝14.2Hz,9H)。

TG-034的数据：

¹H NMR(300MHz,DMSO)δ7.35(d,J＝13.0Hz,5H),7.17(d,J＝15.0Hz,2H),6.88(t,2H),5.09(dd,J＝14.9Hz,3H),4.95(dd,J＝14.2Hz,2H),4.54–4.41(m,3H),4.17–4.04(m,1H),3.87–3.51(m,5H),3.50–3.20(m,4H),3.18–2.87(m,5H).

LRMS(ESI):[M+Na]⁺500.2；HRMS(ESI):[M+H]⁺计算值C₂₄H₃₂O₉N⁺478.2072,实测值为478.2065。

TG-035的数据：

¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ7.55–7.02(m,7H),6.92(d,J＝8.9Hz,2H),5.08(s,2H),4.17(d,J＝7.7Hz,1H),3.98–3.87(m,1H),3.86–3.70(m,6H),3.64(dd,J＝11.9,5.3Hz,1H),3.60–3.50(m,1H),3.36–3.19(m,3H),3.14(t,J＝8.4Hz,1H),1.93–1.74(m,2H).

LRMS(ESI):[M+Na]⁺500.0；HRMS(ESI):[M+Na]⁺计算值C₂₄H₃₁O₉NNa⁺500.1891，实测值为500.1889。

TG-036的数据：

¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ7.43(d,J＝8.7Hz,2H),7.00(d,J＝8.7Hz,2H),4.35(d, J＝7.8Hz,1H),4.20(s,2H),4.09(s,1H),3.90(m,J＝14.0,4.4Hz,2H),3.82(s,3H),3.65(dd,J＝11.7,6.1Hz,1H),3.40–3.32(m,2H),3.24(dt,J＝11.5,9.1Hz,4H).

LRMS(ESI):[M+H]⁺344.1；HRMS(ESI):[M+H]⁺计算值C₁₆H₂₆O₇N⁺344.1704,实测值为344.1701。

TG-037的数据：

¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ6.78–6.72(m,2H),6.72–6.65(m,2H),4.28(d,J＝7.8 Hz,1H),4.07–3.96(m,1H),3.87(dd,J＝11.8,1.4Hz,1H),3.70(s,3H),3.69–3.63(m,2H),3.34(t,J＝4.5Hz,1H),3.29–3.25(m,2H),3.23–3.14(m,3H),1.89(t,J＝6.4Hz,2H).

LRMS(ESI):[M+Na]⁺366.1

该实验过程中的各反应中间体的结构如下：

上述中间体25a-25e的鉴定数据为:

25a：

LRMS(ESI):[M+Na]⁺535.1。

25b：

LRMS(ESI):[M+Na]⁺535.1。

25c：

LRMS(ESI):[M+Na]⁺634.2。

25d：

LRMS(ESI):[M+Na]⁺668.2。

25e：

LRMS(ESI):[M+Na]⁺668.2。

路线F：化合物TG-038，TG-039，TG-040，TG-041，TG-042，TG-043和TG-044 的合成

路线F的实验操作：

将15(1eq)和PPh₃(1.3eq)加入反应瓶，加干燥的THF(0.5mol/L)，加37a～f(1eq)，0℃下滴加DIAD(1.1eq)。升至60℃搅拌，TLC监测反应结束。减压浓缩，硅胶柱层析提纯39a～f。

将37g(1eq)加入THF(0.2mol/L)，冰浴下滴加PPh₃(2eq)，咪唑(2eq)，I₂(2.5eq)，升至室温搅拌过夜。硅藻土过滤，减压浓缩，硅胶柱层析提纯(洗脱剂：乙酸乙酯：石油醚＝1：9)，得产品38g(5.7g，93％yield)。将38g(1.2eq)，15(1eq)和K₂CO₃(2eq) 加入DMF,加热到110℃，搅拌10h。硅藻土过滤，滤液用乙酸乙酯萃取。萃取液合并后水洗，无水硫酸钠干燥。减压浓缩得粗品39g 3.8g。

将39a～g(1eq)加入MeOH(0.5mol/L),室温滴加1M的NaOH水溶液(2.5eq)，搅拌 4小时。以2M的HCl中和反应体系，然后乙酸乙酯萃取，萃取液以无水硫酸钠干燥。减压浓缩，硅胶柱层析提纯(洗脱液：乙酸乙酯：石油醚＝1:5)得产品40a～g。

将8a(120g，0.3mol)500ml的DMF中，室温中加(NH₄)₂CO₃(60g，0.6mol)，将反应液加热到45℃，搅拌5h。硅藻土过滤，滤液加水，以乙酸乙酯萃取。萃取液合并后以依次以水、饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。减压浓缩得粗产品41(95g)，直接用于下一步反应。将41(95g，0.273mol)和K₂CO₃(49g,0.355mol)加入二氯甲烷(400mL)，冰浴下滴加CCl₃CN(157g，1.1mol)升至室温搅拌过夜。硅藻土过滤，减压浓缩，硅胶柱层析提纯得42(95g，71％yield)。

将40a～g(1.1eq)和42(1eq)，4A分子筛加入反应瓶，加干燥的二氯甲烷(0.2mol/L)，将反应冷却至-20℃滴加TMSOTf(0.5eq)。TLC检测反应结束，加Et₃N(1.5eq)淬灭反应。减压浓缩，硅胶柱层析提纯得(洗脱剂：乙酸乙酯：石油醚＝1:5)得产品43a～g。

将43a/43b/43e(1eq)分别加入单颈瓶，加入MeOH(6eq)，H₂O(6eq)，Et₃N(3eq)，搅拌过夜。减压浓缩，硅胶柱层析提纯得(洗脱剂：甲醇/二氯甲烷＝1:15)得产品TG-038 (产率63％)/TG-039(产率60％)/TG-042(产率36％)。

将43c/43d/43f/43g(1eq)分别加入MeOH(0.5mol/L)，冰浴滴加0.2M的MeONa(2.5eq) 升至室温搅拌1h。TLC检测反应结束，减压浓缩，硅胶柱层析提纯得TG-040(产率15％) /TG-041(产率64％)/TG-043(产率55％)/TG-044(产率16％)。

化合物TG-038，TG-039，TG-040，TG-041，TG-042，TG-043和TG-044的结构及鉴定数据如下所示：

TG-038的数据：

¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ7.07(d,J＝8.6Hz,2H),6.89–6.70(m,2H),4.52(dt,J ＝12.1,6.1Hz,1H),4.23(d,J＝7.8Hz,1H),3.95–3.88(m,1H),3.85(dd,J＝11.9,1.9Hz,1H),3.66(dd,J＝11.8,5.3Hz,1H),3.62–3.51(m,1H),3.36–3.33(m,1H),3.28–3.20(m,2H),3.17(dd,J＝15.1,7.2Hz,1H),2.56(t,J＝7.1Hz,2H),1.75–1.54(m,4H),1.27(d,J＝6.0Hz,6H).

LRMS(ESI):[M+Na]⁺393.0；HRMS(ESI):[M+Na]⁺计算值C₁₉H₃₀O₇Na⁺393.1884,实测值为393.1880。

TG-039的数据：

¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ7.07(d,J＝8.6Hz,2H),6.79(d,J＝8.6Hz,2H),4.23(d, J＝7.8Hz,1H),3.91(m,1H),3.88–3.82(m,1H),3.77(d,J＝6.8Hz,2H),3.67(dd,J＝12.0,5.3Hz,1H),3.55(m,1H),3.33-3.17(m,4H),2.56(t,J＝7.1Hz,2H),1.76–1.54(m,4H),1.27–1.16(m,1H),0.59(dd,J＝8.1,1.4Hz,2H),0.38–0.24(m,2H).

LRMS(ESI):[M+Na]⁺405.0；HRMS(ESI):[M+Na]⁺计算值C₂₀H₃₀O₇Na⁺405.1884，实测值为405.1883。

TG-040的数据：

¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ7.07(d,J＝8.5Hz,2H),6.79(d,J＝8.6Hz,2H),4.23(d, J＝7.8Hz,1H),3.99(t,J＝7.1Hz,2H),3.91(dt,J＝9.3,6.3Hz,1H),3.85(dd,J＝11.9,1.9Hz,1H),3.67(dd,J＝11.9,5.3Hz,1H),3.57-3.52(m,1H),3.26-3.11(m,4H),2.56(t,J＝7.1 Hz,2H),1.75–1.53(m,6H),0.99(s,9H).

LRMS(ESI):[M+Na]⁺435.1；HRMS(ESI):[M+Na]⁺计算值C₂₂H₃₆O₇Na⁺435.2353，实测值为435.2352。

TG-041的数据：

¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ7.10(d,J＝8.5Hz,2H),6.82(d,J＝8.5Hz,2H),4.27(d, J＝7.8Hz,1H),4.01–3.82(m,2H),3.71(d,J＝5.2Hz,1H),3.60(m,3H),3.42–3.24(m, 4H),3.20(t,J＝8.4Hz,1H),2.59(t,J＝7.0Hz,2H),1.78–1.53(m,4H),1.06(s,9H).

LRMS(ESI):[M+Na]⁺421.1；HRMS(ESI):[M+Na]⁺计算值C₂₁H₃₄O₇Na⁺421.2197，实测值为421.2194。

TG-042的数据：

¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ6.85(m,2H),6.58(d,J＝8.9Hz,1H),4.23(d,J＝7.8Hz,1H),3.95–3.88(m,1H),3.85(dd,J＝11.9,1.8Hz,1H),3.66(dd,J＝11.9,5.2Hz,1H),3.58–3.51(m,1H),3.36-3.26(m,2H),3.25-3.13(m,2H),2.74(t,J＝6.8Hz,2H),2.51(t,J＝6.9Hz,2H),1.77(t,J＝6.8Hz,2H),1.71–1.56(m,4H),1.28(s,6H)。

LRMS(ESI):[M+Na]⁺419.1；HRMS(ESI):[M+Na]⁺计算值C₂₁H₃₂O₇Na⁺419.2040，实测值为419.2041。

TG-043的数据：

¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ7.07(d,J＝8.6Hz,2H),6.79(d,J＝8.6Hz,2H),4.23(d, J＝7.8Hz,1H),3.92(dd,J＝7.9,5.1Hz,2H),3.85(dd,J＝11.9,1.9Hz,1H),3.66(dd,J＝11.9,5.2Hz,1H),3.55(m,1H),3.34–3.21(m,4H),2.56(t,J＝7.1Hz,2H),1.70(m,6H),1.45(m,2H),1.41–1.20(m,24H),0.99(s,1H),0.89(t,J＝6.8Hz,3H).

LRMS(ESI):[M+Na]575.3；HRMS(ESI):[M+Na]⁺计算值C₃₂H₅₆O₇Na⁺,575.3918，实测值为575.3917。

TG-044的数据：

¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ7.08(d,J＝8.5Hz,2H),6.83(d,J＝8.6Hz,2H),4.23(d, J＝7.8Hz,1H),4.15–4.02(m,2H),3.91(m,1H),3.85(dd,J＝11.8,1.7Hz,1H),3.83–3.78(m,2H),3.71–3.47(m,14H),3.36-3.17(m,7H),2.56(t,J＝7.0Hz,2H),1.66(m,4H).

LRMS(ESI):[M+Na]⁺541.2；HRMS(ESI):[M+Na]⁺计算值C₂₅H₄₂O₁₁Na 541.2619,found 541.2618。

该实验过程中的各反应中间体的结构如下：

上述中间体39a-39f的鉴定数据为:

39a：

LRMS(ESI):[M+Na]⁺273.1。

39b：

LRMS(ESI):[M+Na]⁺285.1。

39c：

LRMS(ESI):[M+Na]⁺315.2。

39d：

LRMS(ESI):[M+Na]⁺301.1。

39e：

LRMS(ESI):[M+Na]⁺299.1。

39f：

LRMS(ESI):[M+Na]⁺455.6。

39g：

LRMS(ESI):[M+Na]⁺421.2。

40b：

LRMS(ESI):[M+Na]⁺243.1。

40c：

LRMS(ESI):[M+Na]⁺273.1。

40d：

LRMS(ESI):[M+Na]⁺259.1。

40e：

LRMS(ESI):[M+Na]⁺257.1。

40f：

LRMS(ESI):[M+Na]⁺413.3。

40g：

LRMS(ESI):[M+Na]⁺329.2。

43a：

LRMS(ESI):[M+Na]⁺561.2。

43b：

LRMS(ESI):[M+Na]⁺573.2。

43c：

LRMS(ESI):[M+Na]⁺603.2。

43d：

LRMS(ESI):[M+Na]⁺589.2。

43e：

LRMS(ESI):[M+Na]⁺587.2。

43f：

LRMS(ESI):[M+Na]⁺743.4。

43g：

LRMS(ESI):[M+Na]⁺709.3。

TG-045的合成

实验操作：

将原料45和Py加入体系中，搅拌溶解，体系降至0℃滴加BzCl，滴加完毕自然升至室温搅拌12h，减压蒸出溶剂。加大量H₂O,二氯甲烷萃取3次，合并有机相。有机相依次用NaHCO₃x 2、饱和NaCl x 1洗，Na₂SO₄干燥。减压蒸除溶剂，硅胶柱柱层析提纯 (洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝2：1)得无色液体化合物46，产率100％。

将46和NH₂NH₂.AcOH加入体系中，DMF搅拌溶解，60℃搅拌7h。加大量H₂O, 二氯甲烷萃取3次，合并有机相。有机相依次用NaHCO₃x 2、饱和NaCl x 1洗，Na₂SO₄干燥。减压蒸除溶剂，硅胶柱柱层析提纯(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝1：1)得无色液体化合物47，产率78％。

将47和二氯甲烷加入体系中，0℃搅拌依次滴加DBU、CCl₃CN，滴加完毕自然升至室温搅拌3h。减压蒸除溶剂，硅胶柱柱层析提纯(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝2：1) 得白色固体化合物48，产率72％。

将化合物48、醇13、二氯甲烷和4A分子筛加入体系中，搅拌溶解，0℃滴加TMSOTf，滴加完毕自然升至室温搅拌12h。抽滤，减压蒸除溶剂，硅胶柱柱层析提纯(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝5：1)得无色液体化合物49,产率85％。

将49、MeOH加入体系中，搅拌溶解，0℃加入NaOMe，加完毕自然升至室温搅拌12h。减压蒸除溶剂，硅胶柱柱层析提纯(洗脱剂：二氯甲烷/MeOH＝5：1)得白色固体终产物TG-045，产率75％。

TG-045的鉴定数据：

¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ7.25-7.01(m,2H),6.95-6.75(m,2H),4.41-4.26(m,2H),3.90-3.38(m,16H),3.31-3.22(m,1H),2.60-2.36(m,2H),1.65-1.42(m,4H).

LRMS(ESI):[M+Na]⁺527.2。

该实验过程中的各反应中间体的结构如下：

46的鉴定数据：

LRMS(ESI):[M+Na]⁺1197.3。

47的鉴定数据：

LRMS(ESI):[M+Na]⁺1093.3。

48的鉴定数据：

LRMS(ESI):[M+Na]⁺1236.2。

49的鉴定数据：

LRMS(ESI):[M+Na]⁺1255.4。

TG-046的合成

将化合物50(9g,50mmol)和13(27g，150mmol)，TsOH.H₂O(1g,5.26mmol)加入反应瓶，加热到80℃，搅拌18小时。冷却至室温，加H₂O(50mL)，搅拌1小时，加乙酸乙酯(100mL)萃取三次。萃取液合并，无水硫酸钠干燥。减压蒸除溶剂，硅胶柱柱层析提纯得到粗产品3.1g，结晶得纯品TG-046(500mg)。

TG-046鉴定数据如下所示：

¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ7.12(d,J＝8.3Hz,2H),6.84(d,J＝8.3Hz,2H),4.79(d,J＝3.5Hz,1H),3.88-3.73(m,2H),3.78(s,3H),3.73-3.64(m,2H),3.62-3.54(m,1H), 3.53-3.45(m,1H),3.41(dd,J＝9.7,3.7Hz,1H),3.29(m,1H),2.63-2.59(m,2H),1.75-1.63 (m,4H).

LRMS(ESI):[M+Na]+365.1

TG-047和TG-048的合成

将化合物9a(16.4g，40mmol)，KSAc(13.28g，80mmol)，依次加入丙酮(150mL) 中，室温搅拌4小时，TLC监测基本反应完全。将反应液倒入150mL水中，乙酸乙酯萃取，萃取液合并，无水硫酸钠干燥。减压蒸除溶剂，硅胶柱柱层析提纯(洗脱剂：乙酸乙酯:石油醚＝1:6)得化合物51 12.7g。

将化合物51(12.7g，31.2mmol)、52(6.26g，40.7mmol)和NaHCO₃(0.262g，3.12mmol)加入DMF(100mL)中室温搅拌1小时。加水150mL，用乙酸乙酯萃取。合并有机相，氯化钠水溶液洗，无水硫酸钠干燥。减压蒸除溶剂，硅胶柱柱层析提纯(洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚＝1:4)得化合物53 10g。

将化合物13(10mmol)、PPh₃(4.3g，13mmol)加入加入25mL二氯甲烷中。室温下分批加入CBr₄(4.3g，13mmol)，室温搅拌1小时。减压蒸除溶剂，硅胶柱柱层析提纯得化合物54(2g)

将化合物53(1.2g，3.34mmol)54(3.674mmol)和Et₃N(334mg，3.34mmol) 依次加入乙腈(20mL)中，室温搅拌1小时，加水20mL，用乙酸乙酯萃取，饱和NaCl 水溶液洗，无水硫酸钠干燥。减压蒸除溶剂，硅胶柱柱层析提纯得化合物55(1.1g)

55

LRMS(ESI):[M+Na]⁺549.2

将化合物55(1.1g)加入MeOH(5mL)中，加H₂O(5mL)，Et₃N(2.5mL)，室温搅拌过夜，TLC显示反应完全。减压蒸除溶剂，硅胶柱柱层析提纯得TG-048(500mg)。

TG-048鉴定数据

¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ7.12(d,J＝8.6Hz,2H),6.85(d,J＝5.7Hz,2H),4.35(d, J＝9.7Hz,1H),3.86(dd,J＝12.0,2.0Hz,1H),3.78(s,3H),3.67(dd,J＝11.8,5.7Hz,1H),3.43-3.16(m,4H),2.76(m,2H),2.60(t,J＝7.2Hz,2H),1.88-1.54(m,4H).

LRMS(ESI):[M+Na]⁺381.1

TG-047的制备方法参考TG-048的制备方法，其结构如下所示：

TG-047鉴定数据

1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.18(d,J＝8.6Hz,2H),6.85(d,J＝8.6Hz,2H),4.38(d,J＝9.5Hz,1H),3.90(dd,J＝12.0,1.8Hz,1H),3.78(s,3H),3.69(dd,J＝12.0,5.4Hz,1H),3.36-3.26(m,3H),3.22(t,J＝8.7Hz,1H),3.07-2.86(m,4H).

LRMS(ESI):[M+COOH]-375.0。

效果实施例

效果实施例1、体外巨噬细胞实验测试化合物的促VEGF-A mRNA表达活性

1.1、活性筛选的具体步骤为：分别将1～10×10⁶对数生长期的巨噬细胞(RAW264.7) 置于细胞培养皿中，将待测化合物(上述化合物TG-001,TG-002,TG-003,TG-004,TG-005, TG-006,TG-007,TG-008，TG-009,TG-010,TG-011,TG-012，TG-013,TG-014,TG-015, TG-016,TG-017,TG-018,TG-019,TG-020,TG-021,TG-022,TG-023，TG-024，TG-025， TG-026，TG-027，TG-028,TG-029,TG-030，TG-031，TG-032，TG-033，TG-034，TG-035，TG-036，TG-037，TG-045，TG-039，TG-040TG-041，TG-042，TG-043，TG-044， TG-045、TG-052、TG-053、TG-054、TG-047、TG-048、TG-046、TG-049、TG-050、TG-051、 TG-055和TG-056)分别稀释成不同的浓度，分别加入到上述的含有巨噬细胞的培养皿中，在37℃、5％CO₂细胞培养箱中于完全培养液(RPMI 1640培养基：胎牛血清：三抗(即青霉素-链霉素-庆大霉素，北京雷根生物技术有限公司)体积比＝89:10:1)中培养 3h，Trizol(康为世纪生物科技有限公司)裂解细胞提取RNA，使用超微量核酸蛋白测定仪(Nanodrop2000c)测定RNA浓度。根据RNA浓度计算所需RNA体积V，根据表 1进行RNA逆转录反应体系配制，然后根据表2所述条件进行RNA逆转录(cDNA合成)(RT EasyTM I(For first-strand cDNA synthesis)反转录试剂盒，成都福际生物技术有限公司)反应。所得cDNA按照表3配制荧光定量PCR反应溶液。按照表4设置荧光定量PCR反应条件，以逆转录反应的cDNA为模板进行荧光定量PCR反应(Realtime PCR EasyTM-SYBR Green荧光定量试剂盒，成都福际生物技术有限公司)。每个样品的Ct值以空白对照组为对照，以β-Actin为内参，计算目标基因的相对表达量2^－ΔΔCt。

化合物TG-052、TG-053和TG-054可参考Chemical&Pharmaceutical Bulletin,2010， 58,1627-1629记载的方法进行合成得到。

化合物TG-056购于(上海源叶生物科技有限公司)，其结构为：

表1 RT反应体系配制

表2 cDNA合成反应条件

表3 QPCR反应溶液

表4 QPCR反应条件

根据药物在一定浓度下能够促进VEGF-A mRNA表达的最大量来判断其活性，规定未加药物时巨噬细胞VEGF-A mRNA表达量为1，以临床上用于心脑血管疾病领域的一款中药注射液丹参多酚酸盐促进巨噬细胞VEGF-A mRNA最大表达量6(结果见表5)为判断标准，最大表达量大于4的化合物为目标化合物。即，当所述待测物质促进巨噬细胞中 VEGF-A mRNA的最大表达量比未加所述待测物质时巨噬细胞中VEGF-A mRNA的表达量提高4倍以上时，所述待测物质即为初步的目标促血管生成活性物质。结果如表6所示，结果显示本发明提供的待测物大部分在一定剂量下具有良好的促VEGF-A mRNA表达的作用。

表5不同浓度的丹参多酚酸盐作用于巨噬细胞时VEGF-A mRNA的表达量

表6不同浓度的化合物作用于巨噬细胞时VEGF-A mRNA的表达量

“-”代表未检测。

效果实施例2利用“海绵(sponge)植入动物模型”筛选促进VEGF-A mRNA表达的活性分子

选用效果实施例1中所获得的在细胞水平表现良好的目标促血管生成化合物TG-052、 TG-053、TG-054、TG-028、TG-055，在炎症性血管生成的“海绵(sponge)植入动物模型”上进一步筛选促进VEGF-A mRNA表达的活性分子。相关研究表明，在“海绵植入动物模型”中，炎症初期能募集到海绵中的细胞约有75％以上为巨噬细胞，该模型可以很好地反映募集到炎症周围的巨噬细胞中VEGF-A mRNA的表达量。

通过Zhang J，Modi Y，Yarovinsky T，et al.Macrophag β₂integrin-mediated，HuR-dependent stabilization of angiogenic factor-encoding mRNAs ininflammatory angiogenesi s.[J].American Journal of Pathology，2012.180(4)：1751-1760中所述方法建立小鼠海绵植入动物模型，本发明所用小鼠为C57/BL6小鼠，雄性，周龄为6-8周，体重为20-25克，购自上海斯莱克实验动物有限公司，生产许可证号SCXK(沪)2013-0016。将效果实施例1中筛选得到的上述化合物按两周用量进行称量，然后与凝胶基质剂及溶剂合制得化合物缓释凝胶剂(所述缓释凝胶的制备方法及模型建立和检测方法详见专利申请CN201610168493.9)，具体步骤为：称取一定量的效果实施例1所得化合物置于1.5mLEP管中，再称取一定量的重均分子量小于1万的左旋聚乳酸(PLLA)与之混合(所得化合物与PLLA的质量比值在0.5∶1到2∶1 之间)，最后加入一定量的DMSO(小于100微升)，涡旋混匀后用封口膜封口，在200W功率， 25℃条件下连续超声5h后得到该化合物的缓释凝胶剂，4℃保存备用。

所制得的缓释凝胶剂可以在2周内将药物释放完全。将该缓释凝胶剂与海绵同时植入到小鼠的背部皮下，2周后将海绵取出，除去多余组织和皮毛后，转移到10mL含胶原酶的 DMEM培养液的细胞培养皿中(胶原酶：DMEM＝10mg/10mL)，将海绵切碎，并置于细胞培养箱中孵育1h。然后将上述含海绵碎屑的培养液过滤，得到的滤液离心，弃去上清液，往沉淀中加入500μ LTrizol试剂，吹散混合均匀后将液体转移到1.5mL EP管中，-80℃保存。按照常规的方法提取RNA，使用超微量核酸蛋白测定仪(Nanodrop 2000c)测定RNA浓度。根据RNA浓度计算所需RNA体积V，根据表1进行RNA逆转录反应体系配制，然后根据表2 所述条件进行RNA逆转录(cDNA合成)反应。所得cDNA按照表3配制荧光定量qPCR反应溶液。按照表4设置荧光定量qPCR反应条件，以逆转录反应的cDNA为模板进行荧光定量PCR 反应。每个样品的Ct值以空白对照组为对照，以β-Actin为内参，计算目标基因的相对表达量2^-ΔΔCt。观察在2周作用时间下，由海绵所提取的细胞中的VEGF-AmRNA的表达水平。

在“海绵植入动物模型”上化合物分别选择了高、中、低三个不同的给药剂量，60mg/kg/d组的丹参多芬酸盐(购于河南省人民医院)为阳性对照(实验表明该剂量为丹参多芬酸盐在此模型上能够促进VEGF-A mRNA表达的最佳剂量，如图1中A所示)，未加药的空白对照缓释凝胶为空白对照，图1为通过RT-qPCR实验所得的结果。

与未加药的空白对照相比，结果发现TG-052(41.37mg/kg/d)、TG-055(19.48mg/kg/d) VEGF-A mRNA表达量增加了约3倍，与丹参多芬酸盐(60mg/kg/d)的活性相当，TG-055(19.48mg/kg/d)的剂量要小于TG-052(41.37mg/kg/d)，其活性要优于TG-052；TG-053 与TG-054VEGF-A mRNA表达量与丹参多芬酸盐(60mg/kg/d)相比，活性稍微降低； TG-028在11.74mg/kg/d及23.48mg/kg/d剂量下，促进VEGF-A mRNA表达量为未加药的空白对照的6倍以上，活性明显高于丹参多芬酸盐(60mg/kg/d)的活性。因此，活性结果可以表述为：TG-028＞TG-055＞TG-052＞丹参多芬酸盐＞TG-053＞TG-054。结果表明，效果实施例1中利用体外细胞实验筛选出的化合物在体内动物筛选模型上大部分活性优于商购的药物丹参多酚酸盐或与其相当。

如图19所示，单独使用不同剂量的红景天苷(TG-056)在海绵植入动物模型上对VEGF-A mRNA表达量非常低。同时，在海绵植入动物模型上我们考察红景天苷和酪醇 LC(红景天苷注射液里面的主要成分)一起作用对VEGF-A mRNA表达的影响，发现在红景天苷20.62mg/(kg.d)+酪醇3.08mg/(kg.d)可以促进VEGF-A mRNA的表达，作用不如丹参多酚酸盐，因此，在后续实验中我们就不再考察红景天苷的作用。

效果实施例3 TG-028在糖尿病小鼠皮肤损伤模型上的效果观察

1、实验材料和设备：

C57/BL6雄鼠、SPF级，重20-22g之间，6周龄；链脲佐菌素(STZ)；血糖检测仪小鼠麻醉机；高脂高糖饲料；尼康照相机等。

(1)柠檬酸钠缓冲液配制：将2.10g柠檬酸加入双蒸100ml配成柠檬酸母液，称为A液；将2.94g柠檬酸三钠加入双蒸100ml配成柠檬酸钠母液，称作B液；将A、B液按1.32:1 比例混合，pH计测定pH值，调定溶液pH＝4.0，即是所需配制STZ的0.1mol/L柠檬酸钠缓冲液。

(2)STZ溶液的配制：将STZ溶于0.1mol/L柠檬酸钠缓冲液中，新鲜配制成10mg/mL浓度的STZ溶液，并用0.22μm滤菌器过滤除菌，避光配制，现用现配。

(3)高脂高糖饲料配方：

(4)SPF级6周龄的C57/BL6雄性小鼠，正常饲料喂养体重至25g左右，连续2-4周高糖高脂饲料喂养，链脲佐霉素STZ按小鼠体重50mg/kg腹腔给药诱导，每次注射前禁食 16h，连续STZ诱导四天，停药后继续高糖高脂饲料喂养，待三天后血糖稳定后检测血糖，血糖>16.7mM的小鼠选为糖尿病小鼠。

2、高糖高脂饲料喂养联合STZ诱导的糖尿病模型建立：

实验方法和步骤：

(1)高脂高糖饲料+STZ诱导制备小鼠Ⅱ型糖尿病模型。具体步骤是：6周龄60只小鼠分为糖尿病组和正常组，其中糖尿病组(以下简称DM组)40只，正常组(简称NC 组)20只。DM组高脂高糖饲料喂养3周，使小鼠产生胰岛素抵抗，后连续4天每天给小鼠按40mg/Kg的量注射STZ,期间每天晚上禁食12小时，期间可自由饮水，待早上空腹时注射STZ,破坏小鼠胰岛细胞，之后12小时喂食；连续4天后，停止注射和禁食。一周后检测小鼠血糖，血糖含量大于16.7mmol/L为造模成功。NC组期间喂以正常饲料，并在术前检测血糖，正常血糖为8-10mmol/L。

(2)制备小鼠全层皮肤损伤模型。具体步骤：对NC组、DM组小鼠分组并编号:依次分为3D、6D、9D、12D组，每组各四只，编号为1、2、3、4。使用小鼠麻醉机将小鼠麻醉后，用推毛机推去小鼠背部皮肤，擦以酒精，后用打孔器在小鼠背部打孔，用剪刀沿孔痕剪出直径为6cm的伤口；将小鼠单笼饲养。③腹腔注射TG-028并观察化合物作用效果。待小鼠清醒后，给实验组(DM+TG-028组)小鼠腹腔注射14mg/Kg的TG-028，连续给药6D。分别在3、6、9、12天拍照，取背部伤口组织，用以生化指标的检测。所取组织的方法是：沿小鼠伤口外缘2mm剪取组织，将组织分为3份，分别用于免疫组织化学、 PCR、Western Blot等的检测。

(3)实验结果：小鼠造模成功率100％，DM给药组小鼠皮肤损伤愈合情况优于DM组，结果见图2。

将图2的结果进行量化处理：具体方法是:通过图2片中尺子的像素与实际刻度之间的比例得出图片所占像素在实际中的面积(刻度尺代表1cm，量化工具是PS软件,测量方法是像素点法测量不规则图形的实际面积)。按照公式计算伤口愈合率Wound closure(％)＝(Wound area on day 0_Wound area on the indicated day)/Wound area on day 0*100％。量化结果见图3：图中的时间点为给药后的3天，6天，9天及12天。

实验结果显示：与未加药的糖尿病组(DM)小鼠相比，在给TG-028第9天及12天伤口的愈合程度要明显优于未加药组，具有显著性差异(P^***<0.001)，正常小鼠的皮肤愈合程度与糖尿病组(DM)小鼠相比也具有显著性差异(P^***<0.001)；但是DM+TG-028 组与正常小鼠的愈合程度没有显著性差异。

图4是对各实验组小鼠体重进行测量的结果。结果显示：糖尿病小鼠给药组 (DM+TG-028)与未给药组(DM)的体重与正常小鼠相比均减轻。

图5是对各实验组小鼠血糖测量的结果，结果显示：糖尿病小鼠给药组(DM+TG-028) 与未给药组(DM)的葡萄糖测定值没有明显变化，说明该TG-028在治愈创伤的同时并不能降低小鼠的葡萄糖，它的作用不是通过降低血糖来实现的。

图6是各实验组小鼠VEGF-A mRNA的表达量测定，结果显示：糖尿病小鼠给药组(DM+TG-028)与未给药组(DM)相比，在给药第6天，糖尿病小鼠给药组(DM+TG-028) 的VEGF-A mRNA表达要显著高于未给药组(DM)，具有显著性差异(P^**<0.01)。

图7是各实验组小鼠TGF-β1mRNA的表达量测定，结果显示：糖尿病小鼠给药组 (DM+TG-028)与未给药组(DM)相比，在给药第6天，糖尿病小鼠给药组(DM+TG-028) 的TGF-β1mRNA表达要显著高于未给药组(DM)，具有显著性差异(P^**<0.01)。

图8是各实验组小鼠皮肤损伤处组织切片HE染色图，由图可知，DM组在造模第九天仍有大量炎症细胞浸润，皮肤附属器基本没有生成，组织表皮层仍然很厚，但也能明显看见一些胶原纤维的生成。而DM+TG-028组、NC组则有大量的胶原纤维生成，皮肤新生附属器明显，表皮层明显变薄，炎性细胞数量较少。

图9是各实验组小鼠皮肤损伤处组织切片Masson染色图，由图可知，DM组新生胶原纤维少且组织散乱，炎症细胞仍有聚集，TG-028组胶原纤维排列规律，且炎症细胞数量较少；NC组炎症细胞主要在皮下，表皮真皮形成已经较完整。

图10是各实验组小鼠皮肤损伤处组织切片CD31染色图，图11是对图10染色图的数据量化图。实验结果显示：糖尿病小鼠给药组(DM+TG-028)与未给药组(DM)相比，在给药第9天，糖尿病小鼠给药组(DM+TG-028)的CD31表达明显增加，具有显著性差异(P**<0.01)，说明给药后糖尿病小鼠的皮肤组织中新生血管增多。

图12是TG-028处理小鼠巨噬细胞(RAW)的上清液对小鼠成纤维细胞(L929)增殖的影响。结果显示，在TG-028 100μM、作用巨噬细胞RAW264.7时间24h后所得的上清液，可以最大化地促进成纤维细胞(L929)增殖。按照2million细胞/mL进行实验，阳性对照bFGF浓度在10ng/L即有增强L929细胞活力的效果。

图13和14是TG-028处理RAW 264.7的上清液对小鼠成纤维细胞(L929)迁移的影响。迁移实验用划痕实验来表征，所用的条件是细胞活力实验中的条件，实验观察到， TG-028作用巨噬细胞RAW264.7后的上清液明显促进了L929的迁移。

图15是TG-028处理巨噬细胞RAW264.7的上清液对小鼠成纤维细胞(L929)胶原生成的影响。条件与前两者一致，测胶原生成用的是羟脯氨酸试剂盒，胶原的量与羟脯氨酸的量成正比。实验观察到，TG-028作用巨噬细胞RAW264.7后的上清液明显促进了L929 的胶原生成。

效果实施例4 TG-028作用于巨噬细胞后可以促进内皮细胞的增殖、迁移和小管形成，从而影响新生血管的形成

此外，进一步验证了：在体外细胞实验上，发现TG-028通过作用于巨噬细胞，可以促进内皮细胞的增殖、迁移、小管形成，从而影响新生血管的形成。

该实验分为七组，第一组为单纯DMEM培养液(Gibcol，上海)加10％FBS(SERANA，德国)直接作用于HUVEC-12内皮细胞(购于上海荣创生物，control)；第二组巨噬细胞用DMEM培养液加10％FBS培养24小时后的上清作用于内皮细胞(s-control)；第三组为TG-028直接作用于DMEM培养液加10％FBS培养的内皮细胞组(TG-028，10μΜ)；第四组为TG-028作用于巨噬细胞(DMEM培养液加10％FBS)并共培养24小时后的上清作用于内皮细胞(s-TG-028，10μM)；第五组为Cpd-18(丹参多酚酸盐)直接作用于 DMEM培养液加10％FBS培养的内皮细胞(cpd-18，10μM)；第六组为Cpd-18(丹参多酚酸盐，10μM)作用于巨噬细胞(DMEM培养液加10％FBS)培养24小时后的上清作用于内皮细胞(s-cpd18)；第七组为VEGF蛋白直接作用于DMEM培养液加10％FBS培养的内皮细胞(Recombinant Human VEGF165，10ng/mL)。

(1)TG-028作用巨噬细胞24h后的上清对内皮细胞增殖的影响

取对数生长期的人脐静脉内皮细胞HUVEC-12细胞进行细胞计数，调整细胞密度为2.5×10⁴个/mL，以每孔100μL接种于96孔培养板。放入培养箱内过夜培养后完全贴壁。根据以上不同分组，处理HUVEC-12内皮细胞，将96孔板置于37℃，5％CO2培养箱中培养24小时。取出96孔板加入5mg/mL MTT，20μL/孔，继续培养4h。4h 后弃上清加DMSO，150μL/孔，摇床上摇10min，使紫色结晶物充分溶解，DMSO溶后 10min置酶联免疫检测仪上测定波长570nm下的OD值。(酶标仪，Thermo Fisher公司)。根据所测得的吸光度OD值，以单纯DMEM培养液直接作用于HUVEC-12内皮细胞 (control)为空白对照(即第一组)，计算各组细胞增加的百分比，并进行对比研究。结果发现：除了Cpd-18(丹参多酚酸盐，10μM)直接作用于内皮细胞(即第五组)对内皮细胞的增殖没有显著性的差异以外，其他各组均显著性地促进了内皮细胞的增殖，而且TG-028作用于巨噬细胞培养24小时后的上清作用于内皮细胞(s-TG-028，10μM) 组(即第四组)与Cpd-18(丹参多酚酸盐，10μM)作用于巨噬细胞培养24小时后的上清作用于内皮细胞组(即第六组)，这两组均比VEGF直接作用于内皮细胞组(即第七组) 促进内皮细胞的增殖作用强，具有显著性差异(##P<0.01)，而巨噬细胞培养24小时后的上清作用于内皮细胞(s-control)组(即第二组)与VEGF直接作用于内皮细胞组(即第七组)相比对内皮细胞的增殖没有显著性差异(ns)，由此说明，TG-028与Cpd-18(丹参多酚酸盐)可以通过作用于巨噬细胞从而促进内皮细胞的增殖，并且不同于VEGF直接对内皮细胞的增殖作用。如图16所示。

(2)TG-028作用巨噬细胞24h后的上清对内皮细胞迁移的影响

取对数生长期的人脐静脉内皮细胞HUVEC-12细胞进行细胞计数，调整细胞密度为5 ×10⁵个/mL，以每孔1mL接种至6孔板。放入培养箱内常规培养形成90％融合的单层细胞，取出铺满六孔板的细胞，用200L枪头垂直于细胞表面由孔一端划向另一端，尽可能垂直于板底的横线划痕，此刻可以清楚地在培养皿表面观察到细胞表面呈井字形划痕。

吸去旧的培养基，用PBS洗掉划下的细胞。同样根据上面的七个分组，处理上述培养好的HUVEC-12细胞，每组两个副孔，放入37℃，5％CO₂饱和温度培养箱培养。按0h、 24h取样，拍照，观察不同处理组的划痕宽度。根据细胞划痕法检测内皮细胞的迁移情况并计算相对迁移率。相对迁移率＝(0h划痕宽度-24h划痕宽度)/0h划痕宽度。划痕实验结果如图17和18所示。

在24小时内与单纯DMEM培养液直接作用于HUVEC-12内皮细胞(control)组(即第一组)相比，TG-028组(即第三组)、VEGF组(即第七组)、s-TG-028(即第四组)及 s-cpd18(即第六组)对于内皮细胞的迁移具有显著性的差异(*P<0.05，***P<0.001)， s-TG-028及s-cpd18对内皮细胞的迁移作用与VEGF相当。与巨噬细胞培养24小时后的上清作用于内皮细胞(s-control)组(即第二组)相比，VEGF组、s-TG-028及s-cpd18 对内皮细胞的迁移作用均优于s-control组，说明化合物TG-028及丹参多酚酸盐可以通过作用于巨噬细胞从而促进内皮细胞的迁移。

(3)TG-028作用巨噬细胞24h后的上清对内皮细胞小管形成的影响

将96孔板和无菌黄枪头放入-20℃冰箱冷藏过夜。将分装好的Matrigel基质胶于实验前放入4℃冰箱融化过夜，第二天待Matrigel基质胶冻融后，离心数分钟。把预冷的Matrigel基质胶在超净台中在冰上加入96孔板，每孔加60μL，然后放到培养箱中放置1h。待Matrigel基质胶凝固后，取对数生长期的HUVEC-12细胞，调整细胞密度，以5×10⁴个/孔密度与各组培养液混匀接种到96孔板，置于37℃，5％CO₂培养箱中3h 之后，取出细胞培养板，开始连续在倒置显微镜下观察并拍照(放大倍数50×，德国Leica DMi1倒置显微镜)，每孔随机选取5个视野拍照观察细胞间连接形成的管样结构并采用 ImageJ图像分析软件分析管样结构，用number of master junction量化指标评价成管能力。结果如图19和图20所示。在成管实验中，与单纯DMEM培养液直接作用于HUVEC-12 内皮细胞(control)组相比，TG-028组、VEGF组、s-TG-028及s-cpd18对于内皮细胞的成管具有显著性的差异(*P<0.05,***P<0.001)，s-TG-028及s-cpd18对内皮细胞的成管作用与VEGF相当。单独巨噬细胞培养24小时后的上清作用于内皮细胞(s-control) 组对于内皮细胞的成管没有作用，但是加入药物TG-028及丹参多酚酸盐的s-TG-028及 s-cpd18组却大大提高了内皮细胞的成管作用，说明化合物TG-028及丹参多酚酸盐可以通过巨噬细胞活化促进内皮细胞的成管活性。

因此，通过本发明的活性筛选方法筛选出的化合物TG-028，其通过作用于巨噬细胞可以促进内皮细胞的增殖、迁移、小管形成，从而影响新生血管的形成。

以上各效果实施例的结果可以看出，本发明化合物，能够通过促进VEGF-A mRNA和TGF-β1mRNA的表达，促进糖尿病小鼠皮肤损伤处的胶原形成，从而促进伤口的愈合。

Claims

1.糖苷类化合物在制备预防和/或治疗下肢缺血性微循环障碍疾病药物中的用途；

所述糖苷类化合物选自如下所示化合物：

所述的下肢缺血性微循环障碍疾病选自糖尿病足。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于所述的下肢缺血性微循环障碍疾病为糖尿病足坏疽。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于所述的下肢缺血性微循环障碍疾病选自湿性坏疽、干性坏疽、混合坏疽。

4.如权利要求2所述的用途，其特征在于所述的下肢缺血性微循环障碍疾病为肢端坏疽。

5.如权利要求1-4任一项所述的用途，其特征在于其特征在于所述预防或治疗包括在与选自由以下各项组成的组中的另外的治疗剂的联合疗法中施用所述化合物：降血糖药物、抗感染药物、降低血脂的药物、溶解血栓的药物、抗血小板聚集的药物、抗凝药物、神经保护药物、钙离子拮抗剂、谷氨酸拮抗剂、谷氨酸释放抑制剂、GABA受体激动剂、自由基清除剂、细胞膜稳定剂。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于所述另外的治疗剂选自由以下各项组成的组：抗生素类药物、胰岛素、瑞替普酶、兰替普酶、孟替普酶、豆豉纤溶酶、新型蚯蚓纤溶酶、纳豆激酶、蛇毒纤溶酶原激活剂、阿司匹林、噻氯匹定、氯吡格雷、普拉格雷、替卡格雷、坎格雷洛、盐酸沙格雷酯、vorapaxar、atopaxar、肝素、低分子肝素、华法林、利伐沙班、比法卢定、达比加群酯、依达拉奉、他汀类药物。

7.根据权利要求5或6所述的用途，其特征在于所述联合疗法包括向受试者同时、依次或分开地施用所述的化合物和所述另外的治疗剂。

8.一种药物组合物，包括糖苷类化合物；和另外的治疗剂；

所述糖苷类化合物选自如下所示结构：

另外的治疗剂选自：降血糖药物、抗感染药物、降低血脂的药物、溶解血栓的药物、抗血小板聚集的药物、抗凝药物、神经保护药物、钙离子拮抗剂、谷氨酸拮抗剂、谷氨酸释放抑制剂、GABA受体激动剂、自由基清除剂、细胞膜稳定剂；用于在预防和/或治疗下肢缺血性微循环障碍疾病中的使用。

9.一种药物组合物，所述药物组合物包含糖苷类化合物；药用赋形剂或载体；

所述糖苷类化合物选自如下所示结构：

10.根据权利要求8或9所述的药物组合物，其中所述药物组合物是通过口服单位剂型、静脉、吸入或喷雾、舌下、透皮、或直肠来给予。

11.根据权利要求8或9所述的药物组合物，其中可以将药物组合物配制成气雾剂、乳膏剂、凝胶剂、丸剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、糖浆剂、透皮贴剂、注射剂。

12.根据权利要求8或9中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物是口服单位剂型、吸入剂型和注射剂型。