CN102772423B - 苦杏仁甙保护缺血心脏的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了苦杏仁甙保护缺血心脏的应用，这些用途是基于其新功能的发现和证实：苦杏仁甙可减轻心肌缺血/再灌损伤，尤其是增强胰岛素激活“生存信号”通路中心分子Akt当中的作用。胰岛素抵抗是糖尿病、高血压、冠心病等心脑血管疾病的共同土壤，且胰岛素抵抗主要表现为以Akt为中心环节的“生存信号”通路信号转导的缺陷。因此可增强胰岛素激活Akt作用的苦杏仁甙用于基于胰岛素抵抗的疾病的辅助治疗，可能具有潜在的较为广阔的应用前景。如开发富含苦杏仁甙的保健品或药品，则可为维护民众健康、特别是预防以胰岛素抵抗为基础的心血管疾病有所裨益。

Description

苦杏仁甙保护缺血心脏的应用

技术领域

本发明属于苦杏仁甙的应用技术领域，涉及苦杏仁甙保护缺血心脏的应用。

背景技术

近年来，心血管疾病已成为威胁人类健康和生存的主要原因之一，而心肌梗死的发病率亦呈上升趋势。早期溶栓治疗是急性心肌梗死最理想的治疗措施，能够缩小梗死面积，提高心脏功能，改善预后，但却引起细胞的缺血/再灌注损伤。

胰岛素是糖与脂肪能量代谢过程中主要的调控激素。胰岛素可激活已知至少两条信号途径：一是磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）途径；另一条是丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）途径。PI3K信号通路是胰岛素的主要信号通路，已有研究表明，在缺血期给予胰岛素治疗，可通过磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B-内皮型一氧化氮合酶（PI3K-Akt-eNOS）途径激活细胞“生存信号”通路，发挥抗炎、抗心肌细胞凋亡的心脏保护作用（Yu QJ,Si R,Zhou N,et al.Insulininhibits b-adrenergic action in ischemic/reperfused heart:A novel mechanism ofinsulin in cardioprotection.Apoptosis.2008;13:305-17;Li J,Zhang HF,Wu F,etal.Suppression of TNF-αinduction by insulin in the ischemic/reperfused rathearts:Roles of Akt and eNOS phosphorylation.Crit Care Med 2008;36:1551-58.）。且有研究表明，在胰岛素抵抗状态，胰岛素刺激引起的PI3K-Akt信号传导途径的作用下降，而MAPK介导的信号通路正常。

苦杏仁为历版中国药典一直收载的中药，对苦杏仁及其制剂的研究已有将近200年的历史。苦杏仁一贯为降气平喘止咳、润肠通便之中药配方选用，单独以苦杏仁命名的制剂为数极少，如苦杏仁止咳糖浆。

苦杏仁的主要成分苦杏仁甙（Semen Armeniacae amarum,SAA），又称维生素B17，也可从杏、苹果、樱桃等果核中提取。国外研究表明，苦杏仁甙对T淋巴细胞有调节作用，因而具有一定抗肿瘤功效（Matthew M.Ames,Thomas P.Moyer,John S.Kovach,et al.Pharmacology of amygdalin(laetrile)incancer patients.Cancer Chemother Pharmacol.1981,6:51-57.）；苦杏仁甙可减少肿瘤坏死因子mRNA含量及诱导型一氧化氮合酶的表达，从而降低脂多糖引起的炎症反应（Hwang,H.J.,Lee,H.J.,Kim,C.J.,et al.Inhibitory effect ofamygdalin on lipopolysaccharide-inducible TNF-alpha and IL-1beta mRNAexpression and carrageenan-induced rat arthritis.J Microbiol Biotechnol.2008,18(10):1641-1647.）。还有研究发现，苦杏仁甙可增加正常以及脑缺血状态下的能量代谢中细胞色素氧化酶的活性（《中药新药与临床药理》,1996,7(2):50-51）。然而，苦杏仁甙抗炎、增加缺血后能量代谢的细胞色素氧化酶的活性的具体机制是什么并未见报道。

发明内容

本发明解决的问题在于提供苦杏仁甙在保护缺血心脏方面的新用途，尤其是其在增强胰岛素“生存信号”系统、提高缺血心脏功能方面的作用。

本发明是通过以下技术方案来实现：

1、苦杏仁甙保护缺血心脏的应用。

2、苦杏仁甙用于抗心肌缺血药物的制备的应用。

3、苦杏仁甙用于抗心脏缺血/再灌注损伤药物的制备的应用。

4、苦杏仁甙促进或增强胰岛素激活Akt的应用。

5、苦杏仁甙与胰岛素的混合物用于激活Akt药物的制备的应用。

6、如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的苦杏仁甙与胰岛素的混合物中胰岛素与苦杏仁甙的配比为药学上可接受的配比。

7、苦杏仁甙用于治疗基于胰岛素抵抗的疾病的辅助药物的应用。

8、苦杏仁甙用于预防心血管疾病的药物、保健品或食品的制备的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明提出了苦杏仁甙的新用途，这些用途是基于其新的功能的发现和证实：苦杏仁甙能够增强胰岛素激活“生存信号”通路蛋白，尤其是PI3K-Akt信号途径当中的作用。苦杏仁甙并不能直接激活Akt，但胰岛素在苦杏仁甙存在情况下，激活Akt的作用大于单独使用等量的胰岛素，并且在胰岛素存在情况下，苦杏仁甙组的Akt磷酸化水平较对照组也显著增加。

因此，苦杏仁甙通过增强胰岛素激活“生存信号”通路下，能够对心肌缺血/再灌注损伤心脏具有保护作用：其保护作用体现在增加缺血/再灌损伤大鼠的心脏功能、减小心肌梗死范围。所以，苦杏仁甙对于缺血心脏的保护就可应用于抗心肌缺血药物的制备或预防心血管疾病的药物的制备。

进一步，鉴于苦杏仁甙对胰岛素激活“生存信号”通路蛋白的显著增加的作用，苦杏仁甙可用于基于胰岛素抵抗的疾病的辅助治疗，可能具有潜在的较为广阔的应用前景。如开发富含苦杏仁甙的保健品或药品，则可为维护民众健康、特别是预防以胰岛素抵抗为基础的心血管疾病有所裨益。

附图说明

图1为苦杏仁甙（SAA）及胰岛素（Insulin）均可减少大鼠缺血/再灌注后心肌梗死范围的检测结果及柱状图。

图2为在基础胰岛素环境，苦杏仁甙（SAA）及胰岛素（Insulin）均可增加大鼠缺血/再灌注后心肌Akt磷酸化水平的检测结果及柱状图。

图3为1型糖尿病模型中单独使用苦杏仁甙（SAA）不能增加大鼠缺血/再灌注后心肌Akt磷酸化水平的检测结果及柱状图。

图4为苦杏仁甙（SAA）不能降低大鼠心肌缺血/再灌注后的血糖水平的柱状图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

1、为说明苦杏仁甙对胰岛素激活信号的增强作用和对缺血/再灌注的保护，采用以下模型及检测手段：

1.1、大鼠心肌缺血/再灌注（MIR）模型的制备：

将SD大鼠以30g/L戊巴比妥钠（40mg/kg）经腹腔注射麻醉后，按常规方法制备大鼠MIR（30min/3h）模型：颈正中切口气管插管，连接呼吸机行正压人工呼吸。经右颈总动脉插管至左心室记录左室压及其微分。开胸暴露心脏，5-0丝线结扎左冠状动脉前降支中上1/3处，心电图ST段抬高为结扎成功指标。缺血30分钟后松开丝线，再灌注3小时。

1.2、心脏功能监测：通过多导生理记录仪（RM-4200）持续监测大鼠心电及血流动力学各指标。心电图、左室收缩压（LVSP）、左室等容收缩/舒张期压力上升或下降最大速率（±LVdP/dt_max）等均通过数据分析系统由计算机自动采集、记录并计算。

1.3、心肌梗死范围：再灌注3h结束后，再次结扎冠脉，向左心室腔注入2%伊文蓝（1～2ml）。速取出心脏，冻存于-20℃。用心脏切片器垂直于心脏长轴将其切成1mm厚的薄片，分片置于含2ml 1%TTC（pH 7.4）的12孔培养皿中，37℃孵育15min。用数码相机拍照并输入计算机。采用单盲法分别将伊文蓝染色区（非缺血区）、TTC染色区（红染，缺血但仍存活组织）以及非TTC染色区（梗死心肌)，用SigmaScan面积测算软件进行计算处理。心肌梗死范围以每一心脏总梗死面积（INF）占总缺血区面积（AAR）的百分比表示。

1.4、蛋白表达水平检测：

为研究SAA减轻心肌缺血/再灌注损伤的分子机制，采用Western blot方法检测心肌细胞中磷酸化Akt（p-Akt）及Akt表达水平。心肌组织在预冷至0℃的PBS（pH 7.4）中剪碎、清洗数次后移入预冷至0℃的裂解液中并进一步剪碎。

裂解液成分如下（mmol/L）：20Tris·HCl、50NaCl、50NaF、50Na₄P₂O₇、250Sucrose、2Na₃VO₄、1DTT、1%复合型蛋白酶抑制剂。

用Heidolph DIA900组织匀浆器匀浆1min，匀浆液12000×g（4℃）离心10min，取上清即得组织蛋白提取液。BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。

蛋白定量后，组织蛋白提取液加入5倍上样缓冲液（溶液成分（mmol/L）：50Tris·HCl、100DTT、2%SDS、0.1%溴酚蓝、10%甘油），100℃煮沸5min，恢复至室温，12000×g离心10min，取上清分装，-80℃保存。

按Laemmli（1970）方法，以每孔50～100μg蛋白上样量加到8～12%十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶（SDS/PGEA）上进行电泳，电泳完成后，小心取下分离胶，用半干电转法将蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上，5%脱脂奶粉室温下封闭1h。将PVDF膜与一抗共孵育，4℃过夜；用PBST缓冲液（溶液成分：10mmol/L PBS加0.1%的Tween 20）洗去所有未结合的一抗，将膜与偶联二抗37℃一起孵育1h（二抗为辣根过氧化物酶标的山羊抗兔抗体），洗去所有未结合的二抗，使用ECL-plus免疫检测试剂盒进行荧光检测。完成p-Akt或β-Actin免疫检测后，50℃解析液（溶液成分（mmol/L,PH 6.7）：1002-巯基乙醇、2%（W/V）SDS、62.5Tris·HCl）对原一抗进行30min解离，用PBST漂洗，5%脱脂奶粉室温下重新封闭，印迹膜进行Akt蛋白表达的免疫检测。

1.5、1型糖尿病动物模型：SD大鼠禁食8h，迅速腹腔注射新鲜配制的链脲霉素（STZ）溶液（35mg/kg），每天一次，连续注射两天。选用7天空腹血糖大于16.7mmol/L的大鼠用于实验。制作心肌缺血/再灌注模型，于再灌注结束后，取危险区心室肌组织，同上方法提取蛋白，用Western blot方法检测心肌细胞中p-Akt及Akt表达水平。

2、苦杏仁甙的新的药用功能：

2.1、确定苦杏仁甙的实验剂量

为确定SAA在缺血/再灌注中的用药量，将大鼠随机分为以下几组：(1)心肌缺血/再灌注组（MIR）；(2)MIR+SAA 10组（10mg/kg，剂量体重比）；(3)MIR+SAA 100组（100mg/kg）；(4)MIR+SAA 1000组（1000mg/kg）。SAA治疗组再灌注前15min给药（iv）。然后检测如表1所示的各指标，从而选择合适的剂量。

表1不同剂量苦杏仁甙对心肌缺血/再灌注大鼠心脏功能的影响

其中，MIR：心肌缺血/再灌注(30min/3h)；SAA：苦杏仁甙；LVSP：左室收缩压；LVEDP：左室舒张末压；+LVdP/dt_max：左室最大收缩速率；-LVdP/dt_max：左室最大舒张速率；I 0min：缺血即刻；I 30min：缺血30分钟；R 180min：再灌注180分钟。x±s，n=6。^*P<0.05，^**P<0.01vs.MIR。

结果显示，缺血前各指标基础值（Baseline）无明显差异。再灌注后，各组间心率无统计学差异；如表1所示，低剂量组（MIR+SAA 10）和高剂量组（MIR+SAA 1000）LVSP值与MIR组无明显差异，中剂量组（MIR+SAA100）再灌180min（n=6,P<0.05）时较MIR组有显著升高；中剂量自缺血末至再灌结束LVEDP值均比MIR组有明显降低（n=6,P<0.05），低、高剂量组再灌结束与MIR组无明显差异；+LVdP/dt_max与MIR组无明显差异，中剂量组在再灌180min时较MIR组明显升高（n=6,P<0.05）；-LVdP/dt_max与+LVdP/dt_max有相似趋势，中剂量组在再灌180min时较MIR组明显升高（n=6,P<0.05）。可见，中剂量苦杏仁甙（100mg/kg）可以提高再灌注后心脏的收缩压及收缩/舒张速率，改善缺血/再灌注心脏的功能。由此确定苦杏仁甙的实验剂量为100mg/kg。

2.2、苦杏仁甙可增强心肌缺血/再灌注大鼠心脏功能

制作大鼠心肌缺血/再灌注损伤模型，然后将大鼠随机分为：(1)假手术组（Sham）；(2)心肌缺血/再灌注组（MIR）；(3)MIR+SAA组（100mg/kg）；(4)MIR+Insulin（胰岛素，60U/L 4ml/kg·h）。SAA治疗组再灌注前15min给药（i.v.），阳性对照组再灌注前15min开始给予胰岛素至再灌注结束（i.v.）。通过检测表2所示的各项指标，评价苦杏仁甙对心肌缺血/再灌注的保护作用。

表2苦杏仁甙及胰岛素均可增强心肌缺血/再灌注大鼠心脏功能

Sham：假手术对照组；MIR：心肌缺血/再灌注(30min/3h)；SAA：苦杏仁甙；Insulin：胰岛素；MABP：平均动脉压；LVSP：左室收缩压；LVEDP：左室舒张末压；+LVdP/dt_max：左室最大收缩速率；－LVdP/dt_max：左室最大舒张速率；MABP：平均动脉压；I 0min：缺血即刻；I 30min：缺血30分钟；R 180min：再灌注180分钟。x±s，n=6。^*P<0.05,^**P<0.01vs.Sham；^#P<0.05vs.MIR。

为观察苦杏仁甙对缺血心肌是否具有保护作用，采用监测大鼠血流动力学指标来判断。缺血前各指标Baseline值无明显差异。再灌注后，各组间心率无统计学差异；如表2所示，正常对照组在再灌注末MABP值为107±9mmHg，MIR组比Sham组有显著降低（n=6,P<0.01），MIR+SAA组使MABP较MIR组有显著升高（n=6,P<0.05）；在缺血后各时间点，MIR组LVSP值比Sham组均有显著降低（n=6,P<0.01），MIR+SAA组再灌180min（n=6,P<0.05）时使LVSP较MIR组有显著升高；在缺血后各时间点，MIR组LVEDP值比Sham组均有显著升高（n=6,P<0.01），再灌注末，MIR+SAA组（n=6,P<0.01）和MIR+Insulin组（n=6,P<0.05）均使LVEDP值较MIR显著降低；缺血后各时间点，MIR组±LVdP/dt_max较Sham组有显著降低（n=6,P均小于0.01），再灌注末，MIR+SAA组（n=6,P均小于0.05）和MIR+Insulin组（n=6,P均小于0.05）均使±LVdP/dt_max值较MIR显著升高。

上述结果提示，在机体存在基础胰岛素时，苦杏仁甙与胰岛素的治疗均可促进恢复再灌后平均动脉压、左室收缩压及左室收缩舒张速率，降低左室舒张末压，呈现与胰岛素治疗类似的改善缺血/再灌注后心脏功能的作用。

2.3、苦杏仁甙可减小大鼠缺血/再灌注后心肌梗死范围

在上述2.2分组的基础上，从减小心肌梗死范围方面，进一步观察苦杏仁甙对缺血心肌的保护作用。不同处理组大鼠心肌梗死情况及对应的柱状分析图如图1所示，其中Sham：假手术对照组；MIR：心肌缺血/再灌注(30min/3h)；SAA：苦杏仁甙；Insulin：胰岛素；Infarction size：心肌梗死范围。x±s，n=8。^**P<0.01vs.Sham；^##P<0.01vs.MIR。心肌梗死范围检测结果显示，在Sham、MIR、MIR+SAA及MIR+Insulin四组间总缺血范围（AAR/LV%）无明显差异的情况下，与Sham相比MIR造成大鼠明显的心肌梗死（n=8，P<0.01），而MIR+SAA组及MIR+Insulin组心肌梗死范围较MIR组均有明显缩小（(26±6)%、(27±5)%vs.(40±6)%,n=8,P均小于0.01）。上述结果表明，在机体存在基础胰岛素时，苦杏仁甙还可以减少缺血损伤心肌的梗死。

鉴于上述苦杏仁甙对心脏缺血的保护作用，那么苦杏仁甙就可以用于：

用于抗心肌缺血药物的制备的应用。

用于抗心脏缺血/再灌注损伤药物的制备。

2.4、在基础胰岛素环境，苦杏仁甙和胰岛素均可增加大鼠缺血/再灌注后心肌Akt磷酸化水平

已有的研究已发现，胰岛素通过细胞内“生存信号”——PI3K-Akt信号转导途径，除调节细胞糖代谢外，还可直接起到抗凋亡、促修复和促生存等细胞保护作用。为研究苦杏仁甙减轻心肌缺血/再灌注损伤的分子机制，采用Western blot方法检测2.2所述的四组的心肌细胞中p-Akt及Akt表达水平。

Western blot检测结果如图2所示，其中，Akt：蛋白激酶B；p-Akt：磷酸化-蛋白激酶B；β-Actin：β-肌动蛋白。x±s，n=4。^fP<0.05vs.SAA；^##P<0.01vs.MIR。检测结果显示，存在基础胰岛素时，苦杏仁甙和胰岛素的给药均可增加“生存信号”途径中重要分子p-Akt与Akt表达的比值（与MIR组相比，P<0.01）。这一结果表明，苦杏仁甙与“生存信号”的活化作用有密切联系。

但是由于动物的基础水平存在胰岛素，苦杏仁甙是通过直接激活“生存信号”还是促进胰岛素活化“生存信号”来发挥减少心梗范围，促进缺血心脏的功能恢复的心脏保护作用尚不明确。因此下面采用STZ破坏胰岛β细胞的大鼠1型糖尿病模型。实施心肌缺血/再灌注，于再灌注结束后检测心肌细胞中p-Akt及Akt表达水平。

3、1型糖尿病模型中苦杏仁甙与胰岛素同时应用显著增加大鼠缺血/再灌注后心肌Akt磷酸化水平

采用1型糖尿病模式动物，制作大鼠心肌缺血/再灌注损伤模型，1型糖尿病模式大鼠随机分为：(1)MIR组（心肌缺血/再灌注组，给予生理盐水对照）；(2)MIR+SAA组（苦杏仁甙，100mg/kg）；(3)MIR+Insulin（胰岛素，60U/L 4ml/kg·h）；(4)MIR+SAA+Insulin（苦杏仁甙100mg/kg，胰岛素60U/L 4ml/kg·h）。SAA治疗组再灌注前15min给药（i.v.），阳性对照组再灌注前15min开始给予胰岛素至再灌注结束（i.v.）。然后采用Western blot方法检测上述四组的心肌细胞中p-Akt及Akt表达水平。

Western blot检测结果及对应的柱状分析图如图3所示，其中，Akt：蛋白激酶B；p-Akt：磷酸化-蛋白激酶B；β-Actin：β-肌动蛋白。x±s，n=4.^**P<0.01vs.Control；^#P<0.05vs.SAA，^##P<0.01vs.SAA；^ffP<0.01vs.Insulin。结果显示，1型糖尿病模型中在无基础胰岛素存在的情况下，苦杏仁甙不能使Akt的磷酸化水平较MIR组升高，然而当外源同时给予胰岛素和苦杏仁甙时，Akt的磷酸化水平高于单独使用等量的胰岛素（n=4,P<0.01）。

上述结果表明，苦杏仁甙对于心脏缺陷/再灌注的保护并不能其单独激活Akt，但可通过促进、增强机体中的胰岛素激活“生存信号”来发挥抗心肌缺血/再灌注损伤作用。

鉴于机体中胰岛素的存在和其激活“生存信号”的作用，而苦杏仁甙可促进、增强胰岛素激活“生存信号”，尤其是对Akt的激活，那么苦杏仁甙可用于：

苦杏仁甙促进或增强胰岛素激活Akt的应用。

苦杏仁甙与胰岛素的混合物用于激活Akt药物的制备的应用。而至于苦杏仁甙与胰岛素的配比为药学上可接受的配比，具体的配比可根据具体的需要而调整。

进一步，苦杏仁甙不仅可以用于抗心肌缺血/再灌注损伤，还可以用于其他以胰岛素抵抗为基础的心血管疾病的预防或辅助治疗。

4、苦杏仁甙不能显著降低大鼠缺血/再灌注后血糖水平

进一步，在2.2所述的正常动物模型中检测再灌注结束时的血糖，检测结果的柱状图如图4所示，其中，Sham：假手术对照组；MIR：心肌缺血/再灌注(30min/3h)；SAA：苦杏仁甙；Insulin：胰岛素；Blood Glucose：血糖。x±s，n=6。^##P<0.01vs.MIR；^ffP<0.01vs.SAA。

血糖结果显示，Sham组静脉血糖为4.5±0.5mmol/L，MIR使血糖升高为5.2±0.3mmol/L，MIR+Insulin组（3.4±0.4mmol/L）较MIR组血糖有显著减低（n=6,P<0.01），MIR+SAA组（苦杏仁甙剂量为100mg/kg，血糖值为4.4±0.4mmol/L）与MIR组相比无明显差异。提示，苦杏仁甙并不显著降低血糖水平。

综上所述，植物提取物苦杏仁甙对心肌缺血/再灌损伤心脏具有保护作用，其保护作用体现在提高缺血/再灌损伤大鼠的心脏功能、减小心肌梗死范围，且这一保护作用与“生存信号”通路蛋白的活性有关；更重要的是，苦杏仁甙并不是直接激活Akt，而是通过增强胰岛素对“生存信号”的激活来发挥上述心脏保护作用。大量的临床和实验资料证明，胰岛素抵抗是糖尿病、高血压、冠心病等心脑血管疾病的共同土壤，胰岛素抵抗与代偿性的高胰岛素血症被普遍看作高血压和冠心病的独立危险因素。并且，胰岛素抵抗主要表现为以Akt为中心环节的“生存信号”通路信号转导的缺陷。因此，可增强胰岛素“生存信号”通路活性的苦杏仁甙用于基于胰岛素抵抗的疾病的辅助治疗，可具有潜在的较为广阔的应用前景。

Claims (4)

1.苦杏仁甙用于抗心肌缺血药物的制备的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抗心肌缺血药物为抗心脏缺血/再灌注损伤的药物。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抗心肌缺血药物为苦杏仁甙与胰岛素的混合物，用于激活Akt药物的制备。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的苦杏仁甙与胰岛素的混合物中胰岛素与苦杏仁甙的配比为药学上可接受的配比。