CN105136781B - 脂肪因子grem2作为药物靶点在治疗肥胖症药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于药物制备技术领域，特别涉及脂肪因子GREM2在制备肥胖症治疗药物中的应用。通过检测血清GREM2水平发现，肥胖患者血清GREM2水平明显高于正常体重对照。通过表达谱分析发现，所述的分泌因子GREM2主要表达于内脏脂肪组织。进一步通过体外原代脂肪前体细胞诱导实验发现，过表达GREM2可明显抑制脂肪前体细胞向米色脂肪分化的能力并抑制线粒体的功能，明显降低棕色脂肪特异性基因UCP1的表达。该作用是通过抑制BMP/Smad信号通路介导。本发明首次发现分泌因子GREM2主要来源于成熟的白色脂肪细胞，并发现GREM2参与白色脂肪棕色化的过程。所以，GREM2可以为临床治疗肥胖提供新的药物靶点。

Description

脂肪因子GREM2作为药物靶点在治疗肥胖症药物中的应用

技术领域

本发明属于药物制备技术领域，特别涉及脂肪因子GREM2在制备肥胖症治疗药物中的应用。

背景技术

肥胖患病率在世界范围内逐年增加，研究报道美国已经有1/3的人处于肥胖。肥胖是众多慢性非传染疾病如2型糖尿病、心血管疾病以及某些肿瘤的重要危险因素，严重危害人类健康。近期FDA通过两种新型减肥药物旨在通过抑制食欲减少能量摄入，由于既往众多抑制食欲减肥药均有较为严重的副作用，其应用前景同样不容乐观。因此，增加能量消耗干预肥胖越来越受到临床医生与基础研究人员的重视，寻找能量消耗相关因子已成为目前肥胖干预研究新热点。

肥胖、能量代谢与白色脂肪及棕色脂肪之间的平衡密切相关。白色脂肪以甘油三酯的形式储存能量，而棕色脂肪以非震颤形式消耗能量。多项研究表明，增强棕色脂肪组织功能可减轻小鼠体重，改善糖脂代谢和能量代谢。经典的棕色脂肪起源于胚胎早期的间充质细胞。近来研究发现，正常成年人体内也存在棕色脂肪，且棕色脂肪活性与体脂含量呈负相关而与静息状态的代谢率呈明显的正相关关系，这些研究结果更新了人们对棕色脂肪的认识，通过增加棕色脂肪对抗肥胖具有潜在的临床应用前景。

经典的棕色脂肪只存在于肩胛周围、锁骨上以及肾上腺周围等，在冷冻及肾上腺激动剂刺激后才会增加，正常成人棕色脂肪组织体积甚小或无法检测到，消耗能量作用有限。但最近研究发现，散在分布于白色脂肪中的类棕色脂肪(beige或brite细胞)具有明显可塑性，能够发挥棕色脂肪样功能，数量颇丰。此类Beige细胞源于白色脂肪组织血管基质成分的细胞(stromal vascular fractions，SVF)，与经典的棕色脂肪起源不一样。在某些生理病理情况下beige细胞大量增殖分化，促进产热，起到消耗能量的作用。因此，促进白色脂肪细胞转变为棕色脂肪的因子能有效抵抗肥胖及代谢综合征。细胞因子如Irisin、Orexin、FGF21、BMP7、BMP8B等亦可调节白色脂肪棕色化过程，由于其可分泌入血，因此有可能成为理想的生物标志物或干预手段。

在调节脂肪发育的细胞因子中，BMPs家族发挥着非常重要的作用。BMP主要通过与BMP受体BMPr1和BMPr2的复合体发挥作用，该复合体具有丝氨酸/苏氨酸激酶的活性，可以磷酸化下游SMAD1/5/8、P38MAPK传递信号，调节骨骼、肌肉、脂肪的发育。BMP家族的众多成员，BMP2、BMP4、BMP7、BMP8B等等，均被报道与脂肪细胞分化相关。之前研究发现，BMP4/BMP7具有促进脂肪形成的作用，在无任何其他诱导剂条件下BMP7可促进棕色脂肪前体细胞发育为成熟的棕色脂肪细胞。而最近另一研究发现，BMP4可以介导白色脂肪组织棕色样改变，从而改善能量代谢。另外BMP8B可以通过中枢和外周两条途径增加棕色脂肪产热[9]。这些结果表明BMP家族在脂肪细胞分化，尤其是棕色脂肪细胞分化过程中发挥着重要作用。BMP家族在体内存在天然的拮抗剂，其中同样为分泌因子的拮抗剂GREM2引起了我们的关注。迄今为止，并无研究报道GREM2在代谢中的作用。

GREM2是一种分泌的糖基化蛋白，属于BMP拮抗剂家族中的CAN(cerberus anddan)亚家族，其C端含有8个胱氨酸环。该家族包含GREM1、GREM2两个成员，其中GREM2在代谢相关组织表达远高于其他组织。GREM2基因位于人1号染色体1q43区段，包含2个外显子，全长4,170bps，编码168个氨基酸。GREM2能够与相应的BMP结合，最终抑制BMP信号通路的激活。既往报道GREM2与骨形成相关，而目前对于GREM2生物学功能所知甚少，尤其在能量代谢方面尚无涉及。基于上述原因，需进一步对GREM2的生物学功能和临床意义进行研究，从而建立GREM2与肥胖发生的关系，为肥胖干预提供新的靶点。

发明内容

本发明的目的是提供脂肪因子GREM2在制备肥胖症治疗药物中的应用，为肥胖的治疗提供新的药物靶点。本发明涉及一种新的脂肪分泌因子GREM2抑制白色脂肪棕色化的新功能。所述脂肪因子GREM2通过抑制BMP下游的Smad信号通路抑制白色脂肪棕色化过程。

通过收集167例伴或不伴代谢综合征的肥胖患者及147例性别年龄匹配的体重正常志愿者并检测血清GREM2水平发现，肥胖患者血清GREM2水平明显高于正常体重对照。通过表达谱分析发现，所述的分泌因子GREM2主要表达于内脏脂肪组织，且GREM2高表达于内脏成熟脂肪细胞。进一步通过体外原代脂肪前体细胞诱导实验发现，过表达GREM2可明显抑制脂肪前体细胞(SVF)向米色脂肪分化的能力，棕色脂肪特异性基因UCP1表达明显降低，并抑制线粒体的功能。随着GREM2剂量的增大，对UCP1的抑制作用也更强。该作用是通过抑制BMP/Smad信号通路介导。本发明首次发现分泌因子GREM2主要来源于成熟的白色脂肪细胞，并发现GREM2参与白色脂肪棕色化的过程。所以，GREM2可以为临床治疗肥胖提供新的药物靶点。

有益效果：本发明首次提供了分泌因子GREM2能够抑制白色脂肪棕色化的新功能，成为了非常好的潜在的治疗肥胖症的药物靶点。为临床上治疗肥胖症提供了实验数据和理论依据。

附图说明

图1为正常对照和肥胖患者血清GREM2水平检测的对比图。

图2为GREM2的组织和细胞表达分析图。

图3为GREM2对白色脂肪前体细胞棕色化的抑制对比图。

图4为GREM2对成脂相关基因和线粒体基因的抑制对比图。

图5为GREM2、BMP4和BMP7对下游信号通路的影响对比图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明作进一步说明：

实施例

1.正常对照和肥胖患者血清GREM2水平检测

本研究从2013年6月至2014年8月间在瑞金医院内分泌科肥胖专病门诊接诊肥胖患者中，纳入符合指征并在本院治疗的肥胖患者167例，同时招募正常志愿者147例。肥胖患者纳入标准为：BMI≥30.0kg/m2，年龄在14-34岁之间。排除标准：1)继发性肥胖；2)应用内分泌激素类药物(包括口服避孕药，糖皮质激素)；3)服用降糖药或降低血脂药物；4)妊娠或哺乳期患者；5)严重的肝肾功能异常患者；6)神经或精神疾病患者。

另外，我们从上海交通大学医学院在校学生中招募了147例正常志愿者。正常人招募纳入标准为：BMI≤23.0kg/m2，年龄14-34岁之间。排除标准为：1)高血压，心脏病；2)血脂异常，糖调节异常；3)肝肾功能异常；4)有糖尿病、肥胖及心血管疾病家族史。

研究方法如下：

(1)问卷调查和体格检查所有问卷调查员进行统一的技术培训，使用统一设计的调查表。调查内容包括：一般情况(性别、年龄、身高、体重、臀围、腰围、颈围、体脂含量、血压、生活习惯、饮食习惯、锻炼情况、是否足月顺产、是否母乳喂养、出生体重、代谢性疾病家族史等，针对女性进一步询问月经及生育情况)，并在后期进行临床检测指标的登记。

(2)采用空腹静脉血浆标本检测空腹血糖(FPG)、空腹胰岛素(insulin0)和HbA1c，采用OGTT-2h静脉血浆标本检测餐后血糖(PPG)。使用葡萄糖激酶法经自动生化仪(ADVIA-1650Chemistry System,Erlangen,Germany)检测FPG和PPG，采用电化学发光法(Roche-Diagnostics,Basel,Switzerland)检测insulin，采用高效液相色谱法(Bio-Rad,Hercules,CA)检测HbA1c。

表1、正常人和肥胖病人临床资料

与正常对照相比，肥胖患者除了性别年龄外，其它指标BMI、Waist circumference、ALT、AST、TC、FBG和PBG等都明显升高，HDL-c则明显降低。肥胖患者血清GREM2水平明显高于正常对照(图1)。

2.GREM2主要表达于成熟的内脏脂肪细胞

血清GREM2水平在肥胖人群中显著升高，我们借助小鼠模型来研究GREM2与脂肪的关系。我们首先检测了Grem2的小鼠组织表达谱，共选取小鼠全身16个组织，包括主要代谢相关组织腹股沟皮下、附睾旁内脏脂肪、肩胛间棕色脂肪、肝脏、肌肉以及重要脏器心、肾、肺等。结果(图2A)表明Grem2在内脏脂肪中表达最高，其次是肝脏，提示Grem2可能在代谢过程中发挥重要作用。脂肪组织包括成熟脂肪细胞和前体脂肪细胞(SVF)，Grem2究竟在那种细胞中表达最高呢？我们进一步分离了正常饮食情况下腹股沟皮下(IWAT)、附睾旁内脏(EWAT)和棕色脂肪(BAT)组织的前体脂肪细胞SVF及对应的成熟脂肪细胞(MA)。如图2B所示，Grem2在内脏脂肪的成熟脂肪细胞中表达最高，且明显高于相应的SVF，皮下脂肪Grem2表达则相对较低。

3、GREM2明显抑制白色脂肪前体细胞诱导分化

为了研究GREM2在白色脂肪棕色化中的参与作用，我们分离小鼠腹股沟皮下脂肪SVF(Inguinal SVF，ISVF)和附睾旁内脏脂肪SVF(epididymal SVF，ESVF)，体外向棕色脂肪诱导分化。检测ISVF诱导不同阶段的脂肪细胞Grem2的变化。如图3A所示，与前体细胞相比，在诱导两天后，Grem2水平急剧下降，随着脂肪细胞的分化成熟，Grem2的表达持续低水平，提示Grem2可能抑制皮下白色脂肪细胞棕色化。

研究表明，皮下白色脂肪棕色化的能力远远高于内脏脂肪。为了进一步阐明Grem2对白色脂肪棕色化的影响，我们分别给予ISVF和ESVF不同剂量的GREM2蛋白作用3天，继而向棕色脂肪细胞诱导分化，诱导成熟后检测标志基因表达。结果如图3B、C所示，GREM2明显抑制棕色脂肪特异性基因UCP1的表达。尤其在皮下脂肪前体细胞中，随着GREM2剂量的增大，对UCP1的抑制作用也更强。GREM2在内脏脂肪前体细胞中也发挥着抑制棕色化的作用，但其抑制作用只在高剂量时明显。

之后，我们用慢病毒下调皮下脂肪前体细胞中Grem2基因表达，再用棕脂诱导方案进行诱导分化。如图3D所示，Grem2基因表达下调后，皮下脂肪细胞棕色化能力明显增强。

4.GREM2抑制棕色脂肪细胞生成和线粒体基因表达

脂肪前体细胞启动分化及成熟过程需要大量的转录因子PPARγ和AP2基因参与，棕色脂肪细胞的分化伴随着线粒体的生成和功能增强，Nrf1、Tfam、Cytochrome c、Pgc-1α、Ucp1等基因表达明显升高。结果显示(图4)，GREM2蛋白处理后，转录因子PPARγ表达下调，AP2基因也受抑制。棕色脂肪特异基因及线粒体合成关键基因Pgc-1α、Nrf1、Tfam、Cytochromec表达明显下调，提示GREM2明显抑制棕色脂肪细胞的生成，抑制线粒体的生成。

5、GREM2通过BMP/Smad信号通路发挥作用

目前BMP家族中研究较多的主要影响脂肪细胞分化的为BMP4和BMP7。BMP下游主要有两条信号通路影响脂肪细胞分化：Smad信号通路和p38MAPK信号通路。我们在分离的皮下和内脏SVF中加入GREM2及BMP家族的BMP4/BMP7并观察下游信号通路的改变情况，作用浓度分别为GREM2 0.2μg/ml、BMP4 1nM、BMP7 3.3nM。BMP4、BMP7、GREM2处理皮下、内脏前体脂肪细胞1小时后下游p-SMAD1/5/8信号通路和p-p38MAPK信号通路的改变情况。结果显示(图5)，皮下脂肪前体细胞对BMP4的反应更明显，GREM2可明显抑制BMP4下游的P-Smad1/5/8。而内脏脂肪前体细胞对BMP4/BMP7都有一个中等强度的反应，GREM2可抑制BMP4/7下游的P-Smad1/5/8。BMP处理后两种脂肪前体细胞中的p38MAPK通路均无明显改变。结果表明GREM2通过抑制BMP4/BMP7介导的smad信号通路发挥抑制白色脂肪棕色化作用。

本发明首次提供了分泌因子GREM2能够抑制白色脂肪棕色化的新功能。肥胖已经成为了一个严重的公共卫生问题，诱导白色脂肪棕色化是肥胖治疗领域的一个重要方向。GREM2能够显著抑制白色脂肪棕色化，成为了非常好的潜在的治疗肥胖症的药物靶点。

以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应该局限于该实施例所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。

Claims (1)

1.脂肪因子GREM2作为药物靶点在治疗肥胖症药物中的应用，其特征在于：所述脂肪因子GREM2通过抑制BMP下游的Smad信号通路抑制白色脂肪棕色化过程。