CN112121057B - 红景天苷在制备抗人工关节磨损颗粒诱导骨溶解药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了红景天苷在制备抗人工关节衍生的磨损颗粒所诱发骨溶解药物中的应用，研究表明人工关节衍生的磨损颗粒是造成假体周围骨溶解的主要因素之一，本研究结果显示高剂量CoCrMo磨损颗粒能够诱导活化的巨噬细胞内线粒体功能及自噬过程受损，从而加速了巨噬细胞应激性损伤，进一步导致炎症因子的外泌和溶骨微环境的形成。而在体外加入线粒体自噬激活剂红景天苷后，不仅能够有效逆转巨噬细胞线粒体自噬受损、稳定线粒体功能稳态，还可减轻巨噬细胞外泌炎症因子的程度。此外通过将CoCrMo磨损颗粒植入颅骨皮下构建颅骨溶解模型，进而在皮下注射线粒体自噬激活剂红景天苷进行干预，进一步证实其对人工关节衍生磨损颗粒所诱导的骨溶解存在显著的抑制效应。

Description

红景天苷在制备抗人工关节磨损颗粒诱导骨溶解药物中的 应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体地说，是红景天苷在制备抗人工关节磨损颗粒诱导骨溶解药物中的应用。

背景技术

假体周围骨溶解仍是目前致使关节置换术远期疗效失败的主要原因之一。有学者估计，仅在全髋关节置换(total hip arthroplasty,THA)术后假体周围骨溶解的发生率就占10％～50％，当假体周围骨溶解影响假体-骨或骨水泥-骨界面稳定性时，可以进一步导致人工关节无菌性松动，造成关节置换术的失败，患者也将接受更加复杂且昂贵的翻修手术，加重病人痛苦及社会负担。迄今为止，有效预防或延缓假体周围骨溶解的药物或治疗方案的研发停滞不前，如何有效预防和治疗人工关节无菌性松动仍是目前关节外科医生面临的重要难题。

线粒体是细胞内三羧酸循环与氧化磷酸化的主要场所，也被称为细胞的“动力工厂”，为细胞存活提供必要的能量供应。在正常情况下，线粒体在结构和功能上均处于动态变化中，包括线粒体生物发生、融合、裂变及线粒体自噬等过程。而当正常线粒体动态变化过程受阻，胞内受损线粒体清除受损的情况下，胞内活性氧的蓄积致使细胞处于过氧化状态，因而进一步促进炎性因子的表达和外泌。而本研究立足于探明假体磨损颗粒对胞内线粒体功能及自噬状态的影响，并给与相应干预措施，以填补该研究领域的空白。

红景天苷(Salidroside,Sal)是主要提取于红景天的块根、块茎，在《本草纲目》和《四部医典》均有所记载，具有免疫调节、清除自由基和延缓衰老等多种药理功效。研究表明红景天苷能够有效增强PINK1/Parkin信号通路介导的线粒体自噬来保护多巴胺能神经元，减轻帕金森疾病的症状。公开号CN 108743597A的发明专利公开了红景天苷可以作为制备Parkin蛋白激动剂药物并用做延缓鼠椎间盘退变的有效药物，但其在磨损颗粒所介导的假体周围骨溶解中的作用效果尚不明确，因而本研究有望拓展红景天苷新的应用价值。

关于本发明红景天苷在制备抗假体磨损颗粒诱导骨溶解药物中的应用目前还未见报道。红景天苷的结构式如下：

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供红景天苷用于制备抗假体磨损颗粒诱导骨溶解的药物。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

第一方面，本发明提供了线粒体自噬激活剂红景天苷在制备抗假体磨损颗粒所诱发的骨溶解的药物中的应用。

第二方面，本发明还提供了线粒体自噬激活剂红景天苷在制备改善假体磨损颗粒所诱导功能线粒体数量的药物中的应用。

第三方面，本发明还提供了线粒体自噬激活剂红景天苷在制备逆转假体磨损颗粒所诱导的巨噬细胞线粒体稳态失调的药物中的应用。

第四方面，本发明还提供了线粒体自噬激活剂红景天苷在制备抑制假体磨损颗粒所诱导巨噬细胞外泌炎症因子程度的药物中的应用。

优选地，所述的炎性因子包括IL-18和IL-1β。

第五方面，本发明提供了一种抗人工关节衍生的磨损颗粒所诱发的骨溶解的药物，所述药物是由线粒体自噬激活剂和药学上可接受的载体和赋形剂制成。

优选地，所述线粒体自噬激活剂是红景天苷。

本发明实验结果证实高剂量CoCrMo磨损颗粒能够诱导巨噬细胞内线粒体氧化磷酸化受损、有功能线粒体数量减少，进而介导活性氧堆积及炎症因子的分泌，营造假体周围溶骨微环境；而线粒体自噬激活剂红景天苷则能够通过激活经典的PINK1/Parkin信号通路介导线粒体自噬激活，提升有功能线粒体的数量，减轻磨损颗粒诱导巨噬细胞的过氧化状态和外泌炎症因子的程度。最终维系细胞的内稳态、抑制溶骨微环境的形成。

本发明优点在于：

本专利首次针对CoCrMo颗粒介导假体周围骨溶解这一病理现象，创新性地发现高浓度CoCrMo颗粒能够诱导巨噬细胞线粒体自噬损失，并能进一步加速骨溶解进程，而本专利中使用红景天苷通过逆转高浓度CoCrMo颗粒所诱导的巨噬细胞线粒体自噬损失从而实现延缓骨溶解进程。实验结果表明：(1)在高浓度磨损颗粒刺激下，正常线粒体的形态有所改变、有功能线粒体数量和氧化磷酸化功能、PINK1/Parkin信号通路介导线粒体自噬过程同样存在较大改变，而在加入梯度浓度红景天苷预处理后，上述过程有所逆转；(2)高浓度磨损颗粒能够极大地促进炎症因子的释放，而在加入梯度浓度红景天苷预处理后，则能够有效逆转高浓度磨损颗粒介导炎症因子的分泌，减轻假体周围溶骨微环境的形成；(3)在体内水平，高浓度CoCrMo磨损颗粒刺激下，C57BL/6小鼠的颅骨溶解程度较大，而在施加梯度浓度红景天苷处理后，小鼠的颅骨溶解程度逐渐降低，进一步证实红景天苷延缓磨损颗粒诱导骨溶解的有效性。

附图说明

附图1是主要阐述了磨损颗粒诱导活化的巨噬细胞对破骨前体细胞分化存在潜在的调控作用。

附图2是透射电镜检测颗粒诱导的巨噬细胞内线粒体形态的改变。

附图3是流式细胞术检测不同处理组中巨噬细胞线粒体总量和有功能线粒体总量的影响。

附图4是Seahorse检测不同处理组中巨噬细胞线粒体功能。体现线粒体功能的关键参数主要包括呼吸水平基础值、ATP生成能力、质子渗漏水平、非线粒体呼吸值和呼吸能力储备值等。

附图5是不同处理组对炎症因子的影响。

附图6是Western Blot检测提纯后的线粒体总蛋白中线粒体自噬相关蛋白的表达情况。

附图7是激光共聚焦检测不同处理组中线粒体自噬相关蛋白的表达情况。

附图8是流式细胞术检测不同处理组中线粒体膜电位变化。

附图9是MicroCT检测不同处理组中颅骨溶解程度及H&E、TRAP染色检测不同处理组中颅骨骨结构的改变及破骨细胞阳性率。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1红景天苷抑制人工关节磨损颗粒诱导骨溶解的体内外研究(一)材料和方法

1.小鼠巨噬细胞系和破骨细胞的培养

小鼠巨噬细胞系Raw264.7购于中科院生化细胞所，使用Hyclone高糖培养基(含10％的胎牛血清和1％的青链霉素)；破骨前体细胞提自于4周龄C57BL/6小鼠的骨髓腔，所用培养基为含10％胎牛血清的α-MEM培养基。小鼠处死后用75％酒精进行消毒后，在无菌操作台取小鼠股骨和胫骨。然后用剪刀剪去骨头两端，用1ml注射器针头冲洗骨髓。将细胞悬液离心(1000rpm/min)，弃上清后再加入培养液(含10ng/mL M-CSF)、混匀细胞悬液，置于37℃，含5％二氧化碳培养箱内培养。

2.磨损颗粒的制备

CoCrMo磨损颗粒由南京凯斯特金属制品有限公司研磨制备。并将其充分分散于双蒸水中，然后分别经过1.2μm和0.2μm滤膜，所得到的粒径集中在120nm左右。再经过环氧乙烷灭菌，按50mg/mL的浓度配置CoCrMo颗粒溶液，CoCrMo颗粒溶液于4℃环境下保存。

3.CCK8检测细胞活力

Raw264.7细胞以每孔8000个铺于96孔板内，待贴壁后吸掉细胞培养基上清，分别加入含不同浓度的CoCrMo颗粒培养基(0，12.5，25，50和100μg/mL)和Sal(50μM/L)，分别处理24h,48h和72h后加入含10％的CCK-8培养基，孵育2小时，使用紫外分光光度计于450nm波长下测定吸光度。

4.诱导分化成熟破骨细胞数量及其功能检测

破骨前体细胞诱导分化后破骨细胞主要通过F-Actin染色、TRAP染色确定，具体步骤：对于F-Actin染色，当诱导结束后吸去培养基上清，使用4％的多聚甲醛固定细胞，然后加入预先配置好的F-Actin染液共孵育15min，吸去染液后使用PBS溶液清洗3次，每次3分钟。之后加入DAPI溶液对样品中细胞核进行染色。骨片吸收试验：将灭菌消毒后的骨片种在96孔内，BMM细胞进而种植于骨片上，保证每孔8000个，不同诱导处理后取出骨片，用氨水浸泡30min后，用毛刷擦除骨片表面的细胞，进而待骨片干燥后进行扫描电镜(SEM)检测。

5.线粒体形态、数量和功能检测

不同浓度磨损颗粒(0和50μg/mL)及红景天苷预(50μM/L)处理后的巨噬细胞线粒体结构和形态的改变主要通过透射电镜(TEM)鉴定；梯度浓度的红景天苷预处理及不同浓度磨损颗粒刺激后，分别使用Mitotracker、MitoLite Orange染液对不同组别的样本进行染色标记后，分别行流式细胞术检测不同样品中线粒体总量和有功能的线粒体数量；Seahorse主要检测不同处理组中巨噬细胞的线粒体功能，体现线粒体功能的关键参数主要包括呼吸水平基础值、ATP生成能力、质子渗漏水平、呼吸能力储备值和非线粒体呼吸水平等。加入线粒体ATP合酶抑制剂(Oligomycin)来计算ATP生成、采用FCCP测定呼吸能力最大值和呼吸能力储备值、鱼藤酮和抗霉素A(Rotenone&antimycin A)阻断的线粒体复合物I和III可以计算非线粒体耗氧量。

6.ELISA检测炎症因子的表达

不同处理组诱导完成后，提取细胞培养基上清，使用Invitrogen ELISA试剂盒检测培养基上清中IL-18、IL-1β两种炎症因子含量，结果表示为pg/mL。

7.Western Blot

不同组间处理完成后，使用线粒体提取试剂盒提纯线粒体总蛋白，将线粒体总蛋白经过BCA法测量蛋白浓度，进一步在总蛋白裂解液中加入适量5X的SDS-PAGE上样缓冲液，所得体系经过加热变性后冷却，即可进行SDS-PAGE蛋白电泳实验。本研究所涉及的蛋白指标包括Parkin、PINK1、LC3B、Beclin 1、P62及Cox IV等。

8.线粒体膜电位检测

不同处理结束后，吸除六孔板中的培养液，用PBS洗涤细胞1遍，加入1mL细胞培养液及1mL JC-1染色工作液，充分混匀后置于细胞培养箱中孵育20min。孵育期间，按每1mLJC-1染色缓冲液(5X)加入4mL蒸馏水的比例配制适量的JC-1染色缓冲液(1X)，并放置于冰浴待用。细胞在37℃孵育结束后吸除细胞上清，用预冷的JC-1染色缓冲液(1X)洗涤2次，用胰酶将细胞从皿底消化下来后冲散转移至EP管中，置于冰上准备行进一步的流式细胞术的检测。

9.磨损颗粒诱导的颅骨溶解模型建立及相关干预操作

首先将C57BL/6小鼠麻醉，然后小鼠颅骨皮肤从正中切开，剔除骨膜，将经过初筛的CoCrMo纳米颗粒(30mg/mL)注射至皮下，然后小心缝合好皮肤。术后3天进行颅骨皮下药物注射实验。

本研究主要分为4组(每组5只)，主要分组如下：第一组为空白对照组(每组5只)；第二组为模型组，即在小鼠颅骨建立磨损颗粒诱导的溶解模型；第三组为低浓度红景天苷干预组：在小鼠颅骨溶解模型建立后，每隔3天行一次颅骨皮下注射低浓度红景天苷(25mg/kg)；第四组为高浓度红景天苷干预组：在小鼠颅骨溶解模型建立后，每隔3天行一次颅骨皮下注射高浓度红景天苷(50mg/kg)。术后第14天取材，小鼠颅骨标本使用4％多聚甲醛固定后，进行Micro CT检测；进而行脱钙，脱水包埋，切片，进行H&E染色和TRAP染色检测颅骨骨质破坏程度。

(二)结果

(1)CoCrMo磨损颗粒诱导活化的巨噬细胞对破骨前体细胞分化的调控作用

通过建立Tanswell(直径0.4μm)共培养体系(图1.A)，在诱导9天后，TRAP染色、F-Actin染色以及骨片吸收试验(图B,C,D)，均证实与单RANKL(50ng/mL)+M-CSF(30ng/mL)诱导组相比，梯度浓度CoCrMo颗粒诱导活化的巨噬细胞能够协同RANKL(50ng/mL)+M-CSF(30ng/mL)的诱导效果，进一步加速了BMDM的破骨细胞分化成熟，进一步提示CoCrMo磨损颗粒诱导活化的巨噬细胞对破骨前体细胞分化有显著的调控作用(*示意p<0.05；**示意p<0.01；***示意p<0.001)。

(2)CoCrMo颗粒诱导的巨噬细胞线粒体形态的改变

如图2所示，与对照组相比，胞内线粒体体积变得膨胀、线粒体嵴的排列紊乱、融合消失以及线粒体的空化和髓样化等病理改变，而在加入线粒体自噬激活剂红景天苷预处理12h后接受磨损颗粒的刺激，胞内线粒体形态和完整性逐渐恢复正常，进一步提示高浓度CoCrMo颗粒能够诱导巨噬细胞线粒体损伤，而线粒体自噬激活剂红景天苷能逆转线粒体形态改变。

(3)不同处理组对巨噬细胞线粒体总量和有功能线粒体总量的影响

不同浓度Sal预处理巨噬细胞12h及不同浓度CoCrMo颗粒刺激巨噬细胞24h后，分别使用Mitotracker染液、MitoLite Orange染液对样品进行染色标记，随之进行流式细胞术检测，如图3所示，Mitotracker标记的样品荧光强度没有显著差别，提示梯度浓度CoCrMo颗粒处理和梯度Sal预处理后，线粒体总量并未发生显著改变。

而MitoLite Orange对不同处理进行染色标记结果显示图3，梯度浓度CoCrMo颗粒显著降低了有功能线粒体数量，而Sal预处理则能够有效逆转有功能线粒体数量，并呈现浓度梯度依赖性特征，进一步提示线粒体自噬激活剂Sal能够有效保护CoCrMo颗粒介导的线粒体功能紊乱(***示意p<0.001；****示意p<0.0001)。

(4)Seahorse检测不同处理组中巨噬细胞线粒体功能

具体分组如下：空白对照组、加25μg/mL的CoCrMo颗粒诱导24h、加50μg/mL的CoCrMo颗粒诱导24h、加100μg/mL的CoCrMo颗粒诱导24h、加入50μM/L的Sal预处理12h后加50μg/mL CoCrMo颗粒诱导24h、加入100μM/L的Sal预处理12h后加50μg/mL CoCrMo颗粒诱导24h。

如图4所示，检测到在加入梯度浓度CoCrMo颗粒刺激后(A-D组)，巨噬细胞细胞代谢参数：呼吸水平基础值、ATP生成能力、质子渗漏水平和呼吸能力储备值均逐渐降低；而在加入梯度浓度红景天苷预处理12h后，巨噬细胞的上述细胞代谢指标逐渐回升，进一步提示红景天苷对磨损颗粒诱导的线粒体代谢功能的保护作用(**示意p<0.01；***示意p<0.001；均与Ctrl组比较)。

(5)如图5所示，ELISA结果证实梯度浓度CoCrMo磨损颗粒能够诱导巨噬细胞炎症因子(IL-18和IL-1β)释放，并呈浓度梯度依赖特征。而加入Sal(50μM/L)的预处理后，磨损颗粒刺激所释放的炎症因子含量则显著降低(*示意p<0.05；**示意p<0.01；***示意p<0.001)。

(6)线粒体自噬相关蛋白的表达情况

如图6A所示，梯度浓度CoCrMo颗粒(0、12.5、25和50μg/mL)刺激RAW264.7巨噬细胞系24h后，12.5μg/mL的CoCrMo颗粒刺激组中线粒体蛋白Parkin、PINK1、LC3B、Beclin1及P62表达量增多，而当浓度加大至25和50μg/mL时，上述蛋白表达量逐渐降低，提示高浓度的磨损颗粒能够进一步抑制PINK1/Parkin通路介导的线粒体自噬过程。为进一步验证PINK1/Parkin通路在其中发挥的作用，进一步在巨噬细胞内转染SiRNA-Parkin，并成功验证转染效果后(5B)，分别设立空白对照组、CoCrMo颗粒(12.5μg/mL)刺激24h组、巨噬细胞内红景天苷预处理12h后CoCrMo颗粒(12.5μg/mL)刺激24h组、敲低Parkin的巨噬细胞接受CoCrMo颗粒(12.5μg/mL)刺激24h组和敲低Parkin的巨噬细胞内预处理红景天苷12h后接受CoCrMo颗粒(12.5μg/mL)刺激24h组，提取各组中线粒体蛋白进行Western Blot检测，结果显示12.5μg/mL的CoCrMo颗粒处理及加入红景天苷预处理后，均能够促进PINK1/Parkin介导的自噬通路激活，但在当转入SiRNA-Parkin后，单纯12.5μg/mL的CoCrMo颗粒处理及加入红景天苷的预处理均未能激活PINK1/Parkin介导的自噬通路，则进一步中证实PINK1/Parkin信号通路在CoCrMo颗粒诱导巨噬细胞线粒体自噬中发挥较为重要作用。

(7)激光共聚焦检测不同处理组中线粒体自噬相关蛋白的表达情况

为使(6)中的结果更直观化，我们在体外水平施加了不同处理后，将细胞进行两种不同指标的荧光标记：Parkin(线粒体自噬的marker)和COX IV(线粒体的marker)，进一步行激光共聚焦检测。

如图7所示，CoCrMo颗粒(12.5μg/mL)刺激24h组Parkin和COX IV的共定位较对照组显著增加，进一步验证了(6)中的结果，当CoCrMo颗粒(25μg/mL)刺激24h后，Parkin表达量显著降低，荧光双标共定位进而减少，而当在CoCrMo颗粒(25μg/mL)处理组前加入红景天苷预处理12h，显著逆转了磨损颗粒所诱导的Parkin介导的线粒体自噬受损过程。

(8)不同处理组中线粒体膜电位变化

为进一步检测红景天苷在逆转磨损颗粒诱导的线粒体膜电位变化及早期凋亡中的作用。本研究进一步在不同处理诱导下，使用JC-1试剂盒检测线粒体膜电位的变化，如图8所示，巨噬细胞转染Si-Parkin后接受12.5μg/mL和25μg/mL CoCrMo刺激24后，线粒体膜电位显著降低，进一步证实PINK1/Parkin信号通路介导的线粒体自噬过程在维持磨损颗粒诱导的巨噬细胞稳态中发挥重要作用。但当在CoCrMo颗粒(50μg/mL)诱导体系中预先加入红景天苷(50μM/L和100μM/L)处理12h后，能够显著逆转线粒体膜电位的降低，进一步维持线粒体的稳定，进而减少高浓度磨损颗粒诱导的细胞早期凋亡。

(9)MicroCT检测不同处理组中颅骨溶解程度

如图9所示，单独磨损颗粒诱导组中颅骨溶解程度显著增加，该组的BV/TV、Tb.N、Tb.Th和SMI参数显著降低，而Tb.Sp显著增加，但当在颅骨溶解模型中加入梯度浓度的红景天苷后，BV/TV、Tb.N、Tb.Th和SMI参数逐渐上升、Tb.Sp则逐渐降低(*示意p<0.05；**示意p<0.01；***示意p<0.001；均与Ctrl组比较)。

对组织进行后续的脱水、包埋、切片等处理，并进一步将切片进行H&E、TRAP染色，检测不同处理组中颅骨骨结构及破骨细胞数量的改变，如图9所示，单独磨损颗粒诱导组中颅骨组织结构破坏较为严重、失去了正常的骨微结构、破骨细胞阳性率也最高，但随着梯度浓度的红景天苷处理后，骨组织微结构被破坏程度有所减轻、成熟破骨细胞的数量也逐渐降低，进一步提示红景天苷的能够有效延缓CoCrMo磨损颗粒介导的体内颅骨骨溶解。

(三)结论

综上所述：本发明首先揭示了CoCrMo磨损颗粒诱导活化的巨噬细胞对破骨前体细胞的分化成熟存在有效调控作用，进一步研究发现磨损颗粒诱导后，巨噬细胞线粒体的形态、有功能线粒体数量、线粒体氧化磷酸化功能、线粒体自噬过程及线粒体膜电位均有所改变。但当加入红景天苷后，上述过程能够有效逆转。此外在CoCrMo磨损颗粒诱导体内颅骨溶解模型中，红景天苷能显著延缓颅骨溶解程度和抑制破骨细胞成熟。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (1)

1.线粒体自噬激活剂红景天苷在制备抗人工关节磨损颗粒所诱发骨溶解的药物中的应用，其特征在于，所述骨溶解是功能线粒体数量减少、巨噬细胞线粒体稳态失衡、巨噬细胞外泌炎症因子产生所导致的疾病，所述的炎性因子是 IL-18 和 IL-1β。

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