JP6441472B2

JP6441472B2 - 活性成分として外因性ミトコンドリアを含む組成物、ならびにその使用およびそのための細胞修復法

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Publication number: JP6441472B2
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Inventors: 鴻麟蘇; 學敏曾; 詩芳 ▲呉▼
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Description

本開示は、損傷したミトコンドリアを含む細胞の抗老化および修復方法に関し、より具体的には、活性成分として外因性ミトコンドリアを含む組成物、ならびにその使用およびそのための細胞修復法に関する。

細胞中のミトコンドリアは、細胞へのエネルギーの供給およびアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の生成に関与する。ミトコンドリアは、細胞内のエネルギー必要量の違いまたは細胞ストレスの違いに応じて動的に変形し、そのためミトコンドリアは、常に単一のミトコンドリア状態にあるわけではない。具体的には、細胞のエネルギー必要量が増加すると、ミトコンドリアは、連続的に分裂することによって、ＡＴＰを迅速に生成する。一方、細胞が飢餓状態のときには、ミトコンドリアは、エネルギーの生成および消費を減少させるために融合し、それによって正常な生理機能を維持する。さらに、ミトコンドリアが膜電位低下およびミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）変異などのような損傷を受けたときにも、ミトコンドリアは、相同組換えにより損傷したｍｔＤＮＡを置き換えるために融合し、またミトコンドリアに変異ｍｔＤＮＡが多く蓄積しすぎて、ミトコンドリアが修復できないときには、変異ｍｔＤＮＡを含むミトコンドリアは、オートファゴソームにより排除され、正常なミトコンドリアのみが保持される（ＬａｍｂＣＡ他、２０１３年）。その結果、細胞中に損傷したミトコンドリアが同時に多く存在しすぎて排除できないときには、その細胞は細胞アポトーシスに至る（ＭｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙＳ他、２０１４年）。

ミトコンドリアの欠損および不足は、レーベル遺伝性視神経症、ミトコンドリア脳筋症、乳酸アシドーシス、および脳卒中様発作（ＭＥＬＡＳ）、赤色ぼろ線維を伴うミオクローヌスてんかん（ＭＥＲＲＦ）などのような多くの疾患に関連している。さらに、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病などのような神経変性疾患は、ミトコンドリアの分裂および融合障害に関連する（ＧｈａｖａｍｉＳ他、２０１４年）。さらに、老化現象または年齢もミトコンドリア中の変異ｍｔＤＮＡの量を増加および蓄積させ、これにより加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）（ＢｒｅｎｎａｎＬＡ他、２０１４年；ＪａｒｒｅｔｔＳＧ他、２０１０年）、皮膚老化（ＢｌａｔｔＴ他、２００５年；Ｍａｋｒａｎｔｏｎａｋｉ他、２００７年）などのような多数の関連疾患が引き起こされる。

皮膚老化を遅延させるために、人々はヒアルロン酸、ビタミンＡおよびビタミンＣ、抗酸化剤、日焼け止め剤などのような多くの化粧品を使用したり、レーザー、ボツリヌス菌、高周波スキンタイトニングなどのような老化現象を軽減するための医療美容クリニックを探し求めたりしている。しかしながら、従来の美容法では、皮膚老化の発生を軽減または遅延させることができない。別の研究により、間葉系幹細胞の注入が、皮膚のしわのような老化現象を効果的に軽減することができることが裏付けられ、そのため幹細胞治療は、老化現象を遅延させる機会であると考えられている。しかしながら、実際には、幹細胞は入手が困難であり、幹細胞の大規模培養には時間と費用がかかりすぎる。さらに、幹細胞移植には、腫瘍または拒絶反応を引き起こす変異などのリスクがある。その結果、皮膚老化を効果的に軽減する安全性が高い方法は現在のところ存在しない。

１９８９年の研究は、外因性ミトコンドリアを共培養するために細胞に供給すると、その外因性ミトコンドリアが、直接注入または膜融合後に細胞に侵入することができ、それにより遺伝子欠損を有するミトコンドリアを含む細胞が正常な機能を回復することを示している（ＫｉｎｇＭＰ他、１９８８年；ＫｉｎｇＭＰ他、１９８９年）。多くの研究は、細胞とミトコンドリアとを単に共培養するだけでは、ミトコンドリアを細胞に侵入させられないことも確認しており（ＣｈａｎｇＪＣ他、２０１３年；ＳｐｅｅｓＪＬ他、１９８９年）、したがって細胞に直接供給された外因性ミトコンドリアが細胞に侵入するかどうかは確認することができない。従来技術によると、異なる細胞の外因性ミトコンドリアを取り込む能力は異なることがある。したがって、ミトコンドリアが細胞に侵入する経路が解明されていなければ、研究者は、実験条件を調整してこのミトコンドリアに関する実験を繰り返すことができない。

さらに、細胞は細菌などのような外因性物質を食作用によって取り込むことができるが、食作用によって取り込まれた外因性物質は、リソソームとともにファゴリソソームを形成し、それによってこの外因性物質は分解される。その結果、外因性ミトコンドリアは、食作用により細胞中に保持することができず、内因性ミトコンドリアを修復することができないと一般に考えられている。最近の研究は、米国特許第８，６４８，０３４号に開示されている細胞透過性ペプチド、または米国特許公報第２０１３／００２２６６６号に開示されているリポソームコーティングミトコンドリアを使用してミトコンドリアが細胞膜と融合するのを助け、このミトコンドリアは、容易に細胞に侵入して細胞の酸化的呼吸を改善する。しかしながら、上記の方法は、ミトコンドリアが細胞に侵入するのを助けるが、細胞透過性ペプチドまたはリポソームのようなこれらの方法の担体は、ミトコンドリア破壊および細胞膜破壊を誘発することがあり、これはミトコンドリアに損傷を与え、標的細胞に対して毒性を示す。

本開示の主目的は、有効量の外因性ミトコンドリアを含む組成物を提供することである。

本開示の別の目的は、損傷したミトコンドリアの修復または細胞老化の軽減のための組成物の使用を提供することである。

本開示の別の目的は、外因性ミトコンドリアが完全に細胞内に送り込まれ、それによって損傷した細胞を修復する効果、細胞老化を軽減または防止する効果が得られるように、有効量の外因性ミトコンドリアを個人に投与するステップを含む、細胞修復法を提供することである。

上記の目的を達成するために、本開示の実施形態は、外因性ミトコンドリアおよび少なくとも１つの薬学的または化粧品的に許容される担体を含む組成物を開示する。

好ましくは、この組成物はアジュバントをさらに含み、このアジュバントは、血清、血漿、補体、および上記成分のうちの少なくとも２つの組み合わせからなる群から選択される。

好ましくは、外因性ミトコンドリアは細胞から抽出される。

好ましくは、外因性ミトコンドリアは、遠心精製法により細胞から得られる。

本開示の別の実施形態では、上記の医療組成物の使用は、皮膚細胞の老化を軽減または防止するためのものである。

本開示のさらに別の実施形態では、上記の医療組成物の使用は、損傷した細胞を修復するためのものである。

本開示の実施形態で開示される細胞修復法は、外因性ミトコンドリアが細胞に侵入し、老化したミトコンドリアまたは損傷したミトコンドリアの代わりとなるように、有効用量の外因性ミトコンドリアを個人に投与するものである。

好ましくは、外因性ミトコンドリアを個人に投与する前に、外因性ミトコンドリアは、血清、血漿、および補体からなる群から選択された少なくとも１つの成分で前処理される。

本開示の有益な効果は、以下の通りである。第１に、外因性ミトコンドリアを使用することで、従来技術における同種細胞移植により誘発される拒絶反応を克服することができる。第２に、外因性ミトコンドリアは、幅広い供給源であり、またヒトの健康に対して有害でない、正常細胞株または生体から得ることができる。例えば、既知の細胞移植技法は、がんまたは腫瘍の発生につながることがある。第３に、外因性ミトコンドリアは、細胞に直接侵入して、内因性ミトコンドリアと融合し、それによって老化した細胞または損傷した細胞中の損傷したミトコンドリアの代わりとなることができ、細胞の酸化的ストレスを軽減する効果、細胞の正常な機能を回復する効果、および細胞の長期的かつ直接的な保護を提供する効果を得ることができる。第４に、外因性ミトコンドリアは、血清または補体での処理後、完全に細胞に侵入することができ、細胞透過性ペプチドまたはリポソームでの処理により誘発される細胞毒性効果を回避することができる。
第５に、外因性ミトコンドリアは、しわおよび皮膚老化現象を根本的に軽減し、コラーゲン合成の増加を効果的に誘発することができる。

したがって、本開示において開示される医薬組成物は、高い安全性を示し、有効用量の医薬組成物を個人に投与することにより、外因性ミトコンドリアが細胞に侵入すると、損傷したミトコンドリアを含む細胞を修復する効果および老化現象を軽減する効果が得られる。

赤色蛍光標識したミトコンドリアおよび緑色蛍光ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ染色したＢＨＫ細胞を１時間共培養した後の、細胞中の取り込まれたミトコンドリアおよびリソソームの相対位置を示す図である。赤色蛍光標識したミトコンドリアおよびＢＨＫ細胞を４時間共培養した後の、細胞中の取り込まれたミトコンドリアおよびのリソソームの相対位置を示す図である。細胞に取り込まれた外因性ミトコンドリアの走査型電子顕微鏡での観察結果を示す図であり、四角の枠は、取り込まれたミトコンドリアを低倍率で示し、矢印は、細胞の仮足により取り込まれたミトコンドリアを高倍率で指し示している。細胞に取り込まれた外因性ミトコンドリアの走査型電子顕微鏡での観察結果を示す図であり、四角の枠は、取り込まれたミトコンドリアを低倍率で示し、矢印は、細胞の仮足により取り込まれたミトコンドリアを高倍率で指し示している。赤色蛍光標識したミトコンドリアおよびファロイジン−ＦＩＴＣ染色したＢＨＫ細胞を４時間共培養した後の、ＢＨＫ細胞に侵入するミトコンドリアの観察結果を示す図であり、白色の線は１０μｍを示す。ＢＨＫ細胞をアクチノマイシンＤ（ＡｃｔＤ）で処理した後の、ＢＨＫ細胞に侵入する赤色ミトコンドリアの結果を示す図であり、白色の線は１０μｍを示す。図４（ＡｃＤで処理していないＢＨＫ細胞）および図５（ＡｃＤで処理してたＢＨＫ細胞）における、外因性ミトコンドリアを含む細胞の割合の統計結果を示す図である。補体で処理していない赤色外因性ミトコンドリアおよび緑色蛍光ミトコンドリアを含むＢＨＫ細胞を４時間共培養した後の、取り込まれたミトコンドリアおよび細胞中のミトコンドリアの相対位置を示す図であり、矢印は、細胞中で外因性ミトコンドリアと内因性ミトコンドリアとが重なった位置を示す、黄色蛍光を指す。１０μｇ／ｍＬのＣ３補体で処理した外因性ミトコンドリアおよび緑色蛍光ミトコンドリアを含むＢＨＫ細胞を４時間共培養した後の、取り込まれたミトコンドリアおよび細胞中のミトコンドリアの相対位置を示す図であり、矢印は、細胞中で外因性ミトコンドリアと内因性ミトコンドリアとが重なった位置を示す、黄色蛍光を指す。外因性ミトコンドリアを示す赤色蛍光シグナルと内因性ミトコンドリアを示す緑色蛍光シグナルとが重なった状態を示す、図７Ｂの赤色直線部分の走査型共焦点顕微鏡による観察結果および分析を示す図である。電子顕微鏡により観察される、未処理のミトコンドリアの外観を示す図である。電子顕微鏡により観察される、血清で処理したミトコンドリアの外観を示す図である。電子顕微鏡により観察される、Ｃ３補体で処理したミトコンドリアの外観を示す図である。電子顕微鏡により観察される、Ｐｅｐ−１細胞透過性ペプチドで処理したミトコンドリアの外観を示す図である。外因性ミトコンドリアおよびＨＵＶＥＣ細胞を共培養した後の、ＨＵＶＥＣ細胞に侵入するミトコンドリアの結果を示す図である。ＳＡ β−ｇａｌ染色後にさまざまな手段で処理したＨＵＶＥＣ細胞群それぞれの結果を示す図である。ＳＡ β−ｇａｌ染色後にさまざまな手段で処理したＨＵＶＥＣ細胞群それぞれの結果を示す図である。ＳＡ β−ｇａｌ染色後にさまざまな手段で処理したＨＵＶＥＣ細胞群それぞれの結果を示す図である。マウスの真皮線維芽細胞に侵入する赤色蛍光タンパク質を含む外因性ミトコンドリアの走査型共焦点顕微鏡による観察結果を示す図である。第Ｉ群〜第ＩＶ群のヌードマウスの外因性ミトコンドリアによる処置後の皮膚表面を顕微鏡で観察した画像である。第Ｉ群〜第ＩＶ群のヌードマウスの外因性ミトコンドリアによる処置後の皮膚表面を顕微鏡で観察した画像である。第Ｉ群〜第ＩＶ群のヌードマウスの外因性ミトコンドリアによる処置後の皮膚表面を顕微鏡で観察した画像である。第Ｉ群〜第ＩＶ群のヌードマウスの外因性ミトコンドリアによる処置後の皮膚表面を顕微鏡で観察した画像である。外因性ミトコンドリアによる処置後の各群のヌードマウスの皮膚のしわの粗さの分析結果を示す図である。マッソン三色染色後の各群のヌードマウスの皮膚組織切片の結果を示す図である。マッソン三色染色後の各群のヌードマウスの皮膚組織切片の結果を示す図である。マッソン三色染色後の各群のヌードマウスの皮膚組織切片の結果を示す図である。マッソン三色染色後の各群のヌードマウスの皮膚組織切片の結果を示す図である。

別途定義しない限り、本明細書および特許請求の範囲における技術用語および科学用語の意味は、本開示の技術分野の当業者が理解する一般的な意味と同様である。矛盾がある場合には、本開示における意味が基準とされる。

「有効用量」という用語は、特定の効果を生じるのに必要な化合物または有効成分の用量を意味し、これは組成物中の重量パーセントで示すことができる。本開示の技術分野の当業者に周知のように、有効用量は、特定の効果を生じるために、投与経路によって変更される。一般に、組成物中の有効成分または化合物の重量パーセントでの用量は、１％以上１００％以下であってよく、より好ましくは約３０％以上１００％以下である。

「薬学的または化粧品的に許容される担体」という用語は、あらゆる基準の医薬製品または化粧品に使用される担体を含み、この担体は、組成物の形態によって、固体、半固体、または液体であってよい。例えば、担体には、ゼラチン、乳化剤、炭化水素混合物、水、グリセロール、生理食塩水、緩衝食塩水、ラノリン、パラフィン、蜜蝋、ジメチルシリコーンオイル、およびエタノールがあるが、これらに限定されない。

「組成物」という用語は、特定の効果を生じるための有効量の化合物または有効成分、および少なくとも１つの担体を含む。本開示の技術分野の当業者に周知のように、組成物の形態は、トローチ剤、粉剤、注射剤など、特定の効果を誘発するために、投与経路によって変更することができ、担体も組成物の形態によって固体、半固体、または液体であってよい。

「投与する」という用語は、目的物を個人の特定の部分、特定の細胞、特定の標的に送達するための経路、または個人に接触するための手段を意味する。一般に、投与経路には、経口、塗布、噴霧、吸入、注入などがあるが、これらに限定されない。

以下において、本開示の効果をさらに説明するために、いくつかの実施形態を詳細に説明する。しかしながら、これらの実施形態は、説明のための例であり、説明に使用するいかなる表現も本開示の明細書および請求項の範囲および意味を制限するものではない。

（実施形態１）
＜蛍光標識したミトコンドリア＞
ミトコンドリアシグナルペプチドを担持する赤色蛍光タンパク質ＤｓＲｅｄまたは緑色蛍光をベビーハムスター腎臓線維芽細胞（ＢＨＫ−２１細胞）にトランスフェクトし、それによって、Ｇ４１８抗生物質およびフローサイトメーターを用いたスクリーニングにより、赤色蛍光タンパク質を連続的に発現することができるＲｅｄＭ−ＢＨＫ細胞またはＧＦＰ−ＢＨＫ細胞を得る。

（実施形態２）
＜ミトコンドリアをＢＨＫ細胞から分離する＞
培養ＢＨＫ細胞の細胞数が２×１０^８に達したら、ＳＨＥ緩衝液（０．２５Ｍショ糖、０．５ｍＭＥＧＴＡ、および３ｍＭＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、ｐＨ７．２）を加えて細胞培養皿を洗浄し、これを１０００ｘｇで３分間遠心分離する。そこから上澄みを取り除いた後、その中に２ｍＬのＳＨＥ緩衝液を加え、これをＤｏｕｎｃｅホモジナイザーで約１５回粉砕するが、この操作は、細胞およびミトコンドリアへの損傷を軽減するために氷上で実施する。粉砕終了後、ホモジネート溶液を１０００ｘｇで１５分間遠心分離して沈殿物を取り除き、その後これを９０００ｘｇで１０分間遠心分離し、最後に、最終沈殿物を５０μＬのＳＨＥ緩衝液に溶解した後、そこにプロテアーゼ阻害剤を加え、これを４℃で保管する。

（実施形態３）
＜ミトコンドリアが細胞に侵入する経路を確認する＞
この実施形態では、ミトコンドリアが細胞に侵入する移動経路を追跡するために、外因性ミトコンドリアを加えて、移動しているミトコンドリアおよびリソソームの位置をさまざまな時点で観察する。

まず、ミトコンドリアを赤色蛍光タンパク質ＤｓＲｅｄで標識し、細胞中のリソソームの位置を確認するために、緑色蛍光を示すＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒでＢＨＫ細胞をトランスフェクトする。赤色蛍光タンパク質で標識した外因性ミトコンドリア５μｇ、およびＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒで処理したＢＨＫ細胞を用意し、それらを室温で共培養する。１時間および４時間の培養時に、ＢＨＫ細胞に侵入する外因性ミトコンドリアの状況、および外因性ミトコンドリアとリソソームとの相対位置を走査型共焦点顕微鏡で観察し、その結果を図１および図２に示す。

図１に示すように、赤色蛍光を示す外因性ミトコンドリアを１時間培養した後、これらの外因性ミトコンドリアはＢＨＫ細胞の周囲に分布する。図２に示すように、４時間培養後、赤色蛍光を示す外因性ミトコンドリアの一部とＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒシグナルの緑色蛍光とが重なる。上記の結果によると、外因性ミトコンドリアおよびリソソームは、外因性ミトコンドリアが細胞に侵入した後、細胞中の同じ位置に位置し、したがって外因性ミトコンドリアが食作用によって細胞に侵入することが推測される。

ＢＨＫ細胞に侵入する外因性ミトコンドリアの状況を走査型電子顕微鏡によりさらに観察する。図３Ａおよび図３Ｂに示すように、図３Ａは、低倍率での観察結果であり、図中の四角の枠は、細胞に取り込まれたミトコンドリアを示しており、図３Ｂは、高倍率での観察結果であり、図中の矢印は、細胞の仮足により取り込まれたミトコンドリアを指す。したがって、図３Ａおよび図３Ｂの結果は、ＢＨＫ細胞が仮足を伸ばして外因性ミトコンドリアを覆うことを示しており、このことは外因性ミトコンドリアが細胞に侵入する経路が食作用であることを裏付ける。

さらに、ＢＨＫ細胞をファロイジン−ＦＩＴＣで染色して、細胞内のアクチンを標識し、細胞の種類を示す。染色したＢＨＫ細胞および赤色蛍光標識した外因性ミトコンドリアを３７℃で４時間培養した後、図４に示すように、多数のミトコンドリアが細胞に侵入することがわかる。しかしながら、ＢＨＫ細胞の食作用が阻害されるように、ＢＨＫ細胞を２０μＭアクチノマイシンＤ（ＡｃｔＤ）で処理すると、図５に示すように、外因性ミトコンドリアが細胞に全く侵入できないことがわかる。異なる手段で処理された上記の細胞に侵入する外因性ミトコンドリアの数を計算し、結果を図６に示す。

上記の結果によると、単に外因性ミトコンドリアを細胞に供給したとき、細胞は食作用によりミトコンドリアを取り込み、それによってミトコンドリアは細胞に侵入することができる。

（実施形態４）
＜血清はミトコンドリアが細胞に侵入するのを助ける＞
希釈したウシ胎仔血清（ＧＩＢＣＯ）を用意し、赤色タンパク質で標識した外因性ミトコンドリアと血清とを１時間混合してから、上澄み中の血清を遠心分離で取り除き、その後沈殿物をＳＨＥ緩衝液で溶解して元の容積に戻す。ＢＨＫ細胞をファロイジン−ＦＩＴＣで染色して、染料とＦ−アクチンとの特異結合により、細胞膜の界面を画定する。

このＢＨＫ細胞を４群に分ける。第Ｉ群はブランク試料であり、第ＩＩ群は１，０００倍に希釈した血清と混合し、第ＩＩＩ群は５００倍に希釈した血清と混合し、第ＩＶ群は１００倍に希釈した血清と混合する。上述のＳＨＥ溶液からミトコンドリアを抽出し、このミトコンドリアと各群のＢＨＫ細胞とを３７℃で４時間培養する。次に、細胞に入る赤色蛍光を示すミトコンドリアの状況をレーザーコンジュゲーションフォーカシング顕微鏡で観察し、赤色ミトコンドリア含む単一細胞の数を分析する。この結果を下記の表１に示す。表１は、一元配置分散分析試験法により分析したものである。アスタリスクは、ｐ値がブランク群である第１群との統計的に有意な差である０．０５以下であることを示す。

上記の表１の結果によると、血清の存在下では、外因性ミトコンドリアを含む細胞の数、および単一細胞に侵入した外因性ミトコンドリアの数は、血清処理を行っていないものよりも有意に多い。外因性ミトコンドリアまたは細胞の血清による処理が、外因性ミトコンドリアが細胞に侵入する効率を向上させる助けとなることがわかる。

（実施形態５）
＜補体はミトコンドリアが細胞に侵入するのを助ける＞
赤色蛍光タンパク質で標識した外因性ミトコンドリアと既定の濃度のＣ３補体とを１時間混合し、これを遠心分離して上澄みからＣ３補体を取り除き、その後沈殿した外因性ミトコンドリアをＳＨＥ緩衝液で溶解して元の容積に戻す。

第Ｉ群は未処理試料である。第ＩＩ群〜第Ｖ群は、それぞれ０．１μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、および２０μｇ／ｍＬのＣ３補体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）で処理した外因性ミトコンドリア５μｇである。３７℃で４時間共培養した後、各群の細胞における赤色蛍光をレーザーコンジュゲーションフォーカシング顕微鏡で観察し、外因性ミトコンドリアを含む各群の細胞の割合を計算し、次いで定量的統計を行う。外因性ミトコンドリアが細胞に侵入した後の内因性ミトコンドリアと外因性ミトコンドリアとの融合状況を図７Ａ〜図７Ｃに示す。

図７Ａおよび７Ｂを参照されたい。図中の矢印は、細胞中で外因性ミトコンドリアと内因性ミトコンドリアとが重なっていることを示す黄色蛍光を指す。したがって、図７Ａ〜図７Ｃの結果によると、外因性ミトコンドリアが補体で処理されているかどうかにかかわらず、細胞に取り込まれた外因性ミトコンドリアと細胞中の元々のミトコンドリアは細胞中の同じ場所に位置しており、これは、外因性ミトコンドリアと内因性ミトコンドリアとの融合現象があり、外因性ミトコンドリアがファゴリソソームから逃れて細胞質に侵入できるということを示している。

さらに、フローサイトメーターの分析結果によると、Ｃ３補体で処理されていない第Ｉ群では、平均約２６．１６±４．７５％の細胞で赤色蛍光が検出され、第ＩＩ群では、平均約４３．４３±３．５％の細胞で赤色蛍光が検出され、第ＩＩＩ群では、平均約６５．１３±７．５％の細胞で赤色蛍光が検出され、第ＩＶ群では、平均約７８．９７±１３．３５％の細胞で赤色蛍光が検出され、第Ｖ群では、約８０％の細胞で赤色蛍光が検出され、さらに、第ＩＩ群〜第Ｖ群は、第Ｉ群との統計的に有意な差（ｐ＜０．０５）を示している。

上記の結果によると、外因性ミトコンドリアに補体を供給すると、細胞に侵入する外因性ミトコンドリアの割合が有意に増加し、取り込まれた外因性ミトコンドリアは内因性ミトコンドリアと融合することができる。さらに、補体の濃度が増加するにつれ、細胞に侵入する外因性ミトコンドリアの数も増加する。

（実施形態６）
＜分離したミトコンドリアは血清または補体による損傷を受けない＞
分離した外因性ミトコンドリアを４つの群に分け、各群を５μｇとする。第Ｉ群はブランク試料であり、第ＩＩ群は１００倍に希釈したウシ胎仔血清で処理した外因性ミトコンドリアであり、第ＩＩＩ群は濃度１０μｇ／ｍＬのＣ３補体で処理した外因性ミトコンドリアであり、第ＩＶ群は濃度１００ｎＭの細胞透過性ペプチドＰｅｐ−１で処理した外因性ミトコンドリアである。各群を３７℃で４時間培養する。その後、各群のミトコンドリアの外観を透過型電子顕微鏡で観察し、結果を図８Ａ〜図８Ｄに示す。

図８Ａ〜図８Ｄの結果によると、第ＩＩ群および第ＩＩＩ群のミトコンドリアの外観は、第Ｉ群のミトコンドリアの外観と類似している。第Ｉ群と比較して、細胞透過性ペプチドで処理した第ＩＶ群の外因性ミトコンドリアは、膨張し、破裂がある。したがって、細胞透過性ペプチドと比較すると、血清および補体は、低い毒性を示し、外観に損傷を与えず、そのため血清および補体は、ミトコンドリアが細胞に侵入した後、ミトコンドリアの完全性を維持することができる。

（実施形態７）
＜ヒト臍血管内皮細胞を培養する＞
ヒト臍血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ細胞）をＦｏｏｄＩｎｄｕｓｔｒｙＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔＩｎｓｔｉｔｕｔｅ社（台湾、新竹市）から購入する。ＨＵＶＥＣ細胞をＭ１９９培地で培養し、１０％ウシ胎仔血清、０．１％ヘパリン、および０．０３％内皮細胞成長サプリメントを添加する。ＨＵＶＥＣ細胞は、０．１重量％ゼラチンでコーティングしたペトリ皿で培養することができる。

（実施形態８）
＜ミトコンドリアは細胞老化を遅延する＞
まず、ミトコンドリアをヒト線維芽細胞ＨＳ６８から分離し、このミトコンドリアを外因性ミトコンドリアの供給源として使用する。各群は５μｇとする。ミトコンドリアを補体で処理した後、このミトコンドリアを赤色蛍光を示すミトコンドリア追跡用染料（Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ）で染色する。

次いで、初代培養ＨＵＶＥＣ細胞を過酸化水素で処理して老化させる。８世代培養ＨＵＶＥＣ細胞（８×１０^５細胞／ウェル）を、３７℃で２時間１００μＭの過酸化水素で処理し、これをリン酸緩衝液で洗浄して過酸化水素を除去する。この細胞を標準細胞培地で１日培養した後、３つの群に分ける。第Ｉ群はミトコンドリアを加えていないブランク群であり、第ＩＩ群は補体で処理されていないミトコンドリアであり、第ＩＩＩ群は補体で処理されたミトコンドリアである。各群の細胞をそれぞれ４時間培養した後、これらの細胞にそれぞれ細胞老化関連βガラクトシダーゼ（ＳＡ β−ｇａｌ）染色を行い、Ｋｉ６７およびＢｒｄＵ染色分析を行う。

Ｋｉ６７およびＢｒｄＵの染色工程は、本開示の技術分野で一般的な周知の技法であり、当業者に一般的に知られており、したがってこの染色工程はここでは繰り返して説明しない。

ＳＡ β−ｇａｌの染色工程を以下に示す。まず、細胞をリン酸緩衝液で洗浄し、次いで２％パラホルムアルデヒドおよび０．２％グルタルアルデヒドで５分間、細胞の固定を行い、その後３７℃で１２時間この細胞を染料で処理する。この染料は、１５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（ＢＣＩＧまたはＸ−ｇａｌ）、４０ｍＭクエン酸／リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、５ｍＭフェリシアン化カリウム、５ｍＭフェリシアン化ナトリウム、１５０ｍＭＮａＣｌ、および２ｍＭＭｇＣｌ_２を含む。最後に、細胞を０．５％エオシンで染色し、顕微鏡で観察する。

ＳＡ β−ｇａｌ染色後の結果を図９Ａ〜図９Ｄに示す。図９Ａに示すように、外因性ミトコンドリアはＨＵＶＥＣ細胞に侵入することができる。図９Ｂ〜図９Ｄに示すように、第Ｉ群のＨＵＶＥＣ細胞は、明らかにＳＡ β−ｇａｌで染色されている。第ＩＩ群のＨＵＶＥＣ細胞はＳＡ β−ｇａｌで染色されているが、第Ｉ群と比較すると、第ＩＩ群の染色されたＨＵＶＥＣ細胞の数は、有意に減少している。第Ｉ群および第ＩＩ群と比較すると、第ＩＩＩ群のＨＵＶＥＣ細胞は、ＳＡ β−ｇａｌでほとんど染色されていない。染色結果の統計的分析をさらに実施すると、第Ｉ群では約８５±１２．３％の細胞が染色され、第ＩＩ群では約６０．１±６．８％の細胞が染色され、第ＩＩＩ群では約２５±６．２％の細胞が染色されていることが示される。

さらに、Ｋｉ６７およびＢｒｄＵの染色結果の計数を実施すると、Ｋｉ６７およびＢｒｄＵで染色された第Ｉ群のＨＵＶＥＣ細胞の割合は、それぞれ１３．３％および１３％となる。第Ｉ群と比較すると、Ｋｉ６７およびＢｒｄＵで染色された第ＩＩ群のＨＵＶＥＣ細胞の割合は、それぞれ３５％および３３％に増加する。Ｋｉ６７およびＢｒｄＵで染色された第ＩＩＩ群のＨＵＶＥＣ細胞の割合は最も高く、それぞれ７１％および５９．６％である。さらに、添加するミトコンドリアをウシ胎仔血清で処理すると、補体で処理したときと同様の効果が得られる。

上記の結果によると、細胞に侵入する外因性ミトコンドリアは、細胞老化の程度を軽減し、細胞の成長を改善し、細胞複製の効率を改善することができる。さらに、細胞に侵入する外因性ミトコンドリアの数の増加に伴い、細胞老化の程度は有意に低下し、細胞分裂の段階の細胞の数が増加し、それによって細胞の複製および成長が改善される。したがって、本開示において開示される外因性ミトコンドリアを含む医薬組成物を個人に投与することは、細胞老化の程度を軽減または遅延することができ、またこの医薬組成物が、血清、血漿、または補体のようなミトコンドリアが細胞に侵入するのを助ける組成物をさらに含むと、その効果は有意に改善する。

（実施形態９）
＜動物実験（１）＞
赤色蛍光を有するミトコンドリアをＲｅｄＭ−ＢＨＫ細胞から分離し、１００倍に希釈したウシ胎仔血清または１０μｇ／ｍＬのＣ３補体で処理する。４８週齢の自然老化ヌードマウスを用意し、このヌードマウスの皮下組織にミトコンドリアを注入する。１時間後、このヌードマウスの全皮膚を採取し、次いで４％パラホルムアルデヒドで５分間固定し、その後この試料を０．１Ｍリン酸緩衝液に試料が沈むまで入れておいてから、この試料を最適切断温度コンパウンド（ＯＣＴ）で浸漬および包理して凍結切断するが、この切片の厚さは１２μｍとする。切片をコンジュゲーションフォーカシング顕微鏡で観察し、結果を図１０に示す。

図１０は、ミトコンドリア移植後のヌードマウスの真皮部分を示している。青色蛍光は、ＤＡＰＩで染色した線維芽細胞の細胞核を示し、赤色蛍光は、ＲｅｄＭ−ＢＨＫ細胞から分離したミトコンドリアを示す。図１０に示すように、ミトコンドリアは、移植後に真皮の線維芽細胞に侵入することができる。

（実施形態１０）
＜ミトコンドリアを肝細胞から分離する＞
まず、マウスを深麻酔下で致死させ、肝臓の血液が除去されるまで、マウスに生理食塩水でかん流を行う。１ｃｍ^３の肝組織を採取し、約６ｍｌのＳＨＥ緩衝液を加えて、組織粉砕装置で粉砕してから、これを１０００ｘｇで１５分間遠心分離して上澄みを得る。さらに、同時に、濃度が５５％、４０％、および３０％のショ糖溶液を遠心管に加えて、３０％以上５５％以下のショ糖勾配遠心管を得る。遠心分離工程で得た上澄みをこの勾配遠心管の最上層に加えてから、これを３５０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して、４０％層と５５％層との界面に白色層を形成する。約１ｍｌの白色層を回収して１５ｍｌ遠心管に加え、５ｍｌのＳＨＥ緩衝液を加えて、これを１３０００ｘｇで３分間遠心分離してから、上澄みを取り除き、その後３分間の遠心分離工程を繰り返す。最後に、ミトコンドリア沈殿物を２００μＬのＳＨＥ緩衝液に溶解した後、そこにプロテアーゼ阻害剤を加え、これを４℃で保管する。

（実施形態１１）
＜動物実験（２）＞
４８週齢の自然老化ヌードマウス３２匹を用意して４群に分ける。各群はマウス８匹であり、異なる条件で１２週間処置する。第Ｉ群は、未処置群であり、第ＩＩ群では、肝細胞ミトコンドリア１０００μｇが週１回各マウスに注入され、第ＩＩＩ群では、補体で処理した肝細胞ミトコンドリア１０００μｇが週１回各マウスに注入され、第ＩＶ群では、血清で処理した肝細胞ミトコンドリア１０００μｇが週１回各マウスに注入される。第ＩＩ群〜第ＩＶ群のマウスでの皮下注射法は、５０００μｇ／ｍＬの肝細胞ミトコンドリアを各マウスの背中の２０個所に注入するように均等に分割し、各個所の注入用量は０．０１ｍｌとし、合計注入用量は０．２ｍｌとする。補体または血清のみによって生じたしわへの効果を除外するために、補体または血清で処理したミトコンドリアを注入する前に、実験中２回の高速遠心分離によって上澄みに残った補体および血清を除去する。

この実験後、実施形態９に示す工程と同様に、各群の各ヌードマウスの全皮膚を撮影し、切片を凍結し、染色する。皮膚の撮影結果を図１１Ａ〜図１１Ｄに示す。各群のヌードマウスの表皮のしわの粗さを分析し、結果を図１２に示すが、図中の＊印は、第Ｉ群との有意な差を示す。さらに、真皮コラーゲン層の中身を示すために、各群のヌードマウスの皮膚組織にマッソン三色染色を行い、結果を図１３Ａ〜図１３Ｄに示す。

図１２に示す結果のとおり、外因性ミトコンドリアを注入した第ＩＩ群〜第ＩＶ群で観察されるしわは、未処置の第Ｉ群よりも低値であり、第ＩＩＩ群および第ＩＶ群のヌードマウスの皮膚のしわは、第ＩＩ群のものよりも薄い。さらに、図１３Ａ〜図１３Ｄに示す結果のとおり、第Ｉ群が最も厚い表皮を有し、第ＩＩ群〜第ＩＶ群の表皮の厚さは、第Ｉ群のものよりも薄く、コラーゲン層の染色は第Ｉ群のものよりも濃い。

図１１Ａ〜図１３Ｄに示す結果によると、投与された本開示において開示される外因性ミトコンドリアは、生体の細胞に侵入することができ、しわの発生を効果的に軽減し、表皮線維芽細胞のコラーゲン生成能力を改善する。さらに、血清および補体が外因性ミトコンドリアの細胞への侵入を助けることから、血清または補体で処理した外因性ミトコンドリアは、より優れた抗老化力を有する。したがって、本開示において開示される外因性ミトコンドリアを含む医薬組成物は、皮膚老化を遅延または軽減する効果を得ることができる。

上記の実施形態によると、本開示において開示される外因性ミトコンドリアおよび有効成分としてこの外因性ミトコンドリアを含む医薬組成物は、以下の利点を有する。
第１に、外因性ミトコンドリアを使用することで、従来技術における同種細胞移植により誘発される拒絶反応を克服することができる。
第２に、外因性ミトコンドリアは、幅広い供給源であり、またヒトの健康に対して有害でない正常細胞株または生体から得ることができる。例えば、既知の細胞移植技法は、がんまたは腫瘍の発生につながることがある。
第３に、外因性ミトコンドリアは、細胞に直接侵入して、内因性ミトコンドリアと融合し、それによって老化した細胞または損傷した細胞中の損傷したミトコンドリアの代わりとなることができ、細胞の酸化的ストレスを軽減する効果、細胞の正常な機能を回復する効果、および細胞の長期的かつ直接的な保護を提供する効果を得ることができる。
第４に、外因性ミトコンドリアは、血清または補体での処理後、完全に細胞に侵入することができ、細胞透過性ペプチドまたはリポソームでの処理により誘発される細胞毒性効果を回避することができる。
第５に、外因性ミトコンドリアは、しわおよび皮膚老化現象を根本的に軽減し、コラーゲン合成の増加を効果的に誘発することができる。

上記は、実施形態による本開示の例示にすぎず、本開示の趣旨の範囲内における、当業者による本明細書の実施形態のいかなる変更または修正も本開示の特許請求の範囲に含まれるものとする。

参考文献
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Claims

Ｃ３補体により処理された外因性ミトコンドリアと、
少なくとも１つの薬学的または化粧品的に許容される担体と、
を含む組成物。
前記外因性ミトコンドリアの濃度は５０００μｇ／ｍＬである
請求項１に記載の組成物。
前記外因性ミトコンドリアは細胞から抽出される、請求項１に記載の組成物。
前記外因性ミトコンドリアが遠心精製法により細胞から得られる、請求項１に記載の組成物。
皮膚細胞の老化を軽減または防止をするための処理に対する医薬の製造のための請求項１に記載の組成物の使用。
損傷したミトコンドリアを含む細胞を修復するための処理に対する医薬の製造のための請求項１に記載の組成物の使用。
細胞を修復するための処理に対する医薬の製造のための組成物の使用であって、
前記組成物は、Ｃ３補体により処理された外因性ミトコンドリアと、
少なくとも１つの薬学的または化粧品的に許容される担体と、
を含み、
前記外因性ミトコンドリアが細胞に侵入し、老化したミトコンドリアまたは損傷したミトコンドリアの代わりとなる、
組成物の使用。
前記外因性ミトコンドリアが０．１μｇ／ｍＬ〜２０μｇ／ｍＬの濃度でＣ３補体により処理される、請求項７に記載の組成物の使用。
前記外因性ミトコンドリアが０．１μｇ／ｍＬ〜２０μｇ／ｍＬの濃度でＣ３補体により処理される、請求項１に記載の組成物。