JP7325170B2 - 美容組成物及びミトコンドリアトランスファー促進剤 - Google Patents
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Description
[1]ミトコンドリアトランスファー促進剤を含有する美容組成物。
[2]ミトコンドリアトランスファー促進剤が、キハダエキス、オウレンエキス、プルーンエキス、ウコンエキス、メリアアザジラクタエキス、ハマメリスエキス、トウガラシエキス、アルテアエキス、トウキンセンカエキス、セイヨウトチノキエキス、ショウガエキス、センチフォリアバラエキス、ブクリョウエキス、ユーカリエキス、ユズエキス、ハトムギエキス、ラベンダーエキス、リンゴエキス、レモンエキス、オウゴンエキス、アロエエキス、カッコンエキス、サイシンエキス、ジオウエキス、シソエキス、サクラエキス、カミツレエキス、アセンヤクエキス、アルニカエキス、クララエキス、ブッチャーブルームエキス、ヘチマエキス、ヤグルマギクエキス、ルイボスエキス、モモエキス、アシタバエキス、セイヨウイラクサエキス、ウイキョウエキス、ゼニアオイエキス、オノニスエキス、オリーブエキス、アンズエキス、ウンシュウミカンエキス、フキタンポポエキス、ウメエキス、アマチャヅルエキス、緑藻エキス、紅藻エキス、褐藻エキス、シイタケエキス、フユムシナツクサタケエキス、レイシエキス、水溶性コラーゲン、及びローヤルゼリーエキスからなる群より選択される少なくとも1種の水溶性有効成分(A)を含む、[1]に記載の美容組成物。
[3]水溶性有効成分(A)が、キハダ樹皮エキス、オウレン根エキス、プルーン分解物、ウコン根茎エキス、メリアアザジラクタ葉エキス、ハマメリス葉エキス、トウガラシ果実エキス、アルテア根エキス、トウキンセンカ花エキス、セイヨウトチノキ種子エキス、ショウガ根茎エキス、センチフォリアバラ花エキス、ブクリョウエキス、ユーカリ葉エキス、ユズ果実エキス、ハトムギ種子エキス、ラベンダー花エキス、リンゴ果実エキス、レモン果実エキス、オウゴンエキス、アロエエキス、カッコンエキス、サイシンエキス、サクラ葉抽出液、カミツレ花エキス、アセンヤクエキス、アルニカ花エキス、クララ根エキス、ブッチャーブルーム根エキス、ヘチマエキス、ヤグルマギク花エキス、ルイボスエキス、モモ葉エキス、アシタバ葉/茎エキス、セイヨウイラクサ葉エキス、ウイキョウ果実エキス、ゼニアオイ花エキス、オノニスエキス、オリーブ葉エキス、アンズ種子エキス、ジオウ根エキス、シソ葉エキス、ウンシュウミカン果皮エキス、フキタンポポ花エキス、ウメ果実エキス、アマチャヅルエキス、クロレラエキス、ヒジキエキス、ワカメエキス、シイタケエキス、フユムシナツクサタケエキス、レイシ柄エキス、及び水溶性コラーゲンからなる群より選択される少なくとも1種の成分である、[2]に記載の美容組成物。
[4]水溶性有効成分(A)が、キハダ樹皮エキス、オウレン根エキス、プルーン分解物、ウコン根茎エキス、メリアアザジラクタ葉エキス、ハマメリス葉エキス、トウガラシ果実エキス、アルテア根エキス、トウキンセンカ花エキス、及びセイヨウトチノキ種子エキスからなる群より選択される少なくとも一種の植物エキスである、[3]に記載の美容組成物。
[5]ミトコンドリアトランスファーを促進するために用いられる、[1]から[4]のいずれかに記載の美容組成物。
[6]皮膚組織においてミトコンドリアトランスファーを促進するために用いられる、[1]から[5]のいずれかに記載の美容組成物。
[7]皮膚線維芽細胞、表皮角化細胞、脂肪由来間葉系幹細胞、表皮幹細胞及び真皮幹細胞からなる群より選択される1種又は2種の細胞間におけるミトコンドリアトランスファーを促進させるために用いられる、[1]から[6]のいずれかに記載の美容組成物。
[8]皮膚外用組成物として用いられる、[1]から[7]のいずれかに記載の美容組成物。
[9]経口用組成物として用いられる、[1]から[7]のいずれかに記載の美容組成物。
[10]キハダエキス、オウレンエキス、プルーンエキス、ウコンエキス、メリアアザジラクタエキス、ハマメリスエキス、トウガラシエキス、アルテアエキス、トウキンセンカエキス、セイヨウトチノキエキス、ショウガエキス、センチフォリアバラエキス、ブクリョウエキス、ユーカリエキス、ユズエキス、ハトムギエキス、ラベンダーエキス、リンゴエキス、レモンエキス、オウゴンエキス、アロエエキス、カッコンエキス、サイシンエキス、ジオウエキス、シソエキス、サクラエキス、カミツレエキス、アセンヤクエキス、アルニカエキス、クララエキス、ブッチャーブルームエキス、ヘチマエキス、ヤグルマギクエキス、ルイボスエキス、モモエキス、アシタバエキス、セイヨウイラクサエキス、ウイキョウエキス、ゼニアオイエキス、オノニスエキス、オリーブエキス、アンズエキス、ウンシュウミカンエキス、フキタンポポエキス、ウメエキス、アマチャヅルエキス、緑藻エキス、紅藻エキス、褐藻エキス、シイタケエキス、フユムシナツクサタケエキス、レイシエキス、水溶性コラーゲン、及びローヤルゼリーエキスからなる群より選択される少なくとも1種の水溶性有効成分(A)を含む、美容組成物用のミトコンドリアトランスファー促進剤。
[11]脂肪由来幹細胞の遊走付与成分をさらに含む、[1]から[9]のいずれかに記載の美容組成物。
[12]コラーゲン産生機能成分をさらに含む、[1]から[9]のいずれかに記載の美容組成物。
[13]コラーゲン産生の促進、肌のハリの回復、ハリの源の再生、細胞再生の促進、肌老化症状の回復・改善のために用いられる、[1]から[9]、[11]、[12]のいずれかに記載の美容組成物。
本発明の美容組成物は、ミトコンドリアトランスファー促進剤を含む。なお、「ミトコンドリアトランスファー」とは、ある細胞から別の細胞へとミトコンドリアが移行する現象を言う。ここで、ミトコンドリアが移行する細胞の種類は、同種の細胞間でもよいし、異種の細胞間でもよい。この移行は、例えば、細胞と細胞とをつなぐトンネリングナノチューブと呼ばれるトンネルの中を通って行われてもよいが、移行経路は特に限定されず、エキソサイトーシス及びエンドサイトーシスを介した経路等でもよい。また、トランスファーされるミトコンドリアとしては、ミトコンドリア自体の他、ミトコンドリアが含むミトコンドリア遺伝子(DNA、RNA)、及び各種タンパク、並びにこれらと他のタンパクや小胞体等の他の器官との複合体を含んでいてもよい。また、「ミトコンドリアトランスファー促進剤」とは、細胞間で起こるミトコンドリアトランスファーを促進する効果を奏する剤のことをいう。ここで、ミトコンドリアトランスファーを促進する効果とは、ミトコンドリアを供給する細胞の供給能力を高めること、ミトコンドリアを受容する側の受容する能力を高めることのいずれの意味も含む。本発明の美容組成物は、外見を美しくする(例えば美肌等の美容)を目的として用いられる組成物のことをいう。本発明の美容組成物は、必須成分であるミトコンドリアトランスファー促進剤に加えて、本発明の効果を損なわない範囲でその他の成分を含んでいてもよい。
本発明のミトコンドリアトランスファー促進剤は、以下の水溶性有効成分(A)を含む。水溶性有効成分(A)は、細胞間のミトコンドリアトランスファーを効果的に促進し、ミトコンドリアの機能障害や質の低下が起こっている細胞に、健常な細胞から正常なミトコンドリアを補給することができ、それらの細胞の好気性呼吸を助けることができる。従って、生体内でミトコンドリアの機能障害や質の低下が起きている細胞が存在することにより引き起こされる症状又は状態の予防・改善、健康状態の維持、肌のハリ改善といった若返り等のために好適に使用することができる。そのため、本発明のミトコンドリアトランスファー促進剤は、美容組成物に好適に用いられる。
キハダ、オウレン、プルーン(セイヨウスモモともいう)、ウコン、メリアアザジラクタ(ニームともいう)、ハマメリス、トウガラシ、アルテア、トウキンセンカ、セイヨウトチノキ、ショウガ、センチフォリアバラ、ブクリョウ、ユーカリ、ユズ、ハトムギ、ラベンダー、リンゴ、レモン、オウゴン、アロエ、カッコン、サイシン、ジオウ、シソ、サクラ、カミツレ、アセンヤク、アルニカ、クララ、ブッチャーブルーム、ヘチマ、ヤグルマギク、ルイボス、モモ、ダイズ、アシタバ、セイヨウイラクサ、ウイキョウ、ゼニアオイ、オノニス、オリーブ、アンズ、ウンシュウミカン、フキタンポポ、ウメ、アマチャヅル、等の植物エキス;
緑藻(例えば、クロレラ等)、紅藻、褐藻(例えば、ヒジキ、ワカメ等)等の藻類(海藻類、淡水藻類を含む)エキス;
シイタケ、フユムシナツクサタケ、レイシ(マンネンタケともいう)等の菌類エキス;
水溶性コラーゲン、ローヤルゼリーエキス等の各種エキス由来物。
本発明のミトコンドリアトランスファー促進剤は、これらの水溶性有効成分(A)を1種単独で含んでいてもよいし、2種以上を組合せて含んでいてもよい。
緑藻エキス(クロレラエキス)、紅藻エキス、褐藻エキス(ヒジキエキス、ワカメエキス)等の海藻類又は淡水藻類の藻類エキス;
シイタケエキス、フユムシナツクサタケエキス、レイシ柄エキス等の菌類エキス;
水溶性コラーゲン等が挙げられる。
本発明の美容組成物は、化粧料、洗浄料、医薬品、医薬部外品、入浴剤等の皮膚外用組成物として用いられる。具体的には、例えば化粧水、乳液、ジェル、クリーム、美容液、パック、マスク、ハンドクリーム、ボディローション、ボディークリーム等の基礎化粧料;日焼け止め用化粧料;メイクアップ化粧料;洗顔料、メイク落とし、ボディーシャンプー、シャンプー、リンス、トリートメント等の洗浄料;育毛剤、発毛剤等の頭皮用組成物;歯磨き粉等の口腔用組成物;創傷用軟膏、ニキビ用外用剤、湿布剤等の医薬品・医薬部外品等が挙げられる。本発明の美容組成物を皮膚外用組成物として使用する場合、上記ミトコンドリアトランスファー促進剤以外のその他の成分としては、本発明の効果を損なわない範囲で、例えば、基剤・担体、添加剤(界面活性剤、増粘剤、保存剤、pH調整剤、キレート剤、安定化剤、刺激軽減剤、防腐剤、着色剤、分散剤、香料、及びパール光沢付与剤等)等を含むことができる。
本発明の美容組成物は、機能性表示食品、保健機能食品(特定保健用食品(疾病リスク低減表示、規格基準型を含む)、条件付き特定保健用食品、又は栄養機能食品を含む)、健康食品、栄養補助食品(バランス栄養食、サプリメント等を含む)等の経口用組成物とすることができる。
息香酸ブチル、パラオキシ安息香酸イソブチル、パラオキシ安息香酸イソプロピル、及びパラオキシ安息香酸エチル等が挙げられる。
本発明のミトコンドリアトランスファー促進剤又は美容組成物のミトコンドリアトランスファー促進効果を評価する方法として、例えば、以下に説明する方法が挙げられる。即ち、複数の細胞を共培養した場合に、受容側の細胞全体のうちミトコンドリアのトランスファーを受けた細胞の割合(%)を確認し、ミトコンドリアトランスファー率(%)を算定し、その数値の増加の程度によって、ミトコンドリアトランスファー促進効果を評価する方法が挙げられる。
ミトコンドリアの供給側となる細胞をミトコンドリア染色試薬で染色し、ミトコンドリアの受容側となる細胞を細胞質染色試薬で染色する。これらの試薬による細胞の染色は、例えば、室温~37℃で所定の時間インキュベートすることにより行われる。ミトコンドリア染色試薬としては、CytoPainter Cell Tracking Staining Kit-Green Fluorescence(abcam社製)、MitoTracker Mitochondrion-Selective Probes Green FM(Molecular Probes社製)等を用いることができる。また、細胞質染色試薬としては、例えば、CellTrace(商標) Far Red Cell Proliferation Kit(invitrogen社製)、CellTrace Violet Cell Proliferation Kit, for flow cytometry(Life tech.社製)、CellTrace Red Cell Proliferation Kit,for flow cytometry(Life tech.社製)等を用いることができる。染色後、細胞をHBSS(+)又はHBSS(-)等で洗浄し、トリプシン等の酵素、EDTA等にて細胞を剥離して、HBSS(+)又はHBSS(-)等で洗浄後、両方の細胞を同じプレート(96well plate等)に播種する。両方の細胞を共培養し、評価したいサンプルを添加し、4時間~24時間程度培養を行う。その後、核染色試薬を添加して所定時間、室温~37℃でインキュベートし、ImageXpress等のイメージングシステムで画像撮影する。上記核染色試薬としては、例えばDAPI、DRAQ5(biostatus社製)、Hoechst33342(DOJINDO社製)等を使用することができる。細胞カウントプログラム等を用いて解析し、ミトコンドリアトランスファー率を計算することができる。
(1)Cy5フィルター又はDAPIフィルター等の核染色を認識するフィルターで観察し、核を認識、計測させる(=細胞数の測定)。
(2)Cy5フィルター又はDAPIフィルター等の受容側細胞染色を認識するフィルターで観察し、ミトコンドリアを受け取る側の細胞(受容側)である細胞質を認識、計測させる(Red染色又はViolet染色された細胞=受容側)。
(3)GFPフィルター又はFITCフィルター等のミトコンドリア染色を認識するフィルターで観察し、ミトコンドリアを持つ細胞(供給側)を認識、計測させる(Green染色又はMitoTracker染色された細胞=供給側)。
(4)下記計算式により、ミトコンドリアトランスファー率(%)を算出することができる。
また、(1)の細胞数を計測することで薬剤の細胞毒性を評価することができる。
計算式:((2)かつ(3)の細胞数/(2)の細胞数)×100
本工程においては、工程1で得られた、細胞のミトコンドリアトランスファー率(%)を、サンプル無添加のコントロール実験において算出されたミトコンドリアトランスファー率(%)と比較する。多くの場合には、得られた細胞のミトコンドリアトランスファー率が基準と決めたコントロールのミトコンドリアトランスファー率より高い場合に、そのサンプルはミトコンドリアトランスファー促進効果があると判断される。逆に、工程1で得られた細胞のミトコンドリアトランスファー率がコントロールのミトコンドリアトランスファー率よりも低い場合、そのサンプルはミトコンドリアトランスファー抑制効果があると判断される。
NHDF(ヒト皮膚線維芽細胞)間のミトコンドリアトランスファーに対する各エキスの効果を以下の方法により検討した。
冷凍保存のNHDF(ヒト皮膚繊維芽細胞)をT75フラスコに起眠し、1日培養した後、HBSS(+)で3回洗浄した。ミトコンドリア供給側の細胞にはミトコンドリア染色試薬を添加して30分間、受容側の細胞には細胞質染色試薬を添加して1時間、37℃インキュベータ内で染色後、DMEM(10%FBS、1%AB)培地に置換した。翌日、HBSS(+)で3回洗浄後、トリプシン/EDTAで細胞を剥がし、供給側、受容側ともに2,000cells/wellになるよう96wellプレートに播種し、一晩37℃インキュベータで共培養した。その際、各エキスを終濃度1/1,000で添加した。翌日、核染色試薬をPBS(-)に希釈し、well内培地と置換した。15分間室温で染色した後、ImageXpressで画像撮影した(16視野/well)。各画像について、細胞カウントプログラムで解析し、ミトコンドリアトランスファー率を計算した。各エキスを添加していないコントロール(100%)と比較してミトコンドリアトランスファー率を上昇させる効果があったエキスについての結果を表1に示した。
(1)DAPIフィルター等の核染色を認識するフィルターで観察し、核を認識、計測させる(=細胞数の測定)。
(2)Cy5フィルター等の受容側細胞染色を認識するフィルターで観察し、ミトコンドリアを受け取る側の細胞(受容側)である細胞質を認識、計測させる(Red染色された細胞=受容側)。
(3)FITCフィルター等のミトコンドリア染色を認識するフィルターで観察し、ミトコンドリアを持つ細胞(供給側)を認識、計測させる(Green染色された細胞=供給側)。
(4)下記計算式により、ミトコンドリアトランスファー率(%)を算出することができる。
また、(1)の細胞数を計測することで薬剤の細胞毒性を評価することができる。
計算式:((2)かつ(3)の細胞数/(2)の細胞数)×100
上記試験でミトコンドリアトランスファー率を特に再現性高く示した数種類のエキスを選び、これらのエキスが供給側の細胞と受容側の細胞のどちらに作用するのかについて、更なる評価を行った。
冷凍保存のNHDF(ヒト皮膚繊維芽細胞)を起眠し、6wellプレートに播種(3x104cells/well)し4日間培養した。HBSS(+)で3回洗浄した後、ミトコンドリア供給側の細胞にミトコンドリア染色試薬を添加して30分間、受容側の細胞に細胞質染色試薬を添加して1時間、37℃インキュベータ内で染色後、DMEM(10%FBS,1%AB)培地に置換した。次いで、供給側又は受容側となる細胞にウコン根茎エキス、キハダ樹皮エキス、メリアアザジラクタ葉エキスを終濃度1/1000で添加し、一晩37℃インキュベータで培養した。なお、甘草エキスの主成分であるグリチルリチン酸ジカリウム、キハダ樹皮エキスの主成分であるベルベリンの硫酸塩についても同様に試験を行った。翌日、HBSS(+)で3回洗浄後、トリプシン/EDTAで細胞を剥がし、供給側、受容側ともに2,000cells/wellになるよう96wellプレートに播種し、処理なしの細胞(2,000cells/well)と共培養した。一晩37℃インキュベータで培養した。その翌日、核染色試薬をPBS(-)に希釈し、well内培地と置換した。15分間室温で染色した後、ImageXpressで画像撮影した(16視野/well)。細胞カウントプログラムで解析し、ミトコンドリアトランスファー率を計算した。カウントプログラムは上記と同様である。各エキスを添加していないコントロール(100%)と比較してミトコンドリアトランスファー率を上昇させる効果があったエキスの前処理についての結果を表2に示した。
細胞:NHDFヒト皮膚線維芽細胞:Human Dermal Fibroblast(KURABO社製 KF-4009)
培地:DMEM(Gibco社製 11995065)+10%FBS+1%AB* 細胞培養時、共培養時
*AB:Antibiotic-Antimycotic(Gibco社製)
薬剤:トリプシン/EDTA(KURABO社製)HK-3120
ミトコンドリア染色試薬:Mito Tracker(登録商標) Green FM(MolecularProbes社製 M7514)1/7,000希釈in HBSS(+)(最終70nM)
細胞質染色試薬:CellTrace(商標) Far Red Cell Proliferation Kit(Invitrogen(商標) C34564)1/1,000希釈in HBSS(+)(最終5uM)
核染色試薬:Hoechst 33342 (DOJINDO社製 346-07951)1/1,000希釈
NHEK(ヒト表皮角化細胞)間のミトコンドリアトランスファーに対する各エキスの効果を以下の方法により検討した。
冷凍保存のNHEK(ヒト表皮角化細胞)をT75フラスコに起眠し、4日間培養した。HBSS(-)で3回洗浄した後、ミトコンドリア供給側の細胞にミトコンドリア染色試薬を添加して30分間、受容側の細胞に細胞質染色試薬を添加して1時間、37℃インキュベータ内で染色後、Humedia KG2培地に置換した。翌日、HBSS(-)で3回洗浄後、トリプシン/EDTAで細胞を剥がし、供給側、受容側ともに2,000cells/wellになるよう96wellプレートに播種し、共培養した。その時、エキスを終濃度1/1,000で添加し、一晩37℃インキュベータで培養した。その翌日、核染色試薬をPBS(-)に希釈し、well内培地と置換した。15分間室温で染色した後、ImageXpressで画像撮影した(16視野/well)。各画像について、細胞カウントプログラムで解析し、ミトコンドリアトランスファー率を計算した。細胞カウントプログラムは上記と同様である。各エキスを添加していないコントロール(100%)と比較してミトコンドリアトランスファー率を上昇させる効果があったエキスについての結果を表3に示した。
上記試験でミトコンドリアトランスファー率を特に再現性高く示した数種類のエキスを選び、これらのエキスが供給側の細胞と受容側の細胞のどちらに作用するのかについて、更なる評価を行った。
冷凍保存のNHEK(ヒト表皮角化細胞)を起眠し、12wellプレートに播種(2x104cells/well)し5日間培養した。HBSS(-)で3回洗浄した後、ミトコンドリア供給側の細胞にミトコンドリア染色試薬を添加して30分間、受容側の細胞に細胞質染色試薬を添加して1時間、37℃インキュベータ内で染色後、Humedia KG2培地に置換した。次いで、供給側又は受容側となる細胞にアルテア根エキス、キハダ樹皮エキスを終濃度1/1,000で添加し添加し、一晩37℃インキュベータで培養した。なお、キハダ樹皮エキスの主成分であるベルベリンの硫酸塩、ウコン根茎エキスの主成分であるクルクミンについても同様に試験を行った。翌日、HBSS(-)で3回洗浄後、トリプシン/EDTAで細胞を剥がし、供給側、受容側ともに2,000cells/wellになるよう96wellプレートに播種し、処理なしの細胞(2,000cells/well)と共培養した。一晩37℃インキュベータで培養した。その翌日、核染色試薬をPBS(-)に希釈し、well内培地と置換した。15分間室温で染色した後、ImageXpressで画像撮影した(16視野/well)。細胞カウントプログラムで解析し、ミトコンドリアトランスファー率を計算した。カウントプログラムは上記と同様である。各エキスを添加していないコントロール(100%)と比較してミトコンドリアトランスファー率を上昇させる効果があったエキスの前処理についての結果を表4に示した。
細胞:NHEK(ヒト表皮角化細胞)KK-4009(KURABO社製)
培地:Humedia-KG2培地 KK-2150S(KURABO社製)細胞培養時、共培養時
薬剤:トリプシン/EDTA(KURABO社製)HK-3120
ミトコンドリア染色試薬:Mito Tracker(登録商標)Green FM(molecularprobesM7514)1/7,000希釈in HBSS(-)(最終70nM)
細胞質染色試薬:CellTrace(商標) Far Red Cell Proliferation Kit(Invitrogen(商標) C34564)1/1,000希釈in HBSS(-)(最終5uM)
核染色試薬:Hoechst 33342 (DOJINDO社製 346-07951)1/1,000希釈
AD-MSC(脂肪由来間葉系幹細胞)とNHDF(ヒト皮膚線維芽細胞)間のミトコンドリアトランスファーに対する各エキスの効果を以下の方法により検討した。
冷凍保存のAD-MSC(脂肪由来間葉系幹細胞)及びNHDF(ヒト皮膚線維芽細胞)をT75フラスコに起眠し、5日間培養した。HBSS(+)で3回洗浄した後、ミトコンドリア供給側の細胞にミトコンドリア染色試薬を添加して30分間、受容側の細胞に細胞質染色試薬を添加して1時間、37℃インキュベータ内で染色後、AD-MSCはStem life培地に、NHDFはDMEM(10%FBS、1%AB)培地に置換した。翌日、HBSS(+)で3回洗浄後、トリプシン/EDTAで細胞を剥がし、供給側、受容側ともに2,000cells/wellになるよう96wellプレートに播種し、共培養した。その時、エキスを終濃度1/1,000で添加し、一晩37℃インキュベータで培養した。その翌日、核染色試薬をPBS(-)に希釈し、well内培地と置換した。15分間室温で染色した後、ImageXpressで画像撮影した(16視野/well)。各画像について、細胞カウントプログラムで解析し、ミトコンドリアトランスファー率を計算した。細胞カウントプログラムは上記と同様である。
上記試験でミトコンドリアトランスファー率を特に再現性高く示した数種類のエキスを選び、これらのエキスが供給側の細胞と受容側の細胞のどちらに作用するのかについて、更なる評価を行った。
冷凍保存のAD-MSC(脂肪由来間葉系幹細胞)を12wellプレートに播種(3.6x104cells/well)し、NHDF(ヒト皮膚線維芽細胞)を起眠し、12wellプレートに播種(8.5x104cells/well)し、4日間培養した。HBSS(+)で3回洗浄した後、ミトコンドリア供給側の細胞にミトコンドリア染色試薬を添加して30分間、受容側の細胞に細胞質染色試薬を添加して1時間、37℃インキュベータ内で染色後、AD-MSCはStem life培地に、NHDFはDMEM(10%FBS、1%AB)培地に置換した。次いで、供給側又は受容側となる細胞に、キハダ樹皮エキス、プルーン分解物を終濃度1/1,000で添加し添加し、一晩37℃インキュベータで培養した。ウコン根茎エキスの主成分であるクルクミンについても同様に試験を行った。翌日、HBSS(+)で3回洗浄後、トリプシン/EDTAで細胞を剥がし、供給側、受容側ともに2,000cells/wellになるよう96wellプレートに播種し、処理なしの細胞(2,000cells/well)と共培養した。一晩37℃インキュベータで培養した。その翌日、核染色試薬をPBS(-)に希釈し、well内培地と置換した。15分間室温で染色した後、ImageXpressで画像撮影した(16視野/well)。細胞カウントプログラムで解析し、ミトコンドリアトランスファー率を計算した。カウントプログラムは上記と同様である。
細胞:AD-MSC(脂肪由来間葉系幹細胞) Adipose derived stem cell(Life Line KW-4109)
NHDFヒト皮膚線維芽細胞:Human Dermal Fibroblast(KURABO社製 KF-4009)
培地:
(1)Stem life MSC Comp Kit(Life Line LL-0034) (AD培養時)
(2)DMEM(Gibco社製 11995065)+10%FBS+1%AB* (NHDF細胞培養時、共培養時)
*AB:Antibiotic-Antimycotic(Gibco社製)
薬剤:トリプシン/EDTA(KURABO社製)HK-3120
ミトコンドリア染色試薬:Mito Tracker(登録商標)Green FM(molecularprobesM7514)1/7,000希釈in HBSS(+)(最終70nM)
細胞質染色試薬:CellTrace(商標) Far Red Cell Proliferation Kit(Invitrogen(商標) C34564)1/1,000希釈in HBSS(+)(最終5uM)
核染色試薬:Hoechst 33342 (DOJINDO社製 346-07951)1/1,000希釈
NHDF(ヒト皮膚線維芽細胞)とNHEK(ヒト表皮角化細胞)間のミトコンドリアトランスファーに対する各エキスの効果を以下の方法により検討した。
冷凍保存のNHDF(ヒト皮膚線維芽細胞)とNHEK(ヒト表皮角化細胞)をT75フラスコに起眠し、5日間培養した。NHDFはHBSS(+)で、NHEKはHBSS(-)で3回洗浄した後、ミトコンドリア供給側の細胞にミトコンドリア染色試薬を添加して30分間、受容側の細胞に細胞質染色試薬を添加して1時間、37℃インキュベータ内で染色後、NHDFはDMEM(10%FBS、1%AB)培地に、NHEKはHumedia KG2培地に置換した。翌日、NHDFはHBSS(+)で、NHEKはHBSS(-)で3回洗浄後、トリプシン/EDTAで細胞を剥がし、供給側、受容側ともに2,000cells/wellになるよう96wellプレートに播種し、共培養した。その時、エキスを終濃度1/1,000で添加し、一晩37℃インキュベータで培養した。その翌日、核染色試薬をPBS(-)に希釈し、well内培地と置換した。15分間室温で染色した後、ImageXpressで画像撮影した(16視野/well)。各画像について、細胞カウントプログラムで解析し、ミトコンドリアトランスファー率を計算した。細胞カウントプログラムは上記と同様である。
上記試験でミトコンドリアトランスファー率を特に再現性高く示した数種類のエキスを選び、これらのエキスが供給側の細胞と受容側の細胞のどちらに作用するのかについて、更なる評価を行った。
冷凍保存のNHDF(ヒト皮膚線維芽細胞)を6wellプレートに播種(5x104cells/well)してT25フラスコに1.5x105cells/well)で播種し、別途NHEK(ヒト表皮角化細胞)を起眠し、6wellプレートに播種(4x104cells/well)してT25フラスコに2x105cells/well)で播種し、4日間培養した。NHDFはHBSS(+)で、NHEKはHBSS(-)で3回洗浄した後、ミトコンドリア供給側の細胞にミトコンドリア染色試薬を添加して30分間、受容側の細胞に細胞質染色試薬を添加して1時間、37℃インキュベータ内で染色後、NHDFはDMEM(10%FBS、1%AB)培地に、NHEKはHumedia KG2培地に置換した。次いで、供給側又は受容側となる細胞にキハダ樹皮エキスを終濃度1/1,000で添加し添加し、一晩37℃インキュベータで培養した。ウコン根茎エキスの主成分であるクルクミンについても同様に試験を行った。翌日、NHDFはHBSS(+)で、NHEKはHBSS(-)で3回洗浄後、トリプシン/EDTAで細胞を剥がし、供給側、受容側ともに2,000cells/wellになるよう96wellプレートに播種し、処理なしの細胞(2,000cells/well)と共培養した。一晩37℃インキュベータで培養した。その翌日、核染色試薬をPBS(-)に希釈し、well内培地と置換した。15分間室温で染色した後、ImageXpressで画像撮影した(16視野/well)。細胞カウントプログラムで解析し、ミトコンドリアトランスファー率を計算した。カウントプログラムは上記と同様である。
細胞:NHDFヒト皮膚線維芽細胞:Human Dermal Fibroblast(KURABO社製 KF-4009)
NHEK(ヒト表皮角化細胞)KK-4009(KURABO社製)
培地:
(1)Humedia-KG2培地 KK-2150S(KURABO社製) (NHEK細胞培養時)
(2)DMEM(Gibco社製 11995065)+10%FBS+1%AB* (NHDF細胞培養時)
*AB:Antibiotic-Antimycotic(Gibco社製)
(3)上記2種類の培地を1:1で混合した培地 (共培養時)
薬剤:トリプシン/EDTA(KURABO社製)HK-3120
ミトコンドリア染色試薬:Mito Tracker(登録商標)Green FM(molecularprobesM7514)1/7,000希釈in HBSS(+)(最終70nM)
細胞質染色試薬:CellTrace(商標) Far Red Cell Proliferation Kit(Invitrogen(商標) C34564)1/1,000希釈in HBSS(-)(最終5uM)
核染色試薬:Hoechst 33342 (DOJINDO社製 346-07951)1/1,000希釈
ミトコンドリアトランスファーを受けた細胞(受容側細胞)内で、どのような機能変化が生じているかを確認する目的で、遺伝子(SOD2及びPPARGC1)の発現変化を調べた。
AD-MSC(脂肪由来間葉系幹細胞HMSC-Ad):Adipose derived stem cell(Life Line FC-0034);
NHDFヒト皮膚線維芽細胞:Human Dermal Fibroblast(KURABO社製 KF-4009)
AD培養時:Stem life MSC Comp Kit(Life Line LL-0034)
NHDF培養時、共培養時:DMEM(Gibco社製)+10%FBS+1%AB*
*AB:Antibiotic-Antimycotic(Gibco社製)
細胞質染色試薬:CellTrace Violet Cell Proliferation Kit, for flow cytometry (Invitrogen)C34557 1/1000希釈in HBSS (+) (最終5uM)
ロテノン:(SIGMA社製) R8875-1G
トリプシン/ EDTA:(KURABO社製) HK-3120
BSA:(SIGMA社製)Bovine Serum Albumin A2153-50G
RNA抽出キット:(QIAGEN社製) RNeasy Mini Kit(250) 74106
cDNA合成キット:(TOYOBO社製) ReverTra Ace(登録商標)qPCR Master Mix with gDNA RemoverFSQ-301
リアルタイムPCR試薬:(applied biosystems社製)TaqMan(登録商標) Fast Advanced Master Mix 4444557
TaqMan probe:(applied biosystems社製) SOD2, PPARGC1, GAPDH
CELL SORTER:(SONY社製)SH800Z
Thermal Cycler:(Applied Biosystems社製) 2720
Real-time PCR System:QuantStudio (applied biosystems社製)
上記試験の結果、プルーン分解物、アロエエキスはミトコンドリアトランスファー促進効果を有することがわかった。これらの物質のコラーゲン産生に対する効果を検討するために、以下の試験を行った。すなわち、冷凍保存のヒト線維芽細胞(クラボウ社製)を推奨播種密度細胞数フラスコに起眠して37℃、5%CO2インキュベータ内で培養した。培養4日目にこの細胞をPBS(-)で2回洗浄し、トリプシンを添加して培養フラスコから細胞を剥がし、48wellプレートにDMEM/10%FBS/1%AB培地(Gibco社製)を使用して3x104cells/wellで播種した。そして、6時間後に培地をDMEM/0.1%FBS/1%ABに置換した。翌日、プルーン分解物(最終0.002%)、アロエエキス(最終0.002%)、コンプレックスA(トリペプチド-1-銅 最終0.1mg/ml、コラーゲン 最終1mg/ml、カプロオイルテトラペプチド-3 最終0.075mg/ml)、アスコルビン酸(最終1mg/ml)を細胞に添加し、52時間後に細胞上清を回収した。
蛋白量測定(コラーゲン量測定)は、ELISA法によるR&D systems Human Pro-Collagen I alpha1 Duo Set ELISAを使用し、プロトコルに従って測定した。サンプルは、上記回収した上清を150倍希釈で使用した。結果を図3に示した。
細胞:NHDFヒト皮膚線維芽細胞:Human Dermal Fibroblast(KURABO社製 KF-4009)
培地:DMEM(Gibco社製)+10%FBS+1%AB*
*AB:Antibiotic-Antimycotic(Gibco社製)
試薬:トリプシン/EDTA(KURABO社製)HK-3120
プルーン分解物、アロエエキスについては市販の化粧品原料を使用した。
Claims (15)
- 水溶性有効成分としてのプルーンエキスを含むミトコンドリアトランスファー促進剤。
- プルーンエキスが、プルーン分解物である、請求項1に記載のミトコンドリアトランスファー促進剤。
- さらにアロエエキスを含有する、請求項1又は2に記載のミトコンドリアトランスファー促進剤。
- さらにアルテア根エキスを含有する、請求項1から3のいずれか1項に記載のミトコンドリアトランスファー促進剤。
- 皮膚組織においてミトコンドリアトランスファーを促進するために用いられる、請求項1から4のいずれか1項に記載のミトコンドリアトランスファー促進剤。
- 皮膚線維芽細胞、表皮角化細胞、脂肪由来間葉系幹細胞、表皮幹細胞及び真皮幹細胞からなる群より選択される1種又は2種の細胞間におけるミトコンドリアトランスファーを促進させるために用いられる、請求項1から4のいずれか1項に記載のミトコンドリアトランスファー促進剤。
- 皮膚外用組成物として用いられる、請求項1から6のいずれか1項に記載のミトコンドリアトランスファー促進剤。
- 経口用組成物として用いられる、請求項1から6のいずれか1項に記載のミトコンドリアトランスファー促進剤。
- プルーンエキスを使用することを特徴とする、細胞間のミトコンドリアトランスファー促進方法。
- プルーンエキスが、プルーン分解物である、請求項9に記載の細胞間のミトコンドリアトランスファー促進方法。
- 上記細胞が皮膚組織の細胞である、請求項9又は10に記載の細胞間のミトコンドリアトランスファー促進方法。
- 皮膚線維芽細胞、表皮角化細胞、脂肪由来間葉系幹細胞、表皮幹細胞及び真皮幹細胞からなる群より選択される1種又は2種の細胞間におけるミトコンドリアトランスファーを促進させる方法である、請求項9又は10に記載の細胞間のミトコンドリアトランスファー促進方法。
- プルーンエキスが皮膚外用組成物の成分として使用される、請求項9から12のいずれか1項に記載の細胞間のミトコンドリアトランスファー促進方法。
- プルーンエキスが経口用組成物の成分として使用される、請求項9から12のいずれか1項に記載の細胞間のミトコンドリアトランスファー促進方法。
- プルーンエキスが美容組成物の成分として使用される、請求項9から14のいずれか1項に記載の細胞間のミトコンドリアトランスファー促進方法。
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