CN102876791A

CN102876791A - 一种用于肛肠疾病患病风险评估基因芯片、制备方法及其试剂盒

Info

Publication number: CN102876791A
Application number: CN2012103564420A
Authority: CN
Inventors: 徐谋胜; 李兵; 王珊; 袁雅燕; 王宁
Original assignee: HUBEI WEIDAJIAN GENE TECHNOLOGY CO LTD
Current assignee: HUBEI WEIDAJIAN GENE TECHNOLOGY CO LTD
Priority date: 2012-09-21
Filing date: 2012-09-21
Publication date: 2013-01-16
Anticipated expiration: 2032-09-21
Also published as: CN102876791B

Abstract

本发明涉及一种用于肛肠疾病患病风险评估基因芯片、制备方法及其试剂盒。他包括固相载体、固定在固相载体上的用于检测肛肠疾病易感基因多态性位点的特异性寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针的核苷酸序列如SEQIDNo.1-78所示。本发明还公开了该基因芯片的制作方法，以及包括该基因方法的试剂盒。其灵敏度高，特异性和可靠性高，可科学预测九种肛肠系统疾病的患病风险，为肛肠疾病的诊断治疗提供分析信息。根据检测分析得到的各肛肠系统疾病的患病风险可有针对性的调整生活饮食习惯，采取相应的其他措施从而预防疾病的发生，或者做到疾病早发现早治疗，提高国民素质，有效预防肛肠疾病的发生。

Description

一种用于肛肠疾病患病风险评估基因芯片、制备方法及其试剂盒

技术领域

本发明属于遗传检测领域，具体涉及一种用于肛肠疾病患病风险评估基因芯片、制备方法及其试剂盒。

背景技术

肛肠疾病是指与肛门直肠有关的一系列疾病，常见的有痔疮、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、结直肠癌、肛乳头瘤、直肠息肉、乳糜腹泻等，是一种临床常见病、多发病。可发生任何年龄，其中20～49岁患病率最高。中国肛肠协会资料表明，中国肛肠疾病发病率占总人口的59.9％，全国约7.7亿人，且呈逐年上升趋势。传统的治疗方法以手术和药物为主，而且往往达不到理想效果，严重影响患者的身心和健康。

肛肠疾病是多基因位点与环境共同作用的结果，目前已有相关研究报道确定了一些基因的单核苷酸多态性(SNPs)与肛肠疾病相关。单核苷酸多态性是由基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性，包括单个碱基的转换、颠换以及单个碱基的缺失和插入。其中最少的一种等位基因在群体中的频率不小于1％。作为第三代遗传标记的SNP在人类基因组中约每1000个碱基就出现一个，并具有如下特点：(1)数量多，分布广泛；(2)遗传稳定；(3)易于基因分型；(4)适于快速、高通量检出。SNP自身的特性决定了它比其他两类遗传标记更适合于对复杂性状的遗传解析以及基于群体基因识别等方面的研究，促使人们不断地寻找新的SNP标记和革新SNP检测技术。

目前已有多种方法可用于SNP检测，传统的SNP检测方法有DNA测序、限制性酶切片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)、单链构象多态性(single strandconformational polymorphism，SSCP)、变性高效液相色谱(denaturing high performance liquidchromatography，DHPLC)等。这些技术虽在某种程度上能完成对SNP的检测，但距快速、高效、自动化的目标还相差甚远。DNA芯片技术是近年来新开发的一种基因检测工具。其原理是将大量的寡核苷酸探针有规律地排列在一张玻片上，这些探针可以与信号显示物质标记的样品DNA的扩增序列的互补序列进行相结合，通过对信号物质进行检测，对杂交结果进行计算机软件处理分析，从而获得杂交信号的强度及其分布模式图。基于寡核苷酸芯片的方法为分析SNP提供了一种高通量的技术，为SNP或基因突变提供了一个高通量的检测平台，可用来平行分析已知基因在不同疾病样本中的突变或SNP位点，以获得疾病易感基因的遗传学改变，并作为线索加强临床上早预防、早发现、早诊断和早治疗，具有重要的社会和经济效益。

经检索，利用肛肠疾病相关基因多态性检测的基因芯片至今还未见报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种用于肛肠疾病具体包括结直肠癌、先天性巨结肠症、克罗恩氏病、乳糖不耐受症、溃疡性结肠炎、酒精脸红反应、家族性结肠腺瘤性息肉病、乳糜腹泻和囊性纤维化九种肛肠疾病患病风险评估的基因芯片、制备方法及其试剂盒。

一种用于肛肠疾病患病风险评估基因芯片，其特征在于：包括固相载体、固定在固相载体上的用于检测肛肠疾病易感基因多态性位点的特异性寡核苷酸探针，所述检测肛肠疾病易感基因多态性位点如下：

结直肠癌基因多态性位点(SNP)4个：rs4939827、rs6983267、rs3802842、rs961253

先天性巨结肠症基因多态性位点(SNP)5个：rs137852525、rs104894388、rs1801710、rs193196427、rs193123285

克罗恩氏病基因多态性位点(SNP)11个：rs2066844、rs10761659、rs2066845、rs2066847、rs11209026、rs2241880、rs7714584、rs3197999、rs11190140、rs17234657、rs1893217

乳糖不耐受症基因多态性位点(SNP)3个：rs193268403、rs193267205、rs193116455

溃疡性结肠炎基因多态性位点(SNP)4个：rs2395185、rs9858542、rs10883365、rs11209026、

酒精脸红反应基因多态性位点(SNP)3个：rs193229433、rs193200096、rs193056481

家族性结肠腺瘤性息肉病基因多态性位点(SNP)2个：rs121912665、rs113993961

乳糜腹泻基因多态性位点(SNP)3个：rs2187668、rs6822844、rs6441961

囊性纤维化基因多态性位点(SNP)4个：rs193230349、rs193273640、rs193221728、rs193219992；

针对肛肠疾病易感基因多态性位点，设计了一组寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针的核苷酸序列如SEQ ID No.1-78所示，具体列表如下：

表1用于肛肠疾病患病风险评估基因芯片的寡核苷酸探针序列

位点名称探针序列(5’→3’)

rs4939827 1W-AAAAGAGGAAACAGGACCCCAGAG

1M-CCAAAAGAGGAAATAGGACCCCAG

rs6983267 2W-AGCAGATGAAAGGCACTGAGAAAA

2M-AGCAGATGAAAGTCACTGAGAAAA

rs3802842 3W-AAAATCTATCCCAGAAATTCA

3M-AGACCCATAGAAAATCTCTCCCA

rs961253 4W-ACATCAAGTAAATTCAGA

4M-ACATCAAGTACATTCAGA

rs137852525 5W-GTTCAGTACCGCATGCAGTG

5M-GTTCAGTACCGCGTGCAGTG

rs104894388 6W-TTCATACAGAAAGCCTCCGTG

6M-TTCATACAGAAAGGCTCCGTG

rs1801710 7W-AGACCTTATGGCCCAAGAGTT

7M-CCAAGGGTTCCAACGCCAG

rs193196427 8W-TTCTCATAGCCTACGGACTCGAAC

8M-ATAGCCTATGGACTCGAACCGG

rs193123285 9W-ACCCTGTCTCGTGGACCGC

9M-CCCTGTCTCGTGGACTGCCCGG

rs2066844 10W-CCGGAGCAGGGCCTTCTCAGAT

10M-CCAGAGCAGGGCCTTCTCAG

rs2066845 11W-TGGTGCAACAGAGTGGGTGACGAG

11M-TGGCGCAACAGAGTGGGTGACGAG

rs10761659 12W-AAACTATAACAGAAGGAAAACAGG

12M-AAACTGTAACAGAAGGAAAACAGG

rs2066847 13W-CTCCTGCAGGCCCTTGAAA

13M-CTCCTGCAGGCCCCTTGAAAG

rs11209026 14W-CAGATCATTCCAAACTGG

14M-CAGATCATTCCGAACTGG

rs2241880 15W-ATGAGCATCCACATTGTCC

15M-GATGAGTATCCACATTGTCC

rs7714584 16W-ACCTTTTAAATTTATTGCTCTGTC

16M-ACCTTTTAAATTTGTTGCTCTGTC

rs3197999 17W-CGCAAGGTCCCGCTGGCCA

17M-GAGTATGCGCAAGGTCCTG

rs11190140 18W-TTCAATAGGCGGAAAAGAAGGCT

18M-TTCAATAGGTGGAAAAGAAGGC

rs17234657 19W-CCAGTCACGTTGTCAAATAGCTTC

19M-TCCTCCCAGTCACGTTTTCAAATA

rs1893217 20W-TCTTCTTCCTCTACCTCTGTCCCT

20M-CTTCTTCCTCTACCTTTGTCCCTA

rs193268403 21W-GAGCCACCATGCCCGGCCGG

21M-GAGCCACCATGCCTGGCCGG

rs193267205 22W-CTTCAGTGATGGACGAGGAGGTGG

22M-CAGTGATGGATGAGGAGGTGGACA

rs193116455 23W-GTGTCTTTGCCCAAGTACTTCTG

23M-GTGTCTTTGCCCAAGTATTTCTG

rs2395185 24W-GCCAAAAATTTGTCTTCCC

24M-GCCAAAAATTTTTCTTCCC

rs9858542 25W-CAAACTGACAGAAGGTATGCACT

25M-AAGCTGGCAAACTGACGGAAGGTA

rs10883365 26W-CAGACGGTTTGAAGGTATTTGTGC

26M-CAGACGGTTTGAAGGTGTTTGTGC

rs11209026 27W-AACAGATCATTCCAAACTGGGTAGG

27M-AACAGATCATTCCGAACTGGGTAGG

rs193229433 28W-CACTCCCCATTCCTCCCACTACCA

28M-CCCCATTCCTCCCCCTACCAG

rs193200096 29W-AGTGGCTGGCCCTGGTTCTG

29M-AGTGGCTGGCCTTGGTTCTG

rs193056481 30W-GGTGCCAGCCTAATTTCTATTAA

30M-GTGCCAGCCTCATTTCTATTAATT

rs121912665 31W-GGTCTGGCCCCTCCTCAGCAT

31M-GGTCTGGTCCCTCCTCAGCAT

rs113993961 32W-TGCTTTTAATACGGTAGAAATTGG

32M-GCTTTTAATAGGGTAGAAATTGGC

rs2187668 33W-GGCAGCTGAGAGTAAATGAGGACC

33M-GAGGCAGCTGAGAGTAAGTGAGGA

rs6822844 34W-TCCATAGCAAAAAGAGAGGACT

34M-TCTCCATAGCAAAAATAGAGGAC

rs6441961 35W-GGCAGCCTTGATAACATCTCCA

35M-GTAGCCTTGATAACATCTCCAGCA

rs193230349 36W-GTAACTAACCCATTCTATTTT

36M-GTAACTACCCCATTCTATTTT

rs193273640 37W-TAGTGTTGGTGGCAGGAAGTAGAA

37M-TAGTGTTGGTGTCAGGAAGTAGAA

rs193221728 38W-GTGTTCGACTGCATGGGGA

38M-GTGTTCGACTGCATGGGTA

rs193219992 39W-TTTGATAGAACTATACACGGAG

39M-TTTGATAGAACTATACATGGAG

阳性对照探针 40-TACTCTAACCGTACCGA

阴性对照探针 41-TAGTGTTGGTGGCAGGAAGTAGAA

按上述方案，所述固相载体为硝酸纤维素膜、尼龙膜或载玻片，所述的固相载体经不同的化学修饰使其表面带有可以固定核酸分子的活性基团。本发明的基因芯片所采用的固相载体选自任何可用于制备基因芯片的材料，包括但不限于硝酸纤维素膜、尼龙膜或载玻片，所述的固相载体经不同的化学修饰，在其表面带有可以固定核酸分子的活性基团如醛基(-CHO)等。

按上述方案，所述用于肛肠疾病患病风险评估基因芯片包括阳性对照探针和阴性对照探针，所述的阳性对照探针序列如SEQ ID No.79所示，所述的阴性对照探针序列如SEQ IDNo.74所示，具体见表1。

一种用于肛肠疾病患病风险评估基因芯片的制作方法，其特征在于：它包括以下步骤：

(1)将固相载体预处理，待用；

(2)根据表1所设计的探针序列，如SEQ ID No.1-78所示，人工合成每条寡核苷酸芯片探针；

(3)将上述各寡核苷酸芯片探针溶解在点样液中，点样固化即得。

按上述方案，所述固相载体为载玻片，所述的预处理为将载玻片用铬酸洗液洗涤，浸泡过夜，水洗，20wt％～25wt％氨水浸泡中过夜，水洗，然后浸入氨丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液中，用冰醋酸调节pH值至4.0～6.0，乙醇超声清洗，烘干4～5小时，戊二醛醛基化处理。

按上述方案，所述每条寡核苷酸芯片探针在合成时5’端经氨基基团修饰。

按上述方案，所述点样时每点点样体积为0.4～0.6nL，点心间距为500～600μm，点直径为200～300μm，每条探针重复点样2～3次；所述的固化处理为室温放置24～26小时固化。

一种试剂盒，包括上述用于肛肠疾病患病风险评估基因芯片。

按上述方案，所述的试剂盒还包括用于检测肛肠疾病各易感基因多态性位点扩增对应所需的引物，其序列如SEQ ID No.80-156所示(其中克罗恩氏病基因多态性位点rs11209026(14)扩增和溃疡性结肠炎基因多态性位点rs11209026(27)扩增对应所需的下游引物相同)，和阳性对照扩增对应所需的引物，其序列如SEQ ID No.157-158所示，见表2。

表2PCR扩增对于所需的引物序列

位点名称引物序列

rs4939827(1) f：5′-ATATCAACAAGCCCTCTTCA-3′

r：5′-GGAGATGCTGCAAAGCATGA-3′

rs6983267(2) f：5′-CAGCTGCATCGCTCCATAGA-3′

r：5′-ATTGCAGAGTTGCACAGTTA-3′

rs3802842(3) f：5′-GCCTTCCTCTGCTGTTCCTA-3′

r：5′-ACTGCTTAAGGTGTTGATAC-3′

rs961253(4) f：5′-TCACCCATAATGCTGCTTAG-3′

r：5′-GACAGTTTAGCTCAATATGG-3′

rs137852525(5) f：5′-ATGGTCATCACGTGGAAGGT-3′

r：5′-GTGGAAGCAGGCGAGCTCAA-3′

rs104894388(6) f：5′-CACTTTCCTGTCCCATACAT-3′

r：5′-GAAGCAACAGCTCGATATCT-3′

rs1801710(7) f：5′-TTCCTTCCTCTGCTTGTCTC-3′

r：5′-TTCGCATGCACTTGTTCTTG-3′

rs193196427(8) f：5′-CTCGTCTTAACTGGATAAGG-3′

r：5′-GAGAGTATCTCAGCGTCTGT-3′

rs193123285(9) f：5′-TGCTGTGCAGGCTCAGGTCT-3′

r：5′-CTCCGTCCAGGTGTGCATGT-3′

rs2066844(10) f：5′-GCCGCACAACCTTCAGATCACAG-3′

r：5′-ATGTCAACTTGAGGTGCCCAACA-3′

rs2066845(11) f：5′-AGTCTGTAATGTAAAGCCACT-3′

r：5′-AAAACTGCAGGATAGACTCTGA-3′

rs10761659(12) f：5′-AACAAAGGAATCACTAGCAGA-3′

r：5′-GCTAAAGTTTCAGAATGCACA-3′

rs2066847(13) f：5′-ACGGTTACATTTCACTGATGGT-3′

r：5′-CCATTCCTCTCTCCCGTCAC-3′

rs11209026(14) f：5′-TTTATTGGGAATGATCGTCT-3′

r：5′-GTCACCTGTAAAATAGGCCAG-3′

rs2241880(15) f：5′-GAATCTAGAAGGACAGGCTA-3′

r：5′-AGGACCCTTTAATTGCCAG-3′

rs7714584(16) f：5′-TTAAGAACTACTTTACGGACA-3′

r：5′-GACAAATCCACAATTACAGT-3′

rs3197999(17) f：5′-CCACCCGAGCCCTAGCAAG-3′

r：5′-GCAGGCTAGTCATTGCTGT-3′

rs11190140(18) f：5′-TGGTAGCGAGCAAATGCCTA-3′

r：5′-GTTAAGCGCTCAGTACGTGTC-3′

rs17234657(19) f：5′-TATCATTTCTTTGTGTTGGGA-3′

r：5′-ATATTATGCGTATTAAGGGAC-3′

rs1893217(20) f：5′-CTGGGCTAGAGAAACACCCT-3′

r：5′-CTTCTGCCTCTACCACTTGC-3′

rs193268403(21) f：5′-ACCCACCAACATATCTGGCTA-3′

r：5′-TTCGGAATCTCCCAGAAAACCC-3′

rs193267205(22) f：5′-ACACCAGCTATGAAAGGCTA-3′

r：5′-TGCTTATGAAATGGCCCACA-3′

rs193116455(23) f：5′-TGTTACAACTGCCTACAGCAT-3′

r：5′-CAGGAGATTCCAGCAGACCC-3′

rs2395185(24) f：5′-TCCACCTATTTATCAAGGCAA-3′

r：5′-AAATAGAAAAGAAACTACGTGA-3′

rs9858542(25) f：5′-CTCTCGTGGGTACTTGCCCTC-3′

r：5′-CAGAGATTGCCCGGAGAACAAC-3′

rs10883365(26) f：5′-TCTCCCAGTGCCGACCGAAG-3

r：5′-AAATGTGGTTATCGCGTTCCAA-3

rs11209026(27) f：5′-TGTGGCCTAAAGTAAAGGTT-3

r：5′-GTCACCTGTAAAATAGGCCAG-3

rs193229433(28) f：5′-TGCACCATTTTAGTGTACGAT-3

f：5′-CTTTAAAACATGGCTACTTGGA-3

rs193200096(29) f：5′-CACTGAGCCCAACTTAAACGA-3

r：5′-GGCCCAACTGTTTTCTTGTCCA-3

rs193056481(30) f：5′-GACCATTCCTGGCTAATTGTGT-3

r：5′-TCCCCATTCTCTTCAACAGT-3

rs121912665(31) f：5′-GGCCATCTACAAGCAGTCACAG-3

r：5′-AGACCCCAGTTGCAAACCAG-3

rs113993961(32) f：5′-CACAGTTTATTTGGCACTGG-3

r：5′-AAAATGCAGAAGTTACAAGA-3

rs2187668(33) f：5′-ATATTTAAAATGTTGCCCGTT-3

r：5′-AAATGATCCCTTATTTTGCTAA-3

rs6822844(34) f：5′-TAGTTCAGGCCAGACATCCTC-3

r：5′-ATCTAGAAACTCGGTTATGGTCA-3

rs6441961(35) f：5′-TGATGACAGCACTAGCCAAC-3

r：5′-CAGAAAGTGCTGCCACAAG-3

rs193230349(36) f：5′-TGAATCCTCTACATAACTGC-3

r：5′-GGGTGTGTACATAAACCAAC-3

rs193273640(37) f：5′-CCTGGATGACAGAGTGAGAC-3

r：5′-GAGCACAACACAAATACCTT-3

rs193221728(38) f：5′-CTTTATGAAGATTCACCTCC-3

r：5′-CAATAATATTTAATGGCCTA-3

rs193219992(39) f：5′-TTTTAAACATTCTCTACCAT-3

r：5′-TGTATATATGCACACACTCA-3

阳性对照肌动蛋白 f：5′-TTAGTTGCGTTACACCCTTTC-3

r：5′-GAACGGTGAAGGTGACAGC-3

按上述方案，所述的试剂盒还包括PCR扩增所用的PCR缓冲液，MgCl₂，dNTPmix，Taq酶。

上述用于肛肠疾病患病风险评估基因芯片的使用方法，具体包括以下步骤：

1、待测样本的制备：

(1)提取样品DNA；

(2)采用各易感基因多态性位点及阳性对照肌动蛋白扩增对应所需的引物分别进行PCR扩增；

(3)PCR结束后经电泳检测确认，然后回收目的片段条带；

2、荧光素标记

对步骤1中回收得到的目的片段和阴性对照品即点样液进行荧光标记；

3、芯片杂交实验

将步骤2中标记后的目的片段和阴性对照品对应滴加到基因芯片上，与固定于上述基因芯片上的寡核苷酸芯片探针进行杂交，然后进行洗涤处理；

4、扫描和结果判定

扫描分析获取杂交信号，判定得到结果。

按上述方案，步骤1(2)中用于检测肛肠疾病各易感基因多态性位点扩增对应所需的引物序列如SEQ ID No.80-156所示，阳性对照扩增所需的引物序列如SEQ ID No.157-158所示，见表2。

本发明的有益效果：

本发明提供的用于肛肠疾病患病风险评估基因芯片灵敏度高，特异性和可靠性高，可科学预测九种肛肠系统疾病的患病风险，为肛肠疾病的诊断治疗提供分析信息。根据检测分析得到的各肛肠系统疾病的患病风险可有针对性的调整生活习惯、饮食习惯，采取相应的其他措施从而预防疾病的发生，或者做到疾病早发现早治疗，提高国民素质，有效预防肛肠疾病的发生；

自动化程度高，便于推广应用；

适应于不同层次医院的需要，具有很好的应用市场和经济效益。

附图说明：

图1是本发明用于肛肠疾病患病风险评估基因芯片探针排布示意图；

图2是本发明用于肛肠疾病患病风险评估基因芯片的检测结果。

具体实施方式：

实施例1

用于肛肠疾病患病风险评估基因芯片的制备：

(1)芯片载体的处理：载玻片用铬酸洗液洗涤，浸泡过夜，水洗，24wt％氨水浸泡过夜，水洗，然后浸入氨丙基三甲氧基硅烷的95％(v/v)乙醇溶液中，用冰醋酸调节pH值至4.0，95％(v/v)乙醇超声清洗，150℃烘干4小时，9％(v/v)戊二醛醛基化处理。

(2)基因芯片的制备及后处理：

根据设计的寡核苷酸芯片探针序列，如表1所示，人工合成相应得到每条寡核苷酸芯片探针，然后将每条寡核苷酸芯片探针分别用点样液稀释至终浓度为50μM/L，所述的点样液为750mmol/L氯化钠，75mmol/L乙酸钠，5％(v/v)甘油，1wt％聚蔗糖和0.1wt％十二烷基黄酸钠溶液，并于96孔板中与浓度为200mmol/L的PBS溶液(含0.05wt％SDS)等体积混合后，通过接触式点样或喷墨式点样，根据图1所述的用于肛肠疾病患病风险评估基因芯片探针排布示意图点载到芯片载体上，每点点样体积约为0.5nL，点心间距为500μm，点直径约为200μm，每条探针重复点样2次，点样完毕后，室温放置24小时固相化即得用于肛肠疾病患病风险评估基因芯片。

该用于肛肠疾病患病风险评估基因芯片在使用时，具体步骤如下：

(1)提取样品DNA

可按照本领域常规方法进行提取，样本可为人唾液或血液DNA，本发明采用DNA提取试剂盒进行提取；

(2)采用各肛肠疾病易感基因多态性位点及阳性对照扩增对应所需的引物序列，配制50μ下述PCR反应体系，并根据如下反应条件，分别进行PCR扩增。

PCR反应体系

PCR反应条件

(3)PCR扩增结束后各取产物5μl，质量体积比为1％的琼脂糖凝胶电泳检测观察确认。然后采用百泰克DNA回收试剂盒对PCR产物进行纯化，回收目的片段。

(4)荧光素标记

将回收的目的片断(包括扩增得到的阳性对照肌动蛋白(β-Actin)，阴性对照品即点样液，于25μl含200mM二甲胂酸钾(potassium cacodylate)，25mM Tris-HCl缓冲液(pH7.2)，1mM二氯化钴(CoCl₂)，0.01％聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100，v/v)，20μM Cy3-dCTP，20U脱氧核苷酸末端转移酶的标记体系中，37℃荧光素标记1小时。

(5)杂交

将荧光素标记后的DNA扩增产物(包括扩增得到的阳性对照肌动蛋白(β-Actin)和阴性对照品即点样液)2μl分别与杂交液等体积混合后对应滴加到基因芯片表面，杂交液为5×SSC(0.5wt％SDS，50％(v/v)甲酰胺)，加盖玻片，然后放入杂交盒中65℃杂交6h。

(6)洗涤

以终浓度为2×SSC+0.2wt％SDS的溶液洗片，每次2min，再用2×SSC冲洗2次，每次2min，最后用三蒸水清洗2次，每次2min，然后800rpm离心5min。

(7)结果检测

用Scanarray 4000扫描仪扫描，扫描参数为：激光强度100％，光电倍增管(PMT)100％。用Quantarray 3.0定量分析软件分析扫描图像的荧光强度值。根据各个探针杂交信号的强弱来判定杂交结果，如图2所示。其中1-W，2-M，3-W，4-W，4-M，5-W，6-W，6-M，7-W，8-W，8-M，9-W，10-M，11-W，11-M，12-M，13-W，13-M，14-M，15-W，15-M，16-M，17-M，18-M，19-M，20-W，20-M，21-W，21-M，22-W，23-W，23-M，24-M，24-M，25-W，26-W，27-W，28-W，28-M，29-W，29-M，30-M，31-W，32-W，32-M，33-W，33-M，34-M，35-W，35-M，36-W，37-W，37-M，38-M，39-W显示阳性结果；阳性对照点40的位置上出现阳性信号；阴性对照位置41上出现阴性结果。

结合上述结果可知，其对应的SNP位点基因分型结果如下：

野生型位点：rs4939827(1)，rs3802842(3)，rs137852525(5)，rs1801710(7)，rs193123285(9)，rs193267205(22)，rs9858542(25)，rs10883365(26)，rs11209026(27)，rs121912665(31)，rs193230349(36)，rs193219992(39)

杂合突变位点：rs961253(4)，rs104894388(6)，rs193196427(8)，rs10761659(11)，rs2066847(13)，rs2241880(15)，rs1893217(20)，rs193268403(21)，rs193116455(23)，rs193229433(28)，rs193200096(29)，rs113993961(32)，rs2187668(33)，rs6441961(35)，rs193273640(37)

纯合突变位点：rs6983267(2)，rs2066844(10)，rs2066845(12)，rs11209026(14)，rs7714584(16)，rs3197999(17)，rs11190140(18)，rs17234657(19)，rs2395185(24)，rs193056481(30)，rs6822844(34)，rs193221728(38)

结合上述结果分析得到该样本的肛肠疾病患病风险：

低度患病风险：先天性巨结肠症，溃疡性结肠炎，家族性结肠腺瘤性息肉病；

中度患病风险：结直肠癌，乳糖不耐受症，酒精脸红反应，乳糜腹泻，囊性纤维化；

高度患病风险：克罗恩氏病。

上述分析结果可为肝肠疾病患者的预防，治疗提供参考。如对于中低度患病风险人群，建议进行合理的饮食，形成良好的生活习惯如少吃辛辣、高纤维食物，而以清淡的软食为主，注意营养均衡进而预防营养的不足，相应学习处理该病的各种办法和对策，并与别人分享，遵照医嘱吃药，保持积极向上的心态。而对于高度患病风险人群，则可及时到医院进行检查，做到早发现早治疗。

测序验证：

采用Bigdye Terminator V3.1试剂盒，在ABI genome analzer3500上进行测序。结果显示其检测得到的肛肠疾病基因多态性结果与基因芯片结果完全一致。

Claims

1.一种用于肛肠疾病患病风险评估基因芯片，其特征在于：包括固相载体、固定在固相载体上的用于检测肛肠疾病易感基因多态性位点的特异性寡核苷酸探针，所述检测肛肠疾病易感基因多态性位点如下：

乳糜腹泻基因多态性位点(SNP)3个：rs2187668、rs6822844、rs6441961

所述寡核苷酸探针的核苷酸序列如SEQ ID No.1-78所示，具体列表如下：

表1用于肛肠疾病患病风险评估基因芯片的寡核苷酸探针序列

位点名称探针序列(5’→3’)

rs4939827 1W-AAAAGAGGAAACAGGACCCCAGAG

1M-CCAAAAGAGGAAATAGGACCCCAG

rs6983267 2W-AGCAGATGAAAGGCACTGAGAAAA

2M-AGCAGATGAAAGTCACTGAGAAAA

rs3802842 3W-AAAATCTATCCCAGAAATTCA

3M-AGACCCATAGAAAATCTCTCCCA

rs961253 4W-ACATCAAGTAAATTCAGA

4M-ACATCAAGTACATTCAGA

rs137852525 5W-GTTCAGTACCGCATGCAGTG

5M-GTTCAGTACCGCGTGCAGTG

rs104894388 6W-TTCATACAGAAAGCCTCCGTG

6M-TTCATACAGAAAGGCTCCGTG

rs1801710 7W-AGACCTTATGGCCCAAGAGTT

7M-CCAAGGGTTCCAACGCCAG

rs193196427 8W-TTCTCATAGCCTACGGACTCGAAC

8M-ATAGCCTATGGACTCGAACCGG

rs193123285 9W-ACCCTGTCTCGTGGACCGC

9M-CCCTGTCTCGTGGACTGCCCGG

rs2066844 10W-CCGGAGCAGGGCCTTCTCAGAT

10M-CCAGAGCAGGGCCTTCTCAG

rs2066845 11W-TGGTGCAACAGAGTGGGTGACGAG

11M-TGGCGCAACAGAGTGGGTGACGAG

rs10761659 12W-AAACTATAACAGAAGGAAAACAGG

12M-AAACTGTAACAGAAGGAAAACAGG

rs2066847 13W-CTCCTGCAGGCCCTTGAAA

13M-CTCCTGCAGGCCCCTTGAAAG

rs11209026 14W-CAGATCATTCCAAACTGG

14M-CAGATCATTCCGAACTGG

rs2241880 15W-ATGAGCATCCACATTGTCC

15M-GATGAGTATCCACATTGTCC

rs7714584 16W-ACCTTTTAAATTTATTGCTCTGTC

16M-ACCTTTTAAATTTGTTGCTCTGTC

rs3197999 17W-CGCAAGGTCCCGCTGGCCA

17M-GAGTATGCGCAAGGTCCTG

rs11190140 18W-TTCAATAGGCGGAAAAGAAGGCT

18M-TTCAATAGGTGGAAAAGAAGGC

rs17234657 19W-CCAGTCACGTTGTCAAATAGCTTC

19M-TCCTCCCAGTCACGTTTTCAAATA

rs1893217 20W-TCTTCTTCCTCTACCTCTGTCCCT

20M-CTTCTTCCTCTACCTTTGTCCCTA

rs193268403 21W-GAGCCACCATGCCCGGCCGG

21M-GAGCCACCATGCCTGGCCGG

rs193267205 22W-CTTCAGTGATGGACGAGGAGGTGG

22M-CAGTGATGGATGAGGAGGTGGACA

rs193116455 23W-GTGTCTTTGCCCAAGTACTTCTG

23M-GTGTCTTTGCCCAAGTATTTCTG

rs2395185 24W-GCCAAAAATTTGTCTTCCC

24M-GCCAAAAATTTTTCTTCCC

rs9858542 25W-CAAACTGACAGAAGGTATGCACT

25M-AAGCTGGCAAACTGACGGAAGGTA

rs10883365 26W-CAGACGGTTTGAAGGTATTTGTGC

26M-CAGACGGTTTGAAGGTGTTTGTGC

rs11209026 27W-AACAGATCATTCCAAACTGGGTAGG

27M-AACAGATCATTCCGAACTGGGTAGG

rs193229433 28W-CACTCCCCATTCCTCCCACTACCA

28M-CCCCATTCCTCCCCCTACCAG

rs193200096 29W-AGTGGCTGGCCCTGGTTCTG

29M-AGTGGCTGGCCTTGGTTCTG

rs193056481 30W-GGTGCCAGCCTAATTTCTATTAA

30M-GTGCCAGCCTCATTTCTATTAATT

rs121912665 31W-GGTCTGGCCCCTCCTCAGCAT

31M-GGTCTGGTCCCTCCTCAGCAT

rs113993961 32W-TGCTTTTAATACGGTAGAAATTGG

32M-GCTTTTAATAGGGTAGAAATTGGC

rs2187668 33W-GGCAGCTGAGAGTAAATGAGGACC

33M-GAGGCAGCTGAGAGTAAGTGAGGA

rs6822844 34W-TCCATAGCAAAAAGAGAGGACT

34M-TCTCCATAGCAAAAATAGAGGAC

rs6441961 35W-GGCAGCCTTGATAACATCTCCA

35M-GTAGCCTTGATAACATCTCCAGCA

rs193230349 36W-GTAACTAACCCATTCTATTTT

36M-GTAACTACCCCATTCTATTTT

rs193273640 37W-TAGTGTTGGTGGCAGGAAGTAGAA

37M-TAGTGTTGGTGTCAGGAAGTAGAA

rs193221728 38W-GTGTTCGACTGCATGGGGA

38M-GTGTTCGACTGCATGGGTA

rs193219992 39W-TTTGATAGAACTATACACGGAG

39M-TTTGATAGAACTATACATGGAG。

2.根据权利要1所述的用于肛肠疾病患病风险评估基因芯片，其特征在于：所述固相载体为硝酸纤维素膜、尼龙膜或载玻片，所述的固相载体经不同的化学修饰使其表面带有可以固定核酸分子的活性基团。

3.根据权利要1所述的用于肛肠疾病患病风险评估基因芯片，其特征在于：所述用于肛肠疾病患病风险评估基因芯片包括阳性对照探针和阴性对照探针，所述的阳性对照探针序列如SEQ ID No.79所示，所述的阴性对照探针序列如SEQ ID No.74所示。

4.一种用于肛肠疾病患病风险评估基因芯片的制作方法，其特征在于：它包括以下步骤：

(1)将固相载体预处理，待用；

5.根据权利要求4所述的用于肛肠疾病患病风险评估基因芯片的制作方法，其特征在于：所述每条寡核苷酸芯片探针在合成时5’端经氨基基团修饰。

6.根据权利要求4所述的用于肛肠疾病患病风险评估基因芯片的制作方法，其特征在于：所述固相载体为载玻片，所述的预处理为将载玻片用铬酸洗液洗涤，浸泡过夜，水洗，20wt％～25wt％氨水浸泡中过夜，水洗，然后浸入氨丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液中，用冰醋酸调节pH值至4.0～6.0，乙醇超声清洗，烘干4～5小时，戊二醛醛基化处理。

7.根据权利要求4所述的用于肛肠疾病患病风险评估基因芯片的制作方法，其特征在于：所述点样时每点点样体积为0.4～0.6nL，点心间距为500～600μm，点直径为200～300μm，每条探针重复点样2～3次；所述的固化处理为室温放置24～26小时固化。

8.一种用于肛肠疾病患病风险评估的试剂盒，其特征在于：它包括上述权利要求1-3中任一项所述的用于肛肠疾病患病风险评估基因芯片。

9.根据权利要求8所述的用于肛肠疾病患病风险评估的试剂盒，其特征在于：它还包括用于检测肛肠疾病各易感基因多态性位点扩增对应所需的引物，其序列如SEQ ID No.80-156所示，和阳性对照扩增对应所需的引物，其序列如SEQ ID No.157-158所示，见表2。

表2 PCR扩增对于所需的引物序列

位点名称引物序列

rs4939827(1) f：5′-ATATCAACAAGCCCTCTTCA-3′

r：5′-GGAGATGCTGCAAAGCATGA-3′

rs6983267(2) f：5′-CAGCTGCATCGCTCCATAGA-3′

r：5′-ATTGCAGAGTTGCACAGTTA-3′

rs3802842(3) f：5′-GCCTTCCTCTGCTGTTCCTA-3′

r：5′-ACTGCTTAAGGTGTTGATAC-3′

rs961253(4) f：5′-TCACCCATAATGCTGCTTAG-3′

r：5′-GACAGTTTAGCTCAATATGG-3′

rs137852525(5) f：5′-ATGGTCATCACGTGGAAGGT-3′

r：5′-GTGGAAGCAGGCGAGCTCAA-3′

rs104894388(6) f：5′-CACTTTCCTGTCCCATACAT-3′

r：5′-GAAGCAACAGCTCGATATCT-3′

rs1801710(7) f：5′-TTCCTTCCTCTGCTTGTCTC-3′

r：5′-TTCGCATGCACTTGTTCTTG-3′

rs193196427(8) f：5′-CTCGTCTTAACTGGATAAGG-3′

r：5′-GAGAGTATCTCAGCGTCTGT-3′

rs193123285(9) f：5′-TGCTGTGCAGGCTCAGGTCT-3′

r：5′-CTCCGTCCAGGTGTGCATGT-3′

rs2066844(10) f：5′-GCCGCACAACCTTCAGATCACAG-3′

r：5′-ATGTCAACTTGAGGTGCCCAACA-3′

rs2066845(11) f：5′-AGTCTGTAATGTAAAGCCACT-3′

r：5′-AAAACTGCAGGATAGACTCTGA-3′

rs10761659(12) f：5′-AACAAAGGAATCACTAGCAGA-3′

r：5′-GCTAAAGTTTCAGAATGCACA-3′

rs2066847(13) f：5′-ACGGTTACATTTCACTGATGGT-3′

r：5′-CCATTCCTCTCTCCCGTCAC-3′

rs11209026(14) f：5′-TTTATTGGGAATGATCGTCT-3′

r：5′-GTCACCTGTAAAATAGGCCAG-3′

rs2241880(15) f：5′-GAATCTAGAAGGACAGGCTA-3′

r：5′-AGGACCCTTTAATTGCCAG-3′

rs7714584(16) f：5′-TTAAGAACTACTTTACGGACA-3′

r：5′-GACAAATCCACAATTACAGT-3′

rs3197999(17) f：5′-CCACCCGAGCCCTAGCAAG-3′

r：5′-GCAGGCTAGTCATTGCTGT-3′

rs11190140(18) f：5′-TGGTAGCGAGCAAATGCCTA-3′

r：5′-GTTAAGCGCTCAGTACGTGTC-3′

rs17234657(19) f：5′-TATCATTTCTTTGTGTTGGGA-3′

r：5′-ATATTATGCGTATTAAGGGAC-3′

rs1893217(20) f：5′-CTGGGCTAGAGAAACACCCT-3′

r：5′-CTTCTGCCTCTACCACTTGC-3′

rs193268403(21) f：5′-ACCCACCAACATATCTGGCTA-3′

r：5′-TTCGGAATCTCCCAGAAAACCC-3′

rs193267205(22) f：5′-ACACCAGCTATGAAAGGCTA-3′

r：5′-TGCTTATGAAATGGCCCACA-3′

rs193116455(23) f：5′-TGTTACAACTGCCTACAGCAT-3′

r：5′-CAGGAGATTCCAGCAGACCC-3′

rs2395185(24) f：5′-TCCACCTATTTATCAAGGCAA-3′

r：5′-AAATAGAAAAGAAACTACGTGA-3′

rs9858542(25) f：5′-CTCTCGTGGGTACTTGCCCTC-3′

r：5′-CAGAGATTGCCCGGAGAACAAC-3′

rs10883365(26) f：5′-TCTCCCAGTGCCGACCGAAG-3

r：5′-AAATGTGGTTATCGCGTTCCAA-3

rs11209026(27) f：5′-TGTGGCCTAAAGTAAAGGTT-3

r：5′-GTCACCTGTAAAATAGGCCAG-3

rs193229433(28) f：5′-TGCACCATTTTAGTGTACGAT-3

f：5′-CTTTAAAACATGGCTACTTGGA-3

rs193200096(29) f：5′-CACTGAGCCCAACTTAAACGA-3

r：5′-GGCCCAACTGTTTTCTTGTCCA-3

rs193056481(30) f：5′-GACCATTCCTGGCTAATTGTGT-3

r：5′-TCCCCATTCTCTTCAACAGT-3

rs121912665(31) f：5′-GGCCATCTACAAGCAGTCACAG-3

r：5′-AGACCCCAGTTGCAAACCAG-3

rs113993961(32) f：5′-CACAGTTTATTTGGCACTGG-3

r：5′-AAAATGCAGAAGTTACAAGA-3

rs2187668(33) f：5′-ATATTTAAAATGTTGCCCGTT-3

r：5′-AAATGATCCCTTATTTTGCTAA-3

rs6822844(34) f：5′-TAGTTCAGGCCAGACATCCTC-3

r：5′-ATCTAGAAACTCGGTTATGGTCA-3

rs6441961(35) f：5′-TGATGACAGCACTAGCCAAC-3

r：5′-CAGAAAGTGCTGCCACAAG-3

rs193230349(36) f：5′-TGAATCCTCTACATAACTGC-3

r：5′-GGGTGTGTACATAAACCAAC-3

rs193273640(37) f：5′-CCTGGATGACAGAGTGAGAC-3

r：5′-GAGCACAACACAAATACCTT-3

rs193221728(38) f：5′-CTTTATGAAGATTCACCTCC-3

r：5′-CAATAATATTTAATGGCCTA-3

rs193219992(39) f：5′-TTTTAAACATTCTCTACCAT-3

r：5′-TGTATATATGCACACACTCA-3

阳性对照肌动蛋白 f：5′-TTAGTTGCGTTACACCCTTTC-3

r：5′-GAACGGTGAAGGTGACAGC-3 。

10.根据权利要求8所述的用于肛肠疾病患病风险评估的试剂盒，其特征在于：它还包括PCR扩增所用的PCR缓冲液，MgCl₂，dNTPmix，Taq酶。