CN105861661A - -α21.9缺失型α-地中海贫血基因检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种可快速检测‑α21_.9缺失型α‑地中海贫血基因型的试剂盒，通过在‑α21_.9缺失型α‑地贫的断裂点上游5’端和下游3端’高保守区分别设计引物21.9‑F(即引物A1)和引物21.9‑R(即引物A3)，21.9‑F结合于α‑globin蛋白基因簇的5’端位置，21.9‑R结合于α‑globin蛋白基因簇的3’端位置，在‑α21_.9缺失型α‑地贫的3’断裂点上游设计正常引物α‑F，正常引物α‑R与21.9‑R序列相同，根据PCR扩增产物电泳条带的大小就可以判断检测样本是‑α21_.9的纯合子、杂合子或正常样本，使得本发明试剂盒可以直接检测出‑α21_.9缺失型α‑地贫基因缺陷。

Description

-α21.9缺失型α-地中海贫血基因检测试剂盒

技术领域

本发明属于生物与新医药技术领域，涉及一种在临床样本中快速检测-α21_.9缺失型α-地中海贫血基因的试剂盒。

背景技术

1、关于α-地中海贫血

α-地中海贫血(Thalassemia，以下简称α-地贫)，是一组因α-珠蛋白链合成减少或不能合成，α-链/非α-链比例失衡为特征的遗传溶血性血红蛋白病。地贫是世界上最常见的人类单基因遗传血液病之一，被世界卫生组织列入危害人类健康的6种常见病，也是中国南方各省最常见、危害最大的遗传病。在我国南方α-地贫的高发区，90万人的流行病学调查得出的总发病率为2.46％，其中广西、广东、江西、四川和浙江各省(区)的发病率分别为14.95％、4.11％、2.60％、1.92％和1.20％。

人的α类珠蛋白基因位于16p13.3，长约40kb，整个α类珠蛋白基因簇共由7个基因组成，包括4个可编码基因和3个假基因：端粒-ξ₂-ψξ₁-ψα₂-ψα₁-α₂-α₁-θ-着丝粒。珠蛋白族基因表达受着严格的时空调控，其中ξ-珠蛋白基因在胚胎期表达，α₂、α₁和θ珠蛋白基因在胎儿和成人期表达。每条染色体各有2个α珠蛋白基因，一对染色体共有4个α珠蛋白基因；大多数α地贫是由于α珠蛋白基因的缺失所致，少数由基因点突变造成。若仅是一条染色体上的一个α-基因缺失或缺陷，则α-链的合成部分受抑制，称为α+地贫；若有一条染色体上的2个α-基因均缺失或缺陷，称为α0地贫。

重型α-地贫是α0地贫的纯合子状态，其4个α-珠蛋白基因均缺失或缺陷，以致完全无α-链生成，因而含有α-链的Hb A、Hb A₂和Hb F的合成均减少。患者在胎儿期即发生大量γ链合成γ₄(Hb Bart′s)。Hb Bart′s对氧的亲合力极高，造成组织缺氧而引起胎儿水肿综合症。

中间型α-地贫是α0和α+地贫的杂合子状态，是由3个α-珠蛋白基因缺失或缺陷所造成，患者仅能合成少量α-链，其多余的β链即合成Hb H(β₄)。Hb H对氧亲合力较高，又是一种不稳定血红蛋白，容易在红细胞内变性沉淀而形成包涵体，造成红细胞膜僵硬而使红细胞寿命缩短。

标准型α-地贫(轻型)是α+地贫纯合子或α0地贫杂合子状态，它仅有2个α-珠蛋白基因缺失或缺陷，故有相当数量的α-链合成，病理生理改变轻微。

静止型α-地贫是α+地贫杂合子状态，它仅有一个α-基因缺失或缺陷，α-链的合成略为减少，病理生理改变非常轻微。

根据α基因突变类型分类，地贫主要包括缺失型α-地贫(DNA片段缺失)、突变型α-地贫(点突变)。我国最常见的缺失类型为-α3_.7、-α4_.2、--SEA3种。随着α-地中海贫血机制的进一步阐明，一些新的基因缺失类型相继被发现，例如--11.1、-α2_.4、-α2_.7、--FIL、--THAI、HKαα、-α21.9等。

自从Long等报道了-α21_.9缺失型α-地贫以来，陆续有病例被检出。-α21_.9缺失型α-地贫5’断裂点位于α珠蛋白基因簇14373位置(NG_000006.1)，3’断裂点位于α珠蛋白基因簇36298位置(NG_000006.1)，缺失了长为21926bp的一段序列，并在缺失部分中间插入一段长29bp的序列。该基因型缺失片段覆盖了部分ζ₂和整个Ψζ₁–Ψα₂–Ψα₁–α₂基因，还剩余一个完整的α₁基因，为α+地贫基因型。该基因型的形成包括如下几个步骤：在α珠蛋白基因簇14370-14372(NG_000006.1)CTG的复制过程中，与36308-36306(NG_000006.1)的反义序列CTG重组；然后与36305-36294(NG_000006.1)的反义序列GGGAAGGGTGGG结合；之后14356-14362的CCTTCCC和36299-36305的CCTTCCC重组，继续36299之后的复制过程；最后产生了-α21_.9这个新的基因型。插入序列TGGGAATAAC的形成发生在14306-14320(NG_000006.1)的正义和反义序列重组的过程中。TGGG的形成由36297-36294(NG_000006.1)的反义序列重复复制而来，序列AGCT能使插入序列重新连接到14350-14353(NG_000006.1)。

在中国人群中，主要的α0地贫是--SEA和--THAI，主要的α+地贫(包括缺失型和非缺失型)是-α3_.7、-α4_.2、αCSα、αQSα和αWSα。由于中国大的人群和华南地区高的携带率，这些试剂盒可以检测出主要的地贫基因型。然而，稀有地贫基因型会在产前诊断中漏检。

-α21_.9是一个新的缺失型α+地贫基因型，与α0地贫基因型结合会造成Hb H病。在传统的地中海贫血筛查过程中，如果一个人带有这种基因型-α21_.9/αα，通过筛查无法被检测到。如果这个人与带有α0基因型的配偶生育一个小孩，应用传统的检测试剂盒就可能导致错误的产前诊断结果，导致Hb H病患儿出生。由于大的人群和华南地区高的携带率，在地中海贫血筛查时，应该仔细检查易患者的血常规数据、高效液相色谱电泳和基因型是否相互匹配。如果常规筛查结果为一个缺失型或非缺失型的纯合个体，应该考虑该个体是否携带了-α21_.9等稀有缺失基因型，以确保分型的准确性。

目前，-α21_.9缺失型α-地贫还没有有效的根治方法，主要以预防为主。因此开展-α21_.9缺失型α-地贫的检测，提早发现地贫异常基因的携带者对指导婚前及产前诊断具有重要的意义。但目前尚未有直接检测-α21_.9缺失型α-地贫的产品。

2、现有常见地贫基因检测技术

目前对地贫筛查方法主要有血常规测定、红细胞脆性检测、血红蛋白电泳等，这些方法的共同不足是只能对患者进行初步的地贫筛查，无法对患者基因型进行确诊，而且对轻型地贫容易漏诊。随着技术的发展，出了基因诊断地贫的方法，主要包括以下几点：southern杂交、多重Gap-PCR、多重连接酶依赖探针扩增技术(MLPA)、PCR-寡核苷酸探针(ASO)法、实时荧光定量PCR、斑点杂交、直接测序技术等。各种基因诊断技术特点如下：

(1)Southern印迹杂交-限制性酶谱分析法：曾是α-地贫基因诊断的主要方法，但由于操作繁琐，所需时间较长，一般只适合研究使用，不适于临床的推广应用。

(2)RFLP(限制性片段长度多态性)连锁分析：其先决条件是在该家庭中至少有一个患儿或一个正常儿，以前是β地贫产前诊断最常用的方法，限制性片段长度的差异反应了各种基因型的差异，是一种间接测试法，对部分家系不能诊断，且操作比较繁琐。

(3)寡核苷酸探针技术：可直接检出受试者的缺陷基因,鉴定出突变基因类型，弥补了RFLP连锁分析的不足，可快速简便地检测已知突变的地贫基因(αT和βT)，为地贫患者进行基因诊断和产前诊断。该法具灵敏、简便、特异的优点，为地贫点突变基因的诊断提供了直接而有效的方法，但要求严格的实验条件和相当数量的DNA。

(4)依赖探针连接扩增技术(MLPA)：MLPA是2002年发展起来的，该方法能对所有的缺失基因型检测以及未知的基因型开展检测，具有高效、特异，在同一反应管内检测多达45个不同核酸序列拷贝数变化；常用于α、β-地贫大片段缺失基因型的检测，但由于检测成本高，操作繁琐，耗时较长，检测流程长达16小时，且需要特殊的仪器设备，一般只用于研究使用，不便于分子筛查方法的推广应用。

(5)测序技术：测序技术直接对DNA序列的分析，一直被认为是临床检测的金标准；目前测序技术面临着标本的处理(核酸提取)扩增标准化认证问题，信号检测、测序平台特异的出错和纠错问题，以及生物信息学方面可能出现的问题，临床验证程序和标准化问题等，一直没有有效的解决，因此还未能在临床中推广应用。

(6)反向斑点杂交(Reverse Dot Blot，RDB)法：这一方法具有灵敏度高、特异性好和准确性高等优点，目前已广泛应用于α、β-地贫点突变的临床产前诊断和基因诊断。主要原理：将大量寡核苷酸作为探针固定于固相支持物上，借助碱基互补，与经PCR扩增、与生物素标记的样本靶分子进行杂交，经化学显色给出杂交信号，通过计算机分析获得信息。这种方法灵敏，但耗时较长，一般用于点突变检测。

(7)实时荧光定量PCR(Taqman探针法)：实时荧光定量PCR是目前临床诊断系统最受欢迎的检测平台，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积，实时监测PCR进程及连续分析扩增相关的荧光信号，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在地中海贫血检测中，报道的均只局限于一种基因型的检测，工作量大，由于探针需要进行荧光标记，检测成本高。

(8)Gap-PCR及其改进的技术：由于其易操作，此技术广泛用于缺失地贫的分子诊断，在缺失区域两端设计一对引物，正常情况下两引物扩增产物很长不属于扩增的范围，而出现缺失区域的时候能出现特异性的扩增。1990年Lebo等应用PCR技术检测α-地中海贫血1，Dode和Baysal等应用PCR技术检测α-地中海贫血2。目前市场上以Gap-PCR开发的试剂盒只能检测中国最常见的3种缺失型-α3_.7、-α4_.2和--SEA，而不能检测-α21_.9等非常见的缺失型α-地贫。

3、现有产品及专利

尽管检测地贫的方法和产品很多，但是目前尚未有直接、快速检测-α21_.9缺失型地贫的产品。本公司相关专利为《用于诊断地中海贫血的DNA芯片及其制备方法》(专利号ZL02117287.0)、《诊断α-地中海贫血的核酸膜条及试剂盒》(专利号ZL200710074203.5)、《用于诊断β-地中海贫血的核酸杂交膜条及试剂盒》(专利号ZL200510034015.0)和《α和β地中海贫血基因检测的核酸膜条及试剂盒》(专利号ZL201210494748.2)，这些专利和现在本公司申请发明专利不属于同一个技术平台，与本公司申请发明专利相关的已经公开或者有权的专利相关统计对比如下，见表1。

表1

目前，我国临床应用的诊断缺失型α地贫的试剂盒均采用多重Gap-PCR技术，主要针对--SEA、-α3_.7和-α4_.2进行检测，如亚能生物技术(深圳)有限公司、深圳益生堂生物科技有限公司和广州达安基因公司的α-地贫检测试剂盒；广东凯普生物科技股份有限公司基于PCR与液相芯片杂交法结合开发的单管扩增同时检测α和β地中海贫血基因试剂盒也只外加了α-地贫的3种突变基因型(αCSα、αQSα、αWSα)的检测，-α21_.9缺失型α-地贫不在其检测的范围。

现有α-地贫检测产品专利技术中，未见直接进行-α21_.9缺失型α-地贫的检测，均只出现基于--SEA、-α3_.7、-α4_.2、--THAI、-α2_.8等的检测技术及方法。

4、现有产品及其缺点：

(1)目前我国临床应用的诊断缺失型α地贫的试剂盒均是基于多重Gap-PCR原理开发的，实现在同一PCR体系中对多种缺失地贫基因型(--SEA、-α3_.7、-α4_.2)的检测，如亚能生物技术(深圳)有限公司、深圳益生堂生物科技有限公司和广州达安基因公司各自开发的α-地中海贫血检测试剂盒，这些产品均只能实现这3种常见的缺失地贫基因型的检测。

(2)广东凯普生物科技股份有限公司基于PCR与液相芯片杂交法结合开发的单管扩增同时检测α和β地中海贫血基因试剂盒，包含了α-地贫的3种缺失型和3种突变基因型的检测以及β-地贫的19个点突变位点，而-α21_.9缺失型α-地贫不在其检测的范围内。

(3)现有α-地中海贫血检测产品专利技术中，未见直接针对-α21.9缺失型α-地贫的检测。

(4)目前-α21.9缺失型α-地贫的检测均是根据现有地贫检测试剂盒检测结果异常，并结合遗传分析父母基因型来实现的，没有一种快速、直接的用于检测稀有型地贫的方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种可快速检测-α21_.9缺失型α-地中海贫血基因型的试剂盒。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：-α21.9缺失型α-地中海贫血基因检测试剂盒，包括PCR反应液，所述PCR反应液包括：

引物A1，其碱基序列如SEQ ID NO：1；

引物A2，其碱基序列如SEQ ID NO：2；

引物A3，其碱基序列如SEQ ID NO：3。

其中，每21体积份PCR反应液中含有：

水：6.1体积份；

5*Q buffer：5.0体积份；

10*CoralLoad PCR Buffer：2.5体积份；

5M甜菜碱：2.5体积份；

DMSO：0.5体积份；

2.5mM dNTP：2.0体积份；

10μM引物A1：0.5体积份；

10μM引物A2：0.5体积份；

10μM引物A3：0.9体积份；

5U/μL Hotstar-Taq DNA polymerase：0.5体积份。

本发明的有益效果在于：通过在-α21_.9缺失型α-地贫的断裂点上游5’端和下游3端’高保守区分别设计引物21.9-F(即引物A1)和引物21.9-R(即引物A3)，21.9-F结合于α-globin蛋白基因簇的5’端位置，21.9-R结合于α-globin蛋白基因簇的3’端位置，在-α21_.9缺失型α-地贫的3’断裂点上游设计正常引物α-F(即引物A2)，正常引物α-R与21.9-R序列相同，根据PCR扩增产物电泳条带的大小就可以判断检测样本是-α21_.9的纯合子、杂合子或正常样本，使得本发明试剂盒可以直接检测出-α21_.9缺失型α-地贫基因缺陷，较在产前诊断利用巢式PCR结合遗传分析操作简单、省时、节约成本，为更全面的进行地贫筛查创造条件，为婚前、产前检测和孕期胎儿的地中海贫血诊断提供科学的依据。

附图说明

图1为本发明实施例1中各引物位置及Gap-PCR检测-α21_.9缺失型α-地贫原理图解。

图2为本发明实施例3中对2例-α21_.9缺失型α-地贫样本检测结果，图中泳道M为DL2000Markers，泳道1、2为(-α21_.9)样本，泳道3为阳性质控，泳道4为阴性质控。

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。

本发明最关键的构思在于：在-α21_.9缺失型α-地贫的断裂点上游5’端和下游3端’高保守区分别设计引物21.9-F(即引物A1)和引物21.9-R(即引物A3)，21.9-F结合于α-globin蛋白基因簇的5’端位置，21.9-R结合于α-globin蛋白基因簇的3’端位置。在-α21_.9缺失型α-地贫的3’断裂点上游设计正常引物α-F(即引物A2)，正常引物α-R与21.9-R序列相同，根据PCR扩增产物电泳条带的大小就可以判断检测样本是-α21_.9的纯合子、杂合子或正常样本。

发明人针对本发明试剂盒的PCR体系及PCR增强剂做了大量的筛选与优化工作后，成功筛选到5×Q buffer与DMSO和甜菜碱的最佳增强剂组合，加入到反应液中进行进一步的体系优化，最终确定的浓度配方，可针对多重PCR体系中不同GC含量模板达到较高的扩增效率。

本发明涉及的术语和缩略语：

PCR：Polymerase Chain Reaction聚合酶链式反应。

α-地贫：α-地中海贫血的简称(英文thalassemia)，是一组因α-珠蛋白链合成减少或不能合成，α-链/非α-链比例失衡为特征的遗传溶血性血红蛋白病。

--SEA：东南亚α-地贫，α-珠蛋白基因簇缺失了约20kb序列，缺失部分包含α₁、α₂基因。

-α3_.7：为α-地贫的一种，α-珠蛋白基因簇缺失了约3.7kb序列，缺失部分包含1/2的α₂和1/2的α₁融合基因。

-α4_.2：为α-地贫的一种，α-珠蛋白基因簇缺失了约4.2kb序列，缺失部分包含全部α₂基因。

-α2_.8：为α-地贫的一种，α-珠蛋白基因簇缺失了约2.8kb序列，缺失部分包含全部α₂基因。

-α2_.4：为α-地贫的一种，α-珠蛋白基因簇缺失了约2.8kb序列，缺失部分包含全部α₁基因。

--FIL：菲律宾α-地贫，α-珠蛋白基因簇缺失了约32kb序列，缺失部分包含α₁、α₂基因。

--THAI：泰国型α-地贫，α-珠蛋白基因簇缺失了约33.5kb序列，缺失部分包含α₁、α₂基因。

--11.1：中国国内发现的新缺失型α-地贫，α-珠蛋白基因簇缺失了约11.1kb序列，缺失部分包含α₁、α₂基因。

-α21_.9：为α-地贫的一种，α-珠蛋白基因簇缺失了约21.9kb序列，缺失部分包含全部α₂基因。

实施例1

1、引物的设计及筛选

本发明利用文献报道的缺失型引物对收集的临床已知基因型阳性样本进行确认，以此阳性样本作为阳性对照模板，进行引物筛选及PCR程序优化。

由于α基因簇之间的高度同源性和高GC含量，采用通常的PCR扩增是很困难的，常常得不到预期产物或产量低、特异性差，特别是扩增高GC含量重复序列的大片段尤其困难。其原因可能是由于此类模板熔点高，退火时引物与模板容易形成稳定的二级结构妨碍DNA聚合酶在模板上的推进，以及模板上可能存在多个非特异性的引物局部复性位点，导致非特异性扩增，而高GC含量的重复序列扩增又进一步加剧了非特异性扩增的产生。所以在进行大片段的扩增时，如果模板为高GC含量的重复序列，会出现大量的非特异扩增现象或者导致PCR反应无法正常进行。为了建立扩增高GC含量的长片段重复序列的有效方法，需要对引物、Taq酶和反应体系中的促解链剂进行比较和选择。

通过研究发现，为了有效地扩增高GC含量的长片段重复序列，引物设计除了要遵循一般的原则外，还需要特别注意以下规则：1)引物结合部位要尽量远离GC富集区域；2)引物链中GC含量占50％-70％左右；3)T_m值高于60℃；4)在能保证PCR扩增的特异性和有效性条件下，尽量增长引物的长度来提高PCR扩增效率。

对人α-globin基因簇序列进行比对分析，-α21_.9缺失型α-地贫的断裂点位置上游为14372-14373位置(Genebank No:NG_000006.1)，下游为36298-36299位置(Genebank No:NG_000006.1)，在断裂点上游5’端和下游3端’高保守区分别设计引物(21.9-F和21.9-R)，21.9-F结合于α-globin蛋白基因簇的5’端位置，21.9-R结合于α-globin蛋白基因簇的3’端位置。在-α21_.9缺失型α-地贫的3’断裂点上游设计正常引物α-F，正常引物α-R与21.9-R序列相同。图1为各引物位置及Gap-PCR检测-α21.9缺失型α-地贫原理图解。这样根据PCR扩增产物电泳条带的大小就可以判断检测样本是-α21_.9的纯合子、杂合子或正常样本。如果电泳仅出现正常条带，表明检测样本无该缺失基因；如果电泳仅出现-α21_.9条带，表明检测样本为-α21_.9的纯合子；如果电泳出现正常条带和-α21_.9条带，表明检测样本为-α21_.9的杂合子；如果电泳没有任何条带，表明扩增失败，没有加入基因组或加入的基因组浓度在检测限以下。

本发明的引物需注意：(1)首先，评估各条引物间的兼容性，排除复杂引物二聚体的产生，降低非特异性扩增，(2)其次，将各条引物的退火温度控制在同一个温度范围内，避免不同退火温度引起的非特异性扩增和效率高低不等的现象，(3)最终，设计不同长度的扩增片段对各个目的产物进行区分。最终确定的-α21_.9缺失型α-地贫检测引物序列见表2。

表2

编号	序列(5’-3’)
		21.9-F(即引物A1，序列号为SEQ ID NO：1)	GGGACAGTGAGGAAGGGACA
α-F(即引物A2，序列号为SEQ ID NO：2)	TGGAATCCATGCTGGGAAGT
		21.9-R/α-R(即引物A3，序列号为SEQ ID NO：3)	GCACCGGGAAGGAATAAACA

2、PCR增强剂的筛选与优化

通过合理设计，选择特异性好的扩增引物，为了达到引物扩增效率更高，本申请还选择了一批不同的PCR增强剂或热稳定剂进行筛选优化。

PCR增强剂可增加所需PCR产物的产量或减少非特异性产物。有许多PCR增强剂，原理各不相同，且不能对所有PCR反应都起作用，根据作用原理可大致分为三类：

(1)用于扩增高GC含量或形成复杂二级结构的模板(共溶剂)。甜菜碱(betaine)、二甲基亚砜(DMSO)、甲酰胺(formamide)和甘油等适合于扩增高GC含量和形成复杂二级结构的模板。

(2)用于保护DNA聚合酶的活性和稳定性。有的反应中，0.1mg/ml的BSA、0.1-10％的明胶(gelatin)或非离子型的去污剂，可以解决一些扩增失败的问题，这类试剂可以增加聚合酶的稳定性，减少试剂在管壁上的吸附。

(3)用于优化引物和模板的结合。铵离子的添加可以减少引物与模板的错配，提高反应的特异性，可以让PCR对反应条件的要求更低，很多PCR试剂都包含了10-20mM的硫酸铵。

本发明先选择商品化的PCR增强剂Qiagen的5×Q buffer进行扩增效率验证，同时在PCR系统中测试上述几种类型的添加剂(甘油、乙醇、DMSO、甜菜碱等)及各种组合，摸索扩增目的基因的最佳条件。结果发现：无或单一的添加剂都不能获得目的基因片段，只有当以Qiagen的5×Q buffer作为主要的PCR增强剂，同时使用DMSO和甜菜碱做辅助增强剂这一组合体系，并在适当浓度时才能够获得特异产物。因此5×Q buffer与DMSO和甜菜碱为最佳增强剂组合，加入到反应液中进行体系优化，最终确定甜菜碱浓度为0.5M和DMSO为2％时扩增效果最佳。

3、引物浓度以及反应体系其他组分浓度确定

引物终浓度范围在0.1-1μM，MgCl₂终浓度选择1.5mM-9mM，等浓度的四种脱氧三磷酸腺苷(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)混合液dNTP终浓度选择100nM-300nM，DNA聚合酶终浓度选择1-7.5IU/反应，利用正交试验方法，通过大量实验对比，最终确定最优的PCR反应液配方见表3。

表3

试剂	1人份(μL)
		纯水	6.1
5*Q buffer(Qiagen)	5.0
		10*CoralLoad PCR Buffer(Qiagen)	2.5
5M甜菜碱	2.5
		DMSO	0.5
2.5mM dNTP	2.0
		10μM Primer 21.9-F(引物A1)	0.5
10μM Primerα-F(引物A2)	0.5
		10μM Primer 21.9-R/α-R(引物A3)	0.9
5U/μL Hotstar-Taq DNA polymerase(Qiagen)	0.5
		总量	21.0

注：DNA加样量为4μL，总反应体积为25μL。

4、PCR反应条件的确定

本试剂采用常规PCR体系。反应条件分以下步骤优化：

经过大量实验对比优化，最佳反应条件为：

退火温度和退火时间对PCR扩增效率和特异性扩增影响较大，上述条件优化结果显示退火温度偏低会有非特异性扩增条带，导致假阳性结果；温度偏高扩增效率偏低，灵敏度下降。本实验通过控制退火温度和退火时间可以做到对其他基因型无非特异性扩增，特异性好，扩增效率高，灵敏度可达10ng/μL。

5、本发明用于缺失基因型的检测过程依次包括如下步骤：

(1)提取待检测样品DNA：从外周血白细胞、绒毛或羊水细胞提取基因组DNA，浓度在10-500ng。

(2)PCR扩增：以提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到扩增产物。

(3)电泳检测鉴定PCR产物：取PCR扩增中的产物3.0μL；点样于1.2％的琼脂糖胶外加0.005％核酸染料；在5V/cm电压下电泳约40分钟，取出于凝胶成像系统里观察结果并拍照保存。

(4)结果判读：-α21_.9缺失型α-地贫扩增产物长度961bp，正常基因型扩增产物长度1598bp。如果电泳仅出现正常条带，表明检测样本无该缺失基因；如果电泳仅出现-α21_.9条带，表明检测样本为-α21_.9的纯合子；如果电泳出现正常条带和-α21_.9条带，表明检测样本为-α21_.9的杂合子；如果电泳没有任何条带，表明扩增失败，没有加入基因组或加入的基因组浓度在检测限以下。

(5)对检测为阳性的PCR产物进行直接测序验证，测序用引物为扩增用引物。

实施例2

本发明试剂盒对临床样品的检测情况

使用本发明试剂盒对临床300例样本进行检测，结果2例为-α21_.9缺失型α-地贫杂合子，与测序结果进行对比，阳性符合率和阴性符合率均为100％，准确率达100％，本发明试剂盒检测临床样本检测结果见表4，本发明试剂盒检测结果和测序结果对比统计结果见表5。

表4

表5

注：测序结果中阳性是指本发明试剂盒检测范围内基因型阳性，阴性是指本发明试剂盒检测范围之外的其他基因型样本阳性或者阴性。

本产品的性能指标：

(1)灵敏度：使用本发明试剂盒对10例-α21_.9缺失型α-地贫临床阳性样本进行灵敏度分析，每个样本包含7个浓度梯度，确定各基因型能够稳定检出的基因组DNA最低浓度为10ng/μL；

(2)准确性：用10例-α21_.9缺失型α-地贫临床阳性样本和20例临床阴性样本，选择高、中、低3个浓度，每个浓度重复3次，分别用3批产品来检测，分别计算阳性符合率和阴性符合率。结果显示相应的基因型，研究结果与测序结果完全符合，产品阳性符合率和阴性符合率都达100％；

(3)特异性：通过干扰筛查试验，临床正常剂量的枸橼酸钠、EDTA不是本品的干扰物质；服用过去铁胺的病人的样本用本品检测时不影响检测结果，说明去铁胺不是本品的干扰物质；溶血样本(即使是完全溶血)不会干扰本试剂盒检测结果；脂血样本中甘油三酯和黄疸样本中总胆红素的浓度分别为13.8mmol/L和359.28μmol/L，均已达到临床的极高水平，却对本品检测无干扰，所以当甘油三酯≤13.8mmol/L或总胆红素≤359.28μmol/L对本试剂盒的检测结果均无干扰，不是本品的干扰物质；肝素钠是本品的外源性干扰物质，干扰效果评价试验结果表明，按15IU肝素钠抗凝1mL血液比例处理的全血样本不适用于本试剂盒。用本产品检测8例本产品检测范围外的临床样本，包括1例α-地贫阴性样本(αα/αα)、3例β-地中海贫血临床样本(41-42M/N、654M/N和-28M/N各1例)、1例G-6-PD临床样本、1例缺铁性贫血临床样本、1例感染弓形虫的全血样本和1例乙肝病毒DNA临床样本，前7例结果均为阴性，乙肝病毒DNA样本结果为无信号，即8例均无交叉反应。

(4)重复性：不同批号产品，不同人(2人)操作，一天做2次，共做2天，每次试验每个参考品重复3次检测。在不同实验条件下能多次重复稳定检测α-地贫基因型，结果显示一致。

(5)稳定性：本发明试剂盒在有效期内使用完全可满足以上各指标。

实施例3

本发明试剂盒的临床应用

1、预期用途

对α-地中海贫血中的稀有基因型-α21_.9缺失型α-地贫进行检测，为地贫的遗传筛查提供可靠的依据。在临床应用中，当使用传统地中海贫血检测试剂盒(检测--SEA，-α3_.7和-α4_.2)检测结果为--SEA纯合，但是患者为成人或临床表现为Hb H病，α地贫点突变(检测αCSα、αQSα、αWSα)未检出，做遗传分析时，患者双亲只有一方携带--SEA基因，而另一方无--SEA基因，可以进行-α21_.9缺失型α-地贫的检测。同时，该试剂盒也可以用作-α21_.9缺失型α-地贫的大规模人群筛查。

2、检验原理

本试剂盒是基于PCR结合琼脂糖凝胶电泳的技术原理，在-α21_.9缺失型α-地贫断裂点上下游位置相对保守区域进行特异性的扩增，实现对-α21_.9缺失型α-地贫的检测。

3、主要组成成分如表6

表6

4、适用仪器

PCR基因扩增仪：ABI 9700、黑马9600、C1000TouchTM Thermal Cycler(Bio-RAD)；电泳仪：Powerpac Basic(Bio-RAD)；凝胶成像分析系统：UV-3C(珠海黑马)。

5、储存条件及有效期

储存条件：试剂盒避光储存于-18℃以下，避免反复冻融。

有效期：6个月。

6、样本要求

(1)本试剂盒样本来源为抗凝全血，所用抗凝剂为枸橼酸钠或EDTA，不能使用肝素抗凝。

(2)样本采集：抽取静脉血1-5mL入含有抗凝剂的管中，标记好样本信息。

(3)血样保存：抗凝全血在室温放置不超过24小时，2-8℃保存不超过一个月，-18℃以下保存不超过两年，-70℃可长期保存，冷冻保存时应避免反复冻融。

(4)血样运输：抗凝全血运输时需用冰壶或泡沫箱加冰袋密封，应保证冰袋不化冻，且在途时限不宜超过72小时。

7、检验方法

7.1DNA的提取

本试剂盒对人基因组DNA的提取方法没有指定要求，一般可用实验室常规方法(酚-氯仿抽提法)或试剂盒提取人基因组DNA，推荐使用亚能生物技术(深圳)有限公司的全血DNA提取试剂盒。若采用亚能生物技术(深圳)有限公司的全血DNA提取试剂盒，直接按说明书加样；若用酚-氯仿或其它方法提取DNA，则要测定DNA浓度，必要时进行浓缩或稀释，将DNA浓度调整至10-200ng/μL后才能进行检测实验。

7.2PCR扩增

取出试剂盒的PCR反应液，在管壁或管盖上做好标记，于5000rpm短暂离心，然后分别加入已提取的待测样本DNA 4μL，反应总体系为25μL，设置阴、阳性对照，短暂离心后置于PCR检测仪中进行扩增。

扩增程序如下：

7.3电泳检测:取3.0μL扩增产物直接点样电泳(已加电泳染料)，1.2％的琼脂糖胶外加适量核酸染料；5V/cm电压下电泳40分钟，电泳结束后，取出于凝胶成像系统里观察结果并拍照保存。

7.4实验成立条件的设定

(1)本产品要求每次检测都应设置一个阳性质控，以监测扩增条件，结果应为电泳出现961bp条带。若无带，则说明实验失败，提示PCR扩增失败，应重新做检测。

(2)本产品要求每次检测都应设置一个阴性质控，以对污染进行监测，阴性质控的结果应为电泳没有条带。若阴性质控有一条或多条带，则提示本次实验有污染，应消除污染后重新检测。

(3)结果判读：-α21_.9缺失型α-地贫扩增产物长度961bp，正常基因型扩增产物长度1598bp。如果电泳仅出现正常条带，表明检测样本无该缺失基因；如果电泳仅出现-α21_.9条带，表明检测样本为-α21_.9的纯合子；如果电泳出现正常条带和-α21_.9条带，表明检测样本为-α21_.9的杂合子；如果电泳没有任何条带，表明扩增失败，没有加入基因组或加入的基因组浓度在检测限以下。检测结果如图2所示，泳道M为DL2000Markers，泳道1、2为(-α21_.9)样本，泳道3为阳性质控，泳道4为阴性质控。

8、检验结果的解释

8.1PCR扩增没有产物：

(1)确认DNA提取及PCR过程无操作失误；

(2)提取的样品DNA浓度过低，PCR时应增加DNA用量；

(3)患者基因型在本试剂盒检测范围外，本试剂盒无扩增。

8.2扩增产物浓度太高：建议降低电泳检测时的上样量或者选取较大的点样孔进行电泳。

9、检验方法的局限性

本试剂盒只检测-α21_.9缺失型α-地贫，作为α-地贫诊断的补充。其他稀有突变基因型可结合相应的检测试剂盒或测序进行检测。

10、产品性能指标

(1)灵敏度：使用本发明试剂盒对10例-α21_.9缺失型α-地贫临床阳性样本进行灵敏度分析，每个样本包含7个浓度梯度，确定各基因型能够稳定检出的基因组DNA最低浓度为10ng/μL；

(2)准确性：用10例-α21_.9缺失型α-地贫临床阳性样本和20例临床阴性样本，选择高、中、低3个浓度，每个浓度重复3次，分别用3批产品来检测，分别计算阳性符合率和阴性符合率。结果显示相应的基因型，研究结果与测序结果完全符合，产品阳性符合率和阴性符合率都达100％；

(3)特异性：通过干扰筛查试验，临床正常剂量的枸橼酸钠、EDTA不是本品的干扰物质；服用过去铁胺的病人的样本用本品检测时不影响检测结果，说明去铁胺不是本品的干扰物质；溶血样本(即使是完全溶血)不会干扰本试剂盒检测结果；脂血样本中甘油三酯和黄疸样本中总胆红素的浓度分别为13.8mmol/L和359.28μmol/L，均已达到临床的极高水平，却对本品检测无干扰，所以当甘油三酯≤13.8mmol/L或总胆红素≤359.28μmol/L对本试剂盒的检测结果均无干扰，不是本品的干扰物质；肝素钠是本品的外源性干扰物质，干扰效果评价试验结果表明，按15IU肝素钠抗凝1mL血液比例处理的全血样本不适用于本试剂盒。用本产品检测8例本产品检测范围外的临床样本，包括1例α-地贫阴性样本(αα/αα)、3例β-地中海贫血临床样本(41-42M/N、654M/N和-28M/N各1例)、1例G-6-PD临床样本、1例缺铁性贫血临床样本、1例感染弓形虫的全血样本和1例乙肝病毒DNA临床样本，前7例结果均为阴性，乙肝病毒DNA样本结果为无信号，即8例均无交叉反应。

(4)重复性：不同批号产品，不同人(2人)操作，一天做2次，共做2天，每次试验每个参考品重复3次检测。在不同实验条件下能多次重复稳定检测α-地贫基因型，结果显示一致。

(5)稳定性：本发明试剂盒在有效期内使用完全可满足以上各指标。

11、注意事项

(1)本试剂盒只用于体外检测。

(2)在运输过程中会有PCR反应液附着在管壁/盖上，因此请在使用前先离心，以保证PCR反应体系的体积及防止潜在的污染。

(3)PCR Mix所含指示剂在扩增前有色差属正常现象，不影响扩增。

(4)保存温度-18℃以下。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (2)

1.-α21_.9缺失型α-地中海贫血基因检测试剂盒，其特征在于：包括PCR反应液，所述PCR反应液包括：

引物A1，其碱基序列如SEQ ID NO：1；

引物A2，其碱基序列如SEQ ID NO：2；

引物A3，其碱基序列如SEQ ID NO：3。

2.根据权利要求1所述的-α21_.9缺失型α-地中海贫血基因检测试剂盒，其特征在于：每21体积份PCR反应液中含有：

水：6.1体积份；

5*Q buffer：5.0体积份；

10*CoralLoad PCR Buffer：2.5体积份；

5M甜菜碱：2.5体积份；

DMSO：0.5体积份；

2.5mM dNTP：2.0体积份；

10μM引物A1：0.5体积份；

10μM引物A2：0.5体积份；

10μM引物A3：0.9体积份；

5U/μL Hotstar-Taq DNA polymerase：0.5体积份。