CN101886115A - 三个microRNA在人急性髓系白血病诊断和治疗中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及三个miRNAs，miR-451、miR-29a和miR-142-3p，在急性髓系白血病(AML)诊断和治疗中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及3个microRNA的功能及其应用，更具体地，本发明涉及在人急性髓系白血病(AML)病人外周血单个核细胞中表达明显减少的miR-451、miR-29a和miR-142-3p的功能及其在AML诊断、预后和治疗中的应用。
背景技术
miRNA是近年来新发现的一类非编码小分子RNA，其长度通常在19-25个核苷酸(nt)。在细胞核内，编码miRNA的基因首先在RNA聚合酶II作用下转录生成初级转录物，随后经过一系列剪切和向胞浆的运输过程产生成熟的miRNA分子。这些miRNA分子通过与靶基因mRNA分子互补配对抑制其翻译或使其降解(Voinnet O，Cell.136：669-87，2009)。自从1993年在线虫中发现第一个miRNA分子以来，到2009年3月，在Sanger miRBaseSequence database ver.12.0上共收录了9277个成熟miRNAs，其中人类miRNA 706个。miRNA已被公认为是多细胞生物基因表达转录后水平调控的一种普遍方式，而且最近的研究表明，miRNA还可以在不同层次调节基因的表达(如转录调节和表观遗传调节等)，预示着miRNA更重要和深远的意义(Chang TC et al.，Annu Rev Genomics Hum Genet.8：215-39，2007；Stefani G et al.，Expert Opin Biol Ther.7：1833-40，2007；Bartel DP，Cell.136：215-33，2009；Gangaraju VK，et al.，Nat Rev Mol Cell Biol.10：116-25，2009)。随着研究的深入，miRNA已被证明在许多重要的生命过程，如发育、代谢、细胞增殖、凋亡及分化过程中起重要作用。如miR-181被证明可以促进小鼠B淋巴细胞的分化；miR-1和miR-133在人心肌细胞发育中起重要作用；miR-24可以促进人骨骼肌的发育；miR-199a*通过参与ERK信号通路调节细胞的增殖和凋亡；miR-34家族的几个成员则与抑癌基因p53协同作用参与了许多重要生理过程等(Chen CZ，et al.，Science.303：83-6，2004；Xu C，et al.，J Cell Sci.120：3045-52，2007；Sun Q，et al.，Nucleic Acids Res.36：2690-9，2008；Migliore C，et al.，Cancer Res.68：10128-36，2008；Yamakuchi M，et al.，Cell Cycle.8：712-5，2009)。
由于miRNA的数目相对有限(至今在人类发现706个miRNA)，成熟分子的长度比较均一(约为19-25nt)，这为整体规模上检测其表达提供了便利，也为其作为疾病或肿瘤标志物奠定了基础。已有许多针对miRNA与特定疾病相关性的报道，人们也开始探索这些miRNA分子作为新的分子标志应用于临床诊断并可能作为未来临床治疗的靶点。比如miR-9和miR-223与卵巢癌相关；miR-21在约92％的胃癌病人中表现为上调趋势；miR-34a和miR-7都以类似抑癌基因的功能在神经母细胞瘤的发生中发挥作用；miR-19a和miR-21表现出与Cowden综合症的显著相关性。在肿瘤治疗研究方面，引入miRNA基因治疗补偿缺失的miRNA基因已经在小鼠模型中取得很好效果。同时通过注射反义寡核苷酸可以直接作用于体内异常激活的miRNA，并且效果显著(Osaki M，et al.，Biomarkers.13：658-70，2008；Waldman SA，et al.，FEBS J.276：2157-64，2009；Nelson KM，et al.，Mol Cancer Ther.7：3655-60，2008)。
miRNA与血液系统密切相关，不仅表现为特定的miRNA在特异的血细胞链系中表达，还陆续发现了若干在造血细胞分化中起重要作用以及在血液系统疾病发生中起重要作用的miRNA分子，如在正常人髓系细胞中富集的miR-223参与了粒系发生过程；miR-221和miR-222通过调节靶基因Kit抑制正常的红系分化过程；miR-150在成熟淋巴细胞中特异表达，它的一个重要靶标就是调控淋巴细胞生长发育多个步骤的转录因子c-Myb；miR-24最近也被证实可以抑制活化素诱导的血红蛋白合成(Fazi F，et al.，Cell.123：819-31，2005；Felli N，et al.，Proc Natl Acad Sci USA.102：18081-6，2005；Wang Q，et al.，Blood.111：588-95，2008)。
在miRNA与血液系统恶性疾病的关系中研究最为深入的是miR-15a和miR-16-1与人慢性淋巴细胞白血病(CLL)的相关性。miR-15a和miR-16-1定位于CLL中最普遍的基因组织异常-13q14.3区域的杂合缺失和转座位置，该缺失直接导致它们的表达减低。miR-15a和miR-16-1通过靶向抗凋亡基因BCL2，以类似于抑癌基因的作用抑制B淋巴细胞的过度增殖，而它们的缺失则导致B细胞增殖能力显著增强，从而脱离正常的增殖凋亡平衡走向恶性转化的途径。体外实验证明miR-15a和miR-16-1有望作为天然的BCL2“抑制剂”应用于临床治疗CLL及其它BCL2过表达引起的肿瘤(Cimmino A，et al.，Proc Natl Acad Sci USA.102：13944-9，2005；Calin GA，et al.，N.Engl.J.Med.353：1793-801，2005)。此外，还有几个miRNA也表现出与白血病的相关性，在弥漫性大B细胞淋巴瘤中(Diffuse large B celllymphoma，DLBCL)，miR-155在具有激活B细胞亚型中显现而在幼稚B细胞亚型中不显现，而前者比后者的侵蚀性强，因此miR-155可能成为DLBCL临床诊断指标；miR-17-92基因簇定位于一段常在B细胞淋巴瘤异常扩增的DNA区域，结果是成熟的miRNA在B细胞淋巴瘤中明显增加。miR-17-92基因簇与另一个原癌基因c-Myc协同作用可以促使小鼠造血干细胞提前癌变，且肿瘤的恶性程度更高。miR-142正好位于侵润性淋巴细胞瘤白血病中常见的t(8；17)号染色体异位区域，与c-Myc基因高表达有关；miR-21也被证实与多发性骨髓瘤的密切关联(Eis PS，et al.，Proc Natl Acad Sci USA.102：3627-32，2005；O′Donnell KA，et al.，Nature.435：839-43，2005)。
白血病是人造血系统恶性肿瘤，是国内十大高发恶性肿瘤之一，其特点为造血组织中某一类型的白血病细胞在骨髓或其他造血组织中发生恶性增生，并侵润体内各脏器、组织，导致正常的造血细胞受到抑制，产生各种症状。在我国，以AML的年发病率最高，约占所有白血病的58.7％。AML是获得性造血祖细胞变异而引起的克隆性疾病，特点为骨髓中髓系祖细胞明显增生而分化受阻，同时抑制正常造血，外周血白细胞有量与质的异常，常伴有贫血和血小板减少。AML共分为7种亚型，即M1-M7。
从细胞遗传学角度，AML可以分为两大类：约52％的AML病人具有染色体异常(包括平衡易位染色体和非平衡易位染色体)，剩余的48％为染色体正常。从预后的存活率来看，带有平衡易位染色体的AML病人预后最佳，其次为染色体正常的一组，预后效果最差的是带有非平衡易位染色体的AML病人。然而，在没有染色体异常的患者中也存在预后完全不同的两个亚群，这两个亚群还不能从细胞遗传学角度进行区分。目前，AML患者的治疗方案也主要都是根据细胞遗传学因素，但是对于那些染色体正常的中度或危险患者，还没有明确的治疗方案。已有研究者利用cDNA芯片得出的基因表达谱对患者进行分类，为治疗和预后提供依据，并为像骨髓移植这种风险大但是效果更明显的治疗方法找到适宜患者。但是这种分类仅依据mRNA表达的差异，具有明显局限性，忽略了同样具有重要功能作用的非编码RNA分子(主要是miRNA)。因此，结合miRNA芯片所显示的表达情况，会进一步丰富基因表达谱，并对那些没有已知分子标志的AML的研究产生深远影响。再将miRNA表达谱与已知的染色体异常标志及已知预后因子相联系，可能实现AML的更明确的诊断和更好的预后。同时，也可以利用过表达或抑制表达的方法改变患者中miRNA的表达或改变其调控的靶基因的表达，以达到更好的治疗目的。
常用的研究miRNA功能的方法包括三个部分。一是表达分析，常用miRNA芯片技术进行大规模的筛选，然后用Northern杂交、实时定量PCR(Real-time PCR)或锁定的反义寡核苷酸技术(LNA)的方法进行验证，以排除假阳性结果；二是miRNA靶基因的研究方法，通过miRNA靶基因软件分析预测靶基因，然后用双荧光报告系统和Western杂交方法证实；三是过表达或抑制特异的miRNA表达后观察对细胞增殖、分化及调亡等的影响。本发明涉及到了运用以上方法研究miR-451、miR-29a和miR-142-3p在AML中的功能。
发明人利用miRNA芯片技术分析了人急性髓细胞白血病(AML)和正常人外周血单个核细胞中的表达，鉴别到一些在AML中表达水平明显变化的miRNA分子。使用Northern杂交进行了部分验证，鉴别出在AML中表达明显下调的miR-451、miR-29a和miR-142-3p。在扩大的样本(包括30例临床初诊AML病人和100例正常人对照)中，用实时定量PCR方法结合统计学分析证明了miR-451、miR-29a和miR-142-3p在AML病人中的表达下调具有显著性。发明人同时在实验过程中建立了特异检测miR-451、miR-29a和miR-142-3p表达水平的方法，以期作为AML的诊断标准应用于临床。这3个miRNAs在AML中的异常表达，也说明它们在AML发生发展中起重要作用。进一步研究miR-451、miR-29a和miR-142-3p在AML发生发展中的作用和机制，可以为发展通过控制这3个miRNA或其靶基因表达或通过人工合成的miRNA给药治疗AML的方法奠定基础。
MiR-451定位于人第17号染色体长臂的负链上(17：24212513-24212584[-])，成熟序列为：5’AAACCGUUACCAU UACUGAGUU 3’。已知miR-451在人红系分化过程中表现为促进作用(Dore LC，et al.，Proc Natl Acad Sci USA.105：3333-8，2008；Pase L，et al.，Blood.113：1794-804，2009)。
MiR-29a定位于人第7号染色体长臂的负链上(7：130212046-130212109[-])，成熟序列为：5’UAGCACCAUCUG AAAUCGGUUA 3’。已有报道miR-29a在人慢性淋巴细胞白血病(CLL)中有上调趋势，并通过其在肺部发育中的调节作用参与了肺癌的发生发展(Calin GA，et al.，Best Pract Res Clin Haematol.20：425-37，2007；Fabbri M，et al.，Proc NatlAcad Sci USA.104：15805-10，2007)。
MiR-142-3p定位于人第17号染色体长臂的负链上(17：53763592-53763678[-])，成熟序列为：5’UGUAGUGUUUCCUA CUUUAUGGA3’。已知miR-142-3p参与了效应T淋巴细胞的活化过程(Wu H，et al.，PLoS ONE.2：e1020，2007)。
虽然国际上已有miRNA与AML相关研究报道，但其筛查出的特异miRNA不涉及miR-29a、miR-142-3和miR-451，因此至今尚无这3个miRNAs与AML相关的研究报告。
发明内容
本发明涉及3个与AML相关的miRNAs，即miR-451、miR-29a和miR-142-3p在AML发生发展过程中的功能，本发明也直接提供了一个与检测这3个miRNA表达水平相关的新的AML临床诊断方法。对于这3个miRNA表达水平的检测，也为用于AML的预后奠定了基础。进一步地，本发明还为发展通过调控这3个miRNA或其靶基因表达或利用人工合成的miRNA作为药物治疗AML的方法奠定了基础。
发明者利用miRNA芯片的方法分析了AML病人和正常人对照外周血单个核细胞中miRNA水平，获得一组与AML发病相关的miRNAs。实施例2中给出了该项实验的具体描述。
对芯片分析的部分结果进行Northern杂交验证，以排除假阳性结果。实施例3中给出了该项实验的具体描述。如图1所示，miR-451、miR-29a和miR-142-3p在AML病人(A-1，A-2)中的相对表达水平明显低于与其性别年龄相符的正常人对照(N-1，N-2)。
随后，发明者利用实时定量PCR方法分析了miR-451、miR-29a和miR-142-3p在30例临床初诊AML病人和100例正常人对照(年龄性别相当)外周血单个核细胞中的相对表达水平。表1给出了样本信息。在实施例4中对该项实验作了具体的描述。由于从每个实验个体外周
表1.本研究的样本资料
具体病例和对照的多项检查资料在中国医学科学院基础医学
研究所和内蒙古医学院附属医院保存。
血样品单个核细胞所能获得的RNA非常有限，较难准确定量，故以在细胞中表达恒定的U6核小RNA(U6snRNA)为内参照，把每个样品中miRNA与U6snRNA的实时定量PCR值归一化校正后，求得与同一个固定对照样品(从1例正常献血者单个核细胞获得的较大量小RNA储存)的相对表达量(图2)。
利用SPSS10.0统计软件分析两组数据(AML组和正常对照组)的集中趋势和离散程度，如图2所示这3个miRNAs的表达在AML外周血单个核细胞中与正常人对照相比显著下降。随后利用SPSS10.0的ROC曲线(接受者操作特性曲线)统计功能，分析了以这3个miRNAs的相对表达水平作为AML诊断指标的诊断方法的准确性。如图3所示，以ROC曲线下面积作为判断诊断效率的指标，miR-451，miR-29a，和miR-142-3p的ROC曲线下面积分别为：0.72、0.94，和0.93，对应的p值分别为：0.001、0.000和0.000。这些说明外周血单个核细胞中的miR-29a、miR-142-3p和miR-451的相对表达水平可以作为衡量AML发生的指标应用于临床诊断。
从应用的方便性考虑，发明者也发展了在RNA准确定量的基础上，应用绝对定量PCR方法，测定外周血单个核细胞中单位质量总RNA中含有的某个miRNA拷贝数的方法(图4)。具体方法也在实施例4中详细描述。从对100例正常人外周血单个核细胞中单位质量总RNA中含有的每个miRNA拷贝数分析，确定了正常参考值范围分别为：miR-451：1.4×105～3.5×106；miR-29a：2.8×108～1.7×109；miR-142-3p：2.1×105～1.4×106(单位：拷贝数/μg总RNA)。低于正常参考范围下限可视为AML的参考诊断标准。
从绝对定量分析结果获得诊断准确性的前提是每个样品的上样量准确一致。考虑到实际推广应用时不易做到上样量准确一致，我们也检测了各个样品单位质量总RNA中含有的U6snRNA拷贝数，为(3.0±0.09)×1010(单位：拷贝数/μg总RNA)。由此也得到了正常人外周血总RNA中含有的miRNA拷贝数与U6snRNA拷贝数比值的参考范围：miR-451：4.67～116.67×10-6；miR-29a：9.33～56.67×10-3；miR-142-3p：7.0～46.7×10-6(也在实施例4中详细描述)。低于正常参考比值范围下限可视为AML的参考诊断标准。
然后，我们对使用绝对定量PCR检测这3个miRNA表达对以上130个试验者进行的AML筛检结果(这与利用miRNA拷贝数与U6snRNA拷贝数比值进行的AML筛检结果是一致的)进行了统计学评价。表2列出了评价结果，说明miR-29a和miR-142-3p单独或联合使用都有较高的诊断价值，且稳定性较高，miR-451则略低。这些说明可以通过检测外周血单个核细胞中的miR-29a和miR-142-3p的绝对表达水平(即单位总RNA中miRNA拷贝数)或相对表达水平(即miRNA拷贝数与U6snRNA拷贝数比值)进行AML临床诊断。
表2：用miR-451、miR-29a和miR-142-3p表达作为AML检测手段的筛检结果的统计学评价
以绝对定量PCR检测了100例正常人外周血单个核细胞中单位质量总RNA中每个miRNA的拷贝数，数据分布分析后为偏态分布。采用百分位数法确定正常参考值，取p＝0.05。正常参考值范围分别为：miR-451：1.4×105～3.5×106；miR-29a：2.8×108～1.7×109；miR-142-3p：2.1×105～1.4×106(单位：拷贝数/μg总RNA)。表3是以低于正常值范围下限作为筛检阳性对共130例受检者的判断结果，与实际的临床诊断结果比较后的统计学评价。
发明者进一步对miR-451、miR-29a和miR-142-3p在正常髓系细胞分化的作用进行了初步探索。利用Northern blot分析证明了miR-451、miR-29a和miR-142-3p在处于髓系单核祖细胞阶段的单核细胞白血病来源的细胞系THP-1中表达较低，但随着PMA诱导的成熟单核细胞分化表达明显上调(在实施例5中对该项实验作了具体的描述，图5显示了实验结果)。这提示miR-451、miR-29a和miR-142-3p很可能在髓系单核细胞分化中具有促进作用。miR-451、miR-29a和miR-142-3p的这种促分化作用正契合了它们在髓系分化受阻的AML病人中的表达下降。就是说，很可能正是由于miR-451、miR-29a和miR-142-3p的下调抑制了正常的髓系细胞分化从而导致白血病的发生(详细的机制研究正在本实验室中进行)。随着miR-451、miR-29a和miR-142-3p在髓系细胞分化中的作用以及在AML发生发展中的作用和机制的揭示，使miR-451、miR-29a和miR-142-3p基因及其靶基因有可能成为治疗AML的靶点。这使得发展通过控制miR-451、miR-29a和miR-142-3p或其靶基因表达，或通过利用人工合成的miR-451、miR-29a和miR-142-3p直接给药的途径治疗AML的新方法成为可能。
概括地，本发明首先确定了3个在AML中表达明显降低的miRNAs，即miR-451、miR-29a和miR-142-3p，说明它们在AML发生发展中具有重要作用。本发明也建立了在RNA准确定量基础上通过绝对定量PCR测定外周血单个核细胞中单位总RNA中每个miRNA的拷贝数(在不能确保RNA准确定量时，则根据每个miRNA拷贝数与U6snRNA拷贝数的比值)进行AML诊断的方法。对于这3个miRNA表达水平的检测，也为AML的预后奠定了基础。本发明还为发展通过调控这3个miRNA或其靶基因表达或利用人工合成的miRNA作为药物治疗AML的方法奠定了基础。
附图说明
图1.部分芯片分析结果的Northern杂交验证。用Northern杂交方法检测到miR-451、miR-29a和miR-142-3p的表达水平在AML病人中比正常人对照中明显下降，这与芯片分析结果一致。其中以表达恒定的U6snRNA为内参。A-1，A-2为两例临床初诊AML病例；N-1，N-2为两例正常人对照。R(Ratio)值，即相对表达量，即在杂交放射自显影后，获得杂交带的扫描灰度值，再把每个样本miRNA与U6snRNA的量化信号值归一化校正后与样本N1的比值。(因为从每个个体所能获得的RNA非常有限，较难做到准确定量和准确的电泳上量，故计算出R值。)
图2.AML病人和正常对照外周血单个核细胞中miR-451、miR-29a和miR-142-3p的表达分布情况。应用实时定量PCR方法测定miR-451、miR-29a和miR-142-3p的表达，用同时扩增的内参照U6snRNA量化归一后，再求得与同一个固定对照样品(从1例正常献血者单个核细胞获得的较大量miRNA储存)的比值，即为每个样品的相对表达量。用SPSS10.0统计软件分析两组数据(AML组和正常对照组)的集中趋势和离散程度。
图3.以miR-451、miR-29a和miR-142-3p的相对表达量为诊断指标用SPSS10.0统计软件绘制的ROC曲线。低于正常人中的表达量作为筛检阳性，曲线下面积表示诊断的准确度。
图4.利用miR-451、miR-29a、miR-142-3p和U6snRNA的标准品的实时定量PCR结果绘制的标准曲线。其中以PCR反应体系中标准品拷贝数的对数值为纵坐标，以PCR反应的Ct值为横坐标。
图5：在THP-1向单核细胞分化过程中miR-451、miR-29a和miR-142-3p的Northern杂交分析。发现单核细胞白血病来源的细胞系THP-1在PMA诱导的单核细胞分化过程中，miR-451、miR-29a和miR-142-3p的表达增加，说明它们可能对单核细胞分化具有促进作用。
具体实施方式
实施例1：实验对象
全部AML患者，均由内蒙古医学院附属医院血液科从就诊的病人中选择。AML诊断根据常规方法，各病例的形态学诊断、分型等均符合《血液病诊断及疗效标准》的要求。年龄和性别相符的正常对照，从志愿献血者中选择，除血象指标正常排除血液病外，也排除其他重要疾病。均遵从知情同意原则。研究计划分别经双方(中国医学科学院基础医学研究所和内蒙古医学院附属医院)伦理审查委员会批准。
实施例2：利用miRNA芯片分析检测在AML病人中表达异常miRNAs
为了比较AML病人与正常人对照中miRNA的表达差异，我们首先使用miRNA芯片分析方法。用于芯片分析的样品为初诊AML(M5型)病例和性别年龄相符的正常人对照各2例。分离其外周血的单个核细胞(分离方法在下段详述)，并委托上海康成生物工程有限公司进行miRNA芯片实验操作(采用Exiqon，LNATMmicroRNA芯片)并提供完整的实验和分析报告。
采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(MNC)。把采集的新鲜外周血用含2mmol/L EDTA的1×磷酸缓冲的生理盐水(PBS)按照1∶4体积稀释，用滴管反复吹打混匀。尽量保证把所有细胞吹打分散，以更好的释放出单个细胞。在20×150mm灭菌试管底部加入4ml淋巴细胞分离液(密度1.077g/ml，购自中国医学科学院生物工程研究所)。把稀释好的外周血用滴管轻铺于分离液上，在20℃，以400×g水平离心30～40min。轻轻吸除上层血浆，小心地吸取中间层(含单个核细胞)到一个新的50ml离心管中。在管中再加入含2mmol/L EDTA的1×PBS，吹打混匀，在20℃，以400×g水平离心10min，去除上清。再重复上步操作2次，收集到的即为单个核细胞，计数备用。
实施例3：芯片结果的Northern杂交验证
为了排除芯片分析中的假阳性结果，我们用Northern杂交方法对部分结果进行了验证。首先提取单个核细胞样品中的总RNA。在大约每1×107个单个核细胞中加入1ml Trizol(购于Invitrogen)，立即反复吹打细胞，于室温放置5min裂解。在裂解液移中加入0.2ml氯仿，在漩涡振动器上剧烈振动离心管15s，室温放置2～3min后，在4℃，12,000×g离心15min。把上层水相转移至一新离心管中，加0.5ml异丙醇混匀，室温放置10min。于4℃，12,000×g离心10min后弃上清。用75％乙醇冲洗沉淀一次，7500×g离心5min后，弃上清，所得沉淀即为RNA。
把RNA沉淀于室温下放置5～10min，待迹量乙醇挥发尽后，把RNA溶于适当体积的无RNase的去离子水中，在55～60℃保温10min，使其完全溶解。-80℃冻存备用。用分管光度计测定RNA样品在230nm、260nm和280nm的吸光值，计算RNA的浓度，分别以OD260/OD280，OD260/OD230判断RNA样品的纯度。
提取的RNA样品用于下一步的Northern杂交分析。按照下述配方配置15％的PAGE分离胶(20ml)：2ml双蒸水，4ml 5×TBE储液，9.6g尿素，6.66ml 45％丙烯酰胺储液，150μl 10％过硫酸氨，6.5μl N，N，N′，N′-四甲基二乙胺。灌胶后室温放置1h，待胶凝聚后，用1×TBE电泳缓冲液，在18mA预电泳5min。取20μg总RNA样品与10μl去离子甲酰胺，2μl 10×上样缓冲液混合，用无RNase的去离子水补充到总体积为20μl的上样混合液，稳流16mA电泳，当溴酚蓝离底部0.5cm时结束电泳，取下凝胶，进行下一步印迹。稀释5×TBE储液为0.5×TBE电转缓冲液。将凝胶块和尼龙膜分别在电转缓冲液中漂洗10min，依次在转移夹中放入海绵、滤纸、凝胶、尼龙膜、滤纸、海绵，成“三明治”状，倒入电转缓冲液，胶面朝负极，膜朝向正极，转移槽外用冰水降温。接通电源，使稳流200mA连续转移2h，然后切断电源。尼龙膜在2×SSC里漂洗5min，晾干后紫外交联固定，-20℃保存。
Northern杂交于37℃杂交炉中进行，首先将交联好的尼龙膜放入杂交管中，加入5ml杂交液(博大泰克高效液相杂交液)中，37℃预杂交2h。其间于以下反应体系中标记探针：10μl 10μmol/L探针，5μl 10×标记缓冲液，5μl[γ-32P]ATP(10μCi/μL)，1U T4激酶，用去离子水补充至总体积为50μl，37℃反应1h。探针序列为合成的与具体miRNA互补的cDNA顺序(见表2)。将上述标记的探针加入杂交管，继续于37℃杂交16-24h。杂交结束后，依次用0.5×SSC/0.1％SDS溶液于室温洗膜2次，1×SSC/0.1％SDS溶液于37℃洗膜1-2次(每次10min)，直至在无RNA区域检测不出放射性信号为止。室温下，将滤膜用0.1×SSC溶液稍稍漂洗，用滤纸吸干水滴后用保鲜膜封好。在-70℃进行放射自显影。
表3.microRNA和U6snRNA的探针序列、逆转录引物序列、实时定量PCR引物序列
通过扫描X光片的杂交带获得杂交结果的定量数据。由于每个RNA样品的上样量不准确等因素，不能直接使用每条杂交带的扫描结果进行miRNA表达定量，把miRNA与U6snRNA(具有恒定表达特征的内参照)的量化信号值归一化校正后，再以其中一个样本N1为参照，得出其余样本相对于N1的相对表达量，即为R(Ratio)值(图1)。R值的大小即可表示相对表达水平的高低。
实施例4：miR-451、miR-29a和miR-142-3p在AML临床初诊病人和正常人对照中表达水平的实时定量PCR检测
由于Northern杂交方法需要较多的RNA样品，不适于应用于大量病例的miRNA分析，为了发展通过miRNA检测用于AML诊断的新方法，我们建立了miR-451、miR-29a和miR-142-3p的实时定量PCR检测方法。
我们首先进行了针对miRNA茎环的反转录PCR(RT-PCR)。就是使用一段5’端可以自身回折形成茎环结构的长逆转录引物，同时该逆转录引物的3’端分别与miR-451、miR-29a和miR-142-3p的成熟序列相匹配以引发特异性逆转录反应的发生(逆转录引物顺序见表3)。使用M-MLV(Invitrogen)逆转录酶合成cDNA第一链。在0.5ml无RNase的离心管中混合以下成分：2μg RNA样品，1μl 2μmol/L miRNA特异逆转录引物，1μl 2μmol/L U6snRNA特异逆转录引物，1μl 10mmol/L dNTP混合物，用无RNase的去离子水补充至总体积为20μl。混匀后，于65℃温育5min。然后立即在冰上冷却，稍离心以集中液体。再依次加入以下成分：4μl 5×First-Strand Buffer，2μl 0.1mol/L DTT，1μl 40U/μlRNase抑制剂，将溶液混匀，稍离心集中液体，37℃温育5min。再加入1.0μl M-MLV(200U/μl)，混匀后37℃反应60min，然后在70℃，15min终止反应，-20℃冻存备用。
再以该逆转录产物为模板，在ABI7500型荧光定量PCR仪上进行实时定量PCR反应及miRNA的相对定量分析。使用分别对应于成熟miRNA序列的上游PCR引物和对应于茎环序列的下游PCR引物引发miRNA cDNA的实时定量PCR扩增，以分别对应于U6snRNA序列的上游PCR引物和下游PCR引物引发内参U6snRNA cDNA的实时定量PCR扩增(PCR引物顺序见表3)。每个PCR反应设3个重复孔，取平均值获得成熟miR-451、miR-29a和miR-142-3p的相对表达量。PCR反应体系如下：10μl 2×Sybrimix，0.4μl ROX II，1μl 15μmol/L上游PCR引物，1μl 7μmol/L下游PCR引物，1μl cDNA，6.6μl去离子水。由于从每个实验个体外周血样品单个核细胞所能获得的RNA非常有限，较难准确定量，故采用以U6snRNA为内参照，把miRNA与U6snRNA的实时定量PCR值归一化校正后，再求得与同一个固定对照样品(从1例正常献血者单个核细胞获得的较大量miRNA储存)的比值，得出其它样本相对于N1的相对表达量。
利用SPSS10.0统计软件对检测的30例初诊AML患者和100例正常对照的实验结果进行数据分布分析，显示miR-451、miR-29a和miR-142-3p的表达水平在AML病人外周血单个核细胞中与年龄性别相当的正常对照相比明显减少(图2)。以ROC曲线方法进行分析，miR-451、miR-29a和miR-142-3p的曲线下面积分别为0.72、0.94和0.93，(相应的p值分别为0.001、0.000和0.000)，说明外周血单个核细胞中的miR-29a、miR-142-3p和miR-451的相对表达水平可以作为衡量AML发生的指标应用于临床诊断。(图3)
从应用的方便性考虑，我们也发展了在RNA准确定量的基础上，应用绝对定量PCR方法，测定外周血单个核细胞中单位质量总RNA中含有的miRNA拷贝数的方法(图4)。为确定正常参考值范围，我们应用绝对定量PCR方法确定了100例正常人外周血单个核细胞中单位质量总RNA中含有的miRNA拷贝数。采用在同一组PCR反应中已知拷贝数的标准品的扩增结果绘制标准曲线，标准品拷贝数的对数值与PCR扩增的Ct值(PCR反应过程中荧光强度达到设定阈值时的循环数)呈线性关系。再根据样本扩增的Ct值，计算获得其拷贝数，由于统一采用从2μg总RNA作为实时定量PCR扩增的初始样品，故可得到单位质量总RNA中含有的miRNA拷贝数(拷贝数/μg总RNA)。标准品是利用实时定量PCR的上下游引物将目标序列扩增并克隆入pGEMT载体中提取和纯化的质粒DNA，其拷贝数通过260nm吸光值计算获得。梯度稀释标准品到以下浓度：1×1010、1×109、1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102和1×101拷贝/μl，随后的实时定量PCR扩增中取1μl梯度稀释标准品作为模板。(附图4)
为确定正常参考值范围，我们应用绝对定量PCR方法分析了100例正常人外周血单个核细胞中单位质量总RNA中含有的每个miRNA拷贝数。数据分布分析后为偏态分布，采用百分位数法确定正常参考值，取p＝0.05。得到的正常参考值范围分别为：miR-451：1.4×105～3.5×106；miR-29a：2.8×108～1.7×109；miR-142-3p：2.1×105～1.4×106(单位：拷贝数/μg总RNA)。
在绝对定量分析过程中，结果准确性的前提之一是保证每个样品的上样量(即U6snRNA的拷贝数)一致。为避免这一限制，我们同时也检测了各个样品单位质量总RNA中含有的U6snRNA拷贝数，为(3.0±0.09)×1010(单位：拷贝数/μg总RNA)。由此也得到了正常人外周血单位质总RNA中含有的miRNA拷贝数与U6snRNA拷贝数比值的参考范围：miR-451：4.67～116.67×10-6；miR-29a：9.33～56.67×10-3；miR-142-3p：7.0～46.7×10-6。在不能保证每个样品的上样量保持一致的情况下，可应用miRNA拷贝数与U6snRNA拷贝数的比值的参考范围做出AML的参考诊断。
我们也用绝对定量PCR方法分析了30例AML病人外周血单个核细胞中单位质量总RNA中含有的每个miRNA的拷贝数。表3列出了以低于正常值下限作为AML阳性对共130例受检者筛检结果的统计学评价，显示miR-29a和miR-142-3p单独或联合使用都有很高的诊断应用价值，且稳定性较高，miR-451则略低(表3)。
实施例5：THP-1细胞诱导分化过程中miR-451、miR-29a和miR-142-3p的表达分析
我们用Northern杂交方法实验了miR-451、miR-29a和miR-142-3p在THP-1细胞诱导分化过程的表达变化，发现miR-451、miR-29a和miR-142-3p的表达水平随着PMA诱导而增加，说明很可能在髓系单核细胞分化具有促进作用(附图5)。
在AML病人中，可能正是因为miR-451、miR-29a和miR-142-3p表达降低，阻碍了正常的髓系分化而发病(详细机制尚待揭示)。进一步地，也可能发展通过干预miR-451、miR-29a和miR-142-3p或其靶基因表达，或通过使用人工合成的miR-451、miR-29a和miR-142-3p序列作为药物，应用于AML的临床治疗的方法。
Claims (7)
1.miR-451、miR-29a和miR-142-3p，单个地和它们的组合在急性髓系白血病(AML)诊断中的应用。
2.miR-451、miR-29a和miR-142-3p，单个地和它们的组合，作为药物在AML治疗中的应用。
3.miR-451、miR-29a和miR-142-3p，单个地和它们的组合，在通过控制它们的表达水平(即增加其表达)实现AML治疗中的应用。
4.权利要求1-3中，在AML诊断和治疗中的应用，包括AML的全部亚型。
5.权利要求1中，在AML诊断中的应用，包括利用以这3个miRNAs各自的cDNA和互补RNA为探针进行杂交(如Northern杂交和液相杂交方法等)检测miRNA水平，以real-time PCR和其它PCR方法检测miRNA水平，以miRNA芯片方法检测miRNA水平等，进行AML诊断。
6.权利要求2中，作为治疗AML的药物，包括利用合成的miRNA直接给药，和通过导入DNA或RNA序列在细胞内产生这些miRNA，治疗AML的方法。
7.权利要求3中，作为AML治疗方法，包括能够通过增加细胞内miRNA基因转录或控制转录后加工等方法增加成熟miRNA水平的全部方法。
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