CN106967714B - 条形叶植物叶绿体dna的高纯度高质量提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种条形叶植物叶绿体DNA的提取方法，包含如下步骤：A、通过在叶片上制造机械创伤并结合酶解处理手段获取叶片原生质体，所得原生质体中含有叶绿体、线粒体和细胞核；B、通过差速离心处理去除步骤A所得产物中的杂物对叶绿体进行粗提；C、通过密度梯度离心去除步骤B所得产物中的杂物对叶绿体进行纯化；D、采用天根生化快捷型植物基因组DNA提取系统对步骤C所得产物进行提取，获取高纯度的叶绿体DNA。本发明的方法能够对条形叶植物叶绿体DNA进行高纯度、高质量的提取。

Description

条形叶植物叶绿体DNA的高纯度高质量提取方法

技术领域

本发明涉及一种植物核苷酸提取技术，具体涉及一种高纯度小提大量小型条形叶植物叶绿体DNA的提取方法。

背景技术

叶绿体是绿色植物进行光合作用的细胞器，也是细胞质中具有遗传功能的主要细胞器之一, 作为半自主性细胞器，其功能是叶绿体基因组和核基因组相互作用的结果(贾婧婧等., 2009)。与核基因组相比，叶绿体等细胞器基因组结构简单、分子量小、且多拷贝，不易于重组，因而，在一定程度上保留了植物的进化信息(荆玉祥, 1985)。其基因含量、顺序上的保守性以及较低的重组率，使细胞器基因组更适合用来做系统进化、发育研究，用于植物细胞质类型划分，结果将更可靠，上述功能又和叶绿体基因组的测序及序列和结构分析密切相关，因此，有关叶绿体DNA及其遗传的研究显得尤为重要，而这些都必须以高质量的叶绿体DNA提取为基础。

自20世纪80年代以来，由于各种植物尤其是小型条形叶植物都很难提取到高浓度、高质量的叶绿体，严重影响了叶绿体相关研究的深入开展，受此影响，小型条形叶植物中，只有水稻的叶绿体进行了测序，但是，水稻的测序也不是以高纯度水稻的叶绿体为基础进行，而是以类似特异标签通过长片段PCR的方式进行测序的(Moon et al., 1987)，这 种方法远不如直接提取高纯度叶绿体测序的方式精准、快捷。谷子、小麦等绝大部分小型条形叶植物的叶绿体未进行测序，为此，关于叶绿体提取和纯化方法改进的报道不断出现。但是，这些方法由于存在难以克服的缺陷，都很难提取到高纯度、高质量的叶绿体，归纳起来，关键性制约因素有2个，其一是提取不到高浓度的完整叶绿体，第二是难以将细胞核和线粒体彻底去除，从而获取高纯度无污染的叶绿体。

在获得高浓度的叶绿体方面，主要受两个因素的影响，其一是在破碎细胞的过程中，既要使植物细胞充分释放出所有的叶绿体，又要使叶绿体尽可能的保持完整。为此，科研人员进行了不断的探索，先后提出了液氮固定研磨(孙晓荣等., 2012; 肖龙 et al.,2016)、常规溶液匀浆(沈志伟等., 1989)和Vc匀浆系统(赵衍等., 1991)等，但是，由于这些方法仍存在液氮固定研磨破坏叶绿体和匀浆处理叶绿体不能充分释放等缺点，很难提取到高浓度的叶绿体。第二是在叶绿体提取过程中如何防止叶绿体被氧化。植物细胞中具有很多的次生代谢物质，而叶绿体是进行氧化还原反应的场所，对氧胁迫非常敏感，因而，这些次生代谢物的氧化会对叶绿体造成破坏，从而导致提取到完整叶绿体的浓度很低，因此，查明叶绿体次生代谢物被氧化的机制，在提取过程中合理改变提取条件，防止叶绿体被氧化的方法成为获取高浓度叶绿体的又一关键因素。

在去除细胞核和线粒体污染方面，科研人员也进行了一些探索，先后提出了DNase1去除核DNA(Edelman et al., 1982; 史公军等., 2005)，密度梯度离心(Heinhorst etal., 1988; Hirai et al., 1985; 肖龙等., 2016)、差速离心方法(欧立军等., 2006;史公军等., 2005; 谢海坤等., 2016)去除细胞核和线粒体，从而获取高质量叶绿体。但是，由于DNase 1对所有的DNA均有降解作用，依赖于细胞核DNA释放而叶绿体DNA未释放的时间差，不能完全保证去除核DNA；况且这些方法较少将密度梯度离心和差速离心结合在一起，很难同时将细胞核和线粒体同时去除。孙富等在甘蔗叶绿体蛋白提取的研究中，虽然采用了差速离心与密度梯度离心(孙富等., 2011)，但是，由于其在差速离心时采用1500g分离叶绿体，离心力没有达到学界公认的叶绿体3,000g的沉降离心力，浪费了大量的完整叶绿体，且细胞破碎采取匀浆法，不能释放其大量的叶绿体，用于提取甘蔗等大型叶叶绿体含量比较丰富的植物叶绿体尚可，却不适用于谷子、小麦等小型条形叶植物叶绿体的分离。且植物细胞核和叶绿体沉降系数差异不大，单纯通过差速离心不能够将细胞核去除干净；而线粒体和叶绿体密度差异较小，单纯通过密度梯度离心很难将线粒体去除干净。必须根据叶绿体和细胞核的密度差异、以及其和线粒体的沉降系数差异，建立适宜小型条形叶植物叶绿体提取的密度梯度和离心速差，并将它们结合在一起才能彻底去除细胞核和线粒体对叶绿体提取过程中的污染。

在此基础上，施菲等通过系列技术改进，近年又发明了茶树叶绿体DNA的分离方法(施菲和李威, 2013)，但是，由于茶树叶片大且肥厚，提取叶绿体相对比较容易，而谷子、小麦等小型条形叶植物，叶片薄，叶肉细胞少，叶绿体含量较少，因此，直接采用茶树等果树、林木叶绿体提取方法提取的小型条形叶植物叶绿体不但浓度低，且污染较重，根本提取不到高质量、高浓度的叶绿体DNA，况且，这种方法的细胞破碎仍然采取匀浆法，去除细胞核和线粒体则单纯的采用差速离心法,在小型条形叶植物叶绿体提取中无法应用。

鉴于此，袁进成、王小纯等又分别提出了谷子叶绿体DNA的快速提取方法和小麦完整叶绿体的制备方法(袁进成等., 2008;王小纯等，2016)，但是，这些方法也是采用匀浆研磨法破碎细胞和单一的差速离心或密度梯度去除核或线粒体污染，因此，仍无法提取到高纯度无污染的叶绿体DNA。

本研究的相关背景技术文献可参考：

Edelman, G.M., Hallick, R.B., and Chua, N.H. (1982). Methods inchloroplast molecuLar biology (Elsevier Biomedical Press ;)。

Heinhorst, S., Gannon, G.C., Galun, E., Kenschaft, L., and Weissbach,A. (1988). Clone bank and physical and genetic map of potato chloroplast DNA.Theoretical and Applied Genetics 75, 244-251。

Hirai, A., Ishibashi, T., Morikami, A., Iwatsuki, N., Shinozaki, K.,and Sugiura, M. (1985). Rice chloroplast DNA: a physical map and the locationof the genes for the large subunit of ribuLose 1,5-bisphosphate carboxylaseand the 32 KD photosystem II reaction center protein. Theoretical and AppliedGenetics 70, 117-122。

Moon, E., Kao, T.H., and Wu, R. (1987). Rice chloroplast DNAmolecuLes are heterogeneous as revealed by DNA sequences of a cluster ofgenes. Nucleic Acids Research 15, 611。

贾婧婧, 潘小军, 张敏, 胡勇,何奕昆 (2009). 叶绿体的遗传进化. 生物学通报 44, 7-9。

荆玉祥 (1985). 叶绿体的遗传信息. 植物学报 3, 8-13。

欧立军, 黄光文, 王京京,陈良碧 (2006). 水稻叶绿体DNA提取和纯化方法优化. 湖南师范大学自然科学学报 29, 92-94。

沈志伟, 孙崇荣,朱俭 (1989). 水稻叶绿体DNA的提取和纯化. 中国生物化学与分子生物学报 5, 7-11。

施菲和李威 (2013). 中国发明专利：一种分离叶绿体dna的方法,CN 103215251A。

史公军, 侯喜林, 王彦华 (2005). 白菜叶绿体DNA快速提取及分析. 应用与环境生物学报 11, 283-285。

孙富, 黄巧玲, 黄杏, 张保青, 陈明辉, 杨丽涛,李杨瑞 (2011). 甘蔗叶绿体分离及其蛋白质提取方法研究. 南方农业学报 42, 463-467。

孙晓荣, 易鼎杰, 何桥,梁国鲁 (2012). 三倍体枇杷叶绿体DNA提取方法的优化. 西南师范大学学报(自然科学版) 37, 93-96。

肖龙, 张彩霞, 张利义, 田义, 宗泽冉,丛佩华 (2016). 苹果叶片叶绿体分离及其蛋白提取、双向电泳方法的优化. 果树学报, 752-761。

谢海坤, 焦健, 樊秀彩, 张颖, 姜建福, 孙海生,刘崇怀 (2016). 中国野生葡萄叶绿体分离及叶绿体DNA提取的研究. 西北植物学报 36, 1464-1469。

袁进成, 贾树利,刘颖慧 (2008). 一种快速提取谷子叶绿体DNA的方法. 河北北方学院学报(自然科学版) 24, 22-24。

赵衍, 翁醒华, 胡华萃, 明镇寰, 费承伟, 沈桂芳, 唐愫, 汪训明,柴建华(1991). 水稻叶绿体DNA的分离纯化及其限制酶切分析. 浙江大学学报(理学版), 321-326。

王小纯,张浩然,韦一昊,熊淑萍,马新明. 一种小麦完整叶绿体的制备方法[P].CN105907697A。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的种种不足，提供一种条形叶植物叶绿体DNA的高纯度高质量提取方法。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。

条形叶植物叶绿体DNA的高纯度高质量提取方法，该方法通过在叶片上制造机械创伤并结合酶解处理手段获取叶片原生质体，所得原生质体中含有叶绿体、线粒体和细胞核。

作为本发明的一种优选技术方案，该方法在获取叶片原生质体后，通过密度梯度离心和差速离心相结合的手段同时将线粒体和细胞核去除干净。

作为本发明的一种优选技术方案，该方法包含如下步骤：

A、叶片原生质体分离：通过在叶片上制造机械创伤并结合酶解处理手段获取叶片原生质体，所得原生质体中含有叶绿体、线粒体和细胞核；

B、叶绿体的粗提：通过差速离心处理去除步骤A所得产物中的杂物对叶绿体进行粗提；

C、叶绿体的纯化：通过密度梯度离心去除步骤B所得产物中的杂物对叶绿体进行纯化；

D、叶绿体DNA的提取：采用天根生化快捷型植物基因组DNA提取系统（DP321）对步骤C所得产物进行提取，获取高纯度的叶绿体DNA。

作为本发明的一种优选技术方案，步骤A包含如下分步骤：

A-1、叶片组织的培养与获取：将目的植物的种子种于育苗盘，并于抽穗前剪取新鲜、健康叶片；

A-2、叶片组织的处理：用刀片将步骤A-1所得叶片沿纵和横方向进行交叉切割，造成密集的纹状或格状创伤面，以利后续处理；

A-3、原生质体的分离：将步骤A-2处理好的叶片置于酶解液中，使酶解液淹没叶片，于黑暗中用脱色摇床30 rpm摇动处理3 h；叶片与酶解液比例为30g：50-150mL；

A-4、原生质体的收集：用buffer 1 稀释步骤A-3所得酶解物后，用200目细胞筛过滤，收集滤液，弃渣；滤液4 ^oC 、200 g，离心10 min，收集沉淀，即得。

作为本发明的一种优选技术方案，所述酶解液的配方如下表所示：

纤维素酶	0.5 g/100mL
		离析酶	0.3 g/100mL
Mannitol	0.4 M
		KCl	20 mM
MES, pH=5.7	20 mM
		55 <sup>o</sup>C 加热 10 min，冷却后
CaCl<sub>2</sub>	10 mM
		BSA	0.1 g/100mL

作为本发明的一种优选技术方案，步骤B包含如下步骤：

B-1、将步骤A所得原生质体用50 mL的 buffer 2 悬浮，然后置于冰上，期间每5min上下颠倒1次，共3次；

B-2、步骤B-1所得悬浮液在4 ^oC、500 g、离心10 min，收集上清，弃沉淀以去除部分细胞核等杂物；

B-3、B-2所得上清液在4 ^oC、3000 g、离心15 min，弃上清以去除线粒体等细胞器杂物，收集沉淀，所得沉淀即为粗提叶绿体。

作为本发明的一种优选技术方案，步骤C包含如下步骤：

C-1、Percoll密度梯度的制备：采用8.9%的NaCl与percoll按1：9的体积比例混合制备percoll工作液；用buffer 3 将percoll工作液稀释成所需梯度（percoll梯度：谷子50%-10 %；小麦：45 %-25 %），并铺于15mL离心管中，备用；

C-2、叶绿体纯化：用500 uL-1000 uL的buffer 3，重悬步骤B的操作进行叶绿体粗提，然后将重悬液铺置于percoll 梯度液表面；4 ^oC、3，000 g、水平离心30 min，收集两种梯度之间的叶绿体；

C-3、高纯度叶绿体的获得：将步骤C-2中收集的叶绿体用1 mL 的buffer 3重悬，4^oC、12，000 rpm、离心5 min，收集沉淀；将收集的沉淀物再用1 mL 的buffer 3重悬，4 ^oC、12，000 rpm、离心5 min，再收集沉淀，即为高纯度的叶绿体，用液氮冷冻后，置于-80 ^oC超低温冰箱中储存，待提；

作为本发明的一种优选技术方案，步骤D包含如下步骤：

D-1、步骤C中收集的高纯度叶绿体中加入缓冲液FP1 （DP321试剂盒配备）400 μL和10 mg/mL的RNase A 6 μL，涡旋振荡1 min，然后室温放置10 min;

D-2、所得溶液中再加入130 μL缓冲液FP2（DP321试剂盒配备），充分混匀，涡旋振荡1 min；4 ^oC、12,000 rpm、离心5 min，将上清转移至新的离心管中；

D-3、所得上清液再次4 ^oC、12,000 rpm、离心5 min，将上清转移至新的离心管中；

D-4、所得上清液中加入0.7倍体积的异丙醇，上下颠倒，充分混匀；4 ^oC、12,000rpm、离心2 min，弃上清，保留沉淀；

D-5、所得沉淀中加入600 μL 70% 乙醇，4 ^oC、12,000 rpm、离心2 min，弃上清；然后再往离心管中加入600 μL 70% 乙醇，4 ^oC、12,000 rpm 、离心2 min，再次弃上清；然后开盖倒置，室温存放5-10 min，彻底晾干残余的乙醇；然后加入30 uL ddH₂O，65^oC水浴10min溶解DNA，其间颠倒混匀数次助溶，最终得到高浓度高质量的DNA溶液。

作为本发明的一种优选技术方案，所述Buffer 1、Buffer 2、Buffer 3的配方如下表所示：

Buffer 1
		氯化钠	0.9 %
氯化钙	1.4 %
		氯化钾	0.04 %
葡萄糖	0.1 %
		MES, pH=5.7	1 mM

Buffer 2
		山梨醇	0.3 M
MgCl<sub>2</sub>·6H<sub>2</sub>O	1 mM
		EDTA·2Na	2 mM
HEPES	50 mM
		β-巯基乙醇	0.04 %

Buffer 3
		山梨醇	0.3 M
MgCl<sub>2</sub>·6H<sub>2</sub>O	1 mM
		EDTA·2Na	2 mM
HEPES	50 mM

采用上述技术方案所产生的有益效果如下所述。

本发明的原理之一是根据小型条形叶植物叶绿体表面角质、蜡质丰富，纤维素含量高，有坚硬的硅质堆积,细胞不易破碎,得到完整叶绿体较难而获得高纯度cpDNA更困难，常用的液氮捣碎力太小时细胞不破,捣碎力太大时细胞、破碎的同时又引起核的破碎,核DNA大量释放,不易获得无核DNA污染的叶绿体；且叶片薄、叶肉细胞少，叶绿体含量低，而匀浆释放的仅仅是细胞机械损伤处释放的少量叶绿体，不足以释放大量的植物细胞的叶绿体，也就无法获得高浓度的叶绿体。根据小型条形叶植物的上述特点，本发明利用手术刀切割叶片，造成机械创伤，增加组织与酶解液的接触面积；利用离析酶降解细胞间的果胶质和木质素，把细胞从组织内分离出来；纤维素酶降解细胞壁上的天然纤维素，得到相对裸露的原生质体；这样既可以减少核DNA的释放，又能保证叶绿体的大量释放，且由于叶绿体未离开细胞环境，从而解决了叶绿体提取过程中易氧化的难题。

本发明的原理之二是根据小型条形叶植物细胞核和叶绿体沉降系数差异不大，但密度差异较大，而线粒体和叶绿体沉降系数差异较大的特点，在探明适合小型条形叶植物密度梯度差和离心速差的基础上，将密度梯度离心和差速离心结合在一起，同时将线粒体和细胞核去除干净。

参见下文的实施例，申请人项目组已利用本发明的方法成功的在小型条形叶植物谷子、小麦中用少量的叶片，提取到了高纯度的叶绿体DNA，为开展叶绿体乃至细胞质的相关研究奠定了坚实的基础。

综上所述，本发明的方法建立了一套适用于小型条形叶植物高纯度大量叶绿体提取方法，进而建立了一种适用于小型条形叶植物高纯度小提大量叶绿体DNA的提取方法，为开展叶绿体基因组学研究提供了有力的技术支持，同时也为开展叶绿体蛋白质组学等系列研究提供了基础性的技术支撑。

附图说明

图1-1为实施例中谷子原生质体收集结果。

图1-2为实施例中谷子细胞核等破碎细胞等杂质等收集结果。

图1-3为实施例中谷子叶绿体粗提收集结果。

图1-4为实施例中谷子叶绿体纯化；图中，左图为密度梯度离心前，右图为离心后的纯化结果，绿色环状物为叶绿体。

图1-5为实施例中纯化后的谷子叶绿体。

图1-6为实施例中用叶绿体特异性引物扩增谷子总提基因组及叶绿体DNA结果；图中，Genome:总体DNA扩增结果；cpDNA-1：572A叶绿体DNA扩增结果；cpDNA-2：56A叶绿体DNA扩增结果；cpDNA-3：大同28叶绿体DNA扩增结果；cpDNA-4：大同29叶绿体DNA扩增结果。

图2-1为实施例中小麦原生质体收集结果。

图2-2为实施例中小麦细胞核等破碎细胞等杂质等收集结果。

图2-3为实施例中小麦叶绿体粗提收集结果。

图2-4为实施例中小麦叶绿体纯化；图中，绿色环状物为离心纯化后的叶绿体。

图2-5为实施例中纯化后的小麦叶绿体。

图2-6为实施例中用叶绿体特异性引物扩增小麦总提基因组及叶绿体DNA结果；图中，Genome:总体DNA扩增结果； cpDNA为叶绿体扩增结果。

具体实施方式

以下实施例详细说明了本发明。本发明所使用的各种原料及各项设备均为常规市售产品，均能够通过市场购买直接获得。

其中，各实施例所用试剂如无特别说明均购自Coolaber公司，果胶酶与离析酶购自YAKuLT PHARMACEUTICAL，Percoll购自GE Healthcare公司，所用叶绿体特异引物由通用生物有限公司合成，离心机为BECKMAN立式高速冷冻离心机或知信低速冷冻离心或Eppenddorf5424R离心机；如无特殊说明，离心均在4 ^oC下进行。

其中，各实施例所用溶液及缓冲液的配方如下表所示：

酶解液

纤维素酶	0.5 g/100mL
		离析酶	0.3 g/100mL
Mannitol	0.4 M
		KCl	20 mM
MES, pH=5.7	20 mM
		55 <sup>o</sup>C 加热 10 min，冷却后
CaCl<sub>2</sub>	10 mM
		BSA	0.1 g/100mL

Buffer1

氯化钠	0.9 %
		氯化钙	1.4 %
氯化钾	0.04 %
		葡萄糖	0.1 %
MES, pH=5.7	1 mM

Buffer 2

山梨醇	0.3 M
		MgCl<sub>2</sub>·6H<sub>2</sub>O	1 mM
EDTA·2Na	2 mM
		HEPES	50 mM
β-巯基乙醇	0.04 %

Buffer 3

山梨醇	0.3 M
		MgCl<sub>2</sub>·6H<sub>2</sub>O	1 mM
EDTA·2Na	2 mM
		HEPES	50 mM

实施例1、谷子叶绿体DNA的提取。

1.谷子叶片原生质体分离。

(1) 将谷子材料的种子播种于育苗盘，并于抽穗前剪取新鲜、健康叶片30-40 g；将叶片用医用手术刀横纵切割成微小的细条状，造成较多的创伤面，以利于酶解液的渗入。

(2) 将处理好的叶片置于100 mL酶解液中，使酶解液淹没叶片，于黑暗中，用脱色摇床30 rpm，摇动处理3 h。

(3) 用100 mL的buffer 1 稀释酶解物后，用200目细胞筛过滤，收集滤液，弃渣；滤液4 ^oC 、200 g，离心10 min，收集沉淀，即为原生质体(图1-1)。

2. 谷子线粒体的去除及叶绿体的粗提。

(4) 将步骤（3）中收集的原生质体用50 mL的 buffer 2 悬浮，然后置于冰上，期间每5 min上下颠倒1次，共3次；将所得的悬浮液4 ^oC、500 g，离心10 min，小心收集上清，弃沉淀（部分细胞核等）(图1-2)；

(5) 将所得的上清液4 ^oC、3,000 g，离心15 min，弃上清（线粒体等细胞器），收集沉淀，所得沉淀即为粗提的叶绿体(图1-3)。

3. 谷子细胞核的去除及叶绿体的纯化。

(6) Percoll密度梯度的制备：采用8.9%的NaCl与percoll按1:9的体积比例混合制备percoll工作液。用buffer 3 将percoll工作液稀释成所需梯度，下部50%，上部10%，并铺于15mL离心管中，备用。

(7) 用500 uL-1000 uL的buffer 3，重悬步骤（5）中粗提的叶绿体。将重悬液小心铺置于percoll 梯度液表面（percoll： 50 %-10 %）4 ^oC、3，000 g，水平离心30 min，收集两种梯度之间的叶绿体(图1-4)。

(8) 将收集的叶绿体用1 mL 的buffer 3重悬，4 ^oC，12,000 rpm，离心5 min，收集沉淀。

(9) 将收集的沉淀物再用1 mL 的buffer 3重悬，4 ^oC，12,000 rpm，离心5 min，再收集沉淀，即为高纯度的叶绿体（图1-5）。然后，将获得的高纯度的叶绿体，用液氮冷冻后，置于– 80 ^oC超低温冰箱中储存，待提取叶绿体DNA。

4.谷子叶绿体DNA提取。

(10) 叶绿体DNA采用天根生化快捷型植物基因组DNA提取系统（DP321）进行提取,将步骤（9）中收集的高纯度叶绿体加入400 μL缓冲液FP1和6 μL的RNase A(10 mg/mL)，涡旋振荡1 min，然后室温放置10 min。

(11) 向所得的溶液中再加入130 μL缓冲液FP2，充分混匀，涡旋振荡1 min；12,000 rpm，离心5 min，将上清转移至新的离心管中。

(12) 将所得的上清液再次12,000 rpm，离心5 min，将上清转移至新的离心管中。

(13) 向所得的上清液中加入0.7倍体积的异丙醇，上下颠倒，充分混匀；4 ^oC，12,000 rpm，离心2 min，弃上清，保留沉淀。

(14) 沉淀中加入600 μL 70% 乙醇， 12,000 rpm，离心2 min，弃上清；然后再往离心管中加入600 μL 70% 乙醇，4 ^oC，12,000 rpm ，离心2 min，再次弃上清；然后开盖倒置，室温存放5-10 min，彻底晾干残余的乙醇；然后加入30 uL ddH2O，65 ^oC水浴10 min溶解DNA，其间颠倒混匀数次助溶，最终得到高浓度高质量的DNA溶液，检测DNA纯度（图1-6）

实施例2、小麦叶绿体DNA的提取。

1. 小麦叶片原生质体分离。

(1) 将小麦材料的种子播种于培养皿中，清水培育，剪取新鲜、健康叶片20-30 g；将叶片用医用手术刀横纵切割成微小的细条状，造成较多的创伤面，以利于酶解液的渗入。

(2) 将处理好的叶片置于100 mL酶解液中，使酶解液淹没叶片，于黑暗中，用脱色摇床室温，30 rpm，摇动处理3 h。

(3) 用100 mL的buffer 1 稀释酶解物后，用200目细胞筛过滤，收集滤液，弃渣；滤液4 ^oC 、200 g，离心10 min，收集沉淀，即为原生质体（图2-1）。

2. 小麦线粒体的去除及叶绿体的粗提。

(4) 将步骤（3）中收集的原生质体用50 mL的 buffer 2 悬浮，然后置于冰上，期间每5 min上下颠倒1次，共3次；将所得的悬浮液4 ^oC、500 g，离心10 min，小心收集上清，弃沉淀（部分细胞核等）（图2-2）；

(5) 将所得的上清液中含有线粒体等细胞器，4 ^oC、3,000 g，离心15 min，弃上清，收集沉淀，所得沉淀即为粗提的叶绿体（图2-3）。

3. 小麦细胞核的去除及叶绿体的纯化。

(6) Percoll密度梯度的制备：采用8.9%的NaCl与percoll按1;9的体积比例混合制备percoll工作液。用buffer 3 将percoll工作液稀释成所需梯度，下层45%，上层25%，并铺于15mL离心管中，备用。

(7) 用500 uL-1000 uL的buffer 3，重悬步骤（5）中粗提的叶绿体。将重悬液小心铺置于percoll 梯度液表面（percoll： 45%-25 %）4 ^oC、3,000 g，水平离心30 min，收集两种梯度之间的叶绿体（图2-4）。

(8) 将收集的叶绿体用1 mL 的buffer 3重悬，4 ^oC，12,000 rpm，离心5 min，收集沉淀。

(9) 将收集的沉淀物再用1 mL 的buffer 3重悬，4 ^oC，12，000 rpm，离心5 min，再收集沉淀，即为高纯度的叶绿体（图2-5）。然后，将获得的高纯度的叶绿体，用液氮冷冻后，置于– 80 ^oC超低温冰箱中储存，待提取叶绿体DNA。

4.小麦叶绿体DNA提取。

(10) 叶绿体DNA采用天根生化快捷型植物基因组DNA提取系统（DP321）进行提取将步骤（9）中收集的高纯度叶绿体加入400 μL缓冲液FP1和6 μL的RNase A(10 mg/mL)，涡旋振荡1 min，然后室温放置10 min。

(11) 向所得的溶液中再加入130 μL缓冲液FP2，充分混匀，涡旋振荡1 min；4 ^oC，12,000 rpm，离心5 min，将上清转移至新的离心管中。

(12) 将所得的上清液再次4 ^oC，12,000 rpm，离心5 min，将上清转移至新的离心管中。

(13) 向所得的上清液中加入0.7倍体积的异丙醇，上下颠倒，充分混匀；4 ^oC，12,000 rpm，离心2 min，弃上清，保留沉淀。

(14) 沉淀中加入600 μL 70% 乙醇，4 ^oC，12,000 rpm，离心2 min，弃上清；然后再往离心管中加入600 μL 70% 乙醇，4 ^oC，12,000 rpm ，离心2 min，再次弃上清；然后开盖倒置，室温存放5-10 min，彻底晾干残余的乙醇；然后加入30 uL ddH2O，65^oC水浴10 min溶解DNA，其间颠倒混匀数次助溶，最终得到高浓度高质量的DNA溶液,检测DNA纯度（图2-6）。

上述描述仅作为本发明可实施的技术方案提出，不作为对其技术方案本身的单一限制条件。

Claims (5)

1.条形叶植物叶绿体DNA的高纯度高质量提取方法，其特征在于：

该方法通过在叶片上制造机械创伤并结合酶解处理手段获取叶片原生质体，所得原生质体中含有叶绿体、线粒体和细胞核；该方法在获取叶片原生质体后，通过密度梯度离心和差速离心相结合的手段同时将线粒体和细胞核去除干净；

该方法包含如下步骤：

A、叶片原生质体分离：通过在叶片上制造机械创伤并结合酶解处理手段获取叶片原生质体，所得原生质体中含有叶绿体、线粒体和细胞核；

B、叶绿体的粗提：通过差速离心处理去除步骤A所得产物中的杂物对叶绿体进行粗提；

C、叶绿体的纯化：通过密度梯度离心去除步骤B所得产物中的杂物对叶绿体进行纯化；

D、叶绿体DNA的提取：采用快捷型植物基因组DNA提取系统对步骤C所得产物进行提取，获取高纯度的叶绿体DNA；

步骤A包含如下分步骤：

A-1、叶片组织的培养与获取：将目的植物的种子种于育苗盘，并于抽穗前剪取新鲜、健康叶片；

A-2、叶片组织的处理：用刀片将步骤A-1所得叶片沿纵和/或横方向进行交叉切割，造成密集的纹状或格状创伤面，以利后续处理；

A-3、原生质体的分离：将步骤A-2处理好的叶片置于酶解液中，使酶解液淹没叶片，于黑暗中用脱色摇床30 rpm摇动处理3 h；叶片与酶解液比例为30g：50-150mL；

A-4、原生质体的收集：用buffer 1 稀释步骤A-3所得酶解物后，用200目细胞筛过滤，收集滤液，弃渣；滤液4 ^oC 、200 g，离心10 min，收集沉淀，即得；

所述酶解液的配方如下表所示：

纤维素酶 0.5 g/100mL 离析酶 0.3 g/100mL Mannitol 0.4 M KCl 20 mM MES, pH=5.7 20 mM 55 ^oC 加热 10 min，冷却后 CaCl₂ 10 mM BSA 0.1 g/100mL

。

2.根据权利要求1所述的条形叶植物叶绿体DNA的高纯度高质量提取方法，其特征在于：步骤B包含如下步骤：

B-1、将步骤A所得原生质体用50 mL的 buffer 2 悬浮，然后置于冰上，期间每5 min上下颠倒1次，共3次；

B-2、步骤B-1所得悬浮液在4 ^oC、500 g、离心10 min，收集上清，弃沉淀以去除部分细胞核等杂物；

B-3、B-2所得上清液在4 ^oC、3,000 g、离心15 min，弃上清以去除线粒体等细胞器杂物，收集沉淀，所得沉淀即为粗提叶绿体。

3.根据权利要求1所述的条形叶植物叶绿体DNA的高纯度高质量提取方法，其特征在于：步骤C包含如下步骤：

C-1、Percoll密度梯度的制备：采用8.9%的NaCl与percoll按1：9的体积比例混合制备percoll工作液；用buffer 3 将percoll工作液稀释成所需梯度，并铺于15mL离心管中，备用；

C-2、叶绿体纯化：用500 uL-1000 uL的buffer 3，重悬步骤B的操作进行叶绿体粗提，然后将重悬液铺置于percoll 梯度液表面；4 ^oC、3，000 g、水平离心30 min，收集两种梯度之间的叶绿体；

C-3、高纯度叶绿体的获得：将步骤C-2中收集的叶绿体用1 mL 的buffer 3重悬，4 ^oC、12，000 rpm、离心5 min，收集沉淀；将收集的沉淀物再用1 mL 的buffer 3重悬，4 ^oC、12000 rpm、离心5 min，再收集沉淀，即为高纯度的叶绿体，用液氮冷冻后，置于-80 ^oC超低温冰箱中储存，待提。

4.根据权利要求1所述的条形叶植物叶绿体DNA的高纯度高质量提取方法，其特征在于：步骤D包含如下步骤：

D-1、步骤C中收集的高纯度叶绿体中加入缓冲液FP1 400 μL和10 mg/mL的RNase A 6μL，涡旋振荡1 min，然后室温放置10 min;

D-2、所得溶液中再加入130 μL缓冲液FP2，充分混匀，涡旋振荡1 min；4 ^oC、12,000rpm、离心5 min，将上清转移至新的离心管中；

D-3、所得上清液再次4 ^oC、12,000 rpm、离心5 min，将上清转移至新的离心管中；

D-4、所得上清液中加入0.7倍体积的异丙醇，上下颠倒，充分混匀；4 ^oC、12,000 rp、离心2 min，弃上清，保留沉淀；

D-5、所得沉淀中加入600 μL 70% 乙醇，4 ^oC、12,000 rpm、离心2 min，弃上清；然后再往离心管中加入600 μL 70% 乙醇，4 ^oC、12,000 rpm 、离心2 min，再次弃上清；然后开盖倒置，室温存放5-10 min，彻底晾干残余的乙醇；然后加入30 uL ddH₂O，65^oC水浴10 min溶解DNA，其间颠倒混匀数次助溶，最终得到高浓度高质量的DNA溶液。

5.根据权利要求1或2或3或4所述的条形叶植物叶绿体DNA的高纯度高质量提取方法，其特征在于：所述Buffer 1、Buffer 2、Buffer 3的配方如下表所示：

Buffer 1 氯化钠 0.9 % 氯化钙 1.4 % 氯化钾 0.04 % 葡萄糖 0.1 % MES, pH=5.7 1 mM

Buffer 2 山梨醇 0.3 M MgCl₂·6H₂O 1 mM EDTA·2Na 2 mM HEPES 50 mM β-巯基乙醇 0.04 %

Buffer 3 山梨醇 0.3 M MgCl₂·6H₂O 1 mM EDTA·2Na 2 mM HEPES 50 mM

。