CN113293102B - 一种衣藻叶绿体以及叶绿体rna提取的方法 - Google Patents

一种衣藻叶绿体以及叶绿体rna提取的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113293102B
CN113293102B CN202110530249.3A CN202110530249A CN113293102B CN 113293102 B CN113293102 B CN 113293102B CN 202110530249 A CN202110530249 A CN 202110530249A CN 113293102 B CN113293102 B CN 113293102B
Authority
CN
China
Prior art keywords
chloroplast
suspension
chlamydomonas
rna
buffer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110530249.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113293102A (zh
Inventor
李辉
尹涛
杨雪珊
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen University
Original Assignee
Shenzhen University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen University filed Critical Shenzhen University
Publication of CN113293102A publication Critical patent/CN113293102A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113293102B publication Critical patent/CN113293102B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/12—Unicellular algae; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Landscapes

  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种衣藻叶绿体以及叶绿体RNA提取的方法。一种衣藻叶绿体以及叶绿体RNA提取的方法，包括如下步骤:取待提取衣藻细胞消化细胞壁，得到悬浮液1；将悬浮液1中原生质体富集；将原生质体破碎后分离叶绿体。步骤(1)中的消化细胞壁的方法为：将待提取衣藻细胞悬浮于细胞壁酶解缓冲液中，消化的条件为：23‑25℃下，避光10min以上；可选的，还包括终止消化细胞壁的步骤。实验证明，本发明方法操作简单，叶绿体RNA中胞质RNA污染少，纯度高。

Description

一种衣藻叶绿体以及叶绿体RNA提取的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种衣藻叶绿体以及叶绿体RNA提取的方法。
背景技术
叶绿体作为独特的半自主性细胞器，拥有一套独立的基因组，在其基质中进行DNA复制、转录、蛋白翻译等一系列有限的遗传活动。但是该遗传系统的自主程度有限，与核遗传系统存在着密切的生物学调控机制。因此，提取分离获得高纯度的叶绿体RNA，能为细胞器的RNA研究提供有效的实验材料，对于分析叶绿体内各项生理活动及了解相关分子调控机制具有十分重要的意义。
由于叶绿体在莱茵衣藻细胞中体积占比较大，尤其靠近细胞膜。在破碎细胞进行细胞结构分离过程中极有可能会使细胞内的叶绿体造成严重的损害。同时叶绿体对温度、酸碱度、渗透压等外界环境极其敏感，在提取过程保持低温、pH偏高、等渗透压的稳定外环境无疑增加了提取分离的难度。因此相比其他细胞结构，提取分离到完整且具有生物活性的叶绿体十分困难。目前发表的关于莱茵衣藻叶绿体的分离方法大多直接选用莱茵衣藻的细胞壁缺失型突变体例如CC-400和CC-4326等作为实验藻株。而细胞壁完整的莱茵衣藻需进行前处理，常规细胞破碎的方法常可分为机械破碎和非机械破碎，常用于衣藻叶绿体分离的机械破碎方法有高压匀浆法和针压法，两者都是通过压力变化使液体产生剪切力，作用于细胞从而使得细胞破碎。破碎细胞后再可通过差速离心和密度梯度离心的方法将细胞和各类亚细胞结构分离开来。同时，传统方法提取的叶绿体RNA中存在胞质RNA污染。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中提取的叶绿体RNA中存在胞质RNA污染缺陷，从而提供一种高纯度的衣藻叶绿体RNA的提取方法。
本发明提供一种衣藻叶绿体以及叶绿体RNA提取的方法，包括如下步骤:
一种衣藻叶绿体以及叶绿体RNA提取的方法，包括如下步骤:
一种衣藻叶绿体以及叶绿体RNA提取的方法，其特征在于，包括如下步骤:
(1)取待提取衣藻细胞消化细胞壁，得到悬浮液1；
(2)将悬浮液1中原生质体富集，所得原生质体重悬浮，得到悬浮液2；
(3)将原生质体破碎后分离叶绿体。
可选的，步骤(1)中的消化细胞壁的方法为：将待提取衣藻细胞悬浮于细胞壁酶解缓冲液中，消化的条件为：23-25℃下，避光10min以上；可选的，还包括终止消化细胞壁的步骤；可选的，将待提取衣藻细胞液离心后，收集沉淀，得待提取衣藻细胞；细胞壁酶解缓冲液与取待提取衣藻细胞液的体积比为1:10；待提取衣藻细胞液为：将莱茵衣藻(cc849)接种到培养基中，在温度为25℃，光照强度为50μmol photons/m2/s、光暗比12h:12h的培养箱中，共培养3个光周期，在第四个光周期的4-6h收集衣藻细胞液。
可选的，所述细胞壁酶解缓冲液溶剂为无RNase的ddH2O，溶质及浓度如下：400mM甘露醇、20mM MES、20mM KCl、1.5％(w/v)的cellulase(纤维素酶)、0.4％(w/v)的macerozyme(离析酶)和0.1％(w/v)BSA，pH为5.7；w/v表示g/mL
可选的，步骤(1)中终止消化细胞壁的方法为在悬浮液1中加入酶解终止缓冲液；细胞壁酶解缓冲液与酶解终止缓冲液的体积比为1:1；
酶解终止缓冲液的pH为5.7，溶剂为无RNase的ddH2O，溶质及浓度如下：终浓度为2mM的MES、终浓度为154mM的NaCl、终浓度为125mM的CaCl2和终浓度为5mM KCl。
可选的，步骤(2)还包括将所得原生质体用原生质体等渗缓冲液重悬浮，得悬浮液2；可选的，步骤(2)和(3)在2℃-6℃条件下进行；
原生质体等渗缓冲液与取待提取衣藻细胞液的体积比为1:10；
可选的，原生质体等渗缓冲液的pH为5.7，溶剂为无RNase的ddH2O，溶质及浓度如下：终浓度为2mM的MES、终浓度为0.4M的蔗糖、终浓度为20mM的KCl。
可选的，步骤(3)中将原生质体破碎的方法为：
S1:将悬浮液2离心，收集细胞沉淀；
S2：将所得沉淀用原生质体破碎缓冲液重悬浮后，获得的悬浮液3利用尼龙筛过滤；可选的，所述尼龙筛孔径为10μm；
可选的，原生质体破碎缓冲液的pH为8.4，溶剂为无RNase的ddH2O，溶质及浓度如下：终浓度为20mM的Tricine、终浓度为300mM的Sorbitol、终浓度为5mM的EDTA、终浓度为5mM的EGTA、终浓度为10mM的NaHCO3和0.1％(w/v)的BSA；
可选的，从悬浮液3中分离叶绿体的方法为Percoll液密度梯度离心。
Percoll液密度梯度离心为在离心管底部加入体积分数为85％的Percoll缓冲液，上层缓缓加入体积分数为40％的Percoll缓冲液，使两者形成明显的Percoll梯度，再在体积分数为40％的Percoll缓冲液上方加入所述悬浮液6，4℃2500g离心25min，离心后可见位于体积分数85％的Percoll缓冲液和体积分数40％的Percoll缓冲液之间的界面有墨绿色条带；
体积分数为40％的Percoll缓冲液pH为7.3，组成如下：体积分数为40％的Percoll、终浓度为330mM的Sorbitol、1mM MgCl2、1mM MnCl2、2mM EDTA和50mM的HEPES–KOH，余量为无RNase的ddH2O；体积分数为85％的Percoll缓冲液pH为7.3，组成如下：体积分数为85％的Percoll、终浓度为330mM的Sorbitol和终浓度为50mM的HEPES–KOH，余量为无RNase的ddH2O。
可选的，密度梯度离心结束后，取出墨绿色条带，用缓冲液A稀释，离心，收集沉淀，获得叶绿体粗提取物，将该叶绿体粗提取物重悬浮于所述缓冲液A中，得到悬浮液4；缓冲液A与墨绿色条带的体积比大于等于5；
可选的，缓冲液A(叶绿体缓冲液)的pH为7.3，溶剂为无RNase的ddH2O，溶质及浓度如下：终浓度为330mM的Sorbitol和终浓度为50mM的HEPES–KOH。
可选的，将悬浮液4中的叶绿体破坏叶绿体外膜后加入缓冲液A(缓冲液A的体积与悬浮液4的体积比为3:1)稀释，得到悬浮液5；可选的，破坏叶绿体外膜的具体方法为：加入Digitonin，置于2-6℃，消化10-15min；加入Digitonin，置于4℃，消化13min；
Digitonin的加入量为100μg的叶绿体蛋白加入2μg-11μg(4μg)的Digitonin；
可选的，还包括将悬浮液5离心，收集沉淀，用缓冲液A重悬，得到悬浮液6的步骤；
可选的，向悬浮液5或6中加入RNase A(每100μL悬浮液6加入2μL RNase A)，收集沉淀，获得无胞质RNA污染的叶绿体。
所述衣藻为莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)；所述莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)为莱茵衣藻细胞壁缺陷型cc849。
本发明提供的一种衣藻叶绿体以及叶绿体RNA提取的方法，具有如下优点：
1.简便：此方法步骤简单，设计仪器常规，普通的分子生物实验室即可完成。
2、纯度高：此方法所得的叶绿体RNA中胞质RNA污染极少,本发明的方法提取得到的叶绿体RNA中叶绿体基因的表达量/胞质基因表达量是参照组(Digitonin＝0)的40倍。
3、本发明获得高纯度的衣藻叶绿体RNA，其方法是改进叶绿体前期提取的步骤，先用纤维素酶酶解掉衣藻细胞壁，在利用10μm的尼龙膜温和地破碎掉细胞，通过密度梯度离心的方法获得高产率的叶绿体粗提取物，并利用Digitonin处理掉叶绿体的外膜，再利用RNase A消化叶绿体外膜上以及内外模之间的RNA，从而达到最大限度的去除胞质RNA的污染。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1，图1a在光学显微镜显示下，正常状态下的莱茵衣藻，其形态成圆球形，且可以看到清晰的细胞壁；图1b在光学显微镜显示下，为通过细胞壁酶解消化并用10μm的尼龙筛过滤后的莱茵衣藻，其细胞壁已经被酶解掉，同时莱茵衣藻也保持了良好的形态；
图2中显示了通过密度梯度离心纯化莱茵衣藻cc849叶绿体的Percoll梯度照片；左边为没有进行细胞壁酶解，中间为传统针压法，右边为细胞壁酶解10分钟；
图3为无Digitonin处理的参照组(0μg)以及Digitonin的处理组(2、4、8、11μg)的叶绿体基因的表达量/胞质基因表达量，图中D(0)、D(2)、D(4)、D(8)、D(11)依次代表Digitonin＝0μg、Digitonin＝2μg、Digitonin＝4μg、Digitonin＝8μg、Digitonin＝11μg的处理组。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
莱茵衣藻细胞壁缺陷型cc849是购自于美国衣藻资源中心(https://www.chlamycollection.org/)。
培养基：
1.正常TAP培养基：NH4Cl 0.4g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L，CaCl2·2H2O 0.038g/L，K2HPO4 0.155g/L，KH2PO4 0.061g/L，Tris 2.42g/L，亨特微量元素(Hutner’straceelements)1mL/L，醋酸1mL/L，余量为水，pH为7.0。
2、亨特微量元素(Hutner’s trace elements)：H3BO3 11.4g/L，ZnSO4·7H2O22.0g/L，MnCl2·4H2O 5.06g/L，CoCl2·6H2O 1.61g/L，CuSO4·5H2O 1.57g/L，(NH4)6Mo7O24·6H2O 1.1g/L，FeSO4·7H2O 4.99g/L,余量为水，pH为7.0。
试剂：
1、细胞壁酶解缓冲液：400mM mannitol(甘露醇)、20mM MES、20mM KCl、1.5％(w/v)的cellulase(纤维素酶)、0.4％(w/v)的macerozyme(离析酶)和0.1％(w/v)BSA，pH为5.7。
配置方法如下：将3.6434g mannitol、0.1952g MES一同加入40mLddH2O中，向上述溶液中不断加入KOH固体，调节pH为5.7，再加ddH2O定容到50mL，0.75g的cellulase和0.2g的macerozyme最后使用前加入0.05g的BSA，得到细胞壁酶解缓冲液。
2、酶解终止缓冲液：2mM MES、154mM NaCl、125mM CaCl2和5mM KCl，pH为5.7。
配置方法如下：将0.019g MES、0.40g NaCl、0.69g CaCl2和0.018g KCl一同加入40mLddH2O中，向上述溶液中不断加入KOH固体，调节pH为5.7，再加ddH2O定容到50mL。
3、质体破碎缓冲液：20mM Tricine、300mM Sorbitol(山梨醇)、5mM EDTA、5mMEGTA、10mM NaHCO3和0.1％(w/v)的BSA，pH为8.4。
配置方法如下：将0.18g Tricine、2.735g Sorbitol、0.073g EDTA、0.095gEGTA、0.042g NaHCO3加入40mLddH2O中，向上述溶液中不断加入KOH固体，调节pH为8.4，再加ddH2O定容到50mL。使用前加入0.05g BSA。
4、缓冲液A(叶绿体缓冲液)：330mM Sorbitol(山梨醇)和50mM HEPES–KOH，pH为7.3。
配置方法如下：将3.006g Sorbitol和0.595g的HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)加入到40mLddH2O中，向上述溶液中不断加入KOH固体，调节pH为7.3，再加ddH2O定容到50mL。
5、原生质体等渗缓冲液：2mM的MES、0.4M的蔗糖和20mM的KCl，pH为5.7。
配置方法如下：将0.019g MES、6.846g蔗糖和0.072g KCl一同加入40mLddH2O中，向上述溶液中不断加入KOH固体，调节pH为5.7，再加ddH2O定容到50mL。
实施例1、高纯度衣藻叶绿体RNA的提取
一、衣藻细胞的培养
将莱茵衣藻cc849接种到含有100mL正常TAP培养基的250mL三角瓶中，在温度为25℃，光照强度为50μmol photons/m2/s、光暗比12h:12h的培养箱中，共培养3个光周期，在第四个光周期的4-6h收集衣藻细胞液。
二、从衣藻细胞中分离叶绿体
1、实验开始前铺好40％-85％Percoll梯度。首先在离心管底层加入4mL体积分数为85％的Percoll缓冲液，再在体积分数为85％的Percoll缓冲液上缓慢加入4mL的体积分数为40％的Percoll缓冲液，使两者之间形成明显的Percoll分成，光下肉眼可见两者分界。配置好的40％-85％Percoll梯度，置于4℃下待用。
2、把50mL的衣藻细胞液转移到50mL离心管中，25℃下3000g离心10min，弃上清留取沉淀；
3、用5mL的新鲜配置的细胞壁酶解缓冲液重悬浮衣藻细胞沉淀，轻轻吹打混匀，避光室温下消化10min；
4、从离心管侧边加入等体积的酶解终止缓冲液，轻轻混匀后，置于冰上；
5、之后的操作都在4℃或者冰上操作；
6、110g，水平转子离心5min，小心地用巴氏吸管吸取上清，留取墨绿色的细胞沉淀；
7、用5mL的原生质体等渗缓冲液重悬浮细胞沉淀(悬浮过程尽可能轻柔)，接着重复步骤6；
8、用4mL的质体破碎缓冲液重悬浮细胞沉淀，用5mL注射器吸取所有的细胞悬液；
9、把注射器的针头去掉，把注射器中的所有细胞悬液推过一张10μm的尼龙膜，膜下方放置一个离心管用于收集过滤后的液体；
结果如图1所示，在光学显微镜下显示下，图1a为正常状态下的莱茵衣藻，其形态成圆球形，且可以看到清晰的细胞壁；图1b为通过酶解消化并用10μm的尼龙筛过滤后的莱茵衣藻，其细胞壁已经被酶解掉，同时莱茵衣藻也保持了良好的形态。
10、把过滤后的细胞悬液加入到体积分数为40％的Percoll缓冲液上方，2500g水平转子离心25min后，可见位于体积分数85％的Percoll缓冲液和体积分数40％的Percoll缓冲液之间的界面有墨绿色条带，用巴氏吸管小心吸取这个条带；
实验同时设置以无酶解反应的方法，以及传统针压法分离莱茵衣藻叶绿体的对照组。对照分离过程中衣藻细胞的用量与以上本发明所提供的分离方法中的衣藻细胞用量相等。无酶解反应的方法中除了莱茵衣藻不经过酶解反应外，其余步骤与本发明所提供的分离方法一致。传统针压法具体操作引用“A rapid method for chloroplast isolationfrom the green alga Chlamydomonas reinhardtii”一文。
图2中显示了通过密度梯度离心纯化莱茵衣藻cc849叶绿体的Percoll梯度照片。从图中可以看到利用无酶解反应的方法分离得到的莱茵衣藻叶绿体在40％与85％的Percoll梯度界面见只有一条极为浅的绿色条带，说明得到的叶绿体产量极低；采用传统针压法分离得到的莱茵衣藻叶绿体在40％与85％的Percoll梯度界面见只有一条浅的绿色条带，说明得到的叶绿体产量较少；利用本发明方法分离得到的莱茵衣藻叶绿体在40％与85％的Percoll梯度界面见只有一条非常明显的墨绿色条带，说明得到的叶绿体产量较多。
11、用5倍体积的叶绿体缓冲液稀释墨绿色条带，4℃2500g离心13min，收集沉淀，获得叶绿体粗提取物，将叶绿体粗提取物重悬浮于100μL的叶绿体缓冲液中，得叶绿体粗提取物悬液。
12、对叶绿体细胞悬液进行蛋白定量，每100μg的叶绿体蛋白加入适量的Digitonin(毛地黄皂苷)，置于4℃，消化13min。
13、加入三倍体积的叶绿体缓冲液(加入的叶绿体缓冲液的体积是叶绿体粗提取物悬液体积的3倍)稀释终止叶绿体外膜破碎的过程，4℃3500g离心13min，收集沉淀，重悬浮于100μL叶绿体缓冲液。
14、向上一步的细胞悬浮液中加入2μL的RNase A，置于4℃，30min。
15、4℃3500g离心13min，收集沉淀，获得无胞质RNA污染的叶绿体。
16、利用商用总RNA试剂盒提取无胞质RNA污染的叶绿体中的叶绿体RNA。整个过程需要4个小时。
三、衣藻叶绿体RNA纯度鉴定
1、以上步骤(二)本发明方法分离所得的叶绿体RNA的荧光定量PCR
先对以上步骤(二)本发明方法分离所得的叶绿体RNA(1μg)RNA进行反转录反应，详细操作步骤见Takara Bio公司的PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)反转录试剂盒。通过此方法得到的cDNA保存于冰上，随后进行qRT-PCR实验，荧光定量实验使用TOYOBO公司生产的的KOD SYBR qPCR Mix试剂盒，具体步骤参考相关说明书。胞质基因β-Actin用于衡量胞质RNA的残留量，其引物为5’-CTGACTCTGCGCTACCCCATT-3’,5’-CCTCAGTCAGCAGCACGGG-3’。叶绿体基因，其引物为5’-CAGCCCATTCGTTCCGTTAG-3’,5’-CCTGACGGGTTTCAAGCAAA-3’。
荧光定量PCR循环条件为：预变性，98℃，2min；变性，98℃，10sec；退火，60℃，10sec；延伸，68℃，30sec；变性到延伸，总共循环40个。
2、叶绿体RNA纯度计算
计算公式：
叶绿体RNA纯度＝叶绿体基因的表达量/胞质基因表达量＝2-(叶绿体基因的Ct值-β-Actin的Ct值)。
实验中每100μg叶绿体蛋白加入的Digitonin设置了4个处理组(2、4、8、11μg)，每组设三个平行重复。以Digitonin＝0(μg)为参照组，其他组的数据进行均一化。图3结果显示，Digitonin处理组(2μg、4μg、8μg、11μg)的叶绿体基因的表达量/胞质基因表达量都比Digitonin＝0的高；其中每100μg叶绿体蛋白加入4μg Digitonin的处理组中叶绿体基因的表达量/胞质基因表达量最高，大约是参照组的40倍，说明其叶绿体以及提取的叶绿体RNA纯度最高。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (11)

1.一种衣藻叶绿体RNA提取的方法，其特征在于，包括如下步骤:
(1)取待提取衣藻细胞消化细胞壁，得到悬浮液1；
(2)将悬浮液1 中原生质体富集；
(3)将原生质体破碎后分离叶绿体；破坏叶绿体外膜的具体方法为：加入Digitonin，置于2-6℃，消化10-15min；Digitonin的加入量为100μg的叶绿体蛋白加入4μg-8μg的Digitonin；
(4)加入RNase A，收集沉淀，获得无胞质RNA污染的叶绿体；利用商用总RNA试剂盒提取无胞质RNA污染的叶绿体中的叶绿体RNA。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中的消化细胞壁的方法为：将待提取衣藻细胞悬浮于细胞壁酶解缓冲液中，消化的条件为：23-25℃下，避光10min以上。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，还包括终止消化细胞壁的步骤。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1）中终止消化细胞壁的方法为在悬浮液1中加入酶解终止缓冲液。
5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，步骤（2）还包括将所得原生质体用原生质体等渗缓冲液重悬浮，得悬浮液2。
6.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，步骤（3）中将原生质体破碎的方法为：
S1:将悬浮液2离心，收集细胞沉淀；
S2：将所得沉淀用原生质体破碎缓冲液重悬浮后，获得的悬浮液3利用尼龙筛过滤。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述尼龙筛孔径为10μm。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，从悬浮液3中分离叶绿体的方法为Percoll液密度梯度离心。
9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，密度梯度离心结束后，取出墨绿色条带，用缓冲液A稀释，离心，收集沉淀，获得叶绿体粗提取物，将该叶绿体粗提取物重悬浮于所述缓冲液A中，得到悬浮液4；所述缓冲液A为：330mM 山梨醇和50mM HEPES-KOH，pH为7.3。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，将悬浮液4中的叶绿体破坏叶绿体外膜后加入缓冲液A稀释，终止叶绿体外膜的破坏，得到悬浮液5。
11. 根据权利要求10所述的方法，其特征在于，向悬浮液5中加入RNase A，收集沉淀，获得无胞质RNA污染的叶绿体。
CN202110530249.3A 2021-04-26 2021-05-14 一种衣藻叶绿体以及叶绿体rna提取的方法 Active CN113293102B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2021104560040 2021-04-26
CN202110456004 2021-04-26

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113293102A CN113293102A (zh) 2021-08-24
CN113293102B true CN113293102B (zh) 2023-07-14

Family

ID=77322185

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110530249.3A Active CN113293102B (zh) 2021-04-26 2021-05-14 一种衣藻叶绿体以及叶绿体rna提取的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113293102B (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105907697A (zh) * 2016-06-15 2016-08-31 河南农业大学 一种小麦完整叶绿体的制备方法
WO2017196790A1 (en) * 2016-05-09 2017-11-16 Mackinder Luke C M Algal components of the pyrenoid's carbon concentrating mechanism

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101117634A (zh) * 2007-07-09 2008-02-06 华中农业大学 一种分离棉花叶绿体dna的方法
CN102311937B (zh) * 2011-09-13 2013-05-01 中山大学 水稻绿色原生质体的制备方法及应用
CN105316275B (zh) * 2015-11-27 2018-07-24 甘肃农业大学 盐生草叶片细胞液泡的提取方法
CN106967714B (zh) * 2017-06-07 2019-09-13 唐山师范学院 条形叶植物叶绿体dna的高纯度高质量提取方法
CN111718928A (zh) * 2020-07-01 2020-09-29 浙江理工大学 一种黄精叶绿体dna提取优化方法
CN111944736B (zh) * 2020-07-06 2022-06-24 深圳大学 一种小立碗藓原生质体及其制备方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017196790A1 (en) * 2016-05-09 2017-11-16 Mackinder Luke C M Algal components of the pyrenoid's carbon concentrating mechanism
CN105907697A (zh) * 2016-06-15 2016-08-31 河南农业大学 一种小麦完整叶绿体的制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN113293102A (zh) 2021-08-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11434483B2 (en) Method for constructing single cell sequencing library and use thereof
EP1735440B1 (en) Reagents and methods for isolation of purified rna
US20090143570A1 (en) Method for isolation of genomic dna, rna and proteins from a single sample
US20090043087A1 (en) DNA purification and recovery from high particulate and solids samples
US20200385675A1 (en) Methods for isolating different types of single cells from ovary
EP2382323B1 (de) Präparation und amplifikation von nukleinsäuren mittels magnetischer partikel
EP3129498B1 (en) Nucleic acid purification method
CN114540297A (zh) 一种间充质干细胞外泌体的分离和miRNA分析方法
CN113293102B (zh) 一种衣藻叶绿体以及叶绿体rna提取的方法
US20090042290A1 (en) Method of modifying a macromolecule without prior extraction from a sample
WO2024077899A1 (zh) 一种拟南芥叶片样本组织解离液及解离方法
US11618917B2 (en) Methods for microbial DNA analysis
CN110408686A (zh) 一种快速鉴定小鼠基因型的方法
CN115466779A (zh) 一种单克隆鉴定试剂盒及鉴定单克隆细胞基因型的方法
CN105274131B (zh) 一种peg介导胶孢炭疽病菌原生质体遗传转化的方法
CN113755488A (zh) 一种快速提取高纯度质粒dna的方法
CN103305418A (zh) 一种干细胞分离培养装置
CN106119132B (zh) 一种寡雄腐霉原生质体的制备和再生方法与复合酶解液
CN114107449B (zh) 一种单细胞内原位qPCR方法
CN114958610B (zh) 苯乳酸在制备酵母菌裂解液中的应用、试剂盒及方法
CN202465712U (zh) 一种干细胞分离培养装置
Young et al. Isolation of macro-nuclear DNA from the rumen ciliate Entodinium caudatum
CN110628873A (zh) 一种去除预处理污泥胞外核酸的方法
CN112094840A (zh) 一种用于基因组片段扩增的微量动物样品基因组dna模板的快速制备方法
CN113913504A (zh) 一种以三角褐指藻藻细胞为模板无需提取纯化dna的快速pcr检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant