CN112094840A - 一种用于基因组片段扩增的微量动物样品基因组dna模板的快速制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及一种用于基因组片段扩增的微量动物样品基因组DNA模板的快速制备方法，其特征在于将微量动物组织或细胞置于YSY缓冲液中，再将混合液经过孵育、变性、和冷却，即可获得可用于常规PCR扩增或定量PCR扩增的DNA模板。本发明公布的微量动物样品体积小于1mm³，具核细胞数不少于1个；YSY缓冲液由盐溶液、去垢剂、和蛋白裂解酶组成。缓冲液与微量动物组织或细胞的混合比例是10体积缓冲液：小于1体积的微量样品。缓冲液与动物样品混合后经孵育、变性、和冷却，即可获得可用于常规PCR扩增或定量PCR扩增的DNA模板。该方法特别适用于大规模基因型鉴定所需微量基因组DNA模板的制备。

Description

一种用于基因组片段扩增的微量动物样品基因组DNA模板的 快速制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种用于基因组片段扩增的微量动物样品基因组DNA模板的快速制备方法，其特征在于将微量动物组织或细胞置于YSY缓冲液中，然后将混合液经过孵育、变性、和冷却等步骤，即可获得可用于常规PCR扩增或定量PCR扩增的DNA模板。

技术背景

自上个世纪五十年代发现遗传的中心法则以来，源自基因组DNA的遗传信息经转录形成RNA、其中编码蛋白质的mRNA被进一步翻译成蛋白质、最终发挥生物学作用这一基本规律已获得了广泛的接受。生物个体基因组DNA携带的遗传信息在正常的发育和生长过程中扮演着关键的作用，任何在基因组DNA 水平上的突变都有可能导致生物体出现发育和生长的异常，在人类临床实践上则可能表现为各种疾病。因此，了解基因组DNA序列特征是否改变已经成为无论是开展生命科学基础研究还是临床应用均不可或缺的日常工作之一。

基因组DNA序列是微观世界的信息，必须通过放大才能间接获知。得益于多聚酶链反应技术(PCR： Ploymerase Chain Reaction)的发明，微观世界的基因组DNA片段经几何级数放大(PCR反应经25个循环的扩增，理论上模板将实现100万倍的增加)后，经琼脂糖凝胶电泳通过DNA染色(如溴化乙锭染色) 在紫外灯照射下可以通过肉眼直接观测到，或者将PCR产物直接进行Sanger测序即可知道基因组DNA片段的DNA序列信息；如果是定量PCR扩增，还可以通过构建目标DNA片段质量的标准曲线，确定目标基因组DNA片段在样品中的实际含量。

可见，要想了解目标基因组DNA片段序列信息，获得可用作基因组DNA放大(PCR扩增)的基因组DNA模板是首先必须要解决的技术问题。

传统的基因组DNA模板的制备是通过抽提目标基因组DNA(制作基因组DNA纯品)来实现的。以《分子克隆实验指南》公布的《方案13用蛋白酶K和苯酚从哺乳动物细胞中分离高分子质量DNA》基因组DNA提取的方法为例(第37页至第42页)，无论是源自单层培养细胞(1×10^7个/ml)还是来源于组织样(1g新鲜组织)或是来自血液(20ml)的人基因组样本需经过细胞裂解、蛋白酶K消化、苯酚抽提、DNA酒精沉淀等步骤，不仅需要大量的样品材料，还需要用到有机溶剂，步骤繁杂，费时需2天左右。即使如《分子克隆实验指南》公布的《方案15从鼠尾或其他小样本中制备基因组DNA》的方法(第 46页至第50页)中不使用有机溶剂(第48页)《替代方案不使用有机溶剂从鼠尾分离DNA)，也还是需要漫长的蛋白酶K消化以及酒精沉淀的过程。

虽然传统的制备基因组DNA方法可一次性获得微克级纯化的基因组DNA，毫无疑问可以用作后续的PCR扩增和定量PCR分析，但是以传统方法获得基因组DNA模板，需要大量的生物样品以及要花费很长的时间。随着功能基因组时代与大健康时代的到来，如何从大批量的且微量的真核生物样品中快速获得可用于PCR扩增的模板成为急需解决的技术难题。本发明旨在公布一种用于基因组片段扩增的微量动物样品基因组DNA模板的快速制备方法，为常规PCR扩增和/或定量PCR扩增提供有效的基因组DNA模板，进而为大规模的DNA扩增提供便利性。

参考文献：

1、分子克隆实验指南：第四版/(美)M.R.格林(Michael R.Green)，(美)J.萨姆布鲁克(Joseph Sambrook)主编：贺福初主译。----北京：科学出版社，2017.3

发明内容

以传统方法获得用作PCR扩增的基因组DNA模板，需要相对较大量的生物样品、花费很长的时间。为解决从大批量的且微量的真核生物样品中快速获得可用于PCR扩增的基因组DNA模板，本发明公布了一种适用于微量动物样品基因组DNA模板的快速制备方法，可以有效地为常规PCR扩增和/或定量PCR扩增提供基因组DNA模板，进而满足大规模地基因型鉴定所需的对基因组DNA模板的需要。

为建立从微量动物样品中制备出可供PCR扩增使用的基因组DNA模板，我们发明了一种特别的缓冲液(YSY Buffer)，其成分包括：盐溶液、去垢剂、和蛋白裂解酶。其中缓冲液中的盐溶液包括0～1mM Tris.HCl(pH7.4-8.0)、0～0.1mM EDTA(pH8.0)、0～200mM NaCl、0～20mM Na2HPO4、和0～20mM NaH2PO4；去垢剂为Triton-100或Tween-20，浓度为0-1％；蛋白裂解酶为可以裂解蛋白质成分的酶。优选蛋白质K或蛋白酶(pronase)，浓度为1-50mg/L。

YSY Buffer适用的微量动物样品的体积一般小于1mm³。所含的有核细胞数不少于1个，优选300 个。

YSY Buffer与微量动物组织或细胞的使用体积比是10体积YSY Buffer：小于1体积的微量动物组织或细胞；优选的比例是10∶1。

将YSY Buffer加入微量动物组织或细胞中后，经过孵育、变性、和冷却等步骤，即可获得可用于常规PCR扩增或定量PCR扩增的DNA模板。其中孵育温度为37-75℃，孵育时间为1-60分钟；优选60℃孵育30分钟。变性的温度为85至100℃，孵育时间为1-10分钟；优选95℃孵育5分钟。冷却的温度为4 至16℃，孵育时间为1-10分钟；优选16孵育1分钟。所获得的基因组DNA模板即可直接用于常规PCR 和定量PCR扩增。

具体实施方式

实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1 斑马鱼单个早期发育胚胎的82bp的cyp26a1基因组片段的扩增

1.1斑马鱼早期发育胚胎的收集

按常规方法将野生型TU品系性成熟斑马鱼进行交配，将所产受精卵按常规方法培养，待胚胎发育至4-细胞期、8-细胞期、16-细胞期、32-细胞期、64-细胞期、128-细胞期、256-细胞期、512-细胞期、1K- 细胞期、4K-细胞期、50％外包期、以及75％外包期等不同发育时期时分别收集3个胚胎置于0.2ml的PCR 管中。以2.5μl移液期尽可能吸去胚胎中的水溶液，然后将胚胎置于冰盒中备用。

1.2单个胚胎基因组DNA模板的制备

在每个盛有单个胚胎的PCR管中加入2.2μl的YSY Buffer。快速离心确保溶液和胚胎均位于PCR 管底，然后放入PCR仪中执行60℃ 30min、95℃ 10min、16℃ 1min的基因组DNA模板制备程序。

1.3 82bp的cyp26a1基因组片段的直接扩增

按常规配制PCR反应液(每胚胎20μl扩增体系)17.8μl含10μl 2×Rapid TaqMaster mix、0.8μl 正向引物cyp-QF4(引物序列为：tacaagacgcacctcttcgg；10μM)、0.8μl反向引物cyp-QR4(引物序列为：tgtgttcgcccagcagaatc：10μM)、6.2μl超纯水(18.2兆欧姆)，混匀，快速离心。将配制好的17.8μl PCR 反应液直接加入前述制备好的单个胚胎基因组DNA模板的PCR管中，快速离心后，放入PCR仪中，执行如下扩增程序：95℃ 3min、30×(95℃ 15sec，60℃ 15sec，72℃ 5sec)、72℃ 5min。

1.4凝胶电泳观测

按常规方法制备2.5％的琼脂糖凝胶(含0.5μg/ml溴化乙锭)，以移液枪吸取5μlPCR反应产物加入样品孔中进行常规电泳(电压200V，电泳15min)。电泳结束后，在电泳观测仪中观测并拍照记录。

图1显示的斑马鱼胚胎发育早期cyp26a1基因的82bp基因组DNA片段的扩增结果，可见128-细胞期的单个胚胎中可微弱的基因组DNA扩增信号，自1K-细胞期的单个胚胎则可见明显扩增产物，自4K- 细胞期的单个胚胎的82bp基因组DNA片段扩增条带则非常清晰明亮。

实施例2 斑马鱼单个早期发育胚胎的467bp的vps28基因组片段的扩增

2.1斑马鱼早期发育胚胎的收集

按常规方法将野生型TU品系性成熟斑马鱼进行交配，将所产受精卵按常规方法培养，待胚胎发育至4-细胞期、8-细胞期、16-细胞期、32-细胞期、64-细胞期、128-细胞期、256-细胞期、512-细胞期、1K- 细胞期、4K-细胞期、50％外包期、以及75％外包期等不同发育时期时分别收集3个胚胎置于0.2ml的PCR 管中。以2.5μl移液枪尽可能吸去胚胎中的水溶液，然后将胚胎置于冰盒中备用。

2.2单个胚胎基因组DNA模板的制备

在每个盛有单个胚胎的PCR管中加入3.0μl的YSY Buffer。快速离心确保溶液和胚胎均位于PCR 管底，然后放入PCR仪中执行60℃ 30min、95℃ 10min、16℃ 1min的基因组DNA模板制备程序。

2.3 467bp的vps28基因组片段的直接扩增

按常规配制PCR反应液(每胚胎30μl扩增体系)27μl含15μl 2×Rapid Taq Mastermix、1.2μl 正向引物vps20-10E F(引物序列为：GCCCTAGCTGGATATTTCAC；5μM)、1.2μl反向引物vps28-10E R(引物序列为：CCCACCCTGAACTAAATGCA；5μM)、9.6μl超纯水(18.2兆欧姆)，混匀，快速离心。将配制好的27μl PCR反应液直接加入前述制备好的单个胚胎基因组DNA模板的PCR管中，快速离心后，放入PCR仪中，执行如下DNA扩增程序：95℃ 3min、30×(95℃15sec，58℃ 15sec，72℃ 15sec)、72℃ 5 min。

2.4凝胶电泳观测

按常规方法制备1.5％的琼脂糖凝胶(含0.5μg/ml溴化乙锭)，以移液枪吸取5μlPCR反应产物加入样品孔中进行常规电泳(电压200V，电泳15min)。电泳结束后，在凝胶成像仪中观测并拍照记录。

图2显示的斑马鱼胚胎发育早期vps28基因的467bp基因组DNA片段的扩增结果，可见64-细胞期的单个胚胎中可微弱的基因组DNA扩增信号，自256-细胞期的单个胚胎则可见明显扩增产物，自4K- 细胞期的单个胚胎的467bp基因组DNA片段扩增条带则非常清晰明亮。

实施例3 人结肠癌细胞系HCT116中GAPDH基因的定量扩增

3.1细胞复苏

从-80℃冰箱中取出冻存的人结肠癌细胞细胞系HCT116一管，迅速置于37℃水浴锅中剧烈晃动。将融化的细胞放入15mL离心管中，1,000rcf离心3min，吸出上清，加入1mL新鲜的完全培养基DMEM (Gibco)，充分重悬，然后转移至含有9mL DMEM的10cm细胞培养皿中，按照“米”字法摇匀细胞，然后将培养皿放入37℃细胞培养箱(5％CO₂)中培养。12小时后吸出废液，换10mL新鲜的DMEM。

3.2细胞传代

复苏24hr后，显微镜下观察细胞已长满培养皿底部约80％的面积。首先用真空吸引泵吸去旧的培养液，用1mL 1×PBS清洗细胞两遍，然后真空吸引泵吸去，加入1mL 0.25％胰酶(Sigma)，覆盖底部，放入37℃培养箱消化1min，消化后加入2mL完全培养基终止消化。将以上液体转移至15mL离心管中， 1,000rcf离心3min，弃上清。向离心管中加入2mL将以上液体转移至15mL离心管中，1,000rcf离心 3min，弃上清。向离心管中加入2mL完全培养基，吹打5-8次。取2个新的培养皿，在每个培养皿中加入 9mL的完全培养基，然后向每个培养皿中加入1mL细胞悬浮液。混匀，将两盘细胞放入37℃细胞培养箱 (5％CO2)中培养。

3.3.细胞收集与计数

观察细胞已长满培养皿底部约90％的面积。首先用真空吸引泵吸去旧的培养液，用1mL 1×PBS清洗细胞两遍，然后真空吸引泵吸去，加入300μL 0.25％胰酶(Sigma)，覆盖底部，放入37℃培养箱消化 1min，消化后加入600μL完全培养基终止消化。将以上液体转移至15mL离心管中，1,000rcf离心3min，弃上清。然后用1mL 1×PBS清洗细胞三遍，然后真空吸引泵吸去。向离心管中加入2mL 1×PBS重悬细胞。从重悬细胞中取出10μL悬浮液加入到10μL 1×PBS中稀释10倍，混匀后，吸入10μL稀释后的悬浮液到血球计数板的两个计数区中，在显微镜下进行计数。计数结果如下：计数区1： (66+53+73+53)/4*10*104＝6.125*10^6/mL；计数区2：(50+40+52+51)/4*10*104＝4.825*10^6/mL。所以，细胞悬浮液的细胞密度为5.47*10^6/mL。

3.4细胞基因组DNA模板的制备

从取剩余细胞悬液中取出995μL细胞悬浮液(内含5.47*10^6个细胞)，快速离心将细胞离心至离心管底部，去除上清液后，加入50μL YSY Buffer重悬细胞后转移至0.2mlPCR管制备基因组模板。将 PCR管放入PCR仪中执行65℃ 30min、95℃ 5min、16℃ 1min的基因组DNA模板制备程序。这样获得的每2μL溶液里面是由2.189*10^5个细胞制备出来的基因组模板。

3.5定量PCR扩增制作GAPDH基因含量的标准曲线

先将收取的细胞制备的基因组模板按照5倍比稀释，作为标准曲线的标准品。

样品号	1	2	3	4	5	6
							样品稀释倍数	5^1	5^2	5^3	5^4	5^5	5^6
2μL基因组模板对应的细胞数	218,000	43,600	8,720	1,744	348	70

配制定量PCR(qPCR)反应体系(10μ)，含5μL 2×SYBR Green reagent(ABI)、0.3μL正向引物GAPDH2F(引物序列为：GGTCTCCTCTGACTTCAACAGC；10μM)、0.3μL反向引物GAPDH2R(引物序列为：AGAGTTGTCAGGGCCCTTTTTCT；10μM)、2μL基因组DNA模板(样品1～6)、以及2.4μL超纯水。

加好样之后上机，仪器为ABI StepOne Plus荧光定量PCR仪。PCR反应程序为：50℃2min，95℃ 2min，40×(95℃ 15s，60℃ 1min)。溶解曲线：95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s。

qPCR结果分析

图3显示的是GAPDH基因扩增的溶解曲线，可以看出该基因被有效特异地进行了定量扩增。

qPCR给出的Ct值

样品号	1	2	3	4	5	6
							样品稀释倍数	5^1	5^2	5^3	5^4	5^5	5^6
2μL基因组模板对应细胞数	218,000	43,600	8,720	1,744	348	70
							Ct值(复孔1)	19.77498	20.87672	22.91840	24.63216	27.35824	29.86975
Ct值(复孔2)	19.76398	20.73381	22.71818	25.01023	27.35304	29.54394
							Ct值(复孔3)	19.94301	20.86817	22.74264	24.71119	27.36340	30.53126
平均Ct值	19.82732	20.82623	22.79307	24.78453	27.35823	30.2005

从qPCR的Ct值来看，除样品6外，每一组样品3个复孔间的Ct值差别均小于0.5。考虑到样品6中的模板中仅含有70个细胞(2μL)对应的基因组DNA模板，因此样品吸取的系统误差相对较大。所有这些Ct值均反映了本发明制备的基因组DNA模板质量足以用作进行定量PCR实验。

图4显示的等比稀释的基因组DNA模板扩增出来的GAPDH基因含量的标准曲线。横坐标是以10 为底样品稀释倍数的对数，纵坐标的Ct值。以样品1～6进行线性回归所得的方程为y＝3.0025x+16.953 (R²＝0.9788)，不符合qPCR标准曲线的有效值，原因在于样品1细胞数太多(大于20万)；而以样品 2～6进行线性回归所得的方程为y＝3.3354x+15.067(R²＝0.9926)，符合qPCR标准曲线的有效值。可见，使用YSY Buffer制备的基因组DNA模板的质量足以用于定量PCR扩增。

Claims (6)

1.一种用于基因组片段扩增的微量动物样品基因组DNA模板的快速制备方法，其特征在于将微量动物组织或细胞置于YSY缓冲液中，然后将混合液经过孵育、变性、和冷却等步骤，即可获得可用于常规PCR扩增或定量PCR扩增的DNA模板。

2.如权利要求1所述的特征，微量动物样品的体积一般小于1mm³。所含的有核细胞数不少于1个，优选300个。

3.如权利要求1所述的特征，溶解动物组织或细胞的溶液为YSY缓冲液(YSY Buffer)，其特征在于含有盐溶液、去垢剂、和蛋白裂解酶。其中缓冲液中的盐溶液包括0～1mMTris.HCl(pH7.4-8.0)、0～0.1mM EDTA(pH8.0)、0～200mM NaCl、0～20mM Na2HPO4、和0～20mM NaH2PO4；去垢剂为Triton-100或Tween-20，浓度为0-1％；蛋白裂解酶为可以裂解蛋白质成分的酶。优选蛋白质K或蛋白酶(pronase)，浓度为1-50mg/L。

4.如权利要求1和权利要求2所述的特征，YSY Buffer与微量动物组织或细胞的使用体积比是10体积YSY Buffer：小于1体积的微量动物组织或细胞；优选的比例是10∶1。

5.如权利要求1所述的特征，孵育温度为37-75℃，孵育时间为1-60分钟；优选65℃孵育30分钟。变性的温度为85至100℃，孵育时间为1-10分钟；优选95℃孵育5分钟。冷却的温度为4至16℃，孵育时间为1-10分钟；优选16孵育1分钟。

6.如权利要求1所述的特征，所获得的基因组DNA模板可直接用于常规PCR和定量PCR扩增。

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