CN106755453B - 微量细胞水平鉴别单原核胚胎类型的方法和系统 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种微量细胞水平鉴别单原核胚胎类型的方法和系统，该方法通过对单原核胚滋养层细胞样本进行全基因组扩增，并将扩增得到第一扩增产物与SNP基因芯片杂交获得SNP位点比率及杂合型位点比率，根据SNP位点比率及杂合型位点比率计算获得样本的杂合概率。然后将样本的杂合概率与预设的胚胎分型标准进行比对，根据比对结果对样本的胚胎类型进行预分，获得样本的胚胎类型。上述方法通过对废弃的胚胎进行准确的分型，提高资源的利用率。

Description

微量细胞水平鉴别单原核胚胎类型的方法和系统

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种微量细胞水平鉴别单原核胚胎类型的方法和系统。

背景技术

正常的受精卵发育而来的二倍体细胞一般含有两个染色体组，一组来自父亲(父源)，一组来自母亲(母源)。通过显微镜观察辅助生殖过程体外受精后16小时～18小时的合子，正常情况下一般具有两个原核，一个雌原核和一个雄原核，即正常受精胚胎，也称2PN胚胎。但是同时存在着1.6％～7.7％的合子只能看到一个原核，即单原核胚胎，也称1PN胚胎。对于1PN胚胎的处理临床上存在争议，有个例报道认为其可以进行移植有可能出生正常婴儿，也有研究认为1PN的胚胎有较高比例的染色体异常和低的发育潜能。目前的普遍的观点认为1PN胚胎移植风险太大，通常将1PN胚胎认为是异常受精产生的，在临床上视为废弃胚胎，对资源造成浪费。

发明内容

基于此，有必要提供一种在微量细胞水平鉴别单原核胚胎类型的方法和系统。

一种微量细胞水平鉴别单原核胚胎类型的方法，包括以下步骤：

将单原核胚胎样本体外培养至囊胚，取所述囊胚滋养层消化成单细胞，收集微量所述单细胞进行全基因组扩增，得到第一扩增产物；

将所述第一扩增产物与SNP基因芯片杂交，扫描杂交后的所述SNP基因芯片得到SNP位点比率及杂合型位点比率，根据所述SNP位点比率及所述杂合型位点比率计算获得所述样本的杂合概率；以及

将获得的所述样本的杂合概率与预设的胚胎分型标准进行比对，根据比对结果对所述样本的胚胎类型进行预分，获得所述样本的胚胎类型，其中，所述胚胎分型标准包括纯合孤雌胚胎和杂合孤雌胚胎。

一种微量细胞水平鉴别单原核胚胎类型的系统，所述系统包括：

第一扩增装置，用于将单原核胚胎样本体外培养至囊胚，取所述囊胚滋养层消化成单细胞，收集微量所述单细胞进行全基因组扩增，得到第一扩增产物；

基因杂交装置，用于将所述第一扩增产物与SNP基因芯片杂交，扫描杂交后的所述SNP基因芯片得到SNP位点比率及杂合型位点比率，根据所述SNP位点比率及所述杂合型位点比率计算获得所述样本的杂合概率；以及

分型装置，将获得的所述样本的杂合概率与预设的胚胎分型标准进行比对，根据比对结果对所述样本的胚胎类型进行预分，获得所述样本的胚胎类型，其中，所述胚胎分型标准包括纯合孤雌胚胎和杂合孤雌胚胎。

上述微量细胞水平鉴别单原核胚胎类型的方法，通过对单原核胚胎滋养层细胞样本进行全基因组扩增，并将扩增得到第一扩增产物与SNP基因芯片杂交获得SNP位点比率及杂合型位点比率，根据SNP位点比率及杂合型位点比率计算获得样本的杂合概率。然后将样本的杂合概率与预设的胚胎分型标准进行比对，根据比对结果对样本的胚胎类型进行预分，获得样本的胚胎类型。通过上述方法一般仅需3个～5个的微量细胞即可实现对单原核胚胎胚胎干细胞样本分型，将临床上鉴定为单原核胚胎而视为废弃的胚胎更加准确分为纯合孤雌胚胎或杂合孤雌胚胎。其中，纯合孤雌胚胎和杂合孤雌胚胎均可用于建立胚胎干细胞系，两者是研究印记基因和父母源基因组在发育过程中的作用的良好细胞模型，且在细胞替代治疗中孤雌细胞系更容易获得HLA单倍型的细胞系，在配型上有优势，另外可用于药物筛选。纯合孤雌胚胎干细胞两套染色体完全相同，类似于单倍体，配型上比杂合孤雌胚胎干细胞更有优势。上述微量细胞水平鉴别单原核胚胎类型的方法和系统，通过对废弃的胚胎进行准确的分型，提高资源的利用率。

附图说明

图1为一个实方式的微量细胞水平鉴别单原核胚胎类型的方法的流程图；

图2为一个实方式的微量细胞水平鉴别单原核胚胎类型的系统的结构框图；

图3为一个实方式的印记基因表达分析装置的结构框图；

图4为一个实方式的亲源性分析装置的结构框图；

图5为实施例2中的实验样本、实验对照、空白对照组经印记基因表达分析后的印记结果图。

具体实施方式

下面主要结合附图及具体实施例对本发明作进一步的说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

一实施方式的微量细胞水平鉴别单原核胚胎类型的方法如图1所示，该方法包括以下步骤S110～S130。

S110、将单原核胚胎样本体外培养至囊胚，取所述囊胚滋养层消化成单细胞，收集微量单细胞进行全基因组扩增，得到第一扩增产物。

一般先通过显微镜观察辅助生殖过程体外受精后16小时～18小时的合子，若合子只能看到一个原核，一般认为是单原核胚胎，也称1PN胚胎。该胚胎在临床上一般视为废弃胚胎。

本实施方式中，将临床上鉴定为单原核胚胎的样本体外培养至囊胚阶段，活检后采用激光辅助的方式切割一片滋养层(一般含有3个～10个细胞)，消化成单细胞，一般可采用消化酶对滋养层细胞进行消化，消化酶例如可以是accutase细胞消化液(购于lifetechnology公司)。消化后在体视镜下用毛细管玻璃针吸取微量细胞进行全基因组扩增，得到第一扩增产物。

具体的，微量细胞一般是指能够实现细胞基因组扩增的细胞量。本实施方式中一般收集3个～5个细胞即可。

具体的，滋养层细胞样本消化成单细胞后，也可将细胞样本保存在无菌管(例如无菌EP管)中，以便下次使用，样本可在-20℃下一般可保存一个月。

具体的，将收集的微量单细胞进行全基因组扩增，基因组扩增是对样本gDNA进行扩增，用于后续的芯片分析和STR分析。一般可采用商业化试剂盒进行全基因组扩增，本实施方式采用的是sigma公司WGA4Genome-Plex Single Cell Whole Genome Amplification试剂盒。可以理解，其他可实现胚胎细胞全基因组扩增的试剂盒亦可。

具体的，单原核胚胎样本还可以通过对孤雌胚胎干细胞的分离、培养和鉴定获得。采用人工激活的方法获得孤雌囊胚，若排出第二极体形成的囊胚为纯合孤雌囊胚，若未排出第二极体形成的囊胚为杂合孤雌囊胚，然后分离孤雌囊胚内细胞团可获得孤雌胚胎干细胞系。孤雌胚胎干细胞系可培养在Matrigel基质胶包被细胞培养皿中，采用mTeSR培养基培养，隔天换液。

S120、将S110中获得的第一扩增产物与SNP基因芯片杂交，扫描杂交后的SNP基因芯片得到SNP位点比率及杂合型位点比率，根据SNP位点比率及杂合型位点比率计算获得样本的杂合概率。

SNP(single nucleotide polymorphism，单核苷酸多态性)是指在基因组上单个核苷酸的变异，包括置换、颠换、缺失和插入。从理论上来看每一个SNP位点都可以有4种不同的变异形式，但实际上发生的基本只有两种，即转换和颠换。二者之比约为2:1。SNP在CG序列上出现最为频繁，而且多是C转换为T，原因是CG中的C常为甲基化的，自发地脱氨后即成为胸腺嘧啶。一般而言,SNP是指变异频率大于1％的单核苷酸变异。在人类基因组中大概每1000个碱基就有一个SNP，人类基因组上的SNP总量大概是3×10⁶个。第一扩增产物与SNP基因芯片杂交后，由于第一扩增产物和探针杂交的程度与荧光强度相关，因此通过激光扫描，即可根据荧光强弱测出被检测序列的变异。

本实施方式中，SNP基因芯片采用的是GeneChip Mapping Nsp I 262Kmicroarray(Affymetrix公司)，其他型号的芯片亦可。芯片扫描后，采用CNAT4.0软件对SNP位点分型结果进行分析。得到SNP位点比率及杂合型位点比率，再根据SNP位点比率及杂合型位点比率可计算获得样本的杂合概率。

具体的，样本的杂合概率＝杂合型位点比率/SNP位点比率×100％。

样本的杂合概率可反应样本中基因的杂合程度，从而用于判断胚胎样本的类型。

S130、将S120中获得的样本的杂合概率与预设的胚胎分型标准进行比对，根据比对结果对样本的胚胎类型进行预分，获得样本的胚胎类型，其中，胚胎分型标准包括纯合孤雌胚胎和杂合孤雌胚胎。

具体的，预设的胚胎分型标准为经过了多次检测试验总结的分型标准。具体而言，预设的胚胎分型标准通过如下方法获得，分别检测多组已知胚胎类型的胚胎，获得多组2PN胚胎的SNP位点比率及杂合型位点比率，计算获得2PN胚胎的杂合概率，以及多组1PN胚胎(包括纯合孤雌胚胎以及杂合孤雌胚胎)的SNP位点比率及杂合型位点比率，计算获得纯合孤雌胚胎的杂合概率以及杂合孤雌胚胎的杂合概率。根据多组2PN胚胎的杂合概率总结得到2PN胚胎的杂合概率范围、纯合孤雌胚胎的杂合概率范围以及杂合孤雌胚胎的杂合概率范围，以此作为胚胎分型标准。

本实施例中参见的分型标准源于中信湘雅生殖与遗传专科医院中进行植入前遗传学筛查/诊断的滋养层细胞的检测数据。当然，根据鉴别的需要，也可以采用外周血淋巴细胞或是其他类型细胞系。

本发明中分型标准的检测数据以及后续的在微量细胞水平鉴别单原核胚胎类型的实验研究通过了中信湘雅生殖与遗传专科医院伦理委员会的讨论通过，并且取得了家属的知情同意。

具体的，预设的胚胎分型标准中，胚胎细胞的杂合概率小于8％的为单原核胚胎(1PN胚胎)，进一步的，胚胎细胞的杂合概率小于3.5％的为纯合孤雌胚胎，胚胎细胞的杂合概率在3.5％～8％之间的为杂合孤雌胚胎。

当然，预设的胚胎分型标准中还可以包括2PN胚胎杂合概率，一般的，胚胎细胞的杂合概率在10％～30％之间的为2PN胚胎。

将获得的样本的杂合概率与预设的胚胎分型标准进行比对，根据比对结果即可对样本的胚胎类型进行预分，例如样本的杂合概率小于8％，可鉴定其为单原核胚胎(1PN胚胎)，进一步的，对该单原核胚胎(1PN胚胎)进一步鉴定，若样本的杂合概率小于3.5％的为纯合孤雌胚胎，样本的杂合概率在3.5％～8％之间的为杂合孤雌胚胎。

上述方法，可将临床上粗略的通过显微镜观察划分成1PN胚胎(废弃胚胎)进一步筛选，判断其是否为确切的1PN胚胎，并对1PN胚胎进一步鉴定，更加准确分为纯合孤雌胚胎或杂合孤雌胚胎。其中，纯合孤雌胚胎和杂合孤雌胚胎均可用于建立胚胎干细胞系，两者是研究印记基因和父母源基因组在发育过程中的作用的良好细胞模型，且在细胞替代治疗中孤雌细胞系更容易获得HLA单倍型的细胞系，在配型上有优势，另外可用于药物筛选。纯合孤雌胚胎干细胞两套染色体完全相同，类似于单倍体，配型上比杂合孤雌胚胎干细胞更有优势，精确分类提高资源的利用率。

在一个实施方式中，该方法还包括将步骤S130中预分结果为杂合孤雌胚胎的样本进行，印记基因表达分析包括以下步骤S141～S143。

S141、获取微量杂合孤雌胚胎的单细胞样本进行微量细胞转录扩增，得到第二扩增产物。

具体的，将单原核胚胎体外培养至囊胚阶段，活检后采用激光辅助的方式切割一片滋养层(一般含有3个～10个细胞)，消化成单细胞，收集微量单细胞样本两份，一份进行步骤S110的全基因组扩增，得到第一扩增产物。另一份可用于微量细胞转录扩增得到第二扩增产物。

一般可采用商业化试剂盒进行转录组扩增。微量细胞转录扩增一般是对mRNA进行扩增，用于后续的印记基因表达分析。杂合孤雌胚胎的单细胞样本的数量一般是指能够实现细胞转录组扩增的细胞量。本实施方式中一般收集3个～5个细胞即可。本实施方式中采用SMART-seq2方法进行微量细胞转录组扩增，得到第二扩增产物。可以理解，其他可实现转录组扩增的方法可行。

S142、向S141中获得的第二扩增产物中分别加入不同的扩增引物后进行PCR反应，得到PCR反应产物。

其中，扩增引物包括用于扩增母源表达印记基因的引物和用于扩增父源表达印记基因的引物。

具体的，PCR反应也称聚合酶链式反应，是一种用于放大扩增特定的基因片段的分子生物学技术。若胚胎细胞样本中含有母源表达印记基因，则在母源表达印记基因的引物的作用下，其序列可得到扩增，从而在后续表达印记分析中显示。同理，若胚胎细胞样本中含有父源表达印记基因，则在父源表达印记基因的引物的作用下，其序列可得到扩增，从而在后续表达印记分析中显示。

具体的，母源表达印记基因包括NLRP基因及UBE3A基因(泛素蛋白酶基因)，父源表达印记基因包括SNRPN基因(小核核糖核蛋白多肽N基因)及PEG3基因(父系表达基因3)。用于扩增NLRP基因的正向引物的序列如SEQ ID No.1所示，用于扩增NLRP基因的反向引物的序列如SEQ ID No.2所示。用于扩增UBE3A基因的正向引物的序列如SEQ ID No.3所示，用于扩增UBE3A基因的反向引物的序列如SEQ ID No.4所示。用于扩增SNRPN基因的正向引物的序列如SEQ ID No.5所示，用于扩增SNRPN基因的反向引物的序列如SEQ ID No.6所示。用于扩增PEG3基因的正向引物的序列如SEQ ID No.7所示，用于扩增PEG3基因的反向引物的序列如SEQ ID No.8所示。

进一步的，扩增引物还包括用于作为内参的引物。本实施方式中，作为内参的引物的基因为GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)的基因，用于扩增GAPDH基因的正向引物的序列如SEQ ID No.9所示，用于扩增GAPDH基因的反向引物的序列如SEQ ID No.10所示。

具体的PCR反应条件为：95℃1分30秒；30个循环(94℃40秒，54℃～64℃40秒，72℃40秒)；72℃延伸7分钟。

S143、对S142中获得的PCR反应产物进行凝胶电泳分析，获得样本的父源表达印记信息和母源表达印记信息。

经过PCR扩增后，若胚胎细胞样本中含有母源表达印记基因，则在母源表达印记基因的引物的作用下，其序列可得到扩增，PCR反应产物进过凝胶电泳后，通过相应的母源抗体印记分析可显示母源表达印记信息。若胚胎细胞样本中含有父源表达印记基因，则在父源表达印记基因的引物的作用下，其序列可得到扩增，PCR反应产物进过凝胶电泳后，通过相应的父源抗体印记分析可显示父源表达印记信息。一般的，若样本经过印记基因表达分析后，同时含有母源表达印记基因和父源表达印记基因，鉴定其可能为实际上为2PN型胚胎。通过对杂合孤雌胚胎的样本进行印记基因表达分析筛选，对于经过临床上鉴定仅有单原核胚胎(1PN胚胎)的人群来说，可降低其胚胎移植的风险。若样本经过印记基因表达分析后，仅含有母源表达印记基因，鉴定其实际上为孤雌胚胎。若样本经过印记基因表达分析后，仅含有父源表达印记基因，鉴定其实际上为孤雄胚胎。

通过上述对杂合孤雌胚胎的样本进行印记基因表达分析，可进一步鉴定杂合孤雌胚胎的类型，提高鉴定的准确性。

在一个实施方式中，还包括将步骤S130中预分结果为杂合孤雌胚胎的样本进行亲源性分析。亲源性分析包括以下步骤S151～S153。

S151、获取杂合孤雌胚胎的单细胞对应的第一扩增产物，并将第一扩增产物的短串联重复序列位点扩增，得到样本的短串联重复序列位点信息。

具体的，参见步骤S110将杂合孤雌胚胎的单细胞对应的第一扩增产物。获取杂合孤雌胚胎的单细胞对应的第一扩增产物，并将第一扩增产物的短串联重复序列位点扩增，得到样本的短串联重复序列位点信息。进一步采用将全基因组扩增得到的第一扩增产物的短串联重复序列位点(STR位点)扩增，得到样本的STR位点信息。本实施方式中采用powerplex16system扩增样本的STR位点。

具体的，进行扩增的STR位点的基因座可以为D3S1358、TH01、D21S11、D18S51、Penta E、D5S818、D13S317、D7S820、D16S539、CSF1PO、Penta D、Amelogenin、vWA、D8S1179、TPOX以及FGA等。

S152、获取杂合孤雌胚胎的样本对应的父源DNA和母源DNA，分别扩增父源DNA和母源DNA的短串联重复序列位点，得到父源DNA短串联重复序列位点信息和母源DNA短串联重复序列位点信息。

一般可采用商业化试剂盒抽提样本对应的双亲DNA。然后分别扩增双亲DNA的STR位点，采用遗传分析仪进行检测，并数据收集检测扩增片段。

S153、将S151得到的样本的短串联重复序列位点信息分别与S152中得到的父源DNA短串联重复序列位点信息以及母源DNA短串联重复序列位点信息进行比对，分析样本的短串联重复序列位点信息来源于父源或者母源。

将样本中的STR位点信息分别母源DNA的STR位点信息以及父源DNA的STR位点信息进行比对，判断样本中STR位点的双亲来源。

若经过亲源性分析后，若样本中STR位点信息有部分源自父源DNA，鉴定其可能为实际上为2PN型胚胎，可将该数据作为中间结果的数据参照。若样本中STR位点信息全部源自母源DNA的STR位点信息，则鉴定其为孤雌胚胎。若样本中STR位点信息全部源自父源DNA的STR位点信息，则鉴定其为孤雄胚胎。

通过上述对杂合孤雌胚胎的样本进行亲源性分析，可进一步鉴定杂合孤雌胚胎的类型，提高鉴定的准确性。

需要说明的是，可以选择印记基因表达分析与亲源性分析两者中的一个检测分析，也可以两种分析都检测。文中的步骤标号只是为了描述上的方便，并不知为了对步骤流程的限定，例如S151与S152的顺序可调换。

上述方法，可将临床上粗略的通过显微镜观察划分成1PN胚胎(废弃胚胎)进一步筛选，判断其是否为确切的1PN胚胎，并对1PN胚胎进一步鉴定，更加准确分为纯合孤雌胚胎或杂合孤雌胚胎。其中纯合孤雌胚胎可用于建立孤雌胚胎干细胞系，具有药物筛选等用途，而杂合孤雌胚胎可作为下一步精确鉴定胚胎类型的材料，提高资源的利用率。进一步的，对于有争议的胚胎(杂合孤雌胚胎)还可进一步进行印记基因表达分析以及亲源性分析进一步鉴定杂合孤雌胚胎的类型，提高鉴定的准确性。

此外，如图2所示，本发明还提供一种微量细胞水平鉴别单原核胚胎类型的系统10，该系统10包括第一扩增装置110、基因杂交装置120以及分型装置130。

第一扩增装置110，用于将单原核胚胎样本体外培养至囊胚，取囊胚滋养层消化成单细胞，收集微量所述单细胞进行全基因组扩增，得到第一扩增产物。

本实施方式中，将临床上鉴定为单原核胚胎的样本体外培养至囊胚阶段，活检后采用激光辅助的方式切割一片滋养层(一般含有3个～10个细胞)，消化成单细胞，一般可采用消化酶对滋养层细胞进行消化，消化酶例如可以是accutase细胞消化液(购于lifetechnology公司)。消化后在体视镜下用毛细管玻璃针吸取微量细胞进行全基因组扩增，得到第一扩增产物。

具体的，用第一扩增装置110进行全基因组扩增时，微量细胞一般是指能够实现细胞基因组扩增的细胞量。本实施方式中一般收集3个～5个细胞即可。

具体的，单原核胚胎的样本消化成单细胞后，也可将细胞样本保存在无菌管(例如无菌EP管)中，以便下次使用，样本可在-20℃下一般可保存一个月。

具体的，将收集的微量单细胞进行全基因组扩增，一般可采用商业化试剂盒进行全基因组扩增，本实施方式采用的是sigma公司WGA4Genome-Plex Single Cell WholeGenome Amplification试剂盒。可以理解，其他可实现胚胎细胞全基因组扩增的试剂盒亦可。

具体的，单原核胚胎样本还可以通过对孤雌胚胎干细胞的分离、培养和鉴定获得。采用人工激活的方法获得孤雌囊胚，若排出第二极体形成的囊胚为纯合孤雌囊胚，若未排出第二极体形成的囊胚为杂合孤雌囊胚，然后分离孤雌囊胚内细胞团可获得孤雌胚胎干细胞系。孤雌胚胎干细胞系可培养在Matrigel基质胶包被细胞培养皿中，采用mTeSR培养基培养，隔天换液。

基因杂交装置120，用于将第一扩增产物与SNP基因芯片杂交，扫描杂交后的SNP基因芯片得到SNP位点比率及杂合型位点比率，根据SNP位点比率及杂合型位点比率计算获得样本的杂合概率。

本实施方式中，SNP基因芯片采用的是GeneChip Mapping Nsp I 262Kmicroarray(Affymetrix公司)，其他型号的芯片亦可。芯片扫描后，采用CNAT4.0软件对SNP位点分型结果进行分析。得到SNP位点比率及杂合型位点比率，再根据SNP位点比率及杂合型位点比率可计算获得样本的杂合概率。

具体的，样本的杂合概率＝杂合型位点比率/SNP位点比率×100％。

样本的杂合概率可反应样本中基因的杂合程度，从而用于判断胚胎样本的类型。

分型装置130，将获得的样本的杂合概率与预设的胚胎分型标准进行比对，根据比对结果对样本的胚胎类型进行预分，获得样本的胚胎类型，其中，胚胎分型标准包括纯合孤雌胚胎和杂合孤雌胚胎。

本实施例中，分型装置130内部的分型标准源于中信湘雅生殖与遗传专科医院中进行植入前遗传学筛查/诊断的滋养层细胞的检测数据。当然，根据鉴别的需要，也可以采用外周血淋巴细胞或是其他类型细胞系。

本发明中分型标准的检测数据以及后续的在微量细胞水平鉴别单原核胚胎类型的实验研究通过了中信湘雅生殖与遗传专科医院伦理委员会的讨论通过，并且取得了家属的同意。

具体的，预设的胚胎分型标准中，胚胎细胞的杂合概率小于8％的为单原核胚胎(1PN胚胎)，进一步的，胚胎细胞的杂合概率小于3.5％的为纯合孤雌胚胎，胚胎细胞的杂合概率在3.5％～8％之间的为杂合孤雌胚胎。

当然，预设的胚胎分型标准中还可以包括2PN胚胎杂合概率，一般的，胚胎细胞的杂合概率在10％～30％之间的为2PN胚胎。

分型装置130将获得的样本的杂合概率与预设的胚胎分型标准进行比对，根据比对结果即可对样本的胚胎类型进行预分，例如样本的杂合概率小于8％，可鉴定其为单原核胚胎(1PN胚胎)，进一步的，对该单原核胚胎(1PN胚胎)进一步鉴定，若样本的杂合概率小于3.5％的为纯合孤雌胚胎，样本的杂合概率在3.5％～8％之间的为杂合孤雌胚胎。

上述系统10，可将临床上粗略的通过显微镜观察划分成1PN胚胎(废弃胚胎)进一步筛选，判断其是否为确切的1PN胚胎，并对1PN胚胎进一步鉴定，更加准确分为纯合孤雌胚胎或杂合孤雌胚胎。其中纯合孤雌胚胎可用于建立孤雌胚胎干细胞系，具有药物筛选等用途，而杂合孤雌胚胎可作为下一步精确鉴定胚胎类型的材料，提高资源的利用率。

具体的，系统10还包括印记基因表达分析装置140，印记基因表达分析装置140用于将预分结果为杂合孤雌胚胎的样本进行印记基因表达分析。其中，如图3所示，印记基因表达分析装置140包括第二扩增装置141、PCR反应装置142以及凝胶电泳分析装置143。

其中，第二扩增装置141，用于获取微量杂合孤雌胚胎的单细胞样本进行微量细胞转录扩增，得到第二扩增产物。

具体的，第二扩增装置141可采用SMART-seq2的方法进行微量细胞转录组扩增，得到第二扩增产物。可以理解，其他可实现转录组扩增的方法可行。

PCR反应装置142，用于向第二扩增产物中分别加入不同的扩增引物后进行PCR反应，得到PCR反应产物，其中，扩增引物包括用于扩增母源表达印记基因的引物和用于扩增父源表达印记基因的引物。

扩增引物包括用于扩增母源表达印记基因的引物和用于扩增父源表达印记基因的引物。具体的，母源表达印记基因包括NLRP基因及UBE3A基因(泛素蛋白酶基因)，父源表达印记基因包括SNRPN基因(小核核糖核蛋白多肽N基因)及PEG3(父系表达基因3)基因。用于扩增NLRP基因的正向引物的序列如SEQ ID No.1所示，用于扩增NLRP基因的反向引物的序列如SEQ ID No.2所示。用于扩增UBE3A基因的正向引物的序列如SEQ ID No.3所示，用于扩增UBE3A基因的反向引物的序列如SEQ ID No.4所示。用于扩增SNRPN基因的正向引物的序列如SEQ ID No.5所示，用于扩增SNRPN基因的反向引物的序列如SEQ ID No.6所示。用于扩增PEG3基因的正向引物的序列如SEQ ID No.7所示，用于扩增PEG3基因的反向引物的序列如SEQ ID No.8所示。

进一步的，扩增引物还包括用于作为内参的引物。本实施方式中，作为内参的引物的基因为GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)的基因，用于扩增GAPDH基因的正向引物的序列如SEQ ID No.9所示，用于扩增GAPDH基因的反向引物的序列如SEQ ID No.10所示。

经验证，上述引物SEQ ID No.1～SEQ ID No.10，使得对应的基因片段扩增效率较高。

具体的PCR反应装置142用于反应时，PCR反应条件为：95℃1分30秒；30个循环(94℃40秒，54℃～64℃40秒，72℃40秒)；72℃延伸7分钟。

凝胶电泳分析装置143，用于对PCR反应产物进行凝胶电泳分析，获得样本的父源表达印记信息和母源表达印记信息。

通过印记基因表达分析装置140，可进一步鉴定杂合孤雌胚胎的类型，提高鉴定的准确性。

在一个实施方式中，系统10还包括亲源性分析装置150，亲源性分析装置150用于将预分结果为杂合孤雌胚胎的样本进行亲源性分析。其中，如图4所示亲源性分析装置150包括第三扩增装置151、父源和母源序列获取装置152以及比对装置153。

其中，第三扩增装置151，用于获取杂合孤雌胚胎的单细胞对应的第一扩增产物，并将第一扩增产物的短串联重复序列位点扩增，得到样本的短串联重复序列位点信息。

具体的，第一扩增装置S110杂合孤雌胚胎的单细胞对应的第一扩增产物。第三扩增装置151将第一扩增产物的短串联重复序列位点扩增，得到样本的短串联重复序列位点信息。进一步采用将全基因组扩增得到的第一扩增产物的短串联重复序列位点(STR位点)扩增，得到样本的STR位点信息。本实施方式中采用powerplex16system扩增样本的STR位点。

具体的，进行扩增的STR位点的基因座可以为D3S1358、TH01、D21S11、D18S51、Penta E、D5S818、D13S317、D7S820、D16S539、CSF1PO、Penta D、Amelogenin、vWA、D8S1179、TPOX以及FGA等。

父源和母源序列获取装置152，用于获取杂合孤雌胚胎的样本对应的父源DNA和母源DNA，分别扩增父源DNA和母源DNA的短串联重复序列位点，得到父源DNA短串联重复序列位点信息和母源DNA短串联重复序列位点信息。

一般的，源和母源序列获取装置152中包括商业化试剂盒，采用商业化试剂盒抽提样本对应的双亲DNA。然后分别扩增双亲DNA的STR位点，采用遗传分析仪进行检测，并数据收集检测扩增片段。

比对装置153，用于将样本的短串联重复序列位点信息分别与父源DNA短串联重复序列位点信息以及母源DNA短串联重复序列位点信息进行比对，分析样本的短串联重复序列位点信息来源于父源或者母源。

比对装置153将样本中的STR位点信息分别母源DNA的STR位点信息以及父源DNA的STR位点信息进行比对，判断样本中STR位点的双亲来源。

若经过亲源性分析后，若样本中STR位点信息有部分源自父源DNA，鉴定其可能为实际上为2PN型胚胎，可将该数据作为中间结果的数据参照。若样本中STR位点信息全部源自母源DNA的STR位点信息，则鉴定其为孤雌胚胎。若样本中STR位点信息全部源自父源DNA的STR位点信息，则鉴定其为孤雄胚胎。

通过亲源性分析装置150可进一步鉴定杂合孤雌胚胎的类型，提高鉴定的准确性。

上述系统10，可将临床上粗略的通过显微镜观察划分成1PN胚胎(废弃胚胎)进一步筛选，判断其是否为确切的1PN胚胎，并对1PN胚胎进一步鉴定，更加准确分为纯合孤雌胚胎或杂合孤雌胚胎。其中，纯合孤雌胚胎和杂合孤雌胚胎均可用于建立胚胎干细胞系，两者是研究印记基因和父母源基因组在发育过程中的作用的良好细胞模型，且在细胞替代治疗中孤雌细胞系更容易获得HLA单倍型的细胞系，在配型上有优势，另外可用于药物筛选。纯合孤雌胚胎干细胞两套染色体完全相同，类似于单倍体，配型上比杂合孤雌胚胎干细胞更有优势。进一步的，上述系统10还包括印记基因表达分析装置140及亲源性分析装置150，可用于对于有争议的胚胎(杂合孤雌胚胎)还可进一步进行印记基因表达分析以及亲源性分析进一步鉴定杂合孤雌胚胎的类型，提高鉴定的准确性。

以下为具体实施例。

如无特别说明，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。

主要实验仪器及用品：

主要仪器：电泳槽(北京六一生物科技有限公司)、凝胶成像系统(VILBERLOURMET)、基因芯片系统(Affymetrix，

Scanner 3000 7G)、二氧化碳培养箱(美国Forma公司)、倒置DIC显微镜TS 100、生物安全柜(海尔公司)、离心机(Eppendorf)、PCR仪(Eppendorf)；毛细玻璃管。

培养基：mTeSR培养基(上海拜力生物科技有限公司(StemCell公司)产品)、Matrigel基质胶(美国BD公司产品)；

实施例1

建立胚胎分型标准

分别检测多组已知胚胎类型的胚胎，获得多组2PN胚胎的SNP位点比率及杂合型位点比率，计算获得2PN胚胎的杂合概率，以及多组1PN胚胎(包括纯合孤雌胚胎以及杂合孤雌胚胎)的SNP位点比率及杂合型位点比率，计算获得纯合孤雌胚胎的杂合概率以及杂合孤雌胚胎的杂合概率。具体的SNP基因芯片采用的是GeneChip Mapping Nsp I 262Kmicroarray(Affymetrix公司)，其他型号的芯片亦可。芯片扫描后，采用CNAT 4.0软件对SNP位点分型结果进行分析。杂合概率＝杂合型位点比率/SNP位点比率×100％。根据多组2PN胚胎的杂合概率总结得到2PN胚胎的杂合概率范围、纯合孤雌胚胎的杂合概率范围以及杂合孤雌胚胎的杂合概率范围，以此作为胚胎分型标准。部分检测结果如表1所示。

表1：不同类型胚胎通过SNP检测得到的杂合概率

注意表1中仅列出部分样本SNP001～SNP0217的检测结果，实际建立胚胎分型标准的过程中还可进行更多样本的测试，以提高可信度。本申请中杂合度信息所用的样本SNP001～SNP0217来源于中信湘雅生殖与遗传专科医院中进行植入前遗传学筛查/诊断的滋养层细胞。由表1可知，正常受精2PN样本杂合性SNP位点所占百分比范围为18.44％±4.18％，而纯合单性生殖的样本为2.60％±0.80％，杂合单性生殖的样本为6.78±1.00％，三者之间有显著性差异。本建立胚胎分型标准，当胚胎细胞的杂合概率小于8％的为单原核胚胎(1PN胚胎)，进一步的，胚胎细胞的杂合概率小于3.5％的为纯合孤雌胚胎，胚胎细胞的杂合概率在3.5％～8％之间的为杂合孤雌胚胎。胚胎细胞的杂合概率在10％～30％之间的为2PN胚胎。

实施例2

印记基因表达分析

收集3个～5个经SNP检测预分结果为杂合孤雌胚胎的单细胞样本SNP0215，取其对应的由滋养层消化获得的单细胞，采用SMART-seq2技术进行微量细胞转录组扩增，扩增以后采用PCR的方法进行印记基因表达分析。PCR扩增时加入分别加入不同的扩增引物后进行PCR反应。具体为用于扩增母源表达印记基因NLRP2的正反引物，用于扩增UBE3A的正反引物。用于扩增父源表达印记基因SNRPN的正反引物，用于扩增PEG3的正反引物。以及作为内参的GAPDH的正反引物。PCR反应条件：95℃1分30秒；30个循环(94℃40秒，54℃-64℃40秒，72℃40秒)；72℃延伸7分钟。将获得的PCR反应产物进行凝胶电泳分析，分别加入相应的母源抗体、父源抗体以内参抗体进行印记分析，凝胶成像系统显示得到结果如图5所示。其中，标号1的垂直对下去的条带表示本实施例中样本的印记，标号2的垂直对下去的条带表示实验对照(采用正常2PN胚胎扩增后)的印记，标号3的垂直对下去的条带表示空白对照(无DNA底物扩增后)的印记。从图5以看出，通过印记基因表达分析其表达母源表达印记基因，不表达父源表达印记基因，因此进一步鉴定其为该1PN胚胎样本为孤雌样本。

实施例3

STR(短串联重复序列)位点亲源性分析

收集3个～5个经SNP检测预分结果为杂合孤雌胚胎的单细胞样本SNP0215取其对应地采用商业化试剂盒进行全基因组扩增获得的第一扩增产物进行STR位点扩增。用试剂盒(qiagen，51304)抽提样本对应的双亲DNA。本文中采用powerplex16system扩增STR位点，分别对以下16个基因座基因(D3S1358、TH01、D21S11、D18S51、Penta E、D5S818、D13S317、D7S820、D16S539、CSF1PO、Penta D、Amelogenin、vWA、D8S1179、TPOX以及FGA)进行扩增。使用ABI3130型遗传分析仪进行检测。进一步使用version3.0版本数据收集软件，检测扩增片段，结果如表2所示。

表2：母源、父源以及样本的STR位点分析结果

其中/代表未获得相应扩增产物的结果

如表2为采用杂合度判断两性生殖的样本，进行STR分析发现其共扩增出来的12个STR，其中D21S11,vWA和D7S820这3个位点明确仅存在母本来源的STR，该结果提示该1PN样本极有可能不含父本来源的STR，可能实际上为1PN杂合型胚胎。

以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖南光琇高新生命科技有限公司

<120> 微量细胞水平鉴别单原核胚胎类型的方法和系统

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 扩增NLRP基因的正向引物

<400> 1

tggaactgcg acataacta 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 扩增NLRP基因的反向引物

<400> 2

cacaaccaca gacatctca 19

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 扩增UBE3A基因的正向引物

<400> 3

ccacagtatg tcgtcttca 19

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 扩增UBE3A基因的反向引物

<400> 4

gcaataggct tgactacca 19

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 扩增SNRPN基因的正向引物

<400> 5

gatactggca ttgctcgggt 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 扩增SNRPN基因的反向引物

<400> 6

tccagcaata ctggcagtcg 20

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 扩增PEG3基因的正向引物

<400> 7

tccccaccat ccaaagacat a 21

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 扩增PEG3基因的反向引物

<400> 8

gcacaccaat ggagacacac 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 扩增GAPDH基因的正向引物

<400> 9

accacagtcc atgccatcac 20

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 扩增GAPDH基因的反向引物

<400> 10

ccaccaccct gttgctgta 19

Claims (2)

1.一种微量细胞水平鉴别单原核胚胎类型的方法，其特征在于，包括以下步骤：

将单原核胚胎样本体外培养至囊胚，取所述囊胚滋养层消化成单细胞，收集微量所述单细胞进行全基因组扩增，得到第一扩增产物；

将所述第一扩增产物与SNP基因芯片杂交，扫描杂交后的所述SNP基因芯片得到SNP位点比率及杂合型位点比率，根据所述SNP位点比率及所述杂合型位点比率计算获得所述样本的杂合概率，所述样本的杂合概率的计算公式如下：样本的杂合概率=杂合型位点比率/SNP位点比率×100%；以及

将获得的所述样本的杂合概率与预设的胚胎分型标准进行比对，根据比对结果对所述样本的胚胎类型进行预分，获得所述样本的胚胎类型，其中，所述胚胎分型标准包括纯合孤雌胚胎和杂合孤雌胚胎，所述预设的胚胎分型标准中，胚胎细胞的杂合概率小于8%的为单原核胚胎，胚胎细胞的杂合概率小于3.5%的为所述纯合孤雌胚胎，胚胎细胞的杂合概率在3.5%~8%之间的为所述杂合孤雌胚胎；

还包括将预分结果为杂合孤雌胚胎的样本进行印记基因表达分析，其中，所述印记基因表达分析包括以下步骤：获取微量所述杂合孤雌胚胎的单细胞样本进行微量细胞转录扩增，得到第二扩增产物；向所述第二扩增产物中分别加入不同的扩增引物后进行PCR反应，得到PCR反应产物，其中，所述扩增引物包括用于扩增母源表达印记基因的引物和用于扩增父源表达印记基因的引物；以及对所述PCR反应产物进行凝胶电泳分析，获得所述样本的父源表达印记信息和母源表达印记信息，其中，所述母源表达印记基因包括NLRP基因及UBE3A基因，所述父源表达印记基因包括SNRPN基因及PEG3基因，用于扩增NLRP基因的正向引物的序列如SEQ ID No.1所示，用于扩增NLRP基因的反向引物的序列如SEQ ID No.2所示，用于扩增UBE3A基因的正向引物的序列如SEQ ID No.3所示，用于扩增UBE3A基因的反向引物的序列如SEQ ID No.4所示，用于扩增SNRPN基因的正向引物的序列如SEQ ID No.5所示，用于扩增SNRPN基因的反向引物的序列如SEQ ID No.6所示，用于扩增PEG3基因的正向引物的序列如SEQ ID No.7所示，用于扩增PEG3基因的反向引物的序列如SEQ ID No.8所示；

还包括将预分结果为杂合孤雌胚胎的样本进行亲源性分析，其中，所述亲源性分析包括以下步骤：获取所述杂合孤雌胚胎的单细胞对应的所述第一扩增产物，并将所述第一扩增产物的短串联重复序列位点扩增，得到样本的短串联重复序列位点信息；获取所述杂合孤雌胚胎的样本对应的父源DNA和母源DNA，分别扩增所述父源DNA和所述母源DNA的短串联重复序列位点，得到父源DNA短串联重复序列位点信息和母源DNA短串联重复序列位点信息；以及将所述样本的短串联重复序列位点信息分别与所述父源DNA短串联重复序列位点信息以及所述母源DNA短串联重复序列位点信息进行比对，分析所述样本的短串联重复序列位点信息来源于父源或者母源；其中，进行扩增的短串联重复序列位点的基因座为D3S1358、TH01、D21S11、D18S51、Penta E、D5S818、D13S317、D7S820、D16S539、CSF1PO、PentaD、Amelogenin、vWA、D8S1179、TPOX以及FGA。

2.一种微量细胞水平鉴别单原核胚胎类型的系统，其特征在于，所述系统包括：

第一扩增装置，将单原核胚胎样本体外培养至囊胚，取所述囊胚滋养层消化成单细胞，收集微量所述单细胞进行全基因组扩增，得到第一扩增产物；

基因杂交装置，用于将所述第一扩增产物与SNP基因芯片杂交，扫描杂交后的所述SNP基因芯片得到SNP位点比率及杂合型位点比率，根据所述SNP位点比率及所述杂合型位点比率计算获得所述样本的杂合概率，所述样本的杂合概率的计算公式如下：样本的杂合概率=杂合型位点比率/SNP位点比率×100%；以及

分型装置，将获得的所述样本的杂合概率与预设的胚胎分型标准进行比对，根据比对结果对所述样本的胚胎类型进行预分，获得所述样本的胚胎类型，其中，所述胚胎分型标准包括纯合孤雌胚胎和杂合孤雌胚胎，所述预设的胚胎分型标准中，胚胎细胞的杂合概率小于8%的为单原核胚胎，胚胎细胞的杂合概率小于3.5%的为所述纯合孤雌胚胎，胚胎细胞的杂合概率在3.5%~8%之间的为所述杂合孤雌胚胎；

所述系统还包括：印记基因表达分析装置，用于将预分结果为杂合孤雌胚胎的样本进行印记基因表达分析，其中，所述印记基因表达分析装置包括第二扩增装置、PCR反应装置以及凝胶电泳分析装置，其中，第二扩增装置，用于获取微量所述杂合孤雌胚胎的单细胞样本进行微量细胞转录扩增，得到第二扩增产物；PCR反应装置，用于向所述第二扩增产物中分别加入不同的扩增引物后进行PCR反应，得到PCR反应产物，其中，所述扩增引物包括用于扩增母源表达印记基因的引物和用于扩增父源表达印记基因的引物；凝胶电泳分析装置，用于对所述PCR反应产物进行凝胶电泳分析，获得所述样本的父源表达印记信息和母源表达印记信息，所述母源表达印记基因包括NLRP基因及UBE3A基因，所述父源表达印记基因包括SNRPN基因及PEG3基因，用于扩增NLRP基因的正向引物的序列如SEQ ID No.1所示，用于扩增NLRP基因的反向引物的序列如SEQ ID No.2所示，用于扩增UBE3A基因的正向引物的序列如SEQ ID No.3所示，用于扩增UBE3A基因的反向引物的序列如SEQ ID No.4所示，用于扩增SNRPN基因的正向引物的序列如SEQ ID No.5所示，用于扩增SNRPN基因的反向引物的序列如SEQ ID No.6所示，用于扩增PEG3基因的正向引物的序列如SEQ ID No.7所示，用于扩增PEG3基因的反向引物的序列如SEQ ID No.8所示；

所述系统还包括：亲源性分析装置，用于将预分结果为杂合孤雌胚胎的样本进行亲源性分析，其中，所述亲源性分析装置包括第三扩增装置、父源和母源序列获取装置以及比对装置，其中，第三扩增装置，用于获取所述杂合孤雌胚胎的单细胞对应的所述第一扩增产物，并将所述第一扩增产物的短串联重复序列位点扩增，得到样本的短串联重复序列位点信息；父源和母源序列获取装置，用于获取所述杂合孤雌胚胎的样本对应的父源DNA和母源DNA，分别扩增所述父源DNA和所述母源DNA的短串联重复序列位点，得到父源DNA短串联重复序列位点信息和母源DNA短串联重复序列位点信息；比对装置，用于将所述样本的短串联重复序列位点信息分别与所述父源DNA短串联重复序列位点信息以及所述母源DNA短串联重复序列位点信息进行比对，分析所述样本的短串联重复序列位点信息来源于父源或者母源；其中，进行扩增的短串联重复序列位点的基因座为D3S1358、TH01、D21S11、D18S51、Penta E、D5S818、D13S317、D7S820、D16S539、CSF1PO、Penta D、Amelogenin、vWA、D8S1179、TPOX以及FGA。

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