CN108342452A - 一种用于微量细胞中基因快速检测的方法及应用 - Google Patents

一种用于微量细胞中基因快速检测的方法及应用 Download PDF

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任红艳
华再东
毕延震
郑新民
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay

Abstract

本发明公开了一种用于微量细胞中基因快速检测的方法及应用，该方法包括以下步骤：包括微量细胞收集、细胞裂解、PCR扩增和检测。本发明解决了细胞裂解过程中存在的裂解不彻底、细胞碎片和残留蛋白酶K影响PCR反应效率等问题，将细胞裂解产物直接用于PCR反应，简化了实验步骤，提高了检测效率。

Description

一种用于微量细胞中基因快速检测的方法及应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种用于微量细胞中基因快速检测的方法及应用。
背景技术
基因修饰技术已被广泛应用，多种克隆动物也相继诞生。检测修饰基因是否成功导入克隆细胞，是体细胞核移植技术的关键一步。但由于经过修饰的细胞株生长缓慢，细胞数量少，其提取DNA模板的量难以达到常规PCR检测所需，因而需要耗费大量的时间、人力和物力来收集大量细胞提取DNA，从而延误了整个实验的进程。本发明能用微量的基因修饰后的克隆细胞快速进行PCR检测，而且此方法在本实验室制备的IGF基因修饰克隆猪成纤维细胞的检测使用中效果良好且稳定。
聚合酶链式反应(polymerase Chain Reaction,PCR)是分子生物学最常用的检测技术之一，在疾病诊断、DNA克隆、基因组分析、遗传检测等方面发挥重大作用。PCR反应体系中包含DNA聚合酶、dNTPs，PCR反应缓冲液、镁离子、引物等，再需要加入相应的反应模板DNA即可。常见的PCR反应样本包括细胞、血液、组织、毛囊等，通常研究者需要从样本中提取纯化的DNA作为PCR模板，从样本裂解到DNA提取纯化完成，至少需要4-5个小时，耗时长、效率低，而且需要较多的样本量才能完成，这给某些难以获得的、少量的样本的基因分析带来了困难。尤其是在动物体细胞核移植的阳性细胞筛选中。应用PCR方法检测细胞中外源基因的整合表达情况是制备克隆动物的第一步，通过对原代细胞中外源基因的整合、表达情况进行分析可以帮助我们尽快筛选到阳性细胞用于后续体细胞核移植，能够大大提高克隆动物的效率，节约时间、降低成本。然而，由于猪原代细胞生长缓慢，传代时间长，繁殖代次有限，尤其是经历了一次或多次基因修饰和药物筛选后，细胞状态和活力已大不如前，想要收集大量的阳性细胞提取DNA后再进行基因鉴定困难很大。传统的DNA抽提方法为苯酚-氯仿抽提方式，该方法耗时较长，步骤繁冗，而且苯酚、氯仿本身对人体有毒，目前已较少使用；目前应用更多的是商业化的基因组DNA提取试剂盒，使用试剂盒提取基因组DNA要经过裂解、吸附、漂洗和洗脱等过程才能将DNA提取出来，耗时较长。此外，我们在实验中还发现，在鉴定阳性细胞时，用大量的细胞提取DNA后再进行检测的效率反不如单个或少数几个细胞直接进行PCR的检测效率高、背景清晰。因此，如果发明一种能够将细胞直接裂解后作为模板进行PCR的方法，这样不仅省时省力，而且成本低，非常适用于高通量细胞鉴定。
细胞裂解是应用微量细胞直接进行PCR反应的关键一步。如果细胞裂解不彻底，并且细胞裂解之后的细胞碎片以及一些蛋白酶会对PCR反应造成干扰，都会导致基因扩增效率低或实验失败。常用的细胞裂解方法包括化学裂解和机械裂解，化学裂解比较温和，很少会使DNA断裂，但加入的化学试剂如SDS等如果不处理彻底会影响接下来的PCR反应效率；机械裂解可以获得更均一的裂解细胞，且无其他化学成分引入，但易造成细胞中的DNA断裂从而影响PCR扩增效率。目前，细胞鉴定中最常用的还是采用化学裂解的方法。常见的裂解试剂包括酸、碱、去污剂、酶等，动物细胞裂解中去污剂使用较多，它的作用是破坏脂质双膜以释放细胞内容物并裂解膜蛋白，但需要后续过程去除掉试剂残留，否则会抑制PCR。蛋白酶促反应裂解细胞的方法应用很广，但对蛋白酶的浓度、作用时间和灭活过程有严格的要求，任一环节出现问题都会导致后续PCR试验失败。
发明内容
本发明的目的在于提供一种反应快速、效率高的用于微量细胞裂解方法，以及用该裂解方法处理的细胞裂解无直接进行PCR的方法。从蛋白酶裂解细胞入手，对蛋白酶的浓度、作用时间和处理方法进行了界定，无需提取基因组DNA即可对较少的细胞裂解物进行PCR检测，省时省力且扩增效率高，应用前景广。
为达到此目的，本发明采用以下具体技术方案：
一种用于微量细胞中基因快速检测的方法，包括以下步骤：
取15μL消化后包含100-300个修饰后成纤维细胞的液滴于含180μL PBS的PCR管中，400g/min离心3min，弃上清液，留约15μL液体和沉淀细胞，向其中加入15μL 0.05％蛋白酶K，混匀；瞬时离心后55℃水浴消化1-2小时；500g/min离心5min；PCR仪95℃灭活15min；取3-5μL为模板直接进行PCR检测。
本发明所述方法在微量细胞的基因扩增和基因快速检测过程中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明解决了细胞裂解过程中存在的裂解不彻底、细胞碎片和残留蛋白酶K影响PCR反应效率等问题，将细胞裂解产物直接用于PCR反应，简化了实验步骤，整个检测过程仅需2个小时。
附图说明
图1外源基因整合结构示意图；
图2猪胎儿成纤维细胞中整合IGF-I基因的检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方案对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
用转IGF-I质粒的猪胎儿成纤维细胞快速检测说明本发明。
1、主要试剂和材料来源
猪胎儿成纤维细胞(本实验室制备)、IGF-I质粒(本实验室设计制备)、DPBS、DMEM、胎牛血清、0.25％胰酶、G418均购HyClone公司、青霉素、链霉素、细胞培养6孔板、细胞培养24孔板、细胞培养48孔板、PCR管、移液器、BTX-2000电转仪、2mm电转杯。
2、操作步骤
(1)将猪胎儿成纤维细胞培养至细胞培养6孔板，当细胞生长汇合度至90％左右时，胰酶消化1min左右(60％细胞间隙出现)，弃胰酶，加入含10％胎牛血清的DMDM 1mL用移液器吹打悬浮并收集细胞于1.5mL离心管中，400g×3min离心去上清液，向沉淀细胞中加入100μL电转液，加5ng/μL IGF-I质粒，悬浮细胞,混匀后转移至电转杯电击。
(2)190V，3ms,1次电击，电击后细胞培养到细胞培养6孔板，1孔细胞电击转3-4孔稀释培养，36h-48h后换液加G418筛选(200μg/mL-300μg/mL)3-4d细胞开始死亡，换培养液降低G418筛选100μg/mL维持至单克隆出现，降G418筛选50μg/mL维持克隆细胞继续生长，直至克隆细胞的挑取。
(3)待克隆斑生长到清晰可见，在倒置显微镜蓝光激发下寻找敲除成功的绿色荧光克隆斑，挑取到24孔或48孔细胞培养板继续培养，以保证其纯度。
(4)将生长旺盛的克隆细胞消化传代时，取150个左右的细胞检测。
(5)取15μL消化含150个左右克隆成纤维细胞的液滴于含180μL DPBS的PCR管，400g离心3-5min，去上清留15μL左右液体和细胞沉淀，再加15μL含0.05％胰蛋白酶的消化液混合；55℃水浴消化1小时；5000rpm离心5min；PCR仪95℃灭活15min；取3-5μL为模板进行PCR鉴定，其余冻存备用。
(6)PCR反应体系和条件
20μL PCR反应体系：在灭菌PCR管中加入0.25μL TaKaRa LATaq HS酶，2μL 10×PCR Buffer，2μL dNTP，5μL Template，上、下游引物各0.4μL，补加ddH2O至20μL，轻弹混匀后瞬时离心。将混好的反应体系放入PCR仪内进行反应，反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸2min，共进行30个循环；72℃总延伸7min。
(7)结果判定
一个小时后，观察结果，如图2所示，出现目的条带，说明裂解后的细胞可用于PCR直接扩增。
如图1所示，本实验是在猪胎儿成纤维细胞系中共转染T11、T31和PBIGFm三个质粒，其中T11和T31质粒的作用是借助CRISPR/Cas9技术在猪基因组上MSTN基因编码区产生双链断裂，并通过同源重组的方式将包含外源基因IGF-Im的载体置换到原MSTN编码区，从而达到敲除猪MSTN基因序列的同时原位整合猪IGF-Im基因和标记基因eGFP的目的。
PCR检测方法：上游引物EGFP-QF1，下游引物T2-down，扩增目的片段为1562bp。
共挑选77个细胞克隆，对其中36个克隆进行了PCR检测，检出27个为基因整合阳性。
表1PCR检测结果统计
细胞类型 转染率 挑取克隆数 检测克隆数 阳性克隆数
纯系大白猪胎儿成纤维细胞 56％ 77 36 27
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

Claims (8)

1.一种用于微量细胞中基因快速检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将待检测细胞与细胞裂解液按比例混合：所述细胞裂解液包括Tris-Hcl,EDTA和蛋白酶K；
(2)将步骤(1)所的混合物在55℃水浴消化1-2h，瞬时离心后，在95℃灭活10-15min。
2.如权利要求1所述的用于微量细胞中基因快速检测的方法，其特征在于，其特征在于，步骤(1)中所述细胞裂解液包括10mM的Tris-Hcl，1mM的EDTA和0.05％的蛋白酶K，pH值为7.6-8.0。
3.如权利要求1所述的用于微量细胞中基因快速检测的方法，其特征在于，其特征在于，步骤(1)中，待测细胞与细胞裂解液的混合比例为20-30个细胞/μl裂解液。
4.如权利要求1所述的用于微量细胞中基因快速检测的方法，其特征在于，所述待检测细胞为动物细胞。
5.权利要求1-4任一项所述方法在微量细胞的基因扩增和基因快速检测过程中的应用，其特征在于，使用如权利要求1-4任一项所述的细胞裂解方法裂解细胞，将所得细胞裂解物加入PCR反应体系中直接进行PCR。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，每个PCR反应体系中使用200-300个细胞的裂解产物。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述PCR反应程序如下：95℃，5min；(95℃30s，60℃30s，72℃2min)×30cycles，72℃7min。
8.权利要求1-4任一项所述的方法在转基因或克隆细胞检测中的应用。
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