CN114032619B - 一种用于构建游离dna文库的试剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于构建游离DNA文库的试剂及其应用。所述试剂包括载体DNA、热敏性蛋白酶和接头连接试剂，所述接头连接试剂包括连接酶、连接缓冲液、丙二醇和聚乙二醇。利用所述试剂能够克服现有技术必须经过单细胞全基因组扩增后才能进行高通量测序文库构建的问题，避免由单细胞全基因组扩增引起的污染DNA信号放大及掩盖cfDNA甲基化位点、cfDNA长度和cfDNA序列特征等信息的问题，并显著缩短建库时间及降低建库成本。

Description

一种用于构建游离DNA文库的试剂及其应用

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，涉及一种用于构建游离DNA文库的试剂及其应用。

背景技术

2013年S. Stigliani教授及其团队首次在废弃的囊胚培养液中检测到胚胎来源的基因组DNA和线粒体DNA（Stigliani, S., et al., Mitochondrial DNA content inembryo culture medium is significantly associated with human embryofragmentation. Hum Reprod, 2013. 28(10): p. 2652-60.），Shamonki及其研究团队首次利用D3-D5/6的胚胎培养液进行无创胚胎植入前基因检测（Non-invasivePreimplantation Genetic Test for Embryo Aneuploidy，niPGT-A），初步证明利用废弃胚胎培养液中游离DNA进行无创胚胎植入前基因检测（PGT-A）的可行性（Shamonki, M.I.,et al., Proof of concept: preimplantation genetic screening without embryobiopsy through analysis of cell-free DNA in spent embryo culture media.Fertil Steril, 2016. 106(6): p. 1312-1318.）。

目前niPGT技术用于胚胎的遗传学评估具有不确定性，胚胎培养液中胚胎来源DNA占比从0%-10%不等，中位数为8%，Chen等发现在所有的废弃胚胎培养液中都存在母源污染，约22%的样本颗粒细胞污染比例超过60%，当母源污染比例高于60%时，性别不一致率和假阴性率分别增加到100%和75%（Chen, Y., et al., DNA methylome reveals cellularorigin of cell-free DNA in spent medium of human preimplantation embryos. JClin Invest, 2021. 131(12).）。如果按照目前的niPGT检测方法，先对囊胚培养液样本进行单细胞全基因组扩增，增大样本中基因量以满足建库需求，再进行文库构建，高通量测序，会将母源DNA的背景信号进一步放大，导致母源污染带来的本底信号非常强，严重干扰胚胎来源的DNA信号，甚至直接覆盖胚胎的信号，如CN111440857A公开了一种用于无创胚胎植入前遗传性检测的方法，该方法使用上述试剂盒对囊胚培养液样本进行全基因组扩增，扩增产物及父母双方DNA样本进行短串联重复序列分析检测母源污染，扩增产物进行文库制备、二代测序检测，确定染色体数目是否异常。

综上所述，本领域亟需要开发一种能够降低母源污染、提高准确性的无创胚胎质量评价方法。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种用于构建游离DNA文库的试剂及其应用，所述用于构建游离DNA文库的试剂能够显著促进样本中微量游离DNA的末端修复、接头连接，降低纯化过程中目的DNA的损失，从而可有效提高目的DNA的捕获效率，无需先对样本中微量游离DNA进行单细胞全基因组扩增后再进行高通量测序文库构建。

为达上述目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种用于构建游离DNA文库的试剂，所述试剂包括载体DNA（Carrier DNA）、热敏性蛋白酶和接头连接试剂，所述接头连接试剂包括连接酶、连接缓冲液、丙二醇和聚乙二醇。

游离DNA（cfDNA）指游离于细胞外的DNA片段，样本中游离DNA含量通常较低，难以直接进行高通量测序文库构建，因此，需通过单细胞全基因组扩增，将游离DNA放大几万倍以上，使其达到能够进行文库构建的起始量。本发明提供的用于构建游离DNA文库的试剂能够克服样本中游离DNA含量低而难以直接进行不依赖于单细胞全基因组扩增的文库构建的问题，在样本中加入热敏性蛋白酶进行裂解，并加入所述载体DNA结合使用所述接头连接试剂，即可直接进行高通量测序文库构建，可避免使用单细胞全基因组扩增，因此，能够避免由单细胞全基因组扩增引起的污染DNA信号放大及掩盖cfDNA甲基化位点、cfDNA长度和cfDNA序列特征等信息的问题，并显著缩短建库时间及降低建库成本。

本发明中，常规载体DNA均适用于本发明技术方案。

优选地，所述载体DNA的核酸序列包括SEQ ID NO.1所示的序列。

SEQ ID NO.1：

augagcccgauccugggcuacuggaaaauuaaaggccugguucaaccgacccgucugcugcuggaauaccuggaggaaaaauacgaggaacaccuguacgaacgugaugagggcgauaaauggcgcaacaaaaaauucgaacugggucuggaauucccgaaccugccguauuacaucgauggcgacguuaaacugacucagagcauggcgaucauucguuacaucgcggacaaacacaacaugcugggcggcugcccaaaagaacgugcggaaaucucuaugcuggaaggcgccgugcuggacauccguuacgguguuucccguaucgcauacagcaaagacuucgaaacccugaaaguugacuuccugagcaaacugccagagaugcugaagauguucgaagaccgucugugccacaaaacuuaccugaacggugaccacguaacucacccagacuucaugcuguacgaugcgcuggacguugugcuguauauggauccaaugugucuggaugccuucccgaagcugguaugcuucaaaaagcguaucgaagcgaucccacagauugacaaauaccugaaaagcuccaaguacauugcuuggccgcugcaagguuggcaggcuaccuucggugguggugaccacccgccaaaa。

第二方面，本发明提供第一方面所述的用于构建游离DNA文库的试剂在制备构建游离DNA文库的产品中的应用。

第三方面，本发明提供一种构建游离DNA文库的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的用于构建游离DNA文库的试剂。

优选地，所述试剂盒还包括末端修复试剂、纯化试剂和PCR扩增试剂。

优选地，所述末端修复试剂包括末端修复缓冲液和末端修复酶混合液。

优选地，所述DNA连接酶包括T4 DNA连接酶。

优选地，所述纯化试剂包括DNA 纯化磁珠。

优选地，所述PCR扩增试剂包括PCR酶混合物。

常规的用于构建基因文库的试剂包括末端修复试剂、纯化试剂和PCR扩增试剂等均适用于本发明技术方案，因此，不做具体限定。

第四方面，本发明提供一种利用第三方面所述的构建游离DNA文库的试剂盒构建游离DNA文库的方法，所述方法包括以下步骤：

（1）使用热敏性蛋白酶处理样本；

（2）向步骤（1）处理后样本中加入载体DNA和末端修复试剂，进行末端修复加dA尾；

（3）向步骤（2）加dA尾产物中加入接头和接头连接试剂，进行接头连接；

（4）向步骤（3）连接产物中加入纯化试剂，进行连接产物纯化；

（5）向步骤（4）纯化产物中加入载体DNA降解剂，进行孵育，所述载体DNA降解剂包括尿嘧啶DNA糖基化酶；

（6）以步骤（5）产物为模板进行PCR扩增并纯化扩增产物，构建所述游离DNA文库。

本发明中，所述构建游离DNA文库的方法能够对样本进行裂解后，直接进行高通量测序文库构建，无需对样本进行单细胞全基因组扩增，能避免由单细胞全基因组扩增引起的污染DNA信号放大及掩盖cfDNA甲基化位点、cfDNA长度和cfDNA序列特征等信息的问题，且大大降低了建库成本并缩短了建库时间，因此能够广泛应用于基因检测领域，如无创胚胎植入前基因检测（niPGT-A），可直接利用胚胎培养液进行检测，不经过单细胞全基因组扩增，不会使母源cfDNA信号进一步放大，避免了母源污染对分析结果的干扰，同时还能够保留cfDNA甲基化位点、cfDNA长度和cfDNA末端序列特征等信息。

优选地，步骤（1）所述处理样本包括将样本与热敏性蛋白酶混合，并在PCR仪中进行裂解处理，裂解处理反应体系包括样本、细胞裂解缓冲液和热敏性蛋白酶，裂解处理反应程序如表1所示。

表1

优选地，步骤（2）所述末端修复加dA尾在PCR仪中进行，反应程序如表1所示。

优选地，步骤（3）所述接头连接在PCR仪中进行，反应程序为20~24℃（例如可以是21℃、22℃或23℃）、28~31 min（例如可以是29℃或30℃）。

优选地，步骤（5）所述孵育的时间为25~35 min，包括但不限于26 min、27 min、28min、29 min、30 min、31 min、32 min、33 min或34 min，所述孵育的温度为35~40℃，包括但不限于36℃、37℃、38℃或39℃。

优选地，步骤（6）所述PCR扩增的反应程序如表2所示。

表2

优选地，所述方法还包括制备载体DNA的步骤。

所述载体DNA的制备方法包括：通过基因合成或PCR扩增制备所述载体DNA。

优选地，制备载体DNA中所述PCR扩增的模板包括SEQ ID NO.2所示的序列。

SEQ ID NO.2：

atgagcccgatcctgggctactggaaaattaaaggcctggttcaaccgacccgtctgctgctggaatacctggaggaaaaatacgaggaacacctgtacgaacgtgatgagggcgataaatggcgcaacaaaaaattcgaactgggtctggaattcccgaacctgccgtattacatcgatggcgacgttaaactgactcagagcatggcgatcattcgttacatcgcggacaaacacaacatgctgggcggctgcccaaaagaacgtgcggaaatctctatgctggaaggcgccgtgctggacatccgttacggtgtttcccgtatcgcatacagcaaagacttcgaaaccctgaaagttgacttcctgagcaaactgccagagatgctgaagatgttcgaagaccgtctgtgccacaaaacttacctgaacggtgaccacgtaactcacccagacttcatgctgtacgatgcgctggacgttgtgctgtatatggatccaatgtgtctggatgccttcccgaagctggtatgcttcaaaaagcgtatcgaagcgatcccacagattgacaaatacctgaaaagctccaagtacattgcttggccgctgcaaggttggcaggctaccttcggtggtggtgaccacccgccaaaa。

优选地，制备载体DNA中所述PCR扩增的引物包括SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的序列。

SEQ ID NO.3：

5’-AminolinkerC6/GGTTA/iSpC9/GGCGCGTGGTCTGAATCAGG-3’。

SEQ ID NO.4：

5’-AminolinkerC6/GGTTA/iSpC9/GAACGGCAGATCTTCTTCAG-3’。

其中，AminolinkerC6为5’端C6氨基修饰，在合成循环的最后一步以亚磷酸胺的形式通过B-氰乙基化学反应添加到引物5’糖环上，目的是封闭5’末端，使之不能连接，阻止载体DNA进入文库，iSpC9指引物修饰间臂Spacer C9，Spacer可为寡核苷酸标记提供必要的间隔以减少标记基团与寡核苷酸间的相互作用，5’SpacerC9用于引进一个5’间臂从而阻止5’端聚合酶发挥作用，使得聚合酶延伸到这里终止，产生5’突出末端，而5’突出末端不能被末端修复酶修复，无法进行接头连接，从而阻止载体DNA进入文库。

优选地，制备载体DNA中所述PCR扩增的反应程序如表3所示。

表3

优选地，本发明中在PCR扩增制备载体DNA时以dUTPs为原料，制备含有dUTP的载体DNA，能够被尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG酶）消化。

优选地，所述样本包括胚胎培养液。

优选地，步骤（3）所述接头连接试剂为T4 DNA 连接酶缓冲液(10X)、丙二醇、PEG-6000和T4 DNA 连接酶。

本发明中，控制使用热敏蛋白酶以及接头试剂组分能够有效提高文库的浓度和产量。

第五方面，本发明提供一种以非疾病诊断和/或治疗为目的的检测游离DNA的方法，所述方法包括：

利用第四方面所述的构建游离DNA文库的方法构建样本的游离DNA文库，对所述游离DNA文库进行检测分析。

优选地，所述样本包括胚胎培养液。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

（1）本发明用于构建游离DNA文库的试剂能够克服样本中游离DNA含量低而必须先对样本进行单细胞全基因组扩增，使样本中DNA量满足文库构建，再进行高通量测序文库构建的问题，因此，能够避免由单细胞全基因组扩增引起的污染DNA信号放大及掩盖cfDNA甲基化位点、cfDNA长度和cfDNA序列特征等信息的问题，并显著缩短建库时间及降低建库成本；

（2）本发明的构建游离DNA文库的方法能够对样本进行裂解后直接进行高通量测序文库构建，无需对样本进行单细胞全基因组扩增，能避免由单细胞全基因组扩增引起的污染DNA信号放大及掩盖cfDNA甲基化位点、cfDNA长度和cfDNA序列特征等信息的问题，且大大降低了建库成本并缩短了建库时间；

（3）本发明的以非疾病诊断和/或治疗为目的的检测游离DNA的方法能够有效降低样本中污染DNA的影响，如在检测胚胎培养液样本时，能够有效富集胎儿来源的信息，避免母源DNA污染，显著提高检测准确性，且检测耗时更短成本更低。

附图说明

图1为实施例2构建的文库的片段长度分布图；

图2为对比例1构建的文库的片段长度分布图；

图3为对比例2构建的文库的片段长度分布图；

图4为对比例3构建的文库的片段长度分布图；

图5为对比例4构建的文库的片段长度分布图；

图6为niEVT与niPGT检测的母源污染比例对比图；

图7为本发明方法（niEVT）构建文库测序数据的染色体拷贝数图；

图8为niPGT方法构建文库测序数据的染色体拷贝数图。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

胚胎指胚胎期动物在卵内或在母体内未孵化或未出生前的个体。动物个体发生被分为胚前期、胚胎期、胚后期3个时期。在胚胎学中，将胚胎期又划分为:①胚卵期，包括受精、卵裂、囊胚或胚泡形成及开始植入；②胚胎期，胎膜和胚盘的形成、三胚层的分化、各器官原基的建立及外部形态的形成；③胎儿期，胎儿逐渐长大，各器官系统的结构功能逐步完善，以适应出生后的生活。

本发明实施例中以囊胚培养液为例进行实验。

实施例1

本实施例制备小鼠囊胚培养液样本，包括以下步骤：

（1）胚胎受精，按照生殖中心标准IVF周期操作流程得到受精卵；

（2）胚胎转移及单囊胚培养，将胚胎转入标记好的囊胚培养皿中进行单微滴培养（培养液体积20μL）；

（3）囊胚培养液样本采集，将换液后的胚胎放置培养箱中继续培养，当囊胚发育到4期，评估胚胎等级，选择4CB/4BC以上，囊胚充分扩张的胚胎，收集对应的囊胚培养液；

取10管4期以上的小鼠胚胎的囊胚培养液样本混合，共计200μL，涡旋混匀3次，每次3s，然后分装至20个新的无核酸酶的PCR管中，每管10μL，置于-80℃保存备用。

实施例2

本实施例利用实施例1制备的小鼠囊胚培养液构建文库，所述文库的构建方法包括以下步骤：

（1）样本裂解

1）将装有囊胚培养液样本的0.2mL PCR管2000 rpm离心10 s，放置于冰上，按表4配制体系，涡旋5 s，使溶液混匀并于2000 rpm离心10 s，同步设置阴性对照，以无核酸酶水替换囊胚培养液；阳性对照，以8个小鼠囊胚细胞替换囊胚培养液；

表4

2）设置PCR仪反应程序，按照表5所示进行裂解。

表5

（2）末端修复加dA尾

1）向步骤（1）裂解产物中加入19 μL无核酸酶水和1 μL 载体DNA（SEQ ID NO.1）；

2）按表6所示在冰上配制末端修复反应液；

表6

3）吸取10μL配制好的末端修复反应液加入步骤1）的PCR管中，涡旋混匀3次，每次3s，瞬时离心将反应液收集至管底；

4）置于PCR仪上，设置PCR仪反应程序，按照表7条件进行孵育；

表7

反应结束后，瞬时离心将反应液收集至管底。

（3）接头连接

1）使用TE缓冲液对接头稀释10倍备用；

2）在步骤（2）产物中加入5 μL稀释后的接头，涡旋震荡3次，每次3 s，瞬时离心将反应液收集至管底；

3）在冰上按表8配制接头连接反应液；

表8

4）用移液器缓慢吸取25 μL配制好的接头连接反应液加入步骤2）PCR管中，涡旋震荡6次，每次3 s，瞬时离心将反应液收集至管底；

5）将步骤4）PCR管置于PCR仪上，按照表9中的条件进行反应；

表9

6）加入20 μL TE缓冲液至总体系100 μL，全部转移到新的1.5 mL离心管中。

（4）连接产物纯化

1）提前30 min取出DNA纯化磁珠（华大智造（MGI），货号1000005279）置于25℃，使用前充分震荡混匀；

2）按照待纯化样本:纯化磁珠体积比1:1.5，用移液器吸取相应体积的DNA 纯化磁珠至步骤（3）的接头连接产物中，充分混匀；

3）25℃孵育5 min；

4）瞬时离心，将离心管置于磁力架，静置3 min至液体澄清，用移液器小心吸取并丢弃上清；

5）保持离心管置于磁力架上，加入200 μL 新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠及管壁，静置30 s后小心吸取并丢弃上清；

6）重复步骤5），尽量吸干管内液体，有少量残留在管壁时可将离心管瞬时离心，在磁力架上分离后，用小量程的移液器将管底的液体吸干；

7）保持离心管固定于磁力架上，打开离心管管盖，25℃干燥，直至磁珠表面无反光、无开裂；

8）将离心管从磁力架上取下，加入21 μL TE缓冲液进行DNA洗脱，用移液器轻轻吸打10次至完全混匀；

9）25℃下孵育5 min；

10）瞬时离心，将离心管置于磁力架上，静置3 min至液体澄清，将19 μL 上清液转移到新的0.2 mL PCR管中。

（5）消化载体DNA

向纯化产物中加入1 μL 载体DNA降解剂尿嘧啶DNA糖基化酶（vazyme，货号P061-01），37℃孵育30 min；

（6）PCR扩增

1）在冰上按表10配制PCR反应液；

表10

2）用移液器吸取31 μL配制好的PCR反应液加入步骤（5）的产物中，涡旋震荡3次，每次3 s，瞬时离心将反应液收集至管底；

3）置于PCR 仪上，按照表11中的条件进行反应；

表11

4）吸取全部反应液转移到新的1.5 mL离心管中。

（7）PCR产物纯化

同步骤（4）。

纯化得到的PCR产物即为囊胚培养液样本游离DNA的文库。

对比例1

本对比例利用实施例1制备的小鼠囊胚培养液构建文库，所述文库的构建方法与实施例2相比，区别仅在于将步骤（1）中热敏蛋白酶替换为细胞裂解酶（TAKARA，货号EN00728），及裂解的反应程序为表12所示。

表12

对比例2

本对比例利用实施例1制备的小鼠囊胚培养液构建文库，所述文库的构建方法与实施例2相比，区别仅在于，步骤（3）所述接头连接反应液如表13所示。

表13

对比例3

本对比例利用实施例1制备的小鼠囊胚培养液样本构建文库，所述文库的构建方法与实施例2相比，区别仅在于，步骤（2）中用等量无核酸酶水替换载体DNA，无消化载体DNA步骤。

对比例4

本对比例利用实施例1制备的小鼠囊胚培养液构建文库，所述文库的构建方法与实施例2相比，区别仅在于，步骤（3）所述接头连接反应液如表14所示。

表14

试验例1

本试验例对实施例2和对比例1-4构建的文库进行质检，包括以下步骤

1）文库浓度测定：所有文库使用荧光染料法Qubit dsDNA HS Assay Kit定量；

2）文库长度分布检测：通过Agilent 2100生物分析仪进行长度分布检测。

文库浓度定量结果如表15所示，与实施例2相比，对比例1将步骤（1）中热敏蛋白酶替换为非热敏细胞裂解酶，导致最终文库的浓度和文库产量均降低，对比例2和对比例4步骤（3）中的接头连接体系仅采用连接缓冲液和连接酶，导致最终文库的浓度和文库产量均降低，对比例3中未使用载体DNA，文库的浓度和文库产量显著降低，文库长度分布检测结果如图1-图5所示，与实施例2相比，对比例1文库构建失败，仅有接头二聚体，对比例2-4构建的文库的胎儿来源的cfDNA占比均较低，综合上述，表明本发明的用于构建游离DNA文库的试剂能够有效应用游离DNA文库构建，制备高质量文库，通过控制裂解反应的蛋白酶为热敏性蛋白酶及接头连接反应液的成分，能够进一步提高文库质量。

表15

应用例1

本应用例使用实施例2中的文库构建方法对囊胚培养液进行建库并进行胚胎植入前基因分析。

1、含母源污染的小鼠囊胚培养液制备

（1）胚胎受精：按照生殖中心标准IVF周期操作流程制备60枚受精卵；

（2）颗粒细胞与受精卵共培养：每对卵子和精子体外授精后，分别收集4个颗粒细胞与单枚受精卵共培养；

（3）于第二天观察胚胎卵裂情况，检查卵裂球数目、是否均匀以及细胞碎片的多少；

（4）胚胎转移及单囊胚培养：第二天将胚胎及4个颗粒细胞一起转入标记好的囊胚培养皿中放置培养箱中进行单微滴培养（培养液体积20μL）；

（5）胚胎样本及对应囊胚培养液样本采集：当囊胚发育到4期，评估胚胎等级，选择4CB/4BC以上，囊胚充分扩张的胚胎活检取内细胞团，收集对应的囊胚培养液，即为含有母源污染的囊胚培养液。

60枚受精卵中共有50枚发育成囊胚，其中囊胚评级在4BC/4CB以上的囊胚有35枚。

2、胚胎植入前非整倍体遗传学检测（PGT-A）

内细胞团PGT-A检测方法参照Afrodite Sialakouma等的研究（Sialakouma, A.,et al., Embryonic Cell-free DNA in Spent Culture Medium: A Non-invasive Toolfor Aneuploidy Screening of the Corresponding Embryos. In Vivo, 2021. 35(6):p. 3449-3457.）进行，根据PGT-A检测结果挑选雄性小鼠样本，35枚评级在4BC/4CB以上的囊胚中有15枚雄性，将挑选出的雄性小鼠样本对应的囊胚培养液均分为2管，每管10μL备用。

3、雄性囊胚培养液检测

（1）本发明方法检测囊胚培养液（niEVT）

取挑选出的雄性小鼠的囊胚培养液，使用实施例2中的文库构建方法进行建库及测序分析。

（2）常规niPGT-A检测囊胚培养液

取挑选出的雄性小鼠的囊胚培养液，采用常规的建库方法进行建库及测序分析，参考Afrodite Sialakouma等研究（Sialakouma, A., et al., Embryonic Cell-free DNAin Spent Culture Medium: A Non-invasive Tool for Aneuploidy Screening of theCorresponding Embryos. In Vivo, 2021. 35(6): p. 3449-3457.）进行。

分别用本发明方法（niEVT）和常规niPGT-A方法检测雄性小鼠囊胚培养液，分析结果如图6所示，本发明方法检测小鼠囊胚培养液组母源污染比例为9.1%±0.06；常规niPGT-A方法的母源污染比例为50.52%±0.18，本发明方法（niEVT）能够显著降低母源污染比例，染色体拷贝数结果如图7和图8所示，同一份雄性小鼠囊胚培养液样本，本发明方法染色体拷贝数结果显示X染色体和Y染色体拷贝数接近；而常规niPGT-A方法染色体拷贝数结果显示存在明显的X染色体嵌合，即存在明显的母源污染。

综上所述，本发明提供了一种用于构建游离DNA文库的试剂，利用所述试剂能够克服样本游离DNA含量低而无法直接进行不依赖于单细胞全基因组扩增的文库构建的问题，使用所述试剂可对样本裂解后直接进行高通量测序文库构建，可避免使用单细胞全基因组扩增，因此，能够避免由单细胞全基因组扩增引起的污染DNA信号放大及掩盖cfDNA甲基化位点、cfDNA长度和cfDNA序列特征等信息的问题，并显著缩短建库时间及降低建库成本，此外，在建库过程中，通过控制使用热敏性蛋白酶和接头连接反应液组分，能够进一步提高文库质量，将所述试剂应用于基因检测如无创胚胎植入前基因检测，能有效富集胎儿来源的信息，避免母源DNA污染，显著提高检测准确性。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

序列表

<110> 苏州贝康医疗器械有限公司

<120> 一种用于构建游离DNA文库的试剂及其应用

<130> 2021-12-20

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 654

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

augagcccga uccugggcua cuggaaaauu aaaggccugg uucaaccgac ccgucugcug 60

cuggaauacc uggaggaaaa auacgaggaa caccuguacg aacgugauga gggcgauaaa 120

uggcgcaaca aaaaauucga acugggucug gaauucccga accugccgua uuacaucgau 180

ggcgacguua aacugacuca gagcauggcg aucauucguu acaucgcgga caaacacaac 240

augcugggcg gcugcccaaa agaacgugcg gaaaucucua ugcuggaagg cgccgugcug 300

gacauccguu acgguguuuc ccguaucgca uacagcaaag acuucgaaac ccugaaaguu 360

gacuuccuga gcaaacugcc agagaugcug aagauguucg aagaccgucu gugccacaaa 420

acuuaccuga acggugacca cguaacucac ccagacuuca ugcuguacga ugcgcuggac 480

guugugcugu auauggaucc aaugugucug gaugccuucc cgaagcuggu augcuucaaa 540

aagcguaucg aagcgauccc acagauugac aaauaccuga aaagcuccaa guacauugcu 600

uggccgcugc aagguuggca ggcuaccuuc ggugguggug accacccgcc aaaa 654

<210> 2

<211> 654

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgagcccga tcctgggcta ctggaaaatt aaaggcctgg ttcaaccgac ccgtctgctg 60

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ggcgacgtta aactgactca gagcatggcg atcattcgtt acatcgcgga caaacacaac 240

atgctgggcg gctgcccaaa agaacgtgcg gaaatctcta tgctggaagg cgccgtgctg 300

gacatccgtt acggtgtttc ccgtatcgca tacagcaaag acttcgaaac cctgaaagtt 360

gacttcctga gcaaactgcc agagatgctg aagatgttcg aagaccgtct gtgccacaaa 420

acttacctga acggtgacca cgtaactcac ccagacttca tgctgtacga tgcgctggac 480

gttgtgctgt atatggatcc aatgtgtctg gatgccttcc cgaagctggt atgcttcaaa 540

aagcgtatcg aagcgatccc acagattgac aaatacctga aaagctccaa gtacattgct 600

tggccgctgc aaggttggca ggctaccttc ggtggtggtg accacccgcc aaaa 654

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggttaggcgc gtggtctgaa tcagg 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggttagaacg gcagatcttc ttcag 25

Claims (3)

1.一种构建游离DNA文库的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

（1）使用热敏性蛋白酶处理样本；

（2）向步骤（1）处理后样本中加入载体DNA和末端修复试剂，进行末端修复加dA尾；

（3）向步骤（2）加dA尾产物中加入接头和接头连接试剂，进行接头连接；

（4）向步骤（3）连接产物中加入纯化试剂，进行连接产物纯化；

（5）向步骤（4）纯化产物中加入载体DNA降解剂，进行孵育，所述载体DNA降解剂包括尿嘧啶DNA糖基化酶；

（6）以步骤（5）产物为模板进行PCR扩增并纯化扩增产物，构建所述游离DNA文库；

所述接头连接试剂包括T4 DNA连接酶、T4 DNA连接缓冲液、丙二醇和聚乙二醇-6000；

所述载体DNA的核酸序列为SEQ ID NO.1所示的序列；

步骤（1）所述样本为废弃胚胎培养液。

2.根据权利要求1所述的构建游离DNA文库的方法，其特征在于，所述方法还包括制备载体DNA的步骤；

所述载体DNA的制备方法包括：通过基因合成制备所述载体DNA。

3.一种以非疾病诊断和/或治疗为目的的检测游离DNA的方法，其特征在于，所述方法包括：

利用权利要求1或2所述的构建游离DNA文库的方法构建样本的游离DNA文库，对所述游离DNA文库进行检测分析。

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